Name: הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-04T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: למד הדמיה חיה של מיטוזה בתאי גזע עצביים בקורטקס עכבר עוברי פיתוח באמצעות מיקרוסקופיה time-lapse. שיטה זו מאפשרת ניתוח דינמיקת חלוקה תאית בזמן אמת לחקר נוירוגנזה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים מימון NINDS / NIH, r00-NS064197 וNINDS / NIH, R01NS083897 (שניהם לDLS).

<ol><li>Gal, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+morphological+heterogeneity+of+neural+precursors+in+the+mouse+neocortical+proliferative+zones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular and morphological heterogeneity of neural precursors in the mouse neocortical proliferative zones.</a> J Neurosci. 26, 1045-1056 (2006).</li>
<li>Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+ventricular+zone+neural+precursors+contributes+to+neuronal+fate+diversity+in+the+postnatal+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex.</a> Journal of Neuroscience. 30, 7028-7036 (2010).</li>
<li>Konno, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroepithelial+progenitors+undergo+LGN-dependent+planar+divisions+to+maintain+self-renewability+during+mammalian+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuroepithelial progenitors undergo LGN-dependent planar divisions to maintain self-renewability during mammalian neurogenesis.</a> Nat Cell Biol. 10, 93-101 (2008).</li>
<li>LoTurco, J. J., Manent, J. -B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 19 Suppl 1, (2009).</li>
<li>Shimogori, T., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+application+with+in+utero+electroporation+in+mouse+embryonic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain.</a> Dev Growth Differ. 50, 499-506 (2008).</li>
<li>Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evolution+of+the+human+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and evolution of the human neocortex.</a> Cell. 146, 18-36 (2011).</li>
<li>Englund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((and+Tbr1+are+expressed+sequentially+by+radial+glia%2C+intermediate+progenitor+cells%2C+and+postmitotic+neurons+in+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex.</a> Journal of Neuroscience. 25, 247-251 (2005).</li>
<li>Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+derived+from+radial+glial+cells+establish+radial+units+in+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex.</a> Nature. 409, 714-720 (2001).</li>
<li>Wang, X., Tsai, J. -W., Lamonica, B., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+subtype+of+progenitor+cell+in+the+mouse+embryonic+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex.</a> Nat Neurosci. 14, 555-561 (2011).</li>
<li>Haydar, T. F., Ang, E., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+rotation+and+mode+of+cell+division+in+the+developing+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle rotation and mode of cell division in the developing telencephalon.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2890-2895 (2003).</li>
<li>Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+cycle+of+the+pseudostratified+ventricular+epithelium+of+the+embryonic+murine+cerebral+wall%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall.</a> J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).</li>
<li>Pilaz, L. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forced+G1-phase+reduction+alters+mode+of+division%2C+neuron+number%2C+and+laminar+phenotype+in+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Forced G1-phase reduction alters mode of division, neuron number, and laminar phenotype in the cerebral cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 21924-21929 (2009).</li>
<li>Calegari, F., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibition+of+cyclin-dependent+kinases+that+lengthens%2C+but+does+not+arrest%2C+neuroepithelial+cell+cycle+induces+premature+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis.</a> J Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).</li>
<li>LaMonica, B. E., Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+orientation+predicts+outer+radial+glial+cell+generation+in+human+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle orientation predicts outer radial glial cell generation in human neocortex.</a> Nature Communications. 4, 1665 (2013).</li>
<li>Postiglione, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Inscuteable+Induces+Apical-Basal+Spindle+Orientation+to+Facilitate+Intermediate+Progenitor+Generation+in+the+Developing+Neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mouse Inscuteable Induces Apical-Basal Spindle Orientation to Facilitate Intermediate Progenitor Generation in the Developing Neocortex.</a> Neuron. 72, 269-284 (2011).</li>
<li>Silver, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exon+junction+complex+component+Magoh+controls+brain+size+by+regulating+neural+stem+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The exon junction complex component Magoh controls brain size by regulating neural stem cell division.</a> Nat Neurosci. 13, 551-558 (2010).</li>
<li>Pulvers, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+mouse+Aspm+%28abnormal+spindle-like+microcephaly+associated%29+cause+not+only+microcephaly+but+also+major+defects+in+the+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline.</a> Proc Natl Acad Sci USA. , 107-16595 (2010).</li>
