Name: הגדרה למעלה במבחנה דגם של מחסום דם מוח חולדה (BBB): פוקוס על BBB האטים ותחבורה בתיווך קולטן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 26 s
Description: למדו כיצד ליצור מודל מעבדתי של מחסום דם-מוח בחולדה באמצעות תרבית משותפת של תאי אנדותל ואסטרוציטים. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני חדירת תרופות למערכת העצבים המרכזית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תמיכה כספית לVect-הורוס הוא הודה מFonds ייחודי Interministériel (פרויקט fui / MEDUL) וVect-הורוס והמעבדה UMR7259 מNationale de la משוכלל ונדיר סוכנות הידיעות (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, adhoc ופרויקטים משותפים PREVENTAD) . המעבדה UMR7259 גם מכירה תמיכה כספית מCNRS ומAix-Marseille האוניברסיטה.

1. הפקה של עכברוש האסטרוציטים עבור כל הכנה להשתמש 10 חולדות Wistar יילודים משני מינים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את החולדות על ידי חיתוך ראשים עם זוג מספריים ולהעביר אותם באופן מיידי בצלחת פטרי יבשה תחת הזרימה למינרית. הסר את המוח מהגולגולת בלי המוח הקטן ולהעביר אותם באופן מיידי לתוך צלחת פטרי המכילה חיץ נתיחה קר: HBSS בתוספת 1% הסרום אלבומין שור (רמה הנמוכה של רעלן פנימי BSA), 100 יחידות פניצילין / מיליליטר וסטרפטומיצין 100 מיקרוגרם / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את המוח לשניים, כדי להפריד בין 2 אונות המוח ולהעביר אותם לתוך צלחת פטרי נקייה עם חיץ לנתיחה על קרח. חותכים את עצב הראייה ולהסיר את קרומי המוח בסטראו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את החלקים בקליפת המוח בהרחבה ב50 מיליליטר של חיץ לנתיחה קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את חתיכות קליפת המוח מ3 מוחות לתוך צינור פלקון 15 מיליליטר ולנתק על ידי pipetting למעלה ולמטה הפיכהle פעמים עם טפטפת חד פעמי 10 מיליליטר מצויד בטיפ כחול ל6 מיליליטר של טריפסין 0.05% - EDTA 0.02% במשך 5 דקות ב37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 24 מיליליטר של DMEM בתוספת 10% FBS והאנטיביוטיקה הבאות, פניצילין 100 יחידות / מיליליטר וסטרפטומיצין 100 מיקרוגרם / מיליליטר, תקשורת בשם תקשורת גליה תא (GCM), ו צנטריפוגות XG 300 5 דקות ב RT. קבוצות FBS נבחרו ואושרו לצמיחה וההישרדות של cutures astrocyte. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור המכיל את התאים ניתקו ב10 GCM מיליליטר וצלחת לתוך 75 סנטימטר 2 T-צפחת (T75). לשנות את המדיום למחרת להסיר את פסולת התא וה-DNA. החלף את תרבות התקשורת פעמיים בשבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השבוע של ריבוי 1, בעדינות לנער את תאי גלייה עם שייקר מסלולית ב60 סל&quot;ד במהלך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס בGCM. אם T75 לא יכול להיות ממוקם באינקובטור עם 5% CO באוויר 2/95% על 37 מעלות אווירת humidified C, להשלים את התקשורת עם 5 HEPES מ&quot;מ. לשטוף את התאים פעמיים לימיןסר תאי microglial שאינם חסיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלושה שבועות לאחר הזריעה, לשטוף את התאים פעמיים עם DPBS ללא סידן ומגנזיום. הוסף 3 מיליליטר של טריפסין החם 0.05%-EDTA 0.02%, דגירה על 37 מעלות צלזיוס ולחכות עד ששכבת התאים מפוזרת (בדרך כלל 5 דקות). לעכב פעילות טריפסין על ידי הוספת 10 מיליליטר של GCM, להעביר את ההשעיה התא לתוך צינור פלקון 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב 120 XG במשך 8 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את כדור astrocyte בFBS 90% - DMSO 10%, להעביר אותם לתוך cryovials (2 x 10 6 תאים לכל cryovial) ולאחסן בחנקן נוזלי. </li></ol> 2. בידוד של microvessels מוח החולדה הפרוצדורות שלנו מאושרות על ידי ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה במרסיי ולעמוד בתקנות הלאומיות והאירופית (EU הוראת מס 86/609). כל המאמצים נעשו כדי למזער את הסבל של בעלי חיים ולצמצם את מספר בעלי החיים המשמשים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל הכנה ולexperimente אחדr, השתמש 3 חולדות Wistar חמישה בשבוע ישנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום שני של השבוע הראשון, להכין 2 צלוחיות T75 על ידי ציפוי עם סוג IV קולגן ופיברונקטין, הן במיקרוגרם / 1 סנטימטר 2 במי תרבות סטרילי (10 מיליליטר לT75). לאפשר לדבוק ב37 מעלות צלזיוס עד זריעת דם קטנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בוקר יום רביעי של השבוע הראשון, להרדים את החולדות תחת שטף גובר של CO 2 לגרום לנמנום, אובדן היציבה והפרעה בנשימה, לאחר מכן על ידי נקע בצוואר הרחם. לרסס את הראשים עם 70% אתנול. חותכים את הראשים עם זוג מספריים ולהעביר אותם לתוך צלחת פטרי יבשה תחת הזרימה למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח מהגולגולת בלי המוח הקטן ועצבי הראייה, ולאחר מכן להעביר אותם לתוך צלחת פטרי מקורר בקרח ומלא בחיץ לנתיחה קרה (HBSS השלים עם BSA 1%, 100 יחידות פניצילין / מיקרוגרם / מיליליטר 100 מיליליטר וסטרפטומיצין) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את המוח במחצית להפריד את 2 אונות מוח ומוח תיכון נפרד לebrain. העבר forebrains לתוך צלחת פטרי נקייה על קרח עם חיץ לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח כמה חצאי המוח בצלחת פטרי חדשה עם חיץ לנתיחה קרה כדי להסיר את קרומי המוח בזהירות מforebrains תחת סטראו עם N ° 5 מלקחיים מעוקלים. לאחר מכן, לנקות את הפנים של המוח כדי להסיר את השמיכה של מיאלין ולקבל קליפה של קליפת המוח. צעדים אלה לא צריכים לקחת יותר משעה 2 לשימור רקמות והישרדות תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את הקליפה מ3 מוחות ל6 מיליליטר של חיץ לנתיחה קר ב7 מיליליטר dounce homogenizer ידי 10 למעלה ולמטה משיכות עם כל אחד מ2 עליים של סיווג שונה, 71 מיקרומטר ואחרי 20 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את ההשעיה כדי להשיג את המקבילה של קליפה 1 ב 1 מיליליטר של צינור 50 מיליליטר פלקון ו צנטריפוגות XG ב 1000 במשך 5 דקות ב RT. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכל את ההשעיה מהקליפה 1 עם 1 מיליליטר של תמיסה אנזימטית המכילה תערובת של collagenases / dispase (R מיקרוגרם / מיליליטר 6011; 0.3 U / ml), סוג DNase אני (35 מיקרוגרם / מיליליטר - 20 K יחידות / מיליליטר) וגנטמיצין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) שבייקר ל30 דקות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את 1 מיליליטר לעכל מקליפה 1 עם 10 מיליליטר של BSA 25% / HBSS 1X ונפרד על ידי צנטריפוגה תלויה הצפיפות ב3,600 XG במשך 15 דקות ב RT. להעביר בזהירות את הדיסק העליון (parenchyma המיאלין והמוח) ואת supernatant לתוך צינור פלקון נקי 50 מיליליטר וחזור צנטריפוגה. שמור את הכדור וכתוצאה מכך המכיל microvessels המוח ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשליך בזהירות את הדיסק העליון ואת supernatant. Resuspend שני כדורים וכתוצאה מכך המכילים microvessels המוח עם 1 מיליליטר של קר HBSS 1X ולהעביר לתוך צינור פלקון נקי 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את microvessels על ידי תוספת של 20 מיליליטר של קר HBSS 1X ו צנטריפוגות XG ב 1000 למשך 5 דקות. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוד לעכל את microvessels מקליפה 1 עם 1 מיליליטר של הפתרון זהה האנזימטית כמתואר בשלב 2.9 בשעה 1 ב37 מעלות צלזיוס בshאקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לערבב את microvessels מתעכל מכל אחת מ3 הקורטקס לתוך צינור אחד ולהפריד עוד יותר לשני 50 צינורות מיליליטר פלקון להשיג microvessels חולץ מן המקבילה של וחצי אחד (1.5) קליפת המוח לכל צינור. הוסף 30 מיליליטר של חיץ לנתיחה קרה ו צנטריפוגות XG ב 1000 במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את כדור הדם הקטן ב10 מיליליטר של DMEM/F12 בתוספת סרום פלזמה עני 20% טסיות דם שור נגזר, גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF, 2 ng / ml), הפרין (100 מיקרוגרם / מיליליטר), גנטמיצין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) וHEPES (2.5 מ&quot;מ), בשם מדיה תא האנדותל (ECM) בתוספת puromycin ב 4 מיקרוגרם / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 2 צלוחיות T75 מצופים מן החממה, לשאוב את עודף הציפוי וצלחת microvessels מצינור אחד בבקבוק אחד T75 (microvessels מופק 1.5 קליפת המוח לכל בקבוק T75). </li></ol> 3. טיהור והפצתו של RBEC Primocultures <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיהור: יום רביעי עד שישי, להוסיף puromycin ב 4 מיקרוגרם / מיליליטר לתקשורת והתרבות. לשנות את המדיום ביום חמישי. ביום שישי, לשטוף את התאים ולהוסיף puromycin ב2 מיקרוגרם / מיליליטר עד יום שני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התפשטות: ביום שני של השבוע השני, לשטוף את התאים ולהוסיף אינסולין, transferrin ותוספת סלניום נתרן לתקשורת והתרבות ועד לתרבויות להגיע למפגש 90% ביום רביעי של השבוע השני. </li></ol> . 4 בידול: הגדרת המודל חוץ גופית BBB <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום שני של השבוע השני, להכין מסננים (פוליאתילן, 12 בארות, גודל נקבובית 1.0 מיקרומטר) על ידי ציפוי בתערובת של סוג IV קולגן ופיברונקטין הן ב0.5μg/cm 2 במי תרבות סטרילי (500 μl של תערובת בתא העליון ו1.5 מיליליטר של מים סטריליים תרבות בתא התחתון). לאפשר לדבוק ב37 מעלות צלזיוס עד זריעת RBEC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום שני של השבוע השני, חמישה ימים לפני הקמתה של התרבות המשותפת, להפשיר את האסטרוציטים מcryovials על 37 מעלות צלזיוס והעברהבפלקון 15 מיליליטר עם 10 GCM מיליליטר. צנטריפוגה ההשעיה ב120 XG במשך 8 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את כדור astrocyte בGCM וצלחת בצפיפות של 30 x 10 3 תאים לכל 2 סנטימטר ב12 גם צלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום רביעי של השבוע השני, ממש לפני הניתוק של RBEC עם טריפסין, לשטוף פעמיים את המסנן המצופה מראש עם מדיום DMEM/F12. טרום למלא את התאים עם ECM: 1.5 מיליליטר בתא התחתון ו0.5 מיליליטר בתא העליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום רביעי של השבוע השני, לשטוף פעמיים RBEC עם DPBS ללא סידן ומגנזיום. הוסף 4 מיליליטר של טריפסין החם 0.05% - פתרון 0,02% EDTA ב 37 C ° לכל בקבוק T75 במהלך 30 שניות בדיוק. ואז להסיר 3.5 מיליליטר של תמיסת טריפסין ולבחון מתחת למיקרוסקופ. כאשר שכבת התאים מתחילה להתנתק מהמטריצה, לעזור להם בעדינות על ידי הקשה על קצה בקבוק T75 עד שכל התאים צפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 9 מיליליטר של ECM לכל בקבוק T75 ולהעביר לתוך צינור פלקון 15 מיליליטר. מאוד בעדינות לנתק את התאהשעיה על ידי pipetting למעלה ולמטה 4 פעמים עם טפטפת 10 מיליליטר מצויד בקצה צהוב (למנוע את הייצור של בועות בפתרון). ספירת התאים בתרחיף (כ 3 x 10 6 cells/T75) ומייד צלחת על מסננים מראש מצופים ומילאו מראש בצפיפות גבוהה (160 x 10 3 תאים / מסנן ומכאן כ 18 filters/T75) (איור 8 ). למחרת (יום חמישי), לשנות פעמיים את המדיום של התא העליון כדי להסיר פסולת תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום חמישי של השבוע השני, ביום שלפני הקמתה של התרבות המשותפת, להחליף את התקשורת ותרבות astrocyte ידי 1.5 מיליליטר של תקשורת בידול (ECM עם הידרוקורטיזון ב500 ננומטר), שניתן בתוספת 1/3 בינוניים מותנים מהתא הבסיסי של תרבות המשותפת קודם (3 ימים של קשר בין תאים והאסטרוציטים אנדותל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום שישי של השבוע השני מוגדר כהיום 0 בידול; להחליף את התקשורת והתרבות מconta המסנניםining RBEC עם תקשורת בידול. העבר את מסנני RBEC לתוך הבארות המכילות את האסטרוציטים. בתנאים אלה, במבחנה מודלים להבדיל ולבטא חלבונים הקשורים לצומת תוך 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המודלים לשמור על הבידול האופטימלי שלהם במהלך 3 ימים נוספים, בין הימים שני ורביעי בשבוע השלישי. </li></ol>

מישל חרסטצ'טיסקי הוא מנהל מעבדת UMR7259, מייסד שותף ויועץ מדעי של חברת הביוטכנולוגיה VECT-HORUS.

תרופות רבות שפותחו לטיפול במערכת עצבים מרכזית (CNS) הפרעות אינן יכולים להגיע למוח parenchyma בריכוזים רלוונטיים טיפולי. BBB מגן על רקמת עצבים במוח מהתנודות של הרכב פלזמה, מגורמים פתוגניים, ושומר על הומאוסטזיס של parenchyma המוח על ידי הגבלת שטף שאינו ספציפי של יונים, פפטידים, חלבונים ואף תאים לתוך ומחוץ למוח 1. מאפייני BBB מושרים ומתוחזק על ידי קירבה אינטימית ולדבר צולב בין התאים בכיתה מיוחדת microvessel המוח אנדותל והאלמנטים השכנים של יחידת נוירו, גליה וכלי הדם (NGVU) כגון תאי עצב, תאי גליה (לייתר דיוק astrocyte קצה רגליים), וpericytes ensheathed בקרום הבסיס שמורכב בעיקר מסוג IV קולגן, פיברונקטין, laminin וproteoglycans 2,3. Pericytes מכסה כ 22-32% מהאנדותל ברמת הנימים ולשחק חשובתפקיד בוויסות של התפשטות האנדותל, אנגיוגנזה ותהליכים דלקתיים. תאי האנדותל יוצרים גיליון רציף המכסה את פני השטח הפנימיים של נימי הדם. הם מחוברים ביניהם על ידי TJS, אשר יוצר מבנה דמוי חגורה באזור הפסגה ושתורם לתא קיטוב. האסטרוציטים מווסתים את מאפייני BBB ומקורות של גורמים רגולטוריים חשובים כגון TGF-β, GDNF, bFGF ו-IL-6. האסטרוציטים חסרים בGFAP עם פונקציונליות שלמה אינם מסוגלים לווסת את מאפייני BBB 4. הנוירונים לא ישירות מעורבים מבני במבנה של BBB, אלא גם להסדיר היבטים חשובים של ביטוי חלבון ופונקציות BBB 5. על מנת ללמוד את המבנה, הפיסיולוגיה ופתולוגיה של BBB נוסף, במבחנה מודלים של BBB פותחו ככלי מחקר. תאי האנדותל במוח כבר חולצו ממינים שונים ליישום בדגמי BBB מבחנה מבוססבתרבויות נמוכות מעבר עיקרי מ6,7 שור, חזיריים 8,9, עכברוש 10,11,12, עכבר 13 וגם 14,15 האנושי. דגמים אלה ידועים לחקות את in vivo BBB, במיוחד כאשר שיתוף תרבותי עם תאי גלייה מחולדה או עכברי ו / או pericytes 16,12, ו / או האסטרוציטים שמקורן בתאי אב עצביים 17 ו / או נוירונים 18. הדגמים &quot;במעבדה&quot; לעתים קרובות מיוצרים ממכרסמים משום שהם מאפשרים במבחנה / in vivo ניסויים והשוואות ו / או המחקר של תאי האנדותל במוח המופקים ממודלים מהונדסים 19. חדש שפותח במודלים של BBB מבחנה גם תוכנן כדי לעזור לנבא ספיגה במוח של תרופות פוטנציאליות במערכת העצבים המרכזית לפני בדיקת in vivo 15,20,21,3,6,22,11,23. במבחנה מודלים BBB משמשים בדרך כלל כדי להשוות ההובלה של תרופות עם: i) חדירה ידועה לתוך מערכת העצבים המרכזית או עם low חדירות פני BBB וללא תופעות מרכזיות, וii) Pe לכאורה של אותן התרופות שנמדדו במודלים של בעלי חיים מאותו המין. התרופות שעוברות בקלות BBB הן בעיקר lipophilic ולחצות את קרום תא אנדותל המוח על ידי תיווך שומנים דיפוזיה חופשית (קפאין, קרבמזפין, וכו &#39;). התרופות מועברים באופן שלילי כגון דיגוקסין, verapamil או ציקלוספורין נמתחים באופן פעיל על ידי מובילים בזרימת אנדותל המוח כגון P-GP. עם זאת, רבים של המולקולות הטיפוליות החדש שפותחו הם תרופות ביולוגיות, כגון חלבונים רקומביננטיים, siRNAs או נוגדנים חד שבטיים. רובם לא לחצות את BBB עקב: א) היעדרות של מובילים מסוימים, וii) השכבה צפופה של תאי האנדותל, המונעים מולקולות במשקל מולקולריות גבוהות מעובר מעבר paracellular. במגבלות אלה, אסטרטגיות &quot;סוס טרויאני&quot; יושמו באמצעות וקטורים (נוגדנים, פפטידים) נגד קולטנים ידועים בBBB, מעורב in קולטן בתיווך תחבורה או transcytosis (RMT), כגון transferrin קולט (TF) (TFR), קולטן האינסולין (IR), או חברים של הקולטן ה-LDL (LDLR) הקשורים למשפחת קולט (LDLR, LRP1). קולטנים כאלה נמצאו בנימים במוח מבודדות ובBBB in vivo 24,25. פרופילי תעתיק לקולטנים אלה, ובמיוחד אלה של משפחת LDLR, נותחו והשוואה בין תאי מוח אנדותל ותאי האנדותל במוח שיתוף תרבותי עם האסטרוציטים או בנימי דם במוח מייד לאחר חילוצם מהמוח 26. 24 Pardridge פתח את השדה עם נוגדן OX-26 נגד קולט transferrin (TFR), ואחריו נוגדנים כנגד קולטן האינסולין והקולטן לגורם צמיחת אינסולין 27,28. עם וקטורי נוגדנים מבוססים אלה, ArmaGen טכנולוגיות פיתחה פלטפורמה טכנולוגית סוס טרויאני BBB מולקולרי, כדי לספק תרופות, כוללים חלבונים, מעבר לBBB 29.הספרות עשירה בנתונים המראים ביטוי LRP1 בתאי האנדותל במוח ואת תפקידה כקולט endocytic / נבלות רבות עוצמה. ניתוח כתם מערבי הציע כי LRP1 מתבטא בשברים מועשרים בנימים במוח ובתאי אנדותל נימים במוח חולדה 30. חברות כמו LRP1 יעד Angiochem עם וקטורי פפטיד נגזרו aprotinin המקדמים זרם תרופה יעיל על פני BBB ביום 31. עם זאת, LRP1 מעורב גם בהובלה פעילה של Aβ והזרימה / פינויה מparenchyma המוח לדם 32. נתונים אלה כוללים LRP1 בתחבורה דו כיוונית על פני BBB בהתאם ligands שלה. biOasis מפתחת טכנולוגית Transcend באמצעות melanotransferrin חלבון להובלת ביולוגי כגון אנזימי lysosomal ונוגדנים פני BBB 33 תוך Vect-הורוס מפתחת וקטורי פפטיד כי יעד LDLR 34. הנתונים מצביעים על כך שיש LRP וLDLR יכולים לשמש להובלת הבדלמולקולות erent כגון אנזימי lysosomal 35,36 או מתחמי nanoparticle פני BBB 37. תחום העניין שלנו הוא אספקת סמים למערכת העצבים המרכזית באמצעות מולקולות וקטור וסמי מועמדי vectorized לטיפול במחלות של מערכת העצבים המרכזית. בפרט, משלוח סמים ברחבי BBB יש לשקול בהקשר של neuroinflammation, תהליך שעשויה להשתנות במידה שלה, אבל זה כנראה משותף לכל נגעים במערכת העצבים המרכזית ומחלות, כולל דלקת קרום המוח, טרשת נפוצה, מחלת אלצהיימר ועוד neuroinflammation קשור עם דלקת BBB ואפשרות לשינויים בפיזיולוגיה של BBB וחדירות בהתחשב בכך שparacellular והתחבורה transcellular יכולים להיות מוגברת במצבים פתולוגיים 38,39,40,41,42,43. למשל, TNF-α, לצבוט, וציטוקינים אחרים לווסת את הדלקת, וניסויים במבחנת מודלים BBB הראו כי הם יכולים לשנות את המאפיינים של ה paracellularדואר monolayer אנדותל תא 38,39,40 וכי TNF-α מובילים גם לעלייה בתחבורה transcellular של LDL 41, holotransferrin 42 ולקטופרין 43. המטרה שלנו הייתה לפתח ולאפיין מותאם ומודל BBB syngeneic עכברוש מאוד לשחזור באמצעות שיתוף תרבויות של תאים ראשוניים במוח אנדותל והאסטרוציטים. אנחנו השתמשנו חולדות Wistar 5 בן שבוע ויילודים לייצור תאי אנדותל במוח וייצור astrocyte בהתאמה. אתגר אחד היה להקים פרוטוקול המאפשר הייצור של דגמי BBB &quot;שבועי לשחזור&quot;. כדי להגיע למטרה זו, בכל שלב של פרוטוקול הייצור בוצע בימים קבועים בשבוע, החל מייצור דם קטן במוח ביום רביעי של השבוע הראשון. ניתוחים בוצעו כמעט בכל שבוע במהלך 3 השנים האחרונות. כדי לשפר את שחזור של התרבויות נוספות, מערכת אבטחת איכות הוקמה. כל reagents וכימיקלים היו בהפניה במסד נתונים (מועד כניסתו, מניות, לטווח תפוגה, וכו &#39;). המודל התאפיין הבא במספר הקריטריונים, כגון ארגון תא האנדותל ובטהרה, Teer, חדירות LY, בתגובה לסוכנים פרו דלקתיים, ביטוי איכותי וכמותית של חלבוני TJ, פונקציונלי של מובילים בזרימת כגון P-GP, וקולטנים מעורב בtranscytosis ברחבי monolayer התא האנדותל כגון TFR או LDLR.

