הפעלת יתר רעיל גירוי של המוח כMicroslices במבחנה דגם של שבץ
4 בפברואר 2014
פיתחנו מודל פרוסת מוח שבו ניתן להשתמש כדי לבחון מנגנונים מולקולריים מעורבים בפגיעה במוח בתיווך הפעלת יתר רעילה. טכניקה זו יוצרת רקמת מוח בוגרת קיימא ומפחיתה את המספרים של בעלי חיים הנדרשים לניסויים, תוך שמירה על המעגלים עצביים, אינטראקציות הסלולר, ותאי postsynaptic שלמים בחלקו.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להחיל גירוי ציטוטוקסי על פרוסות מיקרו במוח כדי ליצור מודל שבץ במבחנה. זה מושג על ידי הכנת פרוסות מיקרו ממוח מבודד טרי. השלב השני הוא לאזן את פרוסות המיקרו בתסיסה עדינה.
לאחר שיווי משקל, פרוסות המיקרו מוכנות לקבל מגוון מניפולציות ניסיוניות. בסופו של דבר, התוצאות מראות שמיקרו פרוסות קיימות לפחות שעתיים לאחר היצירה. היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו על פני טכניקות אחרות קיימות, כגון תרביות עובריות ראשוניות, הוא שהטכניקה שלנו משתמשת בפרוסות של רקמת מוח בוגרת, המכילות יותר מסוג תא אחד, ולכן מייצגות יותר רקמת מוח שלמה.
הצעד הראשון הוא להשיג רקמת מוח טרייה. טבלו את המוח בכמות קטנה של בופר קרבס חם. כדי להסיר שאריות עור, פרווה או דם, הכינו קוצץ מייקל עם שני גיליונות נייר פילטר לחים במאגר קרבס חם.
כשהוא מוכן, הנח את המוח על במת המסוק. שמור על לחות המוח ונייר הסינון עם חוצץ חריצים חמים תוך כדי עבודה כדי למנוע מהמוח להחליק. הימנע מלאפשר ליותר מדי נוזלים להצטבר על פני השטח.
חתכו את המוח לחלקים קורונליים של 250 מיקרומטר. לאחר מכן, סובב את הבמה 90 מעלות וצור פרוסות סגיטליות של 250 מיקרומטר. אחרי השלב הזה, חלקי המוח נקראים מיקרו פרוסות.
מניחים את פרוסות המיקרו לשניים תחתונים עגולים עם 10 עד 15 מיליליטר של חיץ חם. מערבבים בעדינות את הצינור עד להשעיית פרוסות מיקרו בודדות, ואז מניחים להן להתיישב תחת כוח הכבידה. הסר בזהירות את הסופרנטנט, שיהיה עכור עקב פסולת תאים תלויה, והוסף 10 מיליליטר של מאגר זחילה חם טרי לצינור.
חזור על הליך הכביסה ארבע פעמים כדי להסיר את רוב הפסולת לאחר שטיפה יסודית. אזנו את פרוסות המיקרו ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין או היפוך, והחליפו את מאגר קרבס כל 15 דקות למשך שעה בסך הכל. לאחר זמן זה, הוסף שני מיליליטר של מאגר טרי של 37 מעלות צלזיוס קרבס והעביר 15 עד 20 פרוסות מיקרו לצינור פוליסטירן תחתון שטוח של חמישה מיליליטר.
בעזרת קצה פיפטה רחב במיוחד עם קצוות חלקים, מורחים את פרוסות המיקרו באופן שווה על בסיס הצינור בשכבה אחת כך שכל פרוסת מיקרו לא תהיה רחוקה מכמה מילימטרים מהאטמוספירה המחומצנת. לאחר סידור נכון, דגרו את פרוסות המיקרו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס כדי לספק חמצון מתאים לפרוסות המיקרו. העבירו ללא הרף קרבוגן על מתלה פרוסת המיקרו כאשר מיקומי קו הגז ממש מעל פני השטח כדי למנוע הפרעה מכנית של פרוסות המיקרו למגע ישיר עם הגז לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
זה קריטי שפרוסות המיקרוס יהיו מאווררות כהלכה. חשוב שקו הגז ימוקם במרחק הנכון מפני השטח של מתלה המיקרו-אתר. ניתן למזג מספר קווים יחד כדי לאפשר גירויים מרובים להתרחש.
במקביל, ניתן להשתמש במגוון גירויים. בדוגמה זו, פרוסות המיקרו עוברות גירוי AMPA. טפל בפרוסות המיקרו עם גירוי ציטוטוקסי או מאגר קרבס בלבד.
לשליטה על קבוצה מגורה. הסר את תמיסת הדגירה בזמנים שונים לאחר הגירוי והחלף אותה ב-300 מיקרוליטר של מאגר הומוגניזציה קר כקרח בנקודת הזמן הרצויה. לאחר הגירוי, הומוגניזציה של פרוסות המיקרו על הקרח באמצעות הומוגנייזר טפלון מזכוכית לאחסן את ההומוגני במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן לניתוח נוסף.
שיעורי הנשימה מראים שפרוסות מיקרו שנאספו מהמוח הקדמי של התרנגולת הן ברות קיימא עד שעתיים לאחר היצירה. רמות ה-A TP הגבוהות ורמות ה-A DP הנמוכות שנמצאות בפרוסות מיקרו אופייניות גם לתאים ברי קיימא. בדוגמה זו, תכולת האשלגן ברקמות נמדדה ונמצאה מעט מעל הרקע לאחר הדיסקציה, אך כדי לעלות עם הדגירה עם מאגר קרבס, התוספת של WABE ו-EGTA גרמה לירידה בתכולת האשלגן ברקמות, מה שמדגים כי פרוסות מיקרו בדרך כלל שואבות אשלגן באופן פעיל וכי הרמות אינן נובעות מאשלגן הכלוא ברקמות מתות או בחללי ביניים.
כאן נוצרו פרוסות מיקרו מהסטריאטום וקליפת המוח החושית של חולדות זכרים ועברו דה-פולריזציה באמצעות חיץ חריצי אשלגן גבוה. קצב הזרחן של הדבק N 2B השתנה בין קליפת המוח לסטריאטום, בעוד שקצב הדבק זרחון אחד היה דומה בין שני האזורים. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך כשעתיים אם היא מבוצעת כהלכה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג מודל של פרוסות מוח שנועד לחקור את המנגנונים המולקולריים של פגיעה מוחית המתווכת על ידי אקסיטוטוקסיות. הטכניקה מאפשרת יצירת רקמת מוח בוגרת וחיונית תוך מזעור השימוש בבעלי חיים ושימור המעגלים העצביים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- מודלים חוץ-גופיים (In Vitro)
רקע
- רעילות מעוררת (Excitotoxicity) היא גורם משמעותי בפגיעה מוחית.
- מודלים קיימים מסתמכים לעיתים קרובות על תרביות נוירונליות ראשוניות.
- שימוש ברקמת מוח בוגרת מספק ייצוג מדויק יותר של תנאים in vivo.
- מודל זה שואף להפחית את מספר בעלי החיים המשמשים במחקר.
מטרת המחקר
- פיתוח מודל אין ויטרו (in vitro) מהימן לשבץ מוחי.
- בחינת ההשפעות של גרייה ציטוטוקסית על פרוסות מיקרו של המוח.
- שימור אינטראקציות תאיות ומדורים פוסטסינפטיים.
שיטות שהשתמשו בהן
- הכנת מיקרו-פרוסות (micro slices) מרקמת מוח שבודדה acabado טרי.
- השגת שיווי משקל של המיקרו-פרוסות באמצעות ערבול עדין.
- ביצוע מניפולציות ניסיוניות שונות לאחר השגת שיווי המשקל.
- הערכת חיוניות הפרוסות למשך שעתיים לפחות לאחר יצירתן.
תוצאות עיקריות
- פרוסות מיקרוסקופיות נותרות חיוניות לשימוש ניסויי במשך שעתיים.
- הטכניקה משמרת סוגי תאים מרובים בתוך הפרוסות.
- התוצאות מעידות כי מודל זה מייצג בצורה טובה יותר רקמת מוח שלמה.
- מדגים יתרונות על פני שיטות מסורתיות של תרביות נוירונים.
מסקנות
- מודל פרוסות המוח שפותח יעיל לחקר אקסיטוטוקסיות (רעילות עירור).
- גישה זו מפחיתה את השימוש בבעלי חיים תוך שמירה על שלמות הרקמה.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש במודל זה להשגת תובנות נוספות לגבי מנגנוני פגיעה במוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מידול של פגיעה מוחית אקסיטוטוקסית ברקמה עצבית בוגרת נותן מענה לפער קריטי בנוירומדע תרגומי, ומאפשר הערכה ניבוית יותר של מנגנונים מולקולריים הרלוונטיים לשבץ איסכמי. פלטפורמת מיקרו-פרוסות המוח (brain microslice) תומכת בהפחתת סיכונים מנגנונית ובתיקוף מטרות על ידי שימור המורכבות התאית ומבנה הרקמה, שאינם קיימים בתרביות נוירונים ראשוניות. יכולת ההסתגלות שלה בין מינים ואזורי מוח שונים מגבירה את הרלוונטיות של פורטפוליו המחקר לשלבי הגילוי המוקדמים ולמחקר פרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של מסלולי אקסיטוטוקסיות (excitotoxicity) בסביבות עצביות רב-תאיות בוגרות.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי מידול מוות תאי ואיתות ברקמה שלמה.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנוניים על ידי הבחנה בין תגובות של רקמה בוגרת לבין ארטיפקטים של תרביות לא בוגרות.
- משפר את רמת הביטחון בחיזוי עבור מטרות פוטנציאליות המעורבות בשבץ וניוון עצבי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכת מתוקפת וניתנת לשחזור לכימות תוצאות תפקודיות כגון חיוניות תאים ואירועי פוספורילציה.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה על ידי מתן אפשרות לגירוי מקבילי ותנאי בקרה בתוך אותו הקשר רקמתי.
- מאפשר התאמה ניתנת להרחבה למספר אזורי מוח ומינים שונים, ובכך מרחיב את ישימות הסריקה.
- מאפשר הערכה מהימנה של השפעות תרכובות על תגובות של רקמה עצבית בוגרת.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם מנגנונים רלוונטיים למחלה על ידי מידול פגיעה אקסייטוטוקסית בפרוסות מוח בוגרות.
- תומך בגילוי ביומרקרים תרגומיים באמצעות מדידת נקודות קצה מולקולריות לאחר גרייה.
- מספק רצף ממחקרים מכניסטיים ראשוניים ועד לתיקוף פרה-קליני במערכות מורכבות יותר.
- מפחית סיכון תרגומי על ידי גישור על הפער בין תרביות תאים למודלים in vivo.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
מודל פרוסות מיקרוסקופיות של המוח זה מתאים לממשק שבין הגילוי המוקדם לוולידציה פרה-קלינית, ומאפשר בדיקת היפותזות ומחקרים מכניסטיים לפני עבודה in vivo.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהבהרת מסלולים ובהפחתת סיכונים ביולוגיים עבור מטרות של רעילות עיגור (excitotoxicity) והגנה עצבית.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור, כגון חיוניות תאים ומצב פוספורילציה, לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת ניתוח השוואתי של תגובות מולקולריות באזורי מוח שונים ובתנאי טיפול שונים.
- מחקר טרנסלציונלי: מסייעת בהתאמה לנקודות סיום רלוונטיות למחלה ולאסטרטגיות של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: פרוטוקול הניתן להתאמה התומך ביישום חוצה-תוכניות ובסטנדרטיזציה בפורטפוליו של מדעי העצבים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי ניוון עצבי.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של הכנת רקמות וגירוי עבור תהליכי עבודה ניתנים לשחזור ובניית קנה מידה.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של go/no-go על ידי אספקת נתונים מרקמות בוגרות לפני ביצוע מחקרים בבעלי חיים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של מועמדים לנוירופרוטקציה ולויסות אקסיטוטוקסיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיסקציה של המוח, טיפול ברקמה והערכת חיוניות הפרוסות.
- דורש גישה לציוד ייעודי לחיתוך רקמה, אינקובציה ואוكسגנציה.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדת בין-צוותית של פרוטוקולי הגירוי ונקודות קצה אנליטיות.
- ניתן להתאמה למינים ואזורי מוח שונים, אך עשוי לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול עבור כל הקשר.
- חלון החיוניות מגביל את משך הניסוי לכשעתיים לאחר יצירת הפרוסות.
