סינתזה מפוצלת וברכה ואפיון של הספרייה אמידה השלישון פפטיד

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים כיצד לסנתז ספריות קומבינטוריות המכילות פפטיד שלישוני בתוך או יחידות PTA. זה מושג על ידי הכנת תת-מונומר PTA מחומצות אמינו טבעיות. השלב השני הוא לסנתז אזור מקשר פפטיד על תומך מוצק.

לאחר מכן, מסונתזת ספרייה קומבינטורית המכילה יחידות משנה של PTA ופפטידים. השלב האחרון הוא לאפיין את הספרייה המסונתזת כדי להבטיח את איכות הסינתזה. בסופו של דבר, מסונתזת ספרייה קומבינטורית המכילה תת-יחידות PTA מוגבלות לאישור וספרייה כזו יכולה לשמש לבדיקת תפוקה גבוהה כדי לספק ליגנדים חלבונים ולהוביל לגילוי תרופות חדשות.

אז הכימיה שהיא נושא המאמר הזה פותחה בניסיון למצוא מולקולות שהיו הרבה יותר נוקשות מחלק מהפפטידים ודברים אחרים שעבדנו איתם בעבר. הרעיון הוא שאם מזהים ספריות של מולקולות נוקשות יותר והן נקשרות למטרות חלבון עם זיקות הרבה יותר גבוהות, וחשבנו שזה מאוד מאוד חשוב בניסיון לפתח תרופות קדימה או אפילו מולקולות בדיקה מעניינות. הדגמה ויזואלית של סינתזת תת-סדר PTA זו היא ממש קריטית מכיוון שקשה ללמוד את הסינתזה מכיוון שהטמפרטורה ובקרת התזמון הם באמת קריטיים לסינתזה מוצלחת.

ראשית, הוסיפו 8.9 גרם סוחה ו-11.9 גרם אשלגן ברומיד לבקבוק תחתון עגול של 500 מיליליטר עם שלושה צווארים עם מוט ערבוב מגנטי. לאחר מכן הוסף לבקבוק 100 מיליליטר של תמיסת מימן ברומיד 30% שהוכנה בעבר. לאחר הנחת הבקבוק בטמפרטורה שלילית של 10 מעלות צלזיוס אתילן גליקול, יבש ארגון בועות אמבט קרח דרך מחט ארוכה מתחתית הבקבוק למשך 10 דקות.

ערבב את התמיסה עם מוט הערבוב המגנטי ב -300 סל"ד. לאחר מכן, הוסף תמיסת נתרן ניטריט שהוכנה בעבר למשפך נפילה משווה לחץ המחובר לשלושת הצווארים, בקבוק תחתון עגול ואטום אותו במחיצה. פתח לאט את השסתום של משפך הנפילה, ואפשר לתמיסת הנתרן ניטריט לטפטף לתוך הבקבוק.

שלוט בשסתום כדי לכוונן את קצב הטפטוף לכשתי טיפות לשנייה. לאחר השלמת תוספת הנתרן ניטריט, המשיכו לערבב את התמיסה במשך שלוש שעות נוספות, ואפשרו לטמפרטורה להתחמם מ-10 מעלות צלזיוס שליליות לטמפרטורת החדר. אם צבע התמיסה כהה מדי, יש למרוח ואקום כדי להסיר את עודפי תחמוצות החנקן והברום האפשרי שנוצר במהלך התגובה.

לאחר העברת התמיסה למשפך מיצוי, חלץ את המוצר שלוש פעמים עם 35 מיליליטר אתר דתיל. לאחר שילוב השלב האורגני ושטיפה במי מלח רוויים, אוספים אותו לבקבוק ומייבשים מעל נתרן גופרתי למשך שש שעות. לאחר סינון הנתרן הגופרתי, אידוי הממס בוואקום כדי להפיק שמן צלול עד צהוב בהיר.

טהר את המוצר הגולמי על ידי כרומטוגרפיה של עמודת סיליקה ג'ל עם שלושה עד אחד הקסאן אתיל אצטט לתיוג איזוטופי ממיסים 300 מיליגרם של L אלנין עם 10 מיליליטר מים מפוזרים בצינור פוליאתילן של 50 מיליליטר. לאחר הוספת 10 מיליגרם של אלפא קטוגלוטראט כמצע קוס, יש לחמם את הצינור ל -37 מעלות צלזיוס. בסיום, התאם את ה-pH ל-8.5 עד 8.7 באמצעות תמיסת תחמוצת נתרן מולרית אחת ורצועות בדיקת pH.