<li>Feng, Y., Walsh, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+regulation+by+Nde1+controls+cerebral+cortical+size%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle regulation by Nde1 controls cerebral cortical size.</a> Neuron. 44, 279-293 (2004).</li>
<li>Megraw, T. L., Sharkey, J. T., Nowakowski, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdk5rap2+exposes+the+centrosomal+root+of+microcephaly+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cdk5rap2 exposes the centrosomal root of microcephaly syndromes.</a> Trends Cell Biol. 21, 1-11 (2011).</li>
<li>Bond, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+centrosomal+mechanism+involving+CDK5RAP2+and+CENPJ+controls+brain+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A centrosomal mechanism involving CDK5RAP2 and CENPJ controls brain size.</a> Nat Genet. 37, 353-355 (2005).</li>
<li>Shu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doublecortin-like+kinase+controls+neurogenesis+by+regulating+mitotic+spindles+and+M+phase+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Doublecortin-like kinase controls neurogenesis by regulating mitotic spindles and M phase progression.</a> Neuron. 49, 25-39 (2006).</li>
<li>Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Interactions+between+Intermediate+Neurogenic+Progenitors+and+Radial+Glia+in+Embryonic+Mouse+Neocortex%3A+Potential+Role+in+Dll1-Notch+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dynamic Interactions between Intermediate Neurogenic Progenitors and Radial Glia in Embryonic Mouse Neocortex: Potential Role in Dll1-Notch Signaling.</a> Journal of Neuroscience. 33, 9122-9139 (2013).</li>
<li>Hu, D. J. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+recruitment+to+nuclear+pores+activates+apical+nuclear+migration+and+mitotic+entry+in+brain+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells.</a> Cell. 154, 1300-1313 (2013).</li>
<li>Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Publishing+Group%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nature Publishing Group. 7, 136-144 (2004).</li>
<li>Tyler, W. A., Haydar, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Genetic+Fate+Mapping+Reveals+a+Novel+Route+of+Neocortical+Neurogenesis%2C+Which+Is+Altered+in+the+Ts65Dn+Mouse+Model+of+Down+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Multiplex Genetic Fate Mapping Reveals a Novel Route of Neocortical Neurogenesis, Which Is Altered in the Ts65Dn Mouse Model of Down Syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 33, 5106-5119 (2013).</li>
<li>Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Lapse+Imaging+of+Fluorescently+Labeled+Live+Cells+in+the+Embryonic+Mammalian+Forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Time-Lapse Imaging of Fluorescently Labeled Live Cells in the Embryonic Mammalian Forebrain.</a> CSH Protoc. , (2011).</li>
<li>Elias, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+culture+of+E18+rat+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice culture of E18 rat brains.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).</li>
<li>Shitamukai, A., Konno, D., Matsuzaki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oblique+radial+glial+divisions+in+the+developing+mouse+neocortex+induce+self-renewing+progenitors+outside+the+germinal+zone+that+resemble+primate+outer+subventricular+zone+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Oblique radial glial divisions in the developing mouse neocortex induce self-renewing progenitors outside the germinal zone that resemble primate outer subventricular zone progenitors.</a> Journal of Neuroscience. 31, 3683-3695 (2011).</li>
<li>Hadjantonakis, A. -K., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+in+vivo+imaging+and+cell+tracking+using+a+histone+fluorescent+protein+fusion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Dynamic in vivo imaging and cell tracking using a histone fluorescent protein fusion in mice.</a> BMC Biotechnol. 4, 33 (2004).</li>
<li>Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mouse+line+with+green-fluorescent+protein-labeled+Centrin+2+allows+visualization+of+the+centrosome+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells.</a> Transgenic Res. 13, 155-164 (2004).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240, 237-246 (2001).</li>
<li>Yang, Y. -T., Wang, C. -L., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DOCK7+interacts+with+TACC3+to+regulate+interkinetic+nuclear+migration+and+cortical+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">DOCK7 interacts with TACC3 to regulate interkinetic nuclear migration and cortical neurogenesis.</a> Nat Neurosci. 15, (2012).</li>
<li>Siegenthaler, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+Acid+from+the+meninges+regulates+cortical+neuron+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retinoic Acid from the meninges regulates cortical neuron generation.</a> Cell. 139, 597-609 (2009).</li>
<li>Schenk, J., Wilsch-Bräuninger, M., Calegari, F., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+is+required+for+interkinetic+nuclear+migration+of+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Myosin II is required for interkinetic nuclear migration of neural progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 16487-16492 (2009).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

