הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח
4 ביוני 2014
מיטוזה העצבית היא פרמטר קריטי הנוירוגנזה. חלק גדול מההבנה של מיטוזה העצבית שלנו מבוסס על ניתוח של רקמה קבועה. הדמיה בשידור חי בפרוסות מוח עובריים היא טכניקה צדדי כדי להעריך מיטוזה עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה בסביבה מבוקרת.
המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבצע דימות ואנליזה של מיטוזה של תאי אב עצביים בחתכי מוח חיים של עכברים. הדבר משיג תחילה על ידי נתיחה של מוחות מעוברי עכברים. השלב השני הוא הכנת חתכי מוח באמצעות ויברטום.
בשלב הבא, מבוצע דימוי חי של חתכי מוח. השלב האחרון הוא הפקת מידע מסרטונים לצורך ניתוח פרמטרים רלוונטיים של מיטוזה. בסופו של דבר, מיקרוסקופיית time-lapse משמשת להדגמת האופן שבו אוכלוסיות של תאי אב במוח מתחלקות בזמן אמת.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ניתוח של דגימות מקובעות, הוא שניתן להשיג תובנה משמעותית לגבי הדינמיקה הזמנית של חלוקת תאי אב עצביים בחתכי מוח חיים. ניתן להשתמש בה גם כדי להבין כיצד הפרעות גנטיות עשויות להשפיע על חלוקת תאי אב עצביים. אף על פי שאנו משתמשים בשיטה זו כדי להבין את התפתחות קליפת המוח, ניתן להחיל את הניתוח שתיארנו על חקר המיטוזה של תאי גזע באזורי מוח אחרים או אפילו מחוץ למוח.
מי שידגים את הפרוצדורה הוא Louis y, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי. התחילו את הפרוצדורה באיסוף עוברי עכברים ובביצוע דיסקציה של המוחות העובריים, כולל המוח האחורי והמוח הקדמי עם שתי ההמיספרות המוחיות. בתוך דלי קרח, צרו חור בקרח עבור תבניות הקיבוע.
בשלב הבא, מזגו מצע aros בריכוז 3% לתוך תבנית פלסטיק והניחו את התבנית בתוך החור בקרח. ערבבו את מצע ה-aros בעזרת קצה של מדחום דיגיטלי עד שהטמפרטורה תגיע ל-35 °C. לאחר מכן, העבירו במהירות את המוח אל תוך מצע ההטמעה כדי להסיר שאריות HBSS בממשק שבין המוח ל-aros.
סובב את המוח בזהירות ובעדינות באופן חוזר ונשנה בתוך תמיסת ההטמעה. באמצעות הפינצטה, תיווצר כרית של agarose ג'ל בתחתית התבנית במגע עם הקרח. ברגע שניתן להרגיש בכרית בעזרת קצה הפינצטה תוך כדי ערבוב, מקם את המוח כאשר הצד הדורסלי פונה כלפי מעלה; המוח לא צריך לשקוע עד לתחתית התבנית.
הניחו לטבעת ה-aros להתקשח בקרח למשך חמש דקות לפחות לפני חיתוך פינות התבנית באמצעות להב תער. גסלו בזהירות בלוק aros מסביב למוח ונסו לצמצם את מספר החתכים כדי למנוע הפרעה למוח המוטמע. בעזרת מכשיר ה-VT 1000 s Viome, הכינו פרוסות בעובי 200 עד 250 micron.
כעת יש לדלל את cyto 11 לריכוז סופי של 0.5 עד 1 µM בתוך מצע גידול לפרוסות המועשר בגורמי גדילה. בצלחת 12 בארות, יש להדגיר פרוסות ממוח אחד ב-2.5 mL של תמיסת הצביעה בכל בארה למשך שעה אחת ב-37 °C. לאחר מכן, יש לשטוף את הפרוסות ב-2.5 mL של מצע גידול לפרוסות ללא תמיסת צביעה למשך 20 דקות. כדי לקבע את חתכי המוח, יש להניח טיפה של תמיסת קולגן בתחתית של צלחית מיקרו-באר עם תחתית זכוכית בקוטר 35 mm.
פזרו את החומר באמצעות טיפ של פיפט כדי שיתאים לגודל הפרוסה. לאחר מכן, העבירו פרוסה לתוך טיפה של קולגן. דגמו את הפרוסות בדגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לפני העברתן לאינקובטור ב-37 degree Celsius עם 5% carbon dioxide.
לאחר 20 דקות, הוסף סך הכל 1.2 milliliters של מצע גידול לפרוסות לתוך צלחת מיקרו-בארים בעלת תחתית זכוכית, בנפחים של 600 microliters בכל פעם, והפץ את הנוזל באמצעות קצה של פיפטה. הנח לפרוסות להתאושש באינקובטור למשך שעה אחת ו-30 דקות לפחות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius וב-5% carbon dioxide לפני העברתן לתא האינקובציה של מיקרוסקופ קונפוקלי עם דיסק מסתובב תחת אותם תנאים. לצורך דימות חי, השתמש בעדשה אובייקטיבית 60 x עם שמן סיליקון, מרחק עבודה של 300 microns ומספר מפתח (numerical aperture) של 1.3.
לצורך דימוי תאים, צלם את התאים בערימת Z בעובי 30 מיקרון, כאשר מרכז ערימת ה-Z ממוקם כ-40 מיקרון מתחת לפני השטח של הפרוסה. במידת הצורך, כוונן את הספק הלייזר ואת זמני החשיפה כדי להגביל פוטובליצ'ינג (photobleaching), והשתמש בזמן חשיפה שבין 30 ל-200 מילישניות, בהתאם לעוצמת אות ה-cyto 11. להלן נתונים מייצגים שניתן להשיג מניתוח זה לצורך זיהוי דמויות מיטוטיות ב-ImageJ. לאחר פתיחת מערך הנתונים של מיקום אחד כ-hyperstack, בחר מישור Z אחד שבו הרקמה והתאים נראים בריאים.
גללו אחורה בזמן כדי לזהות את נקודת הזמן שבה התא נכנס למטוזה. התא עשוי לנוע בין מישורי Z, אך הרזולוציה הזמנית ופרמטרי ה-Zack שתוארו קודם לכן עברו אופטימיזציה כדי לאפשר תהליך זה. רשמו בגיליון אלקטרוני את ארבעת קואורדינטות ה-D של התא ב-hyper stack בעת כניסתו למטוזה.
הכרת קואורדינטות אלה תמנע ספירה חוזרת של אותו תא. גללו קדימה בציר הזמן ורשמו את הזמן שבו התא עובר משלב אחד למשנהו. תיעדו את משך כל שלב במיטוזה עבור תא נתון, כדי לבצע שחזור תלת-ממדי של התאים וכימות של הסיבוב במהלך המטפאזה.
לאחר זיהוי מספר תאים במצב מיטוזה, השתמש בקואורדינטות של תא אחד וגלול קדימה בזמן עד לתחילת המטאפזה. סובב את כל ה-hyper stack כך שגבול הפרוזדור (ventricular border) יהיה מישורי יותר. השתמש בכלי הזווית כדי לקבוע את הזווית שיש להחיל עבור סיבוב זה.
זהו את מישור Z שבו התא המבוקש נראה בצורה הברורה ביותר. השתמש בכלי בחירת המלבן כדי לצייר בחירה הכוללת את התא כולו. לאחר מכן, זהה את מישורי Z הכוללים את התא המבוקש והשתמש בפקודת שכפול התמונה (image duplicate) כדי ליצור תת-מחסנית (sub stack).
בתיבת הדו-שיח, השאירו את הסימון ב-duplicate hyper stack עבור הפרוסות (slices). פרמטר Z מתייחס למישורי Z, כולל התא השלם והמסגרות, ופרמטר T מתייחס לנקודת הזמן הנוכחית. לאחר מכן, צרו שחזור תלת-ממדי (3D reconstruction) של התא.
בנקודת הזמן הנוכחית. מרווח הפרוסות תואם למרווח שבין כל אחת מתמונות מישור Z במיקרונים. באמצעות סרגל הגלילה, סובבו את השחזור התלת-ממדי שהתקבל כך שקצה לוח המטאפאזה יהיה גלוי.
מספר הפריים תואם לזווית בטא. רשמו מספר זה. לאחר מכן, מדדו את הזווית בין הקו האופקי לבין ה-align bys.
חיתוך של לוח המטפאזה בניצב. זוהי רשומת הזווית alpha. זוויות אלו עבור כל נקודות הזמן של המטפאזה בתא הנבדק.
זווית הסיבוב בין נקודות הזמן t ו-t מינוס אחת שווה לערך המוחלט של ההפרש בין זווית בנקודה t לזווית זו בנקודה T מינוס אחת לאורך הציר הגבי-בטני. מיטוזה מצולמת בקלות רבה יותר באזורים גביים של חתכי מוח מכיוון שהשלוחה הבזאלית של R GCs קצרה יותר ולכן הסבירות שהיא תיחתך על ידי viome נמוכה יותר. לאורך ציר ROS coddle, חתכים באזורי coddle של קליפת המוח הגבית מספקים את התוצאות העקביות ביותר.
אלו הן דוגמאות לאזור טוב ולאזור רע לצורך הדמיה. באזור טוב, הגרעינים הם בעלי צורה אליפטית ותאים מיטוטיים רבים נצפים בגבול החדר לפני ההדמיה בשיטת time-lapse; באזור רע, נצפים תאים מיטוטיים מעטים מאוד בגבול החדר והגרעינים הם עגולים.
להלן דוגמה לפרוסה תקינה שנצפתה במיקרוסקופ בהגדלה נמוכה לפני דימוי חי, וכאן מוצגות מספר דוגמאות לתאים המסומנים ב-cyto 11 בשלבים שונים של המיטוזה. מוצג כאן מונטאז' של אזור בגבול החדר (ventricle) שבו שני תאי אב עצביים עוברים את השלבים השונים של המיטוזה, המסומנים בצבעים שונים, בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון אלקטרופורציה ניטרלית של מבני DNA, כדי לענות על שאלות נוספות, כולל מהו גורלם של תאים המתחלקים וכיצד מתנהג השלד התאי?
מומלץ להשתמש גם בשיטות משניות מעבר ל-CY 11 למעקב אחר מיטוזה, כגון עכברי H two VGFP טרנסגניים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן המניפולציה של פרוסות מוח, אילו פרמטרי התאמה הם המיטביים, וכיצד לנתח את הנתונים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה דן בדימות ובניתוח של מיטוזה של תאי מוצא עצביים בחתכים חיים של מוח עכבר. הטכניקה מאפשרת תצפיות ברזולוציה זמנית ומרחבית גבוהה של מיטוזה בסביבה מבוקרת.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- טכניקות של דימיון חי
רקע
- מיטוזה של תאי פרוגניטור עצביים חיונית לתהליך הנוירוגנזה.
- מחקרים מסורתיים התבססו על ניתוח של רקמות מקובעות.
- דימות חי מספק מבט דינמי על תהליכים תאיים.
- הבנת המיטוזה יכולה לתרום לביולוגיה של ההתפתחות ולמחקר הפרעות התפתחותיות-נוירולוגיות.
מטרת המחקר
- לביצוע דימוג חי (live imaging) של מיטוזה בתאי אב עצביים.
- לניתוח פרמטרים של מיטוזה בזמן אמת.
- לשיפור ההבנה של דינמיקת האוכלוסיות של תאי אב במוח.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ניתוח מוחות מעוברים של עכברים.
- הכנת פרוסות מוח באמצעות ויברטום (vibratome).
- דימות חי של פרוסות מוח לצפייה במטובוזה.
- מיקרוסקופיה של צילומי השהיה (Time-lapse) לניתוח מפורט של חלוקת תאי פרוגניטור.
תוצאות עיקריות
- דימוג מוצלח של מיטוזה של תאי אב עצביים בפרוסות חיות.
- תצפית בזמן אמת על חלוקות של אוכלוסיית תאי האב.
- זיהוי פרמטרים מרכזיים של המיטוזה.
- תובנות על הדינמיקה של הנוירוגנזה.
מסקנות
- דימות חי הוא כלי רב עוצמה לחקר התנהגות של תאי מוצא עצביים.
- גישה זו יכולה להוביל להבנה טובה יותר של תהליך הנוירוגנזה.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על ממצאים אלו כדי לבחון תהליכי התפתחות נוירולוגית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
דימוי חי של מיטוזה בקורטקס של עובר עכבר מאפשר תצפית ישירה על דינמיקת החלוקה של תאי מוצא עצביים, ובכך מספק תובנות קריטיות לתיקוף מטרות בשלבי התפתחות עצבית מוקדמים. גישה זו מגבירה את רמת הביטחון החיזויית במחקרים מכניסטיים על ידי לכידה של אירועים תאיים בזמן אמת ופרמטרים מיטוטיים כמותיים. השיטה תומכת ברציפות תרגומית ממסלול גילוי ביולוגי לפיתוח מודלים פרה-קליניים במחקר ופיתוח של תרופות נוירו-פארמצבטיות.&ד.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה&ד'
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של מנגנונים מיטוטיים העומדים בבסיס הפרעות התפתחותיות עצביות.
- תומך בתיקוף תפקודי של הפרעות גנטיות המשפיעות על חלוקת תאי מוצא עצביים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי כימות משכי שלבים מיטוטיים ודינמיקה של כישור המיטוזה.
- מספק נתונים ברזולוציה גבוהה לצורך תעדוף של יעדים להתפתחות עצבית.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מקיים מערכות מתוקפות של פרוסות מוח ex vivo לצורך סריקת תרכובות או סריקה גנטית.
- מספק פלטים כמותיים וניתנים לשחזור על התקדמות המיטוזה ומורפולוגיה תאית.
- מאפשר סטנדרטיזציה של פרמטרי הדמיה ואנליזה לצורך השוואה בין מחקרים.
- מכין פלטפורמות חסונות להערכת התערבויות מועמדות על מיטוזה של תאי אב עצביים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מקשר פנוטיפים מיוטיים למודלים נוירו-התפתחותיים הרלוונטיים למחלה.
- תומך ברצף מהגילוי המכניסטי ועד לתיקוף פרה-קליני של תרכובות נוירו-אקטיביות.
- מאפשר קבלת החלטות לגבי קידום מותאם סיכונים על בסיס תוצאות תאיות חיות.
- מסייע בזיהוי סמנים ביולוגיים באמצעות דימוי דינמי של אירועים מיוטיים.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow Integration)
פרוטוקול דימוי חי זה משתלב ברצף שבין שלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומגשר בין מחקרים מכניסטיים לבין פיתוח מודלים תרגומיים עבור תהליכי פיתוח בתעשיית התרופות הנוירולוגיות.
- ביולוגיה של גילוי: מספקת בדיקה ישירה של היפותזות לגבי בקרה מיטוטית ומעורבות של מסלולים בתאי מוצא עצביים.
- סינון: מציעה מערכות של פרוסות מוח מוכנות לבדיקה הניתנות לשחזור, עם קריאות מיטוטיות כמותיות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות מדויקות מבחינה מרחבית ובעלות רזולוציית זמן של שלבי המיטוזה ואוריינטציית הציר.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין פנוטיפים תאיים למודלים של מחלות לצורך תיקוף פרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה גמישה הניתנת להתאמה להפרעות גנטיות ופרמקולוגיות מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר התפתחותי-עצבי.
- ערך תפעולי: מתקנן את זרימות העבודה של הדימות והניתוח לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשכיות הפרויקט (go/no-go) באמצעות אספקת נתונים מיטוטיים כמותיים ועתירי תוכן.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות והתערבויות התפתחותיות-עצביות מותאם סיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיסקציה של מוח עוברי, דימוג חי ואנליזה כמותית של תמונות.
- דורש גישה למיקרוסקופיה קונפוקלית מתקדמת ולכלי אנליזה חישוביים.
- מחייב סטנדרטיזציה חוצת-צוותים של פרמטרי הדימוג ואנוטציה של נתונים.
- ניתן להסתגל לרקעים גנטיים שונים ולאסטרטגיות סימון פלואורסצנטיות מגוונות.
- עומק הדימוג ובריאות הרקמה עשויים להגביל את היישום באזורי מוח מסוימים או בשלבים התפתחותיים ספציפיים.