לאחר מכן, הוסף לתמיסה 0.1 מיליגרם אלנין טרנסאמינאז. הנח את הצינור באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס והדגירה למשך הלילה עם טלטול קל ב-10 עד 30 סל"ד. בשלב זה, יש להתנפח גרם אחד של 90 מיקרון, 10 לחרוזי ג'ל עם מקשר ראם ב-10 מיליליטר של דימתילפורממיד למשך שלוש שעות בכור מזרק של 12 מיליליטר עם טלטול קל, לנקז את הדימתילפורממיד מהכור ולהוסיף 10 מיליליטר של תמיסת פרין דימתילפורממיד 20% pi כדי להגן על קבוצת ה-FOC מפני משטח ההחלקה בין המקשר.

לאחר ניעור החרוזים בתמיסת 20% פפרדין למשך 30 דקות, שטפו אותם חמש פעמים עם בשר דימתיל פורמה כדי להסיר את כל הפפרדין. לאחר מכן, הסר כמה חרוזים מהמזרק ובדוק אותם בבדיקת כלורל. מוסיפים לחרוזים שני מיליליטר של תמיסת דימתילפורממיד חומצה אצטית שתי טוחנות ומנערים בעדינות.

לאחר מכן הוסף לחרוזים שני מיליליטר של תמיסת דיופ פרופיל קרבו דיאמין דימתילפורממיד עם שתי טוחנות. לאחר איטום המזרק בבוכנה, יש לנער את החרוזים על שייקר למשך 10 דקות. לאחר שהחרוזים נשטפו היטב עם דימתילפורממיד, הוסיפו להם שני מיליליטר של תמיסת מתוקסי אתיל דימתילפורממיד שהוכנה בעבר.

לאחר ניעור החרוזים ושטיפתם חמש פעמים עם דימתילפורממיד, בדוק כמה מהחרוזים בבדיקת כלורל. לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר של תמיסת די-כלורל מתאן דימתילפורממיד אחד לאחד למזרק ששימש בעבר. חלקו את כל חרוזי הגרם באופן שווה לשלושה כורי מזרק של חמישה מיליליטר באמצעות פיפטה של 1000 מיקרוליטר עם קצה פיפטה קטום.

לאחר שטיפת שלושת המזרקים שלוש פעמים עם כלורו מתאן, שטפו את המזרקים המסומנים r ו-s שלוש פעמים עם tet hydrofurin נטול מים, ואת המזרק המסומן B שלוש פעמים עם dimethylformamide. לצימוד טריסטין של חומצת NOIC ברומו פרופן, הוסף כ-200 מיליגרם של טריסטין לבקבוקון במכסה אדים. לאחר שהבקבוקון נסגר, שקלו את כמות הטריסטין בבקבוקון.

לאחר מכן הוסף את הכמות המתאימה של טטרה הידרו פראן נטול מים לבקבוקון כדי ליצור תמיסת טרי פוסגן טטרה הידרו פראן של 20 מיליגרם למיליליטר. להכנת תערובת חומצות הברומו תלת-פוסגן, הוסיפו 89 מיקרוליטר של R שני חומצה NOIC של ברומו פרופן ו-S שני חומצה NOIC של ברומו פרופן D ארבעה בשני בקבוקונים קטנים בנפרד לכל בקבוקון, הוסיפו חמישה מיליליטר של תמיסת טריסטין טטרה הידרו פוראן. לאחר איטום הבקבוקונים, הכניסו אותם למקפיא שלילי של 20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

בינתיים, הוסף 1,125 מיקרוליטר של תמיסת איזופרופיל אמין של שניים לאחד טטרה הידרו פוראן די איזופרופיל אמין למזרק r ו-s. בנפרד, הוסף 356 מיקרוליטר של 2 4 6 טרימתיל פורין לכל אחד מהבקבוקונים המכילים את תערובות הפוסגן של חומצות הברומו המקוררות המניבות משקעים לבנים. מרחו מיד את ההשעיה המתאימה ישירות על החרוזים המאוגדים, ולאחר מכן הניחו אותם על שייקר לנער מתחת ל -120 סל"ד למשך שעתיים.

