עוקב
23 במאי 2014
מדידת כמותית של פונקצית אב עצם בריפוי שבר דורשת טכנולוגיית הדמיה סידורי ברזולוציה גבוהה. הנה, פרוטוקולים ניתנים לשימוש במיקרוסקופיה intravital ומעקב osteo שושלת ברצף תמונה ולכמת את ההגירה, השגשוג והתמיינות של תאי גזע / אב osteogenic אנדוגני בתהליך של תיקון שברים בעצמות.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לעקוב ולכמת באופן רצפי אחר נדידה, שגשוג ודיפרנציאציה של תאי גזע ותאי פרוגניטור אוסטאוגניים אנדוגניים בתיקון שברים בעצם. דבר זה מושג תחילה על ידי סימון תאים חיוביים ל-MX1 (עמידות לנגיף השפעת, myxovirus resistance) in vivo באמצעות הזרקת poly(I:C) (polyinosinic-polycytidylic acid), ולאחר מכן על ידי סילוק התאים ההמטופויטיים החיוביים ל-MX1 השוכנים ברקמה באמצעות הקרנה. בשלב השני, תאי מחית עצם מסוג wild type מוחדרים באופן סיסטמטי לעכברים שהוקרנו.
בשלב הבא, נוצרים מיקרו-שברים באזור ה-Cal בעכבר באמצעות קידוח במחט. לבסוף, מבוצע דימוי תוך-חי (intravital) רציף של תיקון המיקרו-שברים. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בתמונות תוך-חי אלו כדי להעריך את הדינמיקה של זרימת תאי גזע ותאי פרוגניטורים אוסטאוגניים והתרחבותם לאתרי השברים.
יתרונה המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת דימות חוזר in vivo של תאי גזע ותאי פרוגניטורים אוסטאוגניים במהלך תהליך ריפוי השבר. השלכותיה של טכניקה זו משתרעות על הטיפול בריפוי שברים ובאוסטאופורוזיס, שכן שיטה זו מציעה כלי חדש לניטור של תאי גזע פרוגניטורים אוסטאוגניים אנדוגניים במהלך התחדשות ותיקון של עצם.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן יצירת המיקרו-שבר עם נזק מינימלי לרקמה והדימות החוזר in vivo של פגיעת השבר ללא השראה של היווצרות צלקת חמורה חשובים לשיטה ומאתגרים מבחינה טכנית. כדי לסמן תאים חיוביים ל-MX1 in vivo, התחילו בהזרקה של 200 microliters של poly acidic poly cyto ilic acid לכל 20 גרם ממשקל עכבר MX1 Cree reporter באופן תוך-פעਤوني (intraperitoneal) פעם ביומיים למשך 10 ימים. לאחר מכן, כדי להסיר את התאים ההמטופואטיים התושבים החיוביים ל-MX1, הקרינו את העכברים המוזרקים במינון בודד של 9.5 gras. לאחר 24 שעות, השתילו 1 × 10⁶ תאי מח עצם מסוג wild type באופן תוך-ורידי לכל עכבר.
ארבע עד שש שבועות לאחר מכן, הרדמו את העכבר באמצעות הזרקה תוך-peritoneum של 50 µL של ketamine xylazine. לאחר אישור הסדציה באמצעות צביטה בבוהן, גלחו את קרקפתו של העכבר שקיבל השתלת תאי מחית עצם, ואז סטריליזו את העור החשוף באמצעות סמרטוט אלכוהול 70%. מרחו ג'ל דמעות למניעת התייבשות קרנית, ולאחר מכן בצעו חתך רוחבי באורך של פחות מסנטימטר אחד לרוחב הקרקפת, החל מאוזן אחת ועד לשנייה. לאחר מכן, סובבו את החיה בכ-60 מעלות והמשיכו בחתך עד להגעה למרחק של כ-2 עד 3 mm מהאף באמצעות פינצטה.
משכו את מקרי הרקמה לעבר צידי החיה כדי להפריד את העור; כעת העצמות המצחיות (frontal bones) והמפגש בין התפרים הסגיטליים והקורונליים צריכים להיות חשופים בבירור. שטפו את המשטח הפתוח ב-PBS סטרילי ולאחר מכן נגבו בעדינות את השערות שנותרו באמצעות מקלוני צמר גפן. לאחר מכן, כדי ליצור מיקרו-שברים בגולגולת, החזיקו את ראש העכבר ביד אחת ומחט בכיול 30 gauge ביד השנייה.
השתמשו בקצה מחט בדרגת עובי (gauge) 30 כדי לקדוח בעדינות חור מיקרוסקופי בצד אחד של עצמות המצח, סמוך להצטלבות של התפר הסגיטלי והתפר הקורונלי. כדי למנוע חדירה למוח, עברו למחט בעלת דרגת עובי גדולה יותר וסובבו אותה כדי להרחיב את חור הניקור לקוטר של כ-0.5 millimeters. לאחר יצירת חור ניקור שני בעצם המצח בצד הנגדי, טפטפו באופן רציף PBS לתוך כל נקודה ונגבו עד להפסקת הדימום.
לאחר מכן, כדי למנוע התייבשות, יש להניח טיפה מספקת של תמיסת סליין פיזיולוגית סטרילית על הגולגולת כדי לכסות באופן מלא את האזור לצורך השגת תמונות ה-Vidal. ראשית, הפעל את סורק הלייזר מבוסס הפוליגון כדי לאפשר רכישת תמונות רב-ערוצית סימולטנית בקצב וידאו של 30 פריימים לשנייה. לאחר מכן, הפעל את לייזר הטיטניום-ספיר פמטו-שנייה לצורך דימות רב-פוטוני.
הגדירו את ההספק ואת אורך הגל ל-880 nanometers לצורך דימות של יצירת הרמוניה שנייה (second harmonic generation) של עצם הגולגולת ב-440 nanometers לעירור של GFP ו-TD tomato, והפעילו את לייזרי המצב המוצק של 491 nanometer ו-561 nanometer. לאחר מכן, הפעילו את גלאי צינורת הכפלת הפוטונים (photo multiplier tube) עבור כל אות: מסנן חלף-פס של 435 plus or minus 20 nanometer ליצירת הרמוניה שנייה, מסנן חלף-פס של 528 plus or minus 19 nanometer עבור GFP ומסנן חלף-פס של 590 plus or minus 20 nanometer עבור TD tomato. כעת, הניחו את בעל החיים על במה ממוטרית של מיקרוסקופ בציר XYZ שמעל פד חימום חשמלי המוגדר ל-37 degrees Celsius.
השתמשו בסרט הדבקה כדי להחזיק את העכבר במקומו, ולאחר מכן מרחו טיפה של ג'ל חם מבוסס Methylcellulose בריכוז 2% על הגולגולת. כדי למנוע התייבשות, הניחו זכוכית כיסוי על אזור הדימות. לאחר מכן, השתמשו בעדשה אובייקטיבית לטבילה במים בהגדלה של 30x עם מפתח מספרי (numerical aperture) של 0.9 ובבקר צירי XY ו-Z כדי לזהות את אות ה-SHG מהעצמות.
כדי למצוא את פני השטח של הגולגולת, זהו מיקום של נקודת ציון קריטית, כגון נקודת המפגש בין התפרים הסגיטליים לתפרים הקורונליים, ורכוש תמונה. סמן את קואורדינטות ה-XY וה-Z של נקודת הציון, ולאחר מכן המשך בחיפוש אחר מיקום הפגיעה תוך שימוש באותות ה-SHG והאותות הפלואורסצנטיים כמדריכים. כאשר כל אזור עניין (ROI) נמצא, רכוש תמונה של מישור המוקד הטוב ביותר המכיל את אותות ה-SHG והאותות הפלואורסצנטיים מהתאים הרלוונטיים.
שמרו את קואורדינטות XY, Z ואת המרחק לנקודת המפגש של התפרים הסגיטליים והקורונליים כדי להגדיר את מיקומם המדויק עבור סבב הדמיה הבא. לאחר מכן, אספו מבני תאים ועצם בתלת-ממד של פגיעת השבר. רשמו תמונות במרווחי Z stack של בערך 2 עד 5 מיקרון, בעומק של כ-100 מיקרון מפני השטח של העצם האנדו-אוסאית.
לבסוף, לאחר הדמיית שני אתרי הפגיעה, השתמש במספר טיפות של תמיסת סלין סטרילית כדי להסיר את ג'ל ה-2%Methylcellulose מהגולגולת. כעת, מרח אנטיביוטיקה על פני השטח וכסה את הגולגולת עם השתלי העור, סגור שוב את הקרקפת באמצעות חוט תפירה היפואלרגני והשאר את בעל החיים בתא התאוששות חם עד שיחזור להערות מספקת. לאחר שלושה עד חמישה ימים, חזור על שלבי ההדמיה האינטרה-ויטלית (Intravital imaging) כדי לעקוב אחר השינוי התאי במהלך ריפוי השבר.
