סינתזה מפוצלת וברכה ואפיון של הספרייה אמידה השלישון פפטיד

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים כיצד לסנתז ספריות קומבינטוריות המכילות יחידות peptide tertiary amid או PTA. הדבר מושג תחילה על ידי הכנת סב-מונומר PTA מחומצות אמינו טבעיות. השלב השני הוא סינתזה של אזור מקשר (linker) פפטידי על תומך מוצק.

בשלב הבא, מסנתזים ספרייה קומבינטורית המכילה תתי-יחידות של PTA ופפטידים. השלב הסופי הוא אפיון הספרייה המסנתזת כדי להבטיח את איכות הסינתזה. בסופו של דבר, מסנתזים ספרייה קומבינטורית המכילה תתי-יחידות PTA עם הגבלה קונפורמציונלית, וניתן להשתמש בספרייה כזו לסריקה בסביבה של תפוקה גבוהה (high throughput screening) כדי לספק ליגנדים חלבוניים ולהוביל לגילוי תרופות חדשות.

הכימיה המהווה את נושא מאמר זה פותחה בניסיון למצוא מולקולות שיהיו קשיחות הרבה יותר מכמה מהפפטידים וממרכיבים אחרים שעמם עבדנו בעבר. הרעיון הוא שאם נזהה ספריות של מולקולות קשיחות יותר, הן יקשרו למטרות חלבוניות בעקביות (affinities) גבוהות הרבה יותר, והסכנו שדבר זה חשוב מאוד בניסיון לפתח תרופות בעתיד, או אפילו מולקולות גשש (probe molecules) מעניינות. הדגמה חזותית של סינתזת ה-PTA suborder היא קריטית, מכיוון שהסינתזה קשה ללמידה והשליטה בטמפרטורה ובתזמון הן קריטיים להצלחת הסינתזה.

ראשית, הוסף 8.9 גרם של dine ו-11.9 גרם של potassium bromide לבקבוק תחתית עגולה בעל שלושה צווארים בנפח 500 מיליליטר עם מקל ערבוב מגנטי. לאחר מכן, הוסף לבקבוק 100 מיליליטר של תמיסת hydrogen bromide 30% שהוכנה מראש. לאחר הנחת הבקבוק באמבט של ethylene glycol וקרח יבש בטמפרטורה של 10- מעלות צלזיוס, העבר בועות של argon דרך מחט ארוכה מהתחתית של הבקבוק למשך 10 דקות.

ערבבו את התמיסה בעזרת מקל ערבוב מגנטי במהירות של 300 RPM. לאחר מכן, הוסיפו תמיסת סודיום ניטריט שהוכנה מראש למשפך טפטוף בעל השוואת לחצים המחובר לבקבוק עגול בעל שלושה פיות, ואטמו אותו באמצעות ספטום. פתחו לאט את שסתום משפך הטפטוף, כך שתמיסת הסודיום ניטריט תטפטף אל תוך הבקבוק.

שלוטו בשסתום כדי לכוונן את קצב הטפטוף לכ-שתי טיפות לשנייה. לאחר השלמת הוספת הנתרנית (sodium nitrite), המשיכו לערבב את התמיסה במשך שלוש שעות נוספות, תוך מתן אפשרות לטמפרטורה לעלות מ-10- °C לטמפרטורת החדר. אם צבע התמיסה כהה מדי, השתמשו בוואקום כדי להסיר תחמוצות חנקן עודפות וברום אפשרי שנוצרו במהלך התגובה.

לאחר העברת התמיסה למשפך הפרדה, בצעו מיצוי של המוצר שלוש פעמים באמצעות 35 milliliters של dathyl ether. לאחר איחוד הפאזה האורגנית ושטיפה בתמיסת מלח רוויה, אספו אותה לבקבוק וייבשו בעזרת sodium sulfate למשך שש שעות. לאחר סינון ה-sodium sulfate, האדו את הממס תחת ואקום לקבלת שמן שקוף עד צהוב בהיר.