לצימוד חומצה אצטית ברומו עם די איזופרופיל קרבו דיאמין, הוסף חמישה מיליליטר של תמיסת חומצה אצטית ברומו שתי טוחנות דימתילפורממיד למזרק B.לאחר הטלטול, הוסף חמישה מיליליטר של תמיסת דימתילפורממיד די פרופיל קרבו דיאמין שתי טוחנות לאותו מזרק ונער בעדינות בעקבות מזרק המקום הזה B על אותו שייקר כמו מזרק r ו-s. לאחר מכן יש לנער את המזרקים למשך שעתיים לאחר שטיפה יסודית של המזרקים עם די כלורו מתאן ודימתילפורממיד. אסוף את כל החרוזים ממזרקים R, s ו- B לכור מזרק אחד של 12 מיליליטר.

לאחר שהחרוזים נשטפו חמש פעמים עם דימתילפורממיד, הוסיפו 10 מיליליטר של תמיסת דיכלורו מתאן דימתילפורממיד אחד לאחד למזרק. חלקו את כל החרוזים באופן שווה לשבעה מזרקים בודדים של שני מיליליטר בעזרת פיפטה של 1000 מיקרוליטר עם קצה פיפטה קטום לפליטה, הוסיפו חמישה מיליליטר של שבעה תמיסות אמין מולארי שהוכנו בעבר למזרק המתאים. דגרו את כל שבעת המזרקים באינקובטור של 60 מעלות צלזיוס עם ניעור למשך הלילה לאחר הדגירה.

שוטפים את החרוזים שצריך לחתוך חמש פעמים עם די כלורל מתאן. לאחר ניעור החרוזים 15 דקות ושטיפתם שוב עם די כלורו מתאן, מסננים את הדי כלורו מתאן מהמזרק. לאחר מכן העבירו כל חרוז בודד לצלחת של 96 בארות.

בעזרת מיקרוסקופ אור ופיפטה עם קצה קטום, מכסים את צלחת 96 הבאר בתלוש כיסוי ומניחים אותה במקפיא שלילי של 20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר הוצאת הצלחת מהמקפיא, הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסת כלורו מתאן TFA DI מקוררת שהוכנה בעבר לכל אחת מהבארות המכילה חרוז. החזר את החלקת הכיסוי והנח את לוחית הקיר 96 על שייקר בחזרה במקפיא שלילי של 20 מעלות צלזיוס.

לאחר ניעור של 20 דקות, הוציאו את צלחת הקיר 96 מהמקפיא וקילפו את החלקה של הכיסוי. יבש את הדי כלורו מתאן מכל באר על ידי ניפוח אוויר מעליו. כאשר מבקעים אותו בטמפרטורת החדר באמצעות תמיסת מתאן 50% TFA DI CHLORO, נצפית השפלה משמעותית.

פסגות 593 ו-484 תואמות את המקשר ואת טרימר ה-PTA בהתאמה, מה שמראה שהמולקולה כולה סונתזה בהצלחה על חרוז אך התדרדרה במהלך המחשוף. כאשר מבקעים בתנאי טמפרטורה נמוכה כמתואר לעיל, כמות ההשפלה הנגרמת על ידי TFA מדוכאת מאוד. מנגנון המחשוף תואר בספרות קודמת ומאמינים שהוא עובר דרך מולקולות PTA ביניים של אולאין ניתן לרצף על ידי Ms.MS, ודפוס הפיצול דומה לפפטידים ופפטידים.

מולקולות PTA המסונתזות עם S שתי חומצות פרופול ברומו D ארבע בדרך כלל נותנות שיאים רחבים יותר ב-MS ו-MSM. Ms.Spectra בשל נוכחותם של מוצרים בעלי משך זמן לא שלם כגון S שני ברומו פרופן, חומצה NOIC D שלוש, זה יכול לשמש כאינדיקציה לנוכחות המרכז הכיראלי R במהלך הליך הריצוף, מולקולות PTA נוטות גם ליצור אדוקט יותר מאשר פפטיד פפטיד. לכן עדיפים מים דלי נתרן ומכשירי פלסטיק.

תוצר לוואי פוטנציאלי נוסף הוא האקרילאמיד שנוצר מסילוק הברום במהלך אמינציה. לאחר היווצרות האקרילאמיד, הרצף מסתיים. ניתן לפתור זאת על ידי הורדת ריכוז האמין הראשוני לטוחנת אחת על מנת להפחית את התמיסה.

Basicity לאחר שליטה בספרייה בגודל טוב, ניתן להכין אותה תוך יומיים אם היא מבוצעת כראוי. כעת, לאחר שהכימיה הזו פותחה במלואה והסינתזה יעילה למדי, אני מקווה שחוקרים אחרים יאמצו את הטכנולוגיה רבת העוצמה הזו כדי ליצור חיקוי פפטידים מוגבל קונפורמציה לפיתוח תרופות ופיתוח בדיקות.