הדמיה קוצים הדנדריטים של העכברוש הראשי נוירונים בהיפוקמפוס באמצעות מובנה תאורה מיקרוסקופית

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמות קוצים דנדריטיים ברזולוציה סופר. זה מושג על ידי הכנה ראשונה של היפוקמפוס ראשוני של חולדה הנקרא השלב השני הוא לדמיין את הקוצים הדנדריטיים באמצעות טרנספקציה וצביעה של GFP. לאחר מכן, רכישת קוצים דנדריטיים עם תווית GFP מתבצעת ברזולוציה סופר באמצעות מיקרוסקופ SIM.

השלב האחרון הוא לשחזר את נתוני התמונה הגולמיים לתלת-ממד מוכנים לניתוח תמונה לאחר מכן. בסופו של דבר, GFP המבטא נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס המצולמים ברזולוציה סופר משמש להצגת שינויים עדינים במורפולוגיה של עמוד השדרה הדנדריטית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מיקרוסקופיה קונפוקלית קונבנציונלית, הוא שהיא מאפשרת לך ללמוד מורפולוגיה של עמוד השדרה הדנדריטי ביתר פירוט.

שיטה זו יכולה לסייע בבחינת שאלות מפתח מתמשכות במדעי המוח כגון שינויים תלויים מולקולריים ופרמקולוגיים בצורת עמוד השדרה הדנדריטי. מיקרוסקופ אלימינציה מובנה מבוסס על הקרנה של דפוסי קו על הדגימה, וזה נותן מידע נוסף שניתן לחלץ על ידי תוכנת מחשב ונותן תמונות חדות במיוחד וזה מאפשר לך להסתכל על מיטוכונדריה MI ומבנים קטנים אחרים בתא. הדגמה חזותית של שיטה זו חשובה על מנת להשיג שחזור תקף של תמונת SIM היא חיונית לעבור את השלבים המעניקים לך איכות טובה של הנתונים הגולמיים.

שלב הכנה חשוב כולל ציפוי החלקות הכיסוי, עבודה במכסה מנוע למינרי סטרילי. השתמש במלקחיים סטריליים קטנים כדי למקם את החלקות הכיסוי הבודדות לבארות בודדות של צלחת 12 בארות. לאחר מכן הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת פוליליזין לכל באר כדי להטביע את החלקות הכיסוי.

לאחר שטיפת הבארות, הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום ציפוי והשאירו את החלקות הכיסוי בחממת תרבית הרקמה עד 24 שעות לפני ציפוי התאים. ההליך יודגם על ידי HU הוא SH דוקטורנט בקבוצה שלנו. לאחר בידוד עובר חולדה, השתמש במלקחיים עדינים כדי להסיר ולהשליך את המוח הקטן מהמוח.

הפרד את שתי ההמיספרות על ידי ביצוע חתך סגיטלי לאורך קו האמצע תחת מיקרוסקופ מנתח, השתמש בזוג אחד של מלקחיים קטנים כדי להחזיק בעדינות את המוח האמצעי ולהסיר את המוח האמצעי. עם זוג נוסף של מלקחיים, השאר ללא פגע את שארית חצי הכדור המכיל את קליפת המוח וההיפוקמפוס. לאחר מכן, הסר בזהירות את קרומי המוח, כיוון מחדש את הרקמה כך שההיפוקמפוס פונה כלפי מעלה.

ניתן לזהות את ההיפוקמפוס על ידי המבנה האופייני שלו בצורת CS. בעזרת מלקחיים עדינים מנתחים את ההיפוקמפוס ומניחים אותו בצלחת חדשה של 30 מילימטר המכילה קר טרי X-H-B-S-S. לאחר הוצאת ההיפופוטם קמפי מכל העוברים, ספרו את המספר הכולל של ההיפופוטם קמפי ואז חתכו אותם לחתיכות קטנות.

אוספים את החלקים בצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר המכיל שלושה מיליליטר של X-H-B-S-S אחד. לאחר צנטריפוגה והסרת הסופרנטנט, הוסף שישה מיקרוליטרים של טריפסין לכל היפוקמפוס. לאחר הדגירה ושטיפת שברי ההיפוקמפוס כמתואר בפרוטוקול הטקסט, יש לטשטש לאט את השברים 30 פעמים עם פיפטה מלוטשת באש עד שכל פיסות הרקמה מתפזרות באופן הומוגני לתאים בודדים.