טהרו את המוצר הגולמי באמצעות כרומטוגרפיית עמודה של סיליקה ג'ל עם תערובת של hexane ethyl acetate ביחס של שלושה לאחד. עבור סימון איזוטופי, המססו 300 milligrams של L alanine ב-10 milliliters של מים דויטריים בתוך מבחנה מפוליאתילן בנפח של 50 milliliters. לאחר הוספת 10 milligrams של alpha ketoglutarate כתסבסב נוסף (cosubstrate), חממו את המבחנה ל-37 °C. בסיום, כוון את ה-pH לערך שבין 8.5 ל-8.7 באמצעות תמיסת sodium dute oxide בריכוז של 1 molar וסרטי בדיקת pH.

בשלב הבא, הוסיפו 0.1 milligrams של alanine transaminase לתמיסה. הניחו את המבחנה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C והדגירו למשך לילה עם ניעור עדין ב-10 עד 30 RPM. בנקודה זו, נפחו גרם אחד של חרוזי ג'ל בנפח 10 µm ובגודל 90 micron עם Ram linker ב-10 milliliters של dimethylformamide למשך שלוש שעות בריאקטור מזרק של 12 milliliters עם ניעור עדין, רוקנו את ה-dimethylformamide מהריאקטור והוסיפו 10 milliliters של תמיסת 20%pi Perine dimethylformamide כדי להסיר את הגנת קבוצת ה-FOC מה-rink amid linker.

לאחר ניעור החרוצים עם תמיסת Pepperdine בריכוז 20% למשך 30 דקות, שטפו אותם חמש פעמים עם dimethyl forma meat כדי להסיר את כל ה-Pepperdine. לאחר מכן, הוציאו מספר חרוצים מהמזרק ובדקו אותם באמצעות בדיקת chloral. הוסיפו לחרוצים 2 mL של תמיסת ברומו חומצה אצטית ב-dimethylformamide בריכוז 2 M ונערו בעדינות.

לאחר מכן, הוסיפו לחרוצים שני מיליליטר של תמיסת diop propyl carbo diamine בריכוז two molar ב-dimethylformamide. לאחר איטום המזרק באמצעות בוכנה, נערנו את החרוצים על מנער למשך 10 דקות. לאחר שטיפה יסודית של החרוצים ב-dimethylformamide, הוסיפו אליהם שני מיליליטר של תמיסת methoxy ethyl בריכוז one molar ב-dimethylformamide שהוכנה מראש.

לאחר ניעור החרוצים ושטיפתם חמש פעמים עם dimethylformamide, בדקו מספר חרוצים באמצעות בדיקת chloral. לאחר מכן, הוסיפו 10 milliliters של תמיסת dichloromethane ו-dimethylformamide ביחס של אחד לאחד למזרק ששימש קודם לכן. חלקו את כל גרם החרוצים באופן שווה לשלושה ריאקטורים של מזרקים בנפח של 5 milliliters, באמצעות פיפטה של 1000 microliter עם קצה פיפטה קטום.

לאחר שטיפת שלוש המזרקים שלוש פעמים עם chloro methane, שטפו את המזרקים המסומנים ב-r ו-s שלוש פעמים עם anhydrous tet hydro furin, ואת המזרק המסומן ב-B שלוש פעמים עם dimethylformamide. לצורך צימוד tristine של bromo propan NOIC acid, הוסיפו כ-200 milligrams של tristine לבקבוק בתוך מ 빠르게 תחת מCהוד. לאחר סגירת הבקבוק, שקלו את כמות ה-tristine בבקבוק.

לאחר מכן, הוסיפו את הכמות המתאימה של tetra hydro ferran ללא מים למבחנה כדי להכין תמיסת Tri phosgene tetra hydro ferran בריכוז של 20 mg/mL. כדי להכין את תערובת ה-bromo acids tri phosgene, הוסיפו 89 µL של R two Bromo propan NOIC acid ו-S two Bromo propan NOIC acid D four לשתי מבחנות קטנות בנפרד; לכל מבחנה, הוסיפו 5 mL של תמיסת tristine tetra hydro furan. לאחר איטום המבחנות, הניחו אותן במקפיא בטמפרטורה של 20°C- למשך 20 דקות.

בינתיים, הוסיפו 1,125 µL של תמיסת tetrahydrofuran diisopropylamine ביחס של שניים לאחד למזרקים r ו-s. בנפרד, הוסיפו 356 µL של 2,4,6-trimethylpurine לכל אחד מהמבחנות המכילות את תערובות ה-bromo acids phosgene המקוררות, מה שיוביל להיווצרות משקעים לבנים. העבירו מיד את התסמין המתאים ישירות לחרוזים המופעלים, ולאחר מכן הניחו אותם על שייקר לנערה במהירות של 120 RPM למשך שעתיים.

עבור צימוד של bromo acetic acid עם di isopropyl carbo diamine, הוסף חמישה מיליליטר של תמיסת bromo acetic acid בריכוז two molar ב-dimethylformamide למזרק B. לאחר ניעור, הוסף חמישה מיליליטר של תמיסת di propyl carbo diamine בריכוז two molar ב-dimethylformamide לאותו מזרק ונעור בעדינות, ולאחר מכן הנח את מזרק B על אותו מנער שבו נמצאים מזרקים r ו-s. לאחר מכן, נעור את המזרקים במשך שעתיים לאחר שטיפה יסודית של המזרקים ב-di chloro methane וב-dimethylformamide. העבר את כל החרו지를 ממזרקים R, s ו-B לתוך ריאקטור מזרק אחד בנפח 12 מיליליטר.

לאחר שטיפת החרוצים חמש פעמים ב-dimethylformamide, הוסיפו למזרק 10 milliliters של תמיסת di chloro methane dimethylformamide ביחס של אחד לאחד. חלקו את כל החרוצים באופן שווה לשבעה מזרקים נפרדים של שני milliliter באמצעות פיפט של 1000 microliter עם קצה מקוצר להוצאה; הוסיפו חמישה milliliters מתוך שבעה תמיסות amine בריכוז שני molar שהוכנו מראש למזרק המתאים. לאחר הדגירה, דגרו את שבעת המזרקים באינקובטור בטמפרטורה של 60 degree Celsius עם ניעור למשך הלילה.

שטפו את החרו지를 שדורשים ניתוק (cleavage) חמש פעמים עם di chloral methane. לאחר ניעור של החרוזים למשך 15 דקות ושטיפתם שוב עם di chloro methane, רוקנו את ה-di chloro methane מהמזרק. לאחר מכן, העבירו כל חרוז בנפרד לתוך פלטת 96 בארות.

בעזרת מיקרוסקופ אור ופיפט עם קצה קטום, כסו את פלטת 96 הבארות בזכוכית כיסוי והניחו אותה במקפיא בטמפרטורה של 20°C- למשך 15 דקות. לאחר הוצאת הפלטה מהמקפיא, הוסיפו לכל באר המכילה חרוז 20 µL של תמיסת TFA ו-DI chloro methane בקצב של 1:1 שהוכנה מראש וקוררה. החזירו את זכוכית הכיסוי והניחו את פלטת 96 הבארות על שייקר בתוך המקפיא בטמפרטורה של 20°C-.

לאחר ניעור למשך 20 דקות, הוצא את פלטת ה-96 בעלת הדפנות מהמקפיא והסר את כיסוי ההסלקה. ייבש את ה-di chloro methane מכל באער על ידי נשיפת אוויר עליהם. כאשר מתבצע ניתוק בטמפרטורת החדר באמצעות תמיסת 50% TFA DI CHLORO methane, נצפית דגרדציה משמעותית.

שיאים 593 ו-484 תואמים למקשר (linker) ולטרימר של ה-PTA בהתאמה, מה שמעיד על כך שהמולקולה כולה סונתזה בהצלחה על חרוