עוקב בvivo הדמיה של תאי גזע / אב osteogenic במהלך תיקון שבר

המטרה הכוללת של הליך זה היא לעקוב ולכמת ברצף את התפשטות הנדידה וההתמיינות של תאי גזע ואב אוסטאוגניים אנדוגניים בתיקון שברים בעצם. זה מושג על ידי תיוג ראשון של נגיף המיקסו, עמידות לנגיף שפעת, תא חיובי אחד או MX אחד in vivo על ידי הזרקת חומצה פולי ציטו אילית, ולאחר מכן חיסול התאים ההמטופויאטיים החיוביים של ה-MX על ידי הקרנה. בשלב השני, תאי מח עצם מסוג בר ניתנים באופן שיטתי לעכברים המוקרנים.

לאחר מכן, מיקרו שברים נוצרים באזור Cal של העכבר על ידי קידוח מחט. לבסוף, מבוצעת הדמיה תוך-בקבוקונית רציפה של תיקון השבר המיקרו. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בתמונות תוך-חיוניות אלה כדי להעריך את הדינמיקה של הזרם וההתפשטות של תאי הגזע והאב האוסטיאוגניים לאתרי השבר.

אז היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא המאפשר הדמיה חוזרת ונשנית in vivo של תאי גזע ואב אוסטאוגניים במהלך ריפוי השבר. ההשלכה של טכניקה זו התרחבה לטיפול בריפוי שברים ואוסטאופורוזיס. מכיוון ששיטה זו מציעה כלי חדש לניטור תאי אב גזע אוסטאוגניים אנדוגניים בהתחדשות ותיקון עצם.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כדור של המיקרו-שבר עם נזק מינימלי לרקמות וההדמיה החוזרת ונשנית in vivo של פגיעת השבר מבלי לגרום להיווצרות צלקת חמורה חשובים לשיטה ומאתגרים מבחינה טכנית כדי לתייג MX תאים חיוביים אחד in vivo התחל בהזרקת 200 מיקרוליטר של חומצה פולי ציטו איליק פולי חומצית לכל 20 גרם MX אחד Cree Reporter משקל עכבר תוך-צפקי פעם ביומיים למשך 10 ימים. לאחר מכן, כדי לחסל את ה-MX התושב, תא המטופויאטי חיובי אחד מקרין את העכברים המוזרקים במינון יחיד של 9.5 גראס. לאחר 24 שעות, יש להשתיל פעם אחת 10 עד השישי תאי מח עצם מסוג פרא תוך ורידי לכל עכבר.

ארבעה עד שישה שבועות לאחר מכן, יש להרדים את העכבר על ידי הזרקה תוך-צפקית עם 50 מיקרוליטר קטמין קסילזין לאחר אישור הרגעה על ידי צביטת הבוהן, יש לחתוך את זוג הקרקפת של העכבר המושתל בתאי מח העצם, ולאחר מכן לעקר את העור החשוף עם ספוגית אלכוהול של 70%. מרחו ג'ל דמעות למניעת התייבשות הקרנית, ולאחר מכן בצעו חתך רוחבי באורך של פחות מסנטימטר אחד לאורך הקרקפת, החל מאוזן אחת וכלה באוזן השנייה. לאחר מכן, סובבו את החיה כ-60 מעלות והמשיכו בחתך עד שהיא מגיעה לשניים עד שלושה מילימטרים מהאף בעזרת מלקחיים.

משוך את דש הרקמה לכיוון צידי בעלי החיים כדי להפריד את העור, כעת יש לחשוף בבירור גם את העצמות הקדמיות וגם את הצטלבות התפרים הסגיטלים והעטרה. שטפו את המשטח הפתוח עם PBS סטרילי ולאחר מכן נגבו בעדינות את שאריות השערות בעזרת צמר גפן. לאחר מכן כדי ליצור מיקרו-שברים על העגל, החזק את ראש העכבר ביד אחת ומחט בגודל 30 ביד השנייה.

השתמש בקצה המחט בקוטר 30 כדי לקדוח בעדינות מיקרו ניקוב בצד אחד של העצמות הקדמיות ליד הצומת של התפרים הסגיטלים והעטרה. כדי להימנע מחדירה למוח, עברו למד גדול יותר וסובבו את המחט החדשה כדי להרחיב את חור הניקוב לקוטר של כ-0.5 מילימטרים. לאחר יצירת ניקוב שני בעצם הקדמית הנגדית, זרוק PBS ברציפות לכל נקודה וניגב עד שהדימום נפסק.

לאחר מכן, כדי למנוע התייבשות, יש למרוח טיפה מספקת של תמיסת מלח פיזיולוגית סטרילית על הגולגולת כדי לכסות את האזור במלואו כדי להשיג את תמונות וידאל. ראשית הפעל את סורק הלייזר מבוסס המצולע כדי לאפשר רכישת תמונה רב-ערוצית בו זמנית בקצב וידאו של 30 פריימים לשנייה. לאחר מכן, הפעל את לייזר ספיר טיטניום פמטו-שנייה להדמיה מרובת פוטונים.