<table><tbody><tr><td>שבר BSA V אנדוטוקסין נמוך</td><td>PAA</td><td>K45-011-500g</td><td>4 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122-20</td> <td>&deg; C</td></tr><tr><td>0.05% טריפסין-EDTA (1X)</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054-20</td> <td>& deg; C</td></tr><tr><td>DMEM גלוקוז גבוה</td><td>Invitrogen</td><td>61965-026</td><td>4 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Invitrogen</td><td>10270-098-20</td> <td>& deg; צלוחיות C / 1 שנה</td></tr><tr><td>T75</td><td>בקטון דיקינסון פלקון</td><td>353135</td><td></td></tr><tr><td>מאגר HEPES (1 מ ')</td> <td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td>4 & deg; C / שנה עכבר</td></tr><tr><td>קולגן מסוג IV (10 x 1 מ"ג)</td><td>בקטון דיקינסון</td><td></td> <td>356233-20 מעלות; C / 1 חודש</td></tr><tr><td>פיברונקטין humain פלזמה (5 מ"ג)</td><td>בקטון דיקינסון</td><td></td> <td>356008-20 & deg; C / 1 חודש</td></tr><tr><td>Vannas מספריים קפיציים, ישרים (9 ס"מ)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>מספריים, ישרים (9 ס"מ)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים Dumont #5/45 (11 ס"מ)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים Graefe, רוחב קצה 0.8 מ"מ</td><td>Fine Science</td><td>Tools 11050-10</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים Graefe, רוחב קצה עקומה 0.8 מ"מ</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>תערובת קולגנאזות / דיספאז (2 x 5 מ"ג)</td><td>Roche Diagnostics</td><td>05 401 054 001-20</td> <td>& deg; C / 3 חודשים</td></tr><tr><td>DNase I (100 מ"ג / 569 KU / מ"ג)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>DN25-100 מ"</td><td>ג-20 מעלות; C / 1 שנה</td></tr><tr><td>Gentamicin (10 מ"ג/מ"ל)</td> <td>Invitrogen</td><td>15710-049</td><td>4 & deg; C / שנה</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>31331-028</td><td>4 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>סרום בקר מפלזמה דלה בטסיות דם (500 מ"ל)</td><td>Clinisciences</td><td>BT-214-100-20</td> <td>& deg; C / שנה</td></tr><tr><td>bFGF (10 ומיקרו; ז)</td> <td>Invitrogen</td><td>13256-029-20</td> <td>& deg; C / 6 חודשים</td></tr><tr><td>מלח Heparine Na מרירית חזיר דרגה I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149-100KU</td><td>4 &deg; C / 1 שנה</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8833-10</td> <td>mg-20 &deg; C / 6 חודשים</td></tr><tr><td>ITSX</td><td>Invitrogen</td><td>51500-056</td><td>4 &deg; C / 1 שנה</td></tr><tr><td>פוליאתילן תליית תא הכנס לצלחות 12 בארות</td><td>Millipore</td><td>PIRP15R48</td><td>נקבוביות: 1 ומיקרו; m משטח: 1.1 ס"מ2</td></tr><tr><td>hydrocortisone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0888-1</td> <td>g-20 &deg; C / 1 שנה</td></tr><tr><td>עכבר anti-CD31 / PECAM&nbsp;</td><td>Chemicon</td><td>MAB1393, שיבוט TLD-3A12 (1 מ"ג/מ"ל)</td><td>1/200 - קיבוע PFA 4%</td></tr> <tr><td>ארנב אנטי-פון ווילברנד</td><td>Chemicon</td><td>AB7356</td><td>1/200 - קיבוע PFA 4%</td></tr> <tr><td>עכבר אנטי-דסמין</td><td>Chemicon</td><td>MAB3430</td><td>1/200 - קיבוע PFA 4%</td></tr> <tr><td>עכבר אנטי-וימנטין</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>08-0052 שיבוט V9, (58 ומיקרו; גרם/מ"ל)&nbsp;</td><td>1/50 - PFA קיבוע 4%</td></tr><tr><td>עכבר אנטי-קלודין-5</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>35-2500, (500 ומיקרו; גרם/מ"ל)</td><td>1/200 - קיבוע PFA 4%</td></tr> <tr><td>ארנב אנטי-ZO-1</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>61-7300 (250 ומיקרו; גרם/מ"ל)</td><td>1/200 - קיבוע PFA 4%</td></tr> <tr><td>ארנב נגד אוקלודין&nbsp;</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>71-1500 (250 ומיקרו; גרם/מ"ל)</td><td>1/200 - קיבוע PFA 4%</td></tr> <tr><td>Alexa Fluor 488, 594 נוגדנים משניים מצומדים</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>1/800</td></tr><tr><td>Lucifer Yellow CH, מלח דיליתיום</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L0259-20</td> <td>& deg; C</td></tr><tr><td>TNF-אלפא אנושי</td><td>PeproTech</td><td>300-01A-20</td> <td>& deg; C</td></tr><tr><td>עכברוש MCP-1 ערכת ELISA</td><td>PeproTech</td><td>900-K59</td><td>4 &deg; C / -20 ו-deg; C</td></tr><tr><td>עכבר אנטי-P-גליקופרוטאין</td><td>Covance, Eurogentec</td><td>SIG-38710-1000, שיבוט C219 (1 מ"ג/מ"ל)</td><td>1/400 - קיבוע PFA 4% 1/200 (כתם מערבי)</td></tr><tr><td>ארנב אנטי-GLT-1</td><td>Abcam</td><td>ab41621</td><td>1/1,000 (כתם מערבי)</td></tr><tr><td>רודמין 123</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>83702</td><td>4 &deg; C</td></tr><tr><td>Verapamil hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V4629</td><td>4 &deg; C</td></tr><tr><td>ציקלוספורין A</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>30024</td><td>4 &deg; C</td></tr><tr><td>קולטן מקרוגלובולין חד-שבטי אנטי-a2 (CD91, LRP1) כנגד שרשרת B של חומצת אמינו 4291-4344 בתוך EGF חוזר</td><td>American Diagnostica</td><td>3501 (100 ומיקרו; גרם/מ"ל)</td><td>1/5 - קיבוע PFA 4%</td></tr> <tr><td>עכבר נגד LDLR</td><td>R& מערכות D</td><td>AF2255 (200 ומיקרו; גרם/מ"ל)</td><td>1/50 - קיבוע PFA 4%</td></tr><tr><td>Rat transferrin-Cy3</td><td>Gentaur</td><td>JOR160050</td><td>4 &deg; C</td></tr><tr><td>DiILDL</td><td>Invitrogen</td><td>L-3482</td><td>4 &deg; ג</td></tr></tbody></table>