היתרון העיקרי של הפרוטוקול שתארנו הוא שהיא מספקת פתרון זמני דינמי של מיטוזה של אבות עצביים. בדרך כלל, מבחני לדמיין מיטוזה במוח המתפתח מבוצעים באמצעות immunofluorescence של חלקי רקמות קבועים. אך גישה זו מספקת רק תמונת מצב של מיטוזה בנקודת זמן אחת. ישנם מספר צעדים שהם קריטיים ביותר להדמית מיטוזה בפרוסות מוח: 1) פרוסות המוח צריכה להישאר מחובר לagarose, כדי לשמור על שלמות חלקים במוח בעת העברה וההרכבה. 2) עבור הדור וה...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לתאר כיצד לבצע הדמיה חיה של מיטוזה העצבית בפרוסות מוח עובריים. באמצעות הדמיה חיה של פרוסות מוח בתרבות, פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה לassay היבטים רבים של מיטוזה בתאי אב עצבי בסביבה דומה מאוד להגדרת in vivo. זה יכול להיות מיושם על מוחם של בעלי חיים שעברו מוטציה ו / או מוח שעברו מניפולציה עם electroporation ברחם) 1-5. טכניקה זו היא גם אידיאלית כדי לבחון את ההשפעה של סוכנים תרופתיים במיטוזה &#39;המבשרים עצביים, פשוט על ידי הוספת סוכן למדיום לתרבות. לסיכום, במאמר זה להפוך את פרוטוקול מאתגר מבחינה טכנית נגיש ללומדי נוירוגנזה. במהלך נוירוגנזה, אוכלוסיות עצביות שונות לעבור חטיבות מדויקות כדי לייצר נוירונים שסופו של דבר יתרמו לשש שכבות בקליפת המוח של המבוגרים הניאוקורטקס 6-8. בשלב מוקדם בהתפתחות קליפת המוח, הבריכה העצבית המבשרת מתרחבת כneuroepithelial תאים (NE) לחלק באופן סימטרי לחידוש עצמי. תאי NE לאחר מכן להמיר לתאי גלייה רדיאלי (RGCs). בתחילה RGCs לחלק באופן סימטרי כדי לייצר שתי RGCs החדש, לעומת זאת בחלק הארי של נוירוגנזה, המצב העיקרי &#39;RGCs של החלוקה הוא סימטרי. בחלוקה סימטרית, 1 RGC מוליד RGC חדש וגם נוירון לאחר mitotic, או אב מתמחה יותר (או מבשר קצר עצבי (SNP), גליה חיצונית רדיאלי (ORG), או אב ביניים (INP) 2,3,7,9. INPS, SNPs, וorgs אז ניתן להפיק תאי עצב בתת חדרית, חדרית, ואזורי בסיס של קליפת המוח, בהתאמה. לפיכך, חלוקת תא של אבות הוא תהליך בסיסי ליצירת נוירונים של קליפת מוח. מחקרים רבים מצביעים על קשר בין תכונות ספציפיות mitotic של RGCs וגורלם של תאי בת. חיידר ואח&#39;. ואל טקהאשי et.הראו כי משך המיטוטי RGC ולהגדיל את אורך מחזור התא כתמורת נוירוגנזה, ממצא הדהד במעקב מחקרים 10-13. מספר המחקרים הציעו כי ציר mitotic אורינטציה ביחס לחדר משפיע על היבטי הנוירוגנזה וcorticogenesis, כוללים סוגים של נוירונים שנוצרו ומיקום של צאצאים במוח, בהתאמה 3,10,14-16. האם נטייה מטוס המחשוף משפיעה ישירות על גורל תא הוא שנוי במחלוקת, אבל המסקנה היא שנוירוגנזה משפיע פרמטר המיטוטי זה. יתר על כן מדגישה את החשיבות של מיטוזה היא התצפית כי גנים רבים המעורבים במכניקה של מיטוזה הם קריטיים עבור הנוירוגנזה להתפתחות מוח תקינה 17-20. מיטוזה היא תהליך דינמי, אך עד כה רוב המחקרים המפרטים מיטוזה העצבית לנצל ניתוח של סעיפים קבועים רקמה או הדמיה של אבות עצביים באמצעות תרבית תאים במבחנה. לכן, שיטות הזרם המרכזי כדי להעריך מיטוזה רק לספק תמונת מצב של תהליך זה ולא מצליחים לגלות כיצד תאים להתנהג ברקמות. הדמיה חיה של מיטוזה העצבית הפכה יותר ויותר כלי קריטי להבנת תפקוד עצבי. לדוגמאות ראו אזכור אלה 4,8,10,21-25. כמה פרוטוקולים מצטיינים כבר פורסמו לעריכה ולהדמיה של פרוסות מוח 26,27. עם זאת נכון להיום, פרוטוקול מקיף להדמיה וניתוח של מיטוזה לא תואר ולא הוכיח בוידאו. טכניקה זו מציעה כמה יתרונות משמעותיים על פני ניתוח קבוע של חלקים במוח. ניתוח זמן לשגות של פרוסות המוח מאפשר דור של באופן משמעותי יותר נקודות נתונים שיכולים להיות מנותח באופן גמיש. ראשית, הנתונים שנאספו בנקודות זמן בודדות במהלך כמה דקות או כמה שעות. אפשר לנתח את נקודות זמן בודדות (כדי ליצור מונטאז&#39; סטטית) אוניתן לשלב נקודות זמן שונות לסרטים. שנית, ההדמיה confocal של פרוסות מאפשרת דור של נתונים בסעיפי Z שונים בפרוסות מוח. כתוצאה מכך, ניתן לנתח קטעים בודדים. לחלופין, ערימות של חלקים בודדים ניתן לשלב הקרנת עוצמה מקסימלית. שלישית, ניתוח נעשה בהקשר של רקמה, וחושף כיצד תאים מתחלקים ביחס לתאים ומבנים שכנים. רביעית, הוא אידיאלי לניתוח מוטציות שמראות כמה עדויות של פגמים mitotic. יחד פרוטוקול זה יעזור להבהיר את השלבים קריטיים כדי לסייע לחוקרים המבקשים לבצע הדמיה חיה של מיטוזה העצבית במעבדות שלהם.

<table><tbody><tr>טכנולוגיות <td>100X N2</td><td>Life</td><td>17502048</td><td>למדיום תרבית</td></tr><tr><td>50X B27 ללא ויטמין A</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>12587010</td><td>למדיום</td></tr><tr><td>תרבית DMEM/F12</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>11320033</td><td>למדיום תרבית</td></tr><tr><td>סרום סוסים מומת בחום</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>H1138-500 מ"ל</td><td>למדיום תרבית</td></tr><tr><td>סרום עגל מומת חום</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>F4135-500ML</td><td>לתרבית</td></tr><tr><td>בינונית FGF</td><td>R& D Sytems</td><td>3139-FB-025</td><td>למדיום תרבית</td></tr><tr><td>EGF</td><td></td><td></td><td>למדיום תרבית</td></tr><tr><td>10X HBSS</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>14065-056</td><td>לדיסקציה של העוברים</td></tr><tr><td>Hepes Free Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>מדולל ל-1 M (pH 7.4)</td></tr><tr><td>2.5 M D-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8769</td><td>לדיסקציה של העוברים</td></tr><tr><td>0.9 M NaHCO3</td><td>Life טכנולוגיות</td><td>25080-094</td><td>לנתיחת העוברים</td></tr><tr><td>אגרוז נמס נמוך</td><td>פישר</td><td>BP165-25</td><td>ליצירת פרוסות</td></tr><tr><td>Syto11</td><td>Life technologies</td><td>S7573</td><td>Make 5&micro; l Aliquots</td></tr><tr><td>3 מ"ג/מ"ל קולגן מסוג I</td><td>Life טכנולוגיות</td><td>A1048301</td><td>לתרבית פרוסות</td></tr><tr><td>צלחת תחתית זכוכית</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>לתרבית פרוסות</td></tr><tr><td>צלחות</td><td></td><td></td> פטרי <td>לדיסקציה של העוברים</td></tr><tr><td>מדחום</td><td></td><td></td> דיגיטלי <td>למדידת הטמפרטורה של</td></tr><tr><td>מרית</td><td></td><td></td> האגרוז <td>ל העברת מוחות</td></tr><tr>אלטרנטיבה של<td>מברשת</td><td></td><td></td><td>צבע להעברת מוחות</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000s</td><td>ליצירת פרוסות</td></tr><tr><td>ניתוח מיקרוסקופ</td><td></td><td></td> ניתוח <td>עוברים</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td></td><td></td> הדמיה <td>נדרש מיקרוסקופ קונפוקלי, הוא צריך להיות מצויד בתא דגירה</td></tr></tbody></table>

הדמיה חיה של מיטוזה בcortex עכבר עוברי פיתוח

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

למרות של זמן קצר, מיטוזה היא תהליך רב שלבים מורכב ודינמי בסיסי להתפתחות של איברים, כולל המוח. בפיתוח קליפת המוח, מיטוזה חריגה של אבות עצביים יכולה לגרום למומים בגודל המוח ותפקודו. לפיכך, יש צורך קריטי בכלים להבין את המנגנונים של מיטוזה העצבית. התפתחות קליפת המוח במכרסמים היא מודל יוצא דופן ללימוד התהליך הזה. מיטוזה העצבית נבחנה בדרך כלל בחלקים במוח קבועים. פרוטוקול זה יתאר בפירוט גישה להדמית חיה של מיטוזה בvivo לשעבר פרוסות מוח עובריים. נתאר את השלבים הקריטיים בהליך זה, הכולל: שאיבת מוח, הטבעת מוח, חתך vibratome של פרוסות מוח, מכתים וculturing של פרוסות, וזמן לשגות הדמיה. אז תוכל להפגין ולתאר בפירוט כיצד לבצע ניתוח שלאחר הרכישה של מיטוזה. אנו כוללים fr תוצאות נציגאום assay זה באמצעות הצבע Syto11 החיוני, עכברים הטרנסגניים (היסטון H2B-EGFP וcentrin-EGFP), וelectroporation ברחם (mCherry-α-טובולין). נדון כיצד הליך זה יכול להיות מותאם הכי טוב ואיך זה יכול להיות שונה למחקר של רגולציה הגנטית של מיטוזה. הדמיה חיה של מיטוזה בפרוסות מוח היא גישה גמישה על מנת להעריך את ההשפעה של גיל, אנטומיה, והפרעות גנטיות בסביבה מבוקרת, ולייצר כמות גדולה של נתונים ברזולוציה של זמן ומרחב גבוה. מכאן פרוטוקול זה ישלים כלים קיימים לניתוח של מיטוזה העצבית.

ההצלחה של assay זה וההתבוננות בתאי mitotic המרובים במהלך פגישת הדמיה חיה אחת תלויה במידה רבה על שניהם את השלמות והרמה האנטומי של הפרוסה שבו רכישות נעשות. כפי שנראה להלן, ברמה האנטומי של הפרוסה היא גורם חשוב. איור 3 א מציג rostro-הזנב והמדיאלי לרוחב במקומות בהם יש לנו היו מוצלח ביותר. לדיון נוסף בעניין זה אנא ראה Noctor 26. היושרה של הפרוסה יכולה להשתנות באזורים שונים של הפרוסה. זה יכול להיקבע לפני תחילת הזמן לשגות (באמצעות הדמיה של כל פרוסה כמו בשלב 7.6...

מיטוזה העצבית היא פרמטר קריטי הנוירוגנזה. חלק גדול מההבנה של מיטוזה העצבית שלנו מבוסס על ניתוח של רקמה קבועה. הדמיה בשידור חי בפרוסות מוח עובריים היא טכניקה צדדי כדי להעריך מיטוזה עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה בסביבה מבוקרת.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבצע דימות ואנליזה של מיטוזה של תאי אב עצביים בחתכי מוח חיים של עכברים. הדבר משיג תחילה על ידי נתיחה של מוחות מעוברי עכברים. השלב השני הוא הכנת חתכי מוח באמצעות ויברטום.בשלב הבא, מבוצע דימוי חי של חתכי מוח. השלב האחרון הוא הפקת מידע מסרטונים לצורך ניתוח פרמטרים רלוונטיים של מיטוזה. בסופו של דבר, מיקרוסקופיית time-lapse משמשת להדגמת האופן שבו אוכלוסיות של תאי אב במוח מתחלקות בזמן אמת.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ניתוח של דגימות מקובעות, הוא שניתן להשיג תובנה משמעותית לגבי הדינמיקה הזמנית של חלוקת תאי אב עצביים בחתכי מוח חיים. ניתן להשתמש בה גם כדי להבין כיצד הפרעות גנטיות עשויות להשפיע על חלוקת תאי אב עצביים. אף על פי שאנו משתמשים בשיטה זו כדי להבין את התפתחות קליפת המוח, ניתן להחיל את הניתוח שתיארנו על חקר המיטוזה של תאי גזע באזורי מוח אחרים או אפילו מחוץ למוח.מי שידגים את הפרוצדורה הוא Louis y, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי. התחילו את הפרוצדורה באיסוף עוברי עכברים ובביצוע דיסקציה של המוחות העובריים, כולל המוח האחורי והמוח הקדמי עם שתי ההמיספרות המוחיות. בתוך דלי קרח, צרו חור בקרח עבור תבניות הקיבוע.בשלב הבא, מזגו מצע aros בריכוז 3% לתוך תבנית פלסטיק והניחו את התבנית בתוך החור בקרח. ערבבו את מצע ה-aros בעזרת קצה של מדחום דיגיטלי עד שהטמפרטורה תגיע ל-35 °C. לאחר מכן, העבירו במהירות את המוח אל תוך מצע ההטמעה כדי להסיר שאריות HBSS בממשק שבין המוח ל-aros.סובב את המוח בזהירות ובעדינות באופן חוזר ונשנה בתוך תמיסת ההטמעה. באמצעות הפינצטה, תיווצר כרית של agarose ג'ל בתחתית התבנית במגע עם הקרח. ברגע שניתן להרגיש בכרית בעזרת קצה הפינצטה תוך כדי ערבוב, מקם את המוח כאשר הצד הדורסלי פונה כלפי מעלה; המוח לא צריך לשקוע עד לתחתית התבנית.הניחו לטבעת ה-aros להתקשח בקרח למשך חמש דקות לפחות לפני חיתוך פינות התבנית באמצעות להב תער. גסלו בזהירות בלוק aros מסביב למוח ונסו לצמצם את מספר החתכים כדי למנוע הפרעה למוח המוטמע. בעזרת מכשיר ה-VT 1000 s Viome, הכינו פרוסות בעובי 200 עד 250 micron.כעת יש לדלל את cyto 11 לריכוז סופי של 0.5 עד 1 µM בתוך מצע גידול לפרוסות המועשר בגורמי גדילה. בצלחת 12 בארות, יש להדגיר פרוסות ממוח אחד ב-2.5 mL של תמיסת הצביעה בכל בארה למשך שעה אחת ב-37 °C. לאחר מכן, יש לשטוף את הפרוסות ב-2.5 mL של מצע גידול לפרוסות ללא תמיסת צביעה למשך 20 דקות. כדי לקבע את חתכי המוח, יש להניח טיפה של תמיסת קולגן בתחתית של צלחית מיקרו-באר עם תחתית זכוכית בקוטר 35 mm.פזרו את החומר באמצעות טיפ של פיפט כדי שיתאים לגודל הפרוסה. לאחר מכן, העבירו פרוסה לתוך טיפה של קולגן. דגמו את הפרוסות בדגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לפני העברתן לאינקובטור ב-37 degree Celsius עם 5% carbon dioxide.לאחר 20 דקות, הוסף סך הכל 1.2 milliliters של מצע גידול לפרוסות לתוך צלחת מיקרו-בארים בעלת תחתית זכוכית, בנפחים של 600 microliters בכל פעם, והפץ את הנוזל באמצעות קצה של פיפטה. הנח לפרוסות להתאושש באינקובטור למשך שעה אחת ו-30 דקות לפחות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius וב-5% carbon dioxide לפני העברתן לתא האינקובציה של מיקרוסקופ קונפוקלי עם דיסק מסתובב תחת אותם תנאים. לצורך דימות חי, השתמש בעדשה אובייקטיבית 60 x עם שמן סיליקון, מרחק עבודה של 300 microns ומספר מפתח (numerical aperture) של 1.3.