הגדר את ההספק ואורך הגל ל-880 ננומטר להדמיית דור הרמוני שני של עצם הגולגולת ב-440 ננומטר עבור עירור עגבניות GFP ו-TD, הפעל את לייזרי המצב המוצק של 491 ננומטר ו-561 ננומטר. ואז הפעל את גלאי הצינור מכפיל הצילום עבור כל אות מסנן מעבר פס של 435 פלוס מינוס 20 ננומטר לדור הרמוני שני, מסנן מעבר פס של 528 פלוס מינוס 19 ננומטר עבור GFP ומעבר פס של 590 פלוס מינוס 20 ננומטר עבור עגבניות TD. כעת, הנח את החיה על במת מיקרוסקופ ממונע בציר XYZ על גבי כרית חימום חשמלית המכוונת ל-37 מעלות צלזיוס.

השתמש בסרט כדי להחזיק את העכבר במקומו ולאחר מכן מרח טיפה של ג'ל חם על בסיס מתיל צלולוז 2% על הגולגולת. כדי למנוע התייבשות, הנח זכוכית כיסוי על אזור ההדמיה. לאחר מכן השתמש במטרת טבילה במים של פי 30 עם צמצם מספרי של 0.9 ובבקר ציר XY, Z כדי לזהות את אות ה-SHG מהעצמות.

כדי למצוא את פני השטח של העגל, זהה מיקום ציון דרך מכריע כגון הצטלבות בין התפרים הסגיטלים לתפרים העטרתיים, ורכוש תמונה. סמן את הקואורדינטות XY, Z של ציון הדרך ולאחר מכן המשך לחפש את מיקום הפציעה באמצעות אותות SHG ופלורסנט כמדריכים. כאשר נמצא כל אזור עניין, רכוש תמונה של מישור המוקד הטוב ביותר המכיל את ה-SHG והאותות הפלואורסצנטיים מהתאים המעניינים.

שמור את קואורדינטות XY, Z ואת המרחק לצומת התפרים הסגיטלי והעטרתי כדי להגדיר את מיקומם המדויק לסבב ההדמיה הבא. לאחר מכן לאסוף מבנים תלת מימדיים של תאים ועצמות של פציעת השבר. הקלט תמונות במרווחי ערימה של כ-2 עד 5 מיקרון Z עם עומק של כ-100 מיקרון מפני השטח של עצם האנדו.

לבסוף, לאחר הדמיה, שני אתרי הפציעה משתמשים בטיפות מרובות של מי מלח סטריליים כדי להסיר את ג'ל המתיל צלולוז 2% מהגולגולת. כעת מצפים את פני השטח באנטיביוטיקה ומכסים את הגולגולת בדשי העור, סוגרים מחדש את הקרקפת בחוט תפירה היפואלרגני ושומרים את החיה בתא התאוששות חם עד שהיא חוזרת להכרה מספקת. לאחר שלושה עד חמישה ימים, חזור על שלבי ההדמיה התוך-חיונית כדי לעקוב אחר השינוי התאי במהלך ריפוי השבר.

בניסוי מייצג זה, נוצרו שני מיקרו-שברים על העצמות הקדמיות של עגבניות MX אחת אוסטאוקלצין, עכברי GFP לאחר הקרנה והחלפת מח עצם הדמיה תוך-חיונית תלת מימדית רציפה של השברים המיקרו הראתה מיקום מחדש של תאי הגזע האוסטיאוגניים החיוביים של העגבנייה ותאי האב בתוך אתר השבר ביום השני, כמו גם ההתרחבות שלהם ביום החמישי. למרות שלא זוהו אוסטאובלסטים חיוביים ל-GFP בשלב זה, ביום ה-12, תת-קבוצה של אבות אוסטאו-אבות ליד פני השבר יזמה התמיינות של אוסטאובלסטים חיוביים ל-GFP חיוביים לעגבניות כפי שמצוין על ידי החץ, הצטברות של אוסטאובלסטים חדשים והיווצרות עצם חדשה ביום 21 מצביעה על כך שהנדידה וההתפשטות של תאי האב האוסטיאוגניים היו מנגנון עיקרי לאספקת אוסטאובלסטים חדשים לריפוי השבר. כדי לבדוק אם שיטה זו מספקת תפוקה עקבית וכמותית של מספרי אבות אוסטאוניים במהלך ריפוי השבר, עקבו אחר תאי גזע ואב אוסטאוגניים חיוביים ל-MX 1 YFP במשך 14 יום לאחר הפציעה.

מספר קטן של אבות זוהו באופן עקבי באתר הפגיעה במשך שלושה ימים. מספר התאים גדל ברציפות ביום השביעי, והגיע לשיא האוכלוסייה ביום העשירי שנשמר לאחר 14 ימים. הקינטיקה של יצירת אבות האוסטאו כומתה על ידי מדידת עוצמת האות YFP לאורך זמן, ותואמת לזו שנצפתה במיקרוסקופיה תוך-חיונית.

האבות נצפו לראשונה ביום השלישי, הגיעו לשיא ביום ה-10, ונשארו בעוצמה גבוהה דומה עד היום ה-14. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שטכניקות תפירה מיומנות ודימום מינימלי יכולים להפחית את היווצרות הצלקות ולהוריד את האוטופלואורסצנטיות ברקע. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לצלם ולעקוב אחר התפשטות הנדידה וההתמיינות של תאי אב גזע אוסטאוגניים אנדוגניים בתהליך תיקון שברים.