הגדרה למעלה<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם מוח חולדה (bbb): פוקוס על bbb האטים ותחבורה בתיווך קולטן

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

מחסום דם המוח (BBB) ​​במיוחד מסדיר שטף מולקולרי ותאי בין הדם ורקמת העצבים. המטרה שלנו הייתה לפתח ולאפיין syngeneic חולדה לשחזור מאוד במודל חוץ גופית של BBB באמצעות שיתוף תרבויות של תאים ראשוניים עכברוש אנדותל המוח (RBEC) והאסטרוציטים ללמוד הקולטנים מעורבים בtranscytosis ברחבי monolayer התא האנדותל. האסטרוציטים בודדו על ידי נתיחה מכאנית הבאה עיכול טריפסין והוקפאו לתרבות משותפת מאוחר יותר. RBEC בודדו מקליפת מוח חולדה 5 שבועות בן. המוחות נוקו של קרומי המוח וחומר לבן, ומכאני ניתקו הבא עיכול אנזימטי. לאחר מכן, homogenate הרקמה היה centrifuged באלבומין בסרום שור להפריד ברי כלי מרקמת עצבים. שברי הכלי עברו עיכול אנזימטי שני לתאי האנדותל חופשיים מהמטריצה ​​תאית שלהם. תאים מזהמים שנותרו כגון pericytes היו further בוטל על ידי ציפוי שברי הדם הקטן במדיום המכיל puromycin. לאחר מכן הם היו passaged על מסננים לתרבות משותפת עם האסטרוציטים גדלו על החלק התחתון של הבארות. RBEC הביע רמות גבוהות של צומת הדוקה (TJ) חלבונים כגון occludin, claudin-5 והסתדרות ציונית-1 עם לוקליזציה טיפוסית בגבולות התא. התנגדות transendothelial החשמלית (Teer) של monolayers אנדותל במוח, המציינת את אטימות של TJS הגיעה 300 אוהם · 2 סנטימטר בממוצע. מקדמי החדירות האנדותל (PE) לוציפר הצהוב (LY) היו לשעתקו מאוד עם ממוצע של x 0.26 ± 0.11 10 -3 סנטימטר / דקה. תאי האנדותל במוח מאורגנים בmonolayers הביעו P-גליקופרוטאין בזרימת טרנספורטר (P-gp), הראו תחבורה מקוטבת של rhodamine 123, ליגנד עבור P-GP, והראו תחבורה ספציפית של transferrin-Cy3 וDiILDL ברחבי monolayer התא האנדותל. לסיכום, אנו מספקים פרוטוקול להקמה במבחנהמודל BBB שהוא שחזור מאוד בשל שיטות אבטחת האיכות, וכי הוא מתאים למחקר על מובילי BBB וקולטנים.

מטרת המחקר הנוכחי הייתה לאמת את שחזור של מודל במבחנה BBB מעורב syngeneic חולדה שיתוף תרבות של תאים והאסטרוציטים אנדותל. Monolayer תא אנדותל הציג Teer גבוה וחדירות LY נמוכות. ביטוי של חלבונים ספציפיים TJ, תגובות פונקציונליות לדלקת ופונקציונליות של מובילים וקולטנים הוערכו.