הקפד להימנע מכל בעבוע. לאחר מכן, הוסף חמישה מיליליטר של מדיום ציפוי, שהוזהר מראש ל -37 מעלות צלזיוס. לאחר ספירת התאים באמצעות זרע צביעה חיוני כחול טריאן, 50,000 תאים לבאר של 12, צלחת באר במיליליטר אחד של מדיום ציפוי לנפח כולל של שני מיליליטר.

לאחר נדנוד הצלחת כדי לפזר את התאים באופן שווה, דגרו על התאים ב-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני. לאחר יומיים-שלושה, החלף 0.5 מיליליטר ממדיום הציפוי במדיום תרבית המכיל 10 FUDR מיקרומולר. כדי לטרנספט, הנוירונים מוסיפים כריתת שומן.

מערבבים טיפה לתערובת DNA ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. במכסה זרימה למינרית, 10 דקות לפני תום תערובת כריתת הליפקטומיה של ה-DNA של 30 דקות, הדגירה, פיפטה את המדיום המותנה מצלחת התרבות המקורית או הראשונה ל-12 שנייה. צלחת היטב ואחסנו את הצלחת הזו בחום של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני בצלחת התרבות הראשונה.

החליף במהירות את המדיום המותנה במיליליטר אחד של מדיום דגירה טרום חם כדי למנוע מהתאים להתייבש. הכניסו את שתי הצלחות בחזרה לאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני. בתום דגירה של 30 דקות של כריתת שומן DNA, תערובת כריתת השומן של ה- DNA מוכנה להוספה לתאים.

מוסיפים בעדינות 200 מיקרוליטר מתערובת כריתת השומן של ה-DNA לכל באר ודוגרים במשך 45 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני. אחרי הדגירה של 45 דקות, השתמשו במלקחיים קטנים כדי להרים את החלקות הכיסוי שמחזיקות את הנוירונים. שוטפים אותם על ידי טבילה בכלי של שלושה סנטימטרים המכיל מדיום נוירו-בסיסי טרי וחם ומניחים אותם בבאר.

ב-12 השני, צלחת באר המכילה את המדיום המותנה. לאחר מכן דגרו על הנוירונים שעברו טרנספטציה ב-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני למשך 48 שעות. כדי להתכונן לצביעה חיסונית, שאפו בעדינות את המדיום מהבארות המכילות את החלקות הכיסוי.

לאחר מכן הוסף 500 מיקרוליטר של 4% PFA חם בזהירות כדי למנוע נזק לדנדריטים. לאחר הדגירה ושטיפת התאים גושמים בתמיסת 1% T-B-S-B-S-A בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לאחר השטיפה שוב, הוסיפו את הנוגדן העיקרי המדולל בדגירה, ערבבו ודגרו בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר מכן דגרו למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עם ניעור עדין.

למחרת בבוקר, הסר את הנוגדן הראשוני ושטוף שוב מכאן והלאה, שמור על החלקות הכיסוי מוגנות מפני אור. לאחר מכן, הוסף את הנוגדן המצומד הפלואורסצנטי המשני המדולל בדגירה. מערבבים ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.

לאחר מכן הסר את הנוגדן המשני ושטוף את התאים בעזרת פינצטה עדינה. הסר את החלקות הכיסוי מהבארות וייבש את כל ה-TBS העודף עם טישו. לבסוף הרכיבו את החלקות הכיסוי באמצעות מדיום הרכבה ואטמו עם לק.

כדי להתחיל בהדמיית ה-SIM, הפעל את הלייזר של 488 ננומטר, מנורת הכספית, בקר הבמה, בקר הפיזו ומנורת הלוגן לאור מועבר. הפעל את תוכנת ה-SIM במצב ו/או עבור nsim. לאחר הנחת טיפת שמן טבילה על המטרה, בדוק שאין בועות אוויר בטיפת השמן.