בניסוי מייצג זה, נוצרו שני מיקרו-שברים בעצמות המצח של עכברים גנטיים MX1 tomato osteocalcin, GFP, לאחר הקרנה והחלפת מחית העצם. הדמיה תלת-ממדית תוך-חיה (intra vital) רצופית של המיקרו-שברים הראתה רלוקציה של תאי גזע ותאי פרוגניטור אוסטאוגניים tomato-חיוביים בתוך אתר השבר ביום השני, כמו גם את התרחבותם ביום החמישי. למרות שבשלב זה לא זוהו אוסטאובלסטים GFP-חיוביים, ביום ה-12, תת-קבוצה של פרוגניטורים אוסטאוגניים סמוך לפני השבר החלה בדיפרנציאציה לאוסטאובלסטים tomato-חיוביים ו-GFP-חיוביים, כפי שמוצג על ידי החץ. הצטברות של אוסטאובלסטים חדשים ויצירת עצם חדשה ביום ה-21 מעידה על כך שהנדידה והשכפול של התאים הפרוגניטורים האוסטאוגניים היוו מנגנון מרכזי לאספקת אוסטאובלסטים חדשים לריפוי השבר. כדי לבחון האם שיטה זו מספקת פלט עקבי וכמותי של מספר הפרוגניטורים האוסטאוגניים במהלך ריפוי השבר, נערמם מעקב אחר תאי גזע ותאי פרוגניטור אוסטאוגניים MX1 YFP-חיוביים למשך 14 ימים לאחר הפגיעה.
מספרים קטנים של תאי פרוגניטורים זוהו בעקביות באתר הפגיעה עד היום השלישי. מספר התאים עלה באופן רציף ביום השביעי, והגיע לשיאו ביום ה-10, רמה שנשמרה עד היום ה-14. הקינטיקה של יצירת הפרוגניטורים האוסטאוגניים כומתה על ידי מדידת עוצמת אות ה-YFP לאורך זמן, והייתה תואמת לזו שנצפתה במיקרוסקופיה אינטרה-ויטלית.
הפרוגניטורים נצפו לראשונה ביום השלישי, הגיעו לשיאם ביום ה-10, ונשארו בעוצמה גבוהה דומה עד היום ה-14. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שטכניקות תפירה מיומנות ודימום מינימלי יכולים להפחית את היווצרות הצלקות ולהוריד את האוטופלורסצנציה של הרקע. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן ההדמיה והמעקב אחר הנדידה, השגשוג וההבחנה של תאי פרוגניטור גזעיים אוסטאוגניים אנדוגניים בתהליך של ריפוי שברים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה למדידה כמותית של תפקודם של תאי אב של עצם במהלך ריפוי שברים באמצעות מיקרוסקופיה אינטרה-ויטלית (intravital microscopy). הפרוטוקולים המתוארים מאפשרים מעקב ודימות של תאי גזע/אב אוסטאוגניים אנדוגניים בעודם נודדים, שוכפלים ומבדילים בתגובה לפגיעה בעצם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של העצם
- טכניקות דימוי
רקע
- שברים בעצם דורשים תהליכי ריפוי יעילים המערבים תאי גזע/תאי נקדב (progenitor cells).
- מיקרוסקופיה תוך-חיה (Intravital microscopy) מאפשרת דימות בזמן אמת של דינמיקה תאית.
- הבנת תהליכים אלו יכולה להנחות טיפולים לשברים ולאוסטאופורוזיס.
- לשיטות הנוכחיות חסרה היכולת להדמיות חוזרות של תאים אלו in vivo.
מטרת המחקר
- פיתוח טכניקה למעקב אחר תאי גזע/פרוגניטורים אוסטאוגניים במהלך תיקון של שבר.
- הערכת הדינמיקה של זרימת תאים והתרחבותם באתרי השבר.
- מתן הדגמה חזותית של השיטה לצורך שחזור הניסוי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- סימון של סוגי תאים ספציפיים באמצעות הזרקת polycytidylic acid.
- סילוק תאי המטופואזיס תיישבי באמצעות הקרנה.
- השראה של מיקרו-שברים ב-calvaria באמצעות קידוח במחט.
- דימוג רצפי של תהליך ריפוי השברים באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה מתקדמות.
תוצאות עיקריות
- מעקב מוצלח אחר תאי גזע/প্রוגניטור אוסטאוגניים אנדוגניים in vivo.
- הדגמה של נדידת תאים ודיפרנציאציה באתרי שברים.