הגדרה למעלה<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם מוח חולדה (BBB): פוקוס על BBB האטים ותחבורה בתיווך קולטן

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להקים מודל in vitro בעל הדירות גבוהה של מחסום דם-מוח של חולדה. הדבר מושג על ידי הסרת העצבים האופטיים, המוח הקטן והקרומים תחת מיקרוסקופ סטריאואופטי, ולאחר מכן הפרדת שתי ההמיספרות המוחיות ודיסקציה שלהן להשגת נתח נקי של קורטקס. השלב השני הוא בידוד של מיקרו-כלי דם מהקורטקס באמצעות טיפול אנזימטי וסנטריפוגציה תלוית צפיפות.בשלב הבא, את כלי הדם המיקרוסקופיים זורעים ומדגירים עם pur mycin כדי לטהר את התאים האנדותלליים מתאים מזהמים, כגון טפילים. תרביות טהורות של תאי אנדותל מהמוח של חולדה מתרבות עד שהתאים מגיעים ל-90% confluence. השלב הסופי הוא השראת התמיינות של תאי האנדותל מהמוח של החולדה על ידי התאים בתא העליון של מסנני ההכנסה (insert filters) ועל ידי תרבית משותפת (co-culturing) שלהם עם אסטרוציטים של חולדה שהוכנו וזרעו מראש.בסופו של דבר, ניתן לאפיין את השכבה החד-שכבתיים (monolayer) המובחנת של תאי האנדותל במוח באמצעות ביטוי של חלבוני צומתים הדוקים (tight junction proteins) ספציפיים ובאמצעות מדד חדירות של תרכובת ייחוס דרך שכבת תאי האנדותל מהמדור העליון. מודלים של מחסום הדם-מוח (BBB) in vitro, כגון זה המוצג כאן, מועילים לחקר ההתפלגות התאית של מולקולות מפתח ולפענוח מנגנונים תאיים ומולקולריים בסיסיים של תפקוד ה-BBB. בפרט, מודלים אלו מאפשרים חקירה של רספטורים ב-BBB ומעורבותם בתהליכי אנדוציטוזה, הובלה (trafficking) וטרנסציטוזה במערכת שלנו.מודלים של מחסום הדם המוחי (BBB) in vitro משמשים בעיקר לחקר התargeting של רצפטורים ספציפיים באמצעות וקטורים פפטידיים שאנו מפתחים. כדי להקל על הובלת תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS) דרך ה-BBB, אנו משתמשים בתהליך הנקרא טרנסציטוזה מתווכת רצפטורים, הידוע גם כגישת "סוס טרויאני". תיאור חזותי הוא קריטי, שכן אנשים שאינם מיומנים בשיטה זו יזדקקו למיומנויות דיסקציה ולשימוש במיקרוסקופ כדי לפעול במהירות ובדיוק מספיקים לשמור על חיוניות הרקמה במהלך תהליך ייצור התאים.נקודה קריטית נוספת היא סיום מוקדם של אזורי ה-fragile וה-tele salmon כדי למנוע פתיחת מחסומים במהלך הניסויים. לבסוף, רעיון זה יציג פרטים לאורך הפרוטוקול שיבדילו בין הפרוטוקולים האדומים לממשיים, המדגימים את הפרוגדורה שתבוצע על ידי ועל ידי עמיתי. התחילו את הפרוגדורה על ידי ציפוי של שני בקבוקי T 75 ב-collagen type four וב-fibronectin בריכוז של 1 µg לסמ"ר במי תרבית סטריליים, והמתינו להצמדתם באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עד לזריעת המיקרו-כלי דם.יומיים לאחר מכן, הוצאו את המוח מגולגולתן של שלוש חולדות Vista בנות חמישה שבועות והעבירו את המוחות לצלחית פטרי מלאה במסלק ניתוח קר המוחזק על קרח. בדלו את המוחות ללא הדגלול והעצבים האופטיים. לאחר מכן, חתכו כל מוח לשניים כדי להפריד בין שתי המיספרות המוחיות תחת מיקרוסקופ סטריאו.בצעו חיתוך נוסף להסרת הג้าน המוחי והעבירו את ארבעת המוחות לכלי פטרי נקי על קרח עם בופר לניתוח. לאחר מכן, העבירו מוח קדמי אחד לכלי פטרי חדש מלא בבופר לניתוח קר. החזיקו אותו באמצעות תפסן ונתקו בזהירות את הקרומיות משולי המוח הקדמי.לאחר מכן, הפכו את המוח הקדמי והסירו בזהירות את הקרומים (meninges) מבלי לקרוע אותם. ודאו שהמוח הקדמי נקי מקרומים וחתכו את החלק הנותר של העצבים האופטיים. מטרת שלב זה היא להסיר את שכבת החומר הלבן כדי להשיג קליפה של קורטקס.התחילו בקיבוע של המוח הקדמי בקצהו, ולאחר מכן גררו בזהירות את הפינצטה לאורך השטח, תוך הקפדה שלא לקרוע את פני השטח של הקורטקס. לאחר מכן, ודאו שהמוח נקי מהקרומים על ידי גלגולו כדי לבדוק שאין קרומים שנותרו או כלי דם עיליים גדולים. בהמשך, החל מהוצאת שלושת המוחות מהגולגולת, משך הזמן הכולל של הניתוח לא יעלה על שעתיים, וזאת לצורך שימור הרקמה והישרדות התאים.העבירו את קליפות המוח (cortices) של שלושה מוחות לשש מיליליטרים של בופר דיסקציה קר בתוך הומוגניזר בנפח שבעה מיליליטרים, ולאחר מכן פרקו את קליפות המוח באמצעות 10 תנועות מעלה ומטה עם הפסטל הראשון בעל המרווח הגדול יותר, ולאחריהן 10 תנועות מעלה ומטה עם הפסטל השני בעל המרווח הקטן יותר. לאחר מכן, העבירו שש מיליליטרים מהסספנסיון לשפופרת Falcon חדשה בנפח 50 מיליליטרים ושטפו את ההומוגניזר עם 24 מיליליטרים של בופר דיסקציה קר. חלקו את הסספנסיון לשלוש שפופרות Falcon כדי לקבל כמות השקולה לקליפת מוח אחת לכל שפופרת. לאחר מכן, סבבו בצנטריפוגה במהירות 1000 Gs למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.בדיקת המשקע מראה מדרג של צבע ורוד, המייצג את כלי הדם המיקרוסקופיים של קליפת המוח. כעת יש להשליך את העילום ולהומוגן את המשקע מקליפת מוח אחת עם מיליליטר אחד של תמיסה אנזימטית המכילה תערובת של collagenases, DNA type one ו-Gentamycin. יש להניח את המבחנות בשייקר למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius.לאחר מכן, ערבבו מיליליטר אחד של עיכול עם 10 מיליליטר של 25%B-S-A-H-B-S-S בריכוז one X, וערבבו בעדינות באמצעות וורטקס (vortex). לאחר מכן, הפרידו ביניהם באמצעות צנטריפוגציה תלוית צפיפות ב-3,600 Gs למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגיה התלוית צפיפות, המשקע מכיל את כלי הדם המיקרוסקופיים והדיסקה העליונה מכילה פאראנכימה של מיאלין מהמוח וכלי דם מיקרוסקופיים שאינם מופרדים. העבירו בזהירות את הדיסקה העליונה ואת הנוזל העליון (supernatant) למבחנות פלקון נקיות של 50 מיליליטר.הקפידו לא לשאוב את משקע כלי הדם הזעירים (micro vessels pellet); ערבבו בעדינות את המבחנה באמצעות וורטקס וחזרו על הסרימרגזציה התלויה בצפיפות במהלך הסרימרגזציה השנייה. שמרו את המשקע שהתקבל, המכיל את כלי הדם הזעירים, בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסרימרגזציה התלויה בצפיפות השנייה, השליכו בזהירות את הדיסקה העליונה ואת תערובת ה-snat, ושחזרו את המשקעים שהתקבלו משתי הסרימרגזציות, המכילים את כלי הדם הזעירים, ב-1 mL של HBSS cold 1x.בשלב הבא, שטפו את המיקרו-כלי הדם עם 20 milliliters של hbss one x קר וסובבו בצנטריפוגה ב-1000 Gs למשך חמש דקות. לאחר מכן השליכו את העליון (supranatant), תוך הקפדה לא לאבד את המיקרו-כלי הדם. בצעו הומוגניזציה למשקע של המיקרו-כלי הדם מקורטקס אחד עם one milliliter של אותו תמיסה אנזימטית, לאחר ערבוב עדין של המבחנות בוורטקס.המשיכו בעיכול של המיקרו-כלי הדם למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 °C בתוך שייקר. לאחר מכן, ערבבו את המיקרו-כלי הדם שעוכלו משלושת הקורטקסים לשפרופה אחת. שוב, חלקו את התערובת לשתי שפרופות פאלקון של 50 mL כדי לקבל בset שפרופה את המיקרו-כלי הדם שחולצו משווה ערך של קורטקס אחד וחצי.לאחר מכן, סבבו בצנטריפוגה ב-1000 Gs למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר, רגע לפני זריעת המיקרו-כלי הדם, הוציאו מהאינקובטור שני בקבוקי T 75 מצופים ושאבו את עודפי הציפוי. השליכו את העלייה והשעיכו מחדש את משקע המיקרו-כלי הדם ב-1 mL של ECM, והביאו כל מבחנה לנפח של 10 mL באמצעות ECM המועשר ב-4 µg/mL.הוסיפו purmycin כדי להתחיל את תהליך הניקוי והעבירו את המיקרוכליים (microvessels) לבקבוק תרבית. לאחר מכן, הכניסו את הבקבוקים לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2 כדי לאפשר היצמדות של המיקרוכליים למטריצת קולגן-פיברונקטין כחלק מתהליך הניקוי. 24 שעות לאחר העברת המיקרוכליים, שטפו את שאריות התאים ב-ECM טרי והחליפו את מצע התרבית ב-ECM המועשר ב-4 µg/mL purmycin עד ליום החמישי באינקובטור ב-37 °C וב-5% CO2. 24 שעות לאחר העברת המיקרוכליים, התאי האנדותל מתחילים לנדוד ולהתפשט על מטריצת הקולגן-פיברונקטין. ביום החמישי, כדי להשלים את תהליך הניקוי, שטפו את שאריות התאים ב-ECM טרי והחליפו את מצע התרבית ב-ECM המועשר ב-2 µg/mL.המשך טיפול ב-Puramycin למשך שלושה ימים נוספים לצורך פרוליפרציה. ביום השמינית, שטוף את התאים והוסף אינסולין, טרנספרין וסלניט נתרן. הוסף תסמיכי תמיכה למצע התרבית עד שהתרביות יגיעו ל-90% confluence ביום העשירי.ביום השמיני, הכין את המסננים של שלוש פלטות בעלות 12 בארות על ידי ציפיה שלהם בתערובת של collagen type four ו-fibronectin, שניהם בריכוז של 0.5 micrograms per square centimeters במים לתרבית סטריליים. התחל בהוספה של 1.5 milliliters של מים לתרבית סטריליים לתא התחתון.לאחר מכן, הוסיפו 0.5 milliliters מהתערובת לתא העליון. אפשרו למטריקס להיקשר בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עד לזריעה של התאים האנדותליאליים באותו היום, חמישה ימים לפני הקמת התרבית המשולבת (co-culture). הפשיתו את האסטרוציטים מהמבחנות הקריוגניות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius והעבירו את התאים לפלקון של 15 milliliters עם 10 milliliters של GCM לצורך צנטריפוגה.סבבו את התוך השביעי ב-120 Gs למשך שמונה דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השעיקו מחדש את משקע האסטרוציטים ב-GCM והעבירו למצע בצפיפות של 30,000 תאים לסמ"ר. במישראות בעלות 12 בארות, הכניסו את המישראות לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2 ביום ה-10, רגע לפני הדיסוציאציה של RBEC באמצעות טריפסין.שטפו את המסנן המקודד מראש במצע DMM F 12, מלאו מראש את התאים ב-ECM והחזירו אותם לאנקובטור עד לזריעת ה-RBEC באותו היום. שטפו את ה-RBEC פעמיים ב-DPBS ללא סידן ומגנזיום. הוסיפו ארבעה מיליליטר של תמיסת trypsin EDTA חמימה לכל בקבוק T 75 בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 שניות בדיוק, והסירו 3.5 מיליליטר של תמיסית trypsin EDTA.יש להקפיד ששכבת trypsin EDTA תכסה תמיד את התאים האנדותליאליים. לאחר מכן, יש לעקוב אחר ניתוק התאים באמצעות תצפית תחת המיקרוסקופ. כאשר שכבת התאים מתחילה להתנתק מהמטריקס, יש להקיש בעדינות על דופן בקבוק ה-T 75 עד שכל התאים יצופו.הוסיפו שלושה מיליליטרים של ECM לכל בקבוק T 75 והעבירו לשפופרת פלקון של 50 מיליליטר. חזרו על שלב זה פעמיים, תוך שטיפת המצע כדי לאסוף את כל התאים.נתקו בעדינות רבה את תרחיף התאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה ארבע פעמים באמצעות פיפט של 10 מיליליטר עם טיפ צהוב. ספרו את התאים בתרחיף וזרעו אותם מיד בצפיפות גבוהה על המסננים המקודדים והמלאים מראש ביום למחרת. החליפו את המצע בתא העליון פעמיים כדי להסיר שאריות תאים, וזאת כדי למנוע פגיעה בשכבת התאים החד-שכבתית (monolayer) במהלך החלפת המצע.הטה את הפלטה מעט ואל תתקרב עם פיפטת השאיבה, כך שיישאר תמיד מעט מדיום מעל השכבה התאית (monolayer), כדי למנוע התייבשות של השכבה התאית במהלך החלפת המדיום. שטוף שישה תבתים (inserts) בלבד בכל פעם. 24 שעות לאחר הזריעה, השכבה התאית חייבת להגיע לקונפלואנס (confluence).לאחר מכן, באותו היום, יום אחד לפני הקמת התרבית המשולבת (co-culture), החליפו את מצע הגדילה של האסטרוサイトים ב-1.5 milliliters של מצע דיפרנציאציה מועשר ביום 12, המוגדר כיום הראשון של הדיפרנציאציה. החליפו את מצע הגדילה מהמסננים המכילים את ה-RBEC במצע דיפרנציאציה. לאחר מכן, העבירו את מסנני ה-RBEC אל הבארים המכילות את האסטרוサイトים תחת תנאים אלו.מודלים in vitro מבצעים דיפרנציאציה ומבטאים חלבונים הקשורים לצומת תוך שלושה ימים, והדיפרנציאציה האופטימלית נמשכת שלושה ימים נוספים. כאן, השכבה התאית (monolayer) עברה צביעה אימונוהיסטוכימית כדי לחשוף שכבה רציפה של תאי אנדותל של המוח בעלת מורפולוגיה שאינה חופפת ותאים טיפוסיים בצורת פסיים עם מורפולוגיה אנדותליאלית, כמו גם ביטוי של חלבונים בצומת הדוקה (tight junction proteins), כולל ZO-1 ו-occludin. אטימות השכבה במודל BBB ב-12 בארות נבדקה על ידי מדידת הטרנספורט של Lucifer yellow.התוצאות מוצגות כחדירות או PE ביחידות של 10⁻³ סנטימטרים לדקה, והמחסום נחשב לחדיר או פתוח כאשר ה-PE של LY גבוה מ-0.6 × 10⁻³ סנטימטרים לדקה. בעשורים האחרונים, פרסומים וסקירות רבות סיפקו מידע על מודלים סטטיים ודינמיים של BBB in vitro ממינים שונים. עם זאת, מודלים כאלה נותרו קשיים לטיפול, והשחזור של איכות המחסום נותר מטרה מרכזית.לאחר צפייה בסרטון זה, מדענים ישיגו הבנה טובה של האופן שבו מייצרים ומאפיינים מודל in vitro של ה-PBB.

setting-up-an-vitro-model-rat-blood-brain-barrier-bbb-focus-on-bbb

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

סרטון זה מתאר בדיקת חדירות להערכת החדירות של מחסום דם-מוח במבחנה באמצעות מולקולות נתרן פלואורסצאין.

מחסום דם-מוח מחקה בדיקת חדירות: בדיקת מבחנה להערכת החדירות של חיקוי BBB למולקולות עוקבות

סרטון זה מדגים שיטה לחקר חלחול באמצעות מודל מחסום דם-מוח במבחנה (BBB) באמצעות אסטרוציטים ותאי אנדותל על גבי ממברנה, עם פריטין חופשי מסוג FITC ו-FITC. FITC-פריטין נקשר לקולטנים על תאי אנדותל וחצה את מחסום הממברנה לחדר התחתון בעוד FITC חופשי הראה חדירה מוגבלת ונשאר בחדר העליון.

חקר החדירה של FITC ו- FITC-Ferritin באמצעות מודל מחסום דם-מוח במבחנה

מתוארת ומאומתת שיטה להקמת מודל מבחנה של מחסום דם-מוח המבוסס על תרבית משותפת של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח חולדות ואסטרוציטים. מערכת זו הוכיחה את עצמה ככלי תקף לחקר השפעת הננו-פורמולה על חדירת מחסום הטרנס-מחסום של מולקולות פלואורסצנטיות.

במבחנה חלחול של FITC טעון Ferritins מעבר מכשול עכברוש דם-מוח: מודל לחקר משלוח מולקולות Nanoformulated

כאן, אנו מתארים מודל עכברי במבחנה של מחסום הדם-מוח העושה שימוש בספקטרוסקופיה של תאי עכבה, תוך התמקדות בהשלכות על שלמות תאי האנדותל וחדירות באינטראקציה עם תאי T מופעלים.

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם-מוח באמצעות ספקטרוסקופיית עכבה: התמקדות T Cell-אנדותל אינטראקציה תא

שמירה על כיסוי מחסום דם מוחי היא המפתח להומיאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה מתאר טכניקות חוץ גופית כדי לתמצת את התהליכים הבסיסיים הפתולוגיים כי לווסת דם מוח המכשול הכיסוי.

ב מבחני מבחנה כדי להעריך דם מוח מחסום כמו רשת כלי שיטפון ושיבוש

המטרה של הפרוטוקול היא להציג את הליך בלתי אופטימליים להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח (BBB) מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי הראשי (pBECs). המודל מראה הפארמצבטית גבוהה, אטימות גבוהה, מתאים ללימודי תחבורה, וגדילת גילוי סמים.

שיפור שיטה להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי

כאן נציג של assay חדירות כלי דם במוח העכבר באמצעות הזרקה בקרום הבטן של המשדרים פלורסנט ואחריו זלוף הרלוונטיים מודלים חייתיים של תפקוד לקוי של מחסום הדם - מוח. חמי-המוח משמש עבור הערכת חדירות באופן כמותי, והשני עבור מעקב חזותי/immunostaining. התהליך לוקח ב' 5-6-10 עכברים.

In Vivo מחסום הדם - מוח חדירות Assay בעכברים באמצעות Fluorescently עם התווית המשדרים

. הנה, מתוארת שיטה עבור בידוד של עכברוש המוח microvessels, הכנת דוגמאות ממברנה. פרוטוקול זה יש יתרון ברור של הפקת microvessel מועשר דגימות עם חלבון מקובל תשואה של חיות בודדות. דוגמאות יכול לשמש לאחר מכן עבור ניתוחים חלבון חזקה על אנדותל microvascular המוח.

שיטה פשוטה לשחזור כדי להכין ממברנה דגימות מן החולדה טרי מבודד המוח Microvessels

פרוטוקול זה מתאר שיטה להקמת מחסום דם-מוח אנושי (BBB) במודל מבחנה . תאי האנדותל והפריציטים נזרעים בכל צד של מסנן הכנסה (תא דם), ואסטרוציטים נזרעים בבאר התחתונה (תא המוח). המודל שאפיין שימש לניסויים בהובלת ננו-חלקיקים.

מערכת תאי תרבית משולשת המדגימה את מחסום הדם-מוח האנושי

למחסום הדם-מוח (BBB) יש תפקיד מכריע בשמירה על סביבת מוח יציבה ובריאה. תפקוד לקוי של BBB קשור למחלות נוירולוגיות רבות. פיתחנו מודל תלת-ממדי, הנגזר מתאי גזע של BBB כדי לחקור פתולוגיה של כלי דם במוח, שלמות BBB, וכיצד BBB משתנה על ידי גנטיקה ומחלות.

שחזור מחסום הדם-מוח במבחנה כדי למדל ולטפל במחלות נוירולוגיות

פרוטוקול זה מתאר מודל אמין ויעיל במבחנה של מחסום הדם במוח. השיטה משתמשת בתאי אנדותל של כלי דם מוחיים בעכבר bend.3 ומודדת התנגדות חשמלית טרנסממברנלית.

רישום תקינות תפקודית של מחסום ב-bend.3 תאי אנדותל וסקולריים באמצעות זיהוי התנגדות חשמלית טרנסאנדותל

למדו כיצד ליצור מודל מעבדתי של מחסום דם-מוח בחולדה באמצעות תרבית משותפת של תאי אנדותל ואסטרוציטים. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני חדירת תרופות למערכת העצבים המרכזית.

הגדרה למעלה

גלה סרטונים נוספים