הנח את החלקת הכיסוי עם נוירוני ההיפוקמפוס על במת המיקרוסקופ. הזז את המטרה כלפי מעלה עד שהשמן נוגע בדגימה. זכור להניח כיסוי מעל הבמה במהלך הליך הרכישה כדי להגן על הדגימה מפני אור הסביבה ולעמעם את האור בחדר ככל האפשר.

בתוכנת ה-SIM, בחר את התצורה האופטית IFI ובחר בלוק מסנן ריק בין אחד לבדיקה ויזואלית עם הגדרת אור לבן לדוגמה מיקוד. לאחר מכן כבה את האור הלבן והפעל את הכספית lamp פתח את התריס ובחר את המסנן הירוק כדי לחפש דנדריט בהיר מספיק.

כאשר נתקלים בדנדריט בהיר מספיק של עניין ומרכז קטע עניין בשדה הראייה, סגור את התריס. הגדר את התוכנה לתצורה אופטית 3D SIM 4 88, ואת הגדרות המצלמה כדלקמן. הגדר את מצב הקריאה ל-em.

הרווח מגה-הרץ אחד 16 סיביות. הגדר את זמן החשיפה ל-100 אלפיות השנייה. הגדר את עוצמת הלייזר ל-5%הגדר את רווח ה-EM ל-200.

כאשר מהירות המיקוד מוגדרת לעדינה במיוחד, התמקד במושא העניין. התאם במהירות את הגדרות המצלמה באופן הבא. כדי לקבל ערך עוצמה בין 30, 040 5, 000, הגדר את עוצמת הלייזר ל-0% עד 20%הגדר את זמן החשיפה ל-50 אלפיות השנייה עד שתי שניות.

הגדר את מצב הקריאה ל-em. הרווח מגה-הרץ אחד 16 סיביות. הגדר את הרווח האלקטרומגנטי לאפס ל-300.

הגדר את רווח ההמרה ל-x אחד ל-5.1 x. הגדר את הפורמט עבור שידור חי ללא Benning. הגדר את הפורמט ללכידה ללא Benning.

לאחר מכן, הגדר את ההגדרות של שלושת ערימת ה-DZ בלוח הרצף ND באופן הבא, הגדר את הטווח לשני מיקרון. הגדר את גודל המדרגה ל-120 ננומטר ולחץ על מיקום הבית. לאחר מכן בחר את התצורה האופטית, 3D SIM 4 88 בקטע הלמבדה.

לאחר בחירת SIM תלת מימדי כמצב הרכישה, הפעל את רכישת רצף ה-ND ושמור את הנתונים הגולמיים דנדריטים וקוצי דנדריטי המצולמים במיקרוסקופיה קונפוקלית וסים מוצגים כאן. הרכישות שוחזרו מתמונות קונפוקליות ו-SIM. עקבו אחר דנדריטים וקוצים סווגו אוטומטית עם התוכנה לאחר התאמת פרמטרים עיקריים כמו אורך הצוואר, קוטר הצוואר וקוטר הראש.

האזורים הקופסאות מציגים עמוד שדרה דנדריטי בודד אחד שצולם במיקרוסקופיה קונפוקלית וסים ושוחזר מערימות ה-Z המתאימות להם, ומתאר הבדלים ברזולוציה ובדיוק של השחזורים התלת-ממדיים המתקבלים. על פי SIM, ניתוח כמותי ברזולוציה גבוהה יותר של קוטר הראש והצוואר גילה כי מיקרוסקופיה של SIM מודדת ממדים קטנים משמעותית ממיקרוסקופיה קונפוקלית עבור אותם קוצים דנדריטיים, מה שמצביע על כך ש-SIM מסוגל לזהות שינויים קטנים יותר במורפולוגיה של עמוד השדרה הדנדריטית. בזמן ההשתתפות בהליך זה, חשוב לזכור לרכוש תמונות גולמיות באיכות גבוהה לשחזור תקף יותר של אותה תמונה.

מיקרוסקופ תאורה מובנה יכול להיות יעיל גם להדמיית תאים חיים, ומאפשר חקירה של דינמיקה של תאים כמו תאי הלה, נוירונים או חיידקי אי קולי. לאחר צפייה בסרטון זה, אדם אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד להתכונן, לדמיין ולהסביר את תקן התמונה מתאי עצב ראשוניים בהיפוקמפוס ברזולוציה על.