- ביסוס של שיטה لديמות חוזרת ללא נזק משמעותי לרקמה.
- תובנות לגבי המנגנונים התאיים המעורבים ברגנרציה של העצם.
מסקנות
- טכניקה זו מספקת גישה חדשנית לחקר דינמיקת ריפוי העצם.
- יש לה השלכות פוטנציאליות לשיפור טיפולים לריפוי שברים.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב להבנת הטיפול באוסטאופורוזיס.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה ישירה וכימות של הדינמיקה של תאי גזע/פרוגניטורים אוסטאוגניים אנדוגניים במהלך ריפוי שברים, ובכך מספקת תובנות מכניסטיות לגבי התחדשות העצם. באמצעות מעקב אחר נדידה, שגשוג ודיפרנציאציה של תאים in vivo, היא תומכת בתיקוף מטרות ובהפחתת סיכונים בפיתוח טיפולים לאוסטאופורוזיס ולריפוי שברים. גישה זו מציעה פלטפורמה הניתנת לשחזור להערכת רגולטורים פנימיים וחיצוניים של תאי גזע, ובכך משפרת את הביטחון החזוי בקבלת החלטות פרה-קליניות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות באמצעות מעקב אחר אתר ההגירה וההתרחבות של תאי גזע/פרוגניטורים אוסטאוגניים באתרי פגיעה.
- ערך תפעולי: מספק מדדים כמותיים של קינטיקת זרימת תאים והתרבות לצורך תיקוף פונקציונלי של מטרות.
- ערך חיזוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי קישור דינמיקה תאית לתוצאות של בניית עצם.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: יוצר פלטים של דימות סטנדרטיים הניתנים לשחזור לצורך הערכת השפעות של תרכובות על התנהגות תאי גזע.
- ערך תפעולי: מבסס זרימת עבודה של דימות תוך-חי (intravital imaging) הניתנת להרחבה למעקב אורך של תגובות תאיות.
- מוכנות הבדיקה: מייצר מדדי עוצמת אות YFP כמותיים המתואמים עם קינטיקה של תאי פרוגניטור לאורך זמן.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר בין אירועים תאיים מוקדמים לבין שלבי היווצרות העצם המאוחרים, ובכך תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים.
- ערך תפעולי: מאפשר רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מעקב אחר התמיינות תאי פרוגניטור לתוך אוסטאובלסטים.
- קידום מותאם סיכונים: מספק בסיס לקבלת החלטות של go/no-go בהתבסס על מנגנונים תאיים מאושרים של תיקון.
שילוב זרימת עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מאימות המטרה ועד למחקר פרה-קליני, באמצעות אספקת קריאות תאיות דינמיות וכמותיות המנחות את האסטרטגיה הטיפולית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים באמצעות ויזואליזציה של תגובות תאי גזע לפגיעה בזמן אמת.
- סריקה: מספקת נתוני דימוי הניתנים לשחזור ומוכנים לבדיקה, להערכת השפעות של מודולטורים על נדידה ושכפול של תאי פרוגניטור.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות כמותיות של עוצמת אות YFP לאורך זמן, המאפשרות קורלציה עם נקודות סיום היסטולוגיות.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלבי הגילוי לשלבים פרה-קליניים על ידי קישור הדינמיקה של תאי פרוגניטור לדיפרנציאציה של אוסטאובלסטים ולהיווצרות עצם.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמה רב-פעמית לדימוי אינטרה-ויטלי עבור מחקרי התחדשות עצם מרובים בתחומי טיפול שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במסלולי תיקון העצם.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה והדירות באמצעות פרוטוקולי דימות intravital רצופים.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים מוקדמת עבור מועמדים לטיפול באוסטאופורוזיס ובריפוי שברים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים המבוסס על מנגנוני פעולה מאוששים המתווכים על ידי תאי גזע.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה אינטרה-ויטלית (intravital microscopy), בניתוחים בעכברים ובטכניקות סימון תאים פלואורסצנטיות.
- תלוי בתשתית סריקה בלייזר רב-פוטוני עם אורכי גל ומערכות מסננים ספציפיות לגילוי SHG ופלואורסצנציה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים כדי להבטיח השראה עקבית של מיקרו-שברים וביצוע של מרווחי הדמיה אחידים.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום המודל לאתרים שונים בעצם או להקשרי מחלה שונים.
- מוגבל על ידי האתגר הטכני של מזעור נזקי הרקמה והיווצרות צלקות במהלך מפגשי הדמיה חוזרים.