לצורך דימוי תאים, צלם את התאים בערימת Z בעובי 30 מיקרון, כאשר מרכז ערימת ה-Z ממוקם כ-40 מיקרון מתחת לפני השטח של הפרוסה. במידת הצורך, כוונן את הספק הלייזר ואת זמני החשיפה כדי להגביל פוטובליצ'ינג (photobleaching), והשתמש בזמן חשיפה שבין 30 ל-200 מילישניות, בהתאם לעוצמת אות ה-cyto 11. להלן נתונים מייצגים שניתן להשיג מניתוח זה לצורך זיהוי דמויות מיטוטיות ב-ImageJ. לאחר פתיחת מערך הנתונים של מיקום אחד כ-hyperstack, בחר מישור Z אחד שבו הרקמה והתאים נראים בריאים.גללו אחורה בזמן כדי לזהות את נקודת הזמן שבה התא נכנס למטוזה. התא עשוי לנוע בין מישורי Z, אך הרזולוציה הזמנית ופרמטרי ה-Zack שתוארו קודם לכן עברו אופטימיזציה כדי לאפשר תהליך זה. רשמו בגיליון אלקטרוני את ארבעת קואורדינטות ה-D של התא ב-hyper stack בעת כניסתו למטוזה.הכרת קואורדינטות אלה תמנע ספירה חוזרת של אותו תא. גללו קדימה בציר הזמן ורשמו את הזמן שבו התא עובר משלב אחד למשנהו. תיעדו את משך כל שלב במיטוזה עבור תא נתון, כדי לבצע שחזור תלת-ממדי של התאים וכימות של הסיבוב במהלך המטפאזה.לאחר זיהוי מספר תאים במצב מיטוזה, השתמש בקואורדינטות של תא אחד וגלול קדימה בזמן עד לתחילת המטאפזה. סובב את כל ה-hyper stack כך שגבול הפרוזדור (ventricular border) יהיה מישורי יותר. השתמש בכלי הזווית כדי לקבוע את הזווית שיש להחיל עבור סיבוב זה.זהו את מישור Z שבו התא המבוקש נראה בצורה הברורה ביותר. השתמש בכלי בחירת המלבן כדי לצייר בחירה הכוללת את התא כולו. לאחר מכן, זהה את מישורי Z הכוללים את התא המבוקש והשתמש בפקודת שכפול התמונה (image duplicate) כדי ליצור תת-מחסנית (sub stack).בתיבת הדו-שיח, השאירו את הסימון ב-duplicate hyper stack עבור הפרוסות (slices). פרמטר Z מתייחס למישורי Z, כולל התא השלם והמסגרות, ופרמטר T מתייחס לנקודת הזמן הנוכחית. לאחר מכן, צרו שחזור תלת-ממדי (3D reconstruction) של התא.בנקודת הזמן הנוכחית. מרווח הפרוסות תואם למרווח שבין כל אחת מתמונות מישור Z במיקרונים. באמצעות סרגל הגלילה, סובבו את השחזור התלת-ממדי שהתקבל כך שקצה לוח המטאפאזה יהיה גלוי.מספר הפריים תואם לזווית בטא. רשמו מספר זה. לאחר מכן, מדדו את הזווית בין הקו האופקי לבין ה-align bys.חיתוך של לוח המטפאזה בניצב. זוהי רשומת הזווית alpha. זוויות אלו עבור כל נקודות הזמן של המטפאזה בתא הנבדק.זווית הסיבוב בין נקודות הזמן t ו-t מינוס אחת שווה לערך המוחלט של ההפרש בין זווית בנקודה t לזווית זו בנקודה T מינוס אחת לאורך הציר הגבי-בטני. מיטוזה מצולמת בקלות רבה יותר באזורים גביים של חתכי מוח מכיוון שהשלוחה הבזאלית של R GCs קצרה יותר ולכן הסבירות שהיא תיחתך על ידי viome נמוכה יותר. לאורך ציר ROS coddle, חתכים באזורי coddle של קליפת המוח הגבית מספקים את התוצאות העקביות ביותר.אלו הן דוגמאות לאזור טוב ולאזור רע לצורך הדמיה. באזור טוב, הגרעינים הם בעלי צורה אליפטית ותאים מיטוטיים רבים נצפים בגבול החדר לפני ההדמיה בשיטת time-lapse; באזור רע, נצפים תאים מיטוטיים מעטים מאוד בגבול החדר והגרעינים הם עגולים.להלן דוגמה לפרוסה תקינה שנצפתה במיקרוסקופ בהגדלה נמוכה לפני דימוי חי, וכאן מוצגות מספר דוגמאות לתאים המסומנים ב-cyto 11 בשלבים שונים של המיטוזה. מוצג כאן מונטאז' של אזור בגבול החדר (ventricle) שבו שני תאי אב עצביים עוברים את השלבים השונים של המיטוזה, המסומנים בצבעים שונים, בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון אלקטרופורציה ניטרלית של מבני DNA, כדי לענות על שאלות נוספות, כולל מהו גורלם של תאים המתחלקים וכיצד מתנהג השלד התאי?מומלץ להשתמש גם בשיטות משניות מעבר ל-CY 11 למעקב אחר מיטוזה, כגון עכברי H two VGFP טרנסגניים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן המניפולציה של פרוסות מוח, אילו פרמטרי התאמה הם המיטביים, וכיצד לנתח את הנתונים.

live-imaging-of-mitosis-in-the-developing-mouse-embryonic-cortex

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מפתחים את הכלים הדרושים...

Ex vivo הדמיה חיה של חלוקות תא יחיד בNeuroepithelium מאוס

סרטון זה מדגים פרוטוקול לבידוד וטיפוח תאי קליפת המוח הראשוניים מהטלנספלון הדורסולטרלי של עוברי עכברים.

בידוד וגידול תאים מעובר עכבר טלנספלונים דורסולטרליים

Source: Wiegreffe, C., et. al.,  הדמיה קונפוקלית של נוירונים נודדים בתרבית פרוסה אורגנוטיפית של מוח עכבר עוברי באמצעות In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (2017) סרטון זה מדגים מיקרוסקופיה קונפוקלית של זמן-lapse כדי לצפות בנדידה רדיאלית של נוירונים בקליפת המוח מהאזור התת-חדרי לצלחת קליפת המוח באמצעות פיגומי גליה רדיאליים בפרוסות מוח עובריות של עכבר.

הדמיית זמן-lapse של נדידה רדיאלית של נוירונים בקליפת המוח בפרוסות מוח עובריות של עכבר

פרוטוקול זה מתאר כיצד תמונת חלוקת תאים בתוך רקמה בעוברי elegans Caenorhabditis. בעוד כמה פרוטוקולים מתארים כיצד חלוקת תאי תמונה בעובר המוקדם, פרוטוקול זה מתאר כיצד תמונת חלוקת תאים בתוך רקמה מתפתחת במהלך embryogenesis אמצע סוף.

חזותי neuroblast cytokinesis במהלך<em&gt; ג elegans</em&gt; עובר

הדמיה חיה הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור התנהגויות הסלולר בזמן אמת. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור זמן לשגות וידאו-מיקרוסקופיה של קליפת המוח ראשי תאים המאפשרת בדיקה מקיפה של השלבים שחוקקו במהלך ההתקדמות שושלת היוחסין מתאי גזע עצביים העיקרי נוירונים הבדיל, עכשיו, דונלד.

חיים הדמיה של קליפת המוח ראשי תאים באמצעות מערכת תרבות 2D

פרוטוקול זה מתאר שיטה קלה ונוחה כדי לתייג והמחש בשידור חי הכרומוזומים בתאים mitotic באמצעות תווית 2.0 BacMam Histone2B-GFP ומערכת מיקרוסקופיה קונפוקלית דיסק מסתובב.

תא חי הדמיה של הפרדה בין כרומוזום במהלך מיטוזה

כאן, אנו מספקים שיטה נמוכים ואמין כדי ליצור electroporated המוח organotypic פרוסה תרבויות מעוברים עכבר מתאים מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות הדמיה לחיות.

. פשוט תאכל לשעבר אלקטרופורציה ותרבויות פרוסה Organotypic מוח עובריים בעכבר עבור Live-הדמיה של העברת Interneurons GABAergic

אנו מציגים פרוטוקול מפורט לתרבית והדמיית עוברי עכבר המאפשר הדמיה תלת ממדית + זמן של תאי אב לבביים. ערכת כלי וידאו זו מתייחסת למיומנויות המפתח הנדרשות להדמיה חיה מוצלחת שאחרת קשה לרכוש מפרסומים של טקסט בלבד.

הדמיה חיה של אבות לב מוקדמים בעובר העכבר

במהלך התפתחות קליפת המוח, נוירונים ותאי גלייה מקורם באזור החדר המצפה את החדר ונודדים לעבר פני המוח. גנים רבים מעורבים בתהליך זה. פרוטוקול זה מציג את הטכניקה לדימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה.

דימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה בפרוסות מוח עובריות של עכבר

בחומר וידאו משלים זה, אנו מראים פרוטוקול עבור...

הדמיה כרונית של עכבר-Visual Cortex שימוש ההכנה סחוט הגולגולת

למד הדמיה חיה של מיטוזה בתאי גזע עצביים בקורטקס עכבר עוברי פיתוח באמצעות מיקרוסקופיה time-lapse. שיטה זו מאפשרת ניתוח דינמיקת חלוקה תאית בזמן אמת לחקר נוירוגנזה.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

גלה סרטונים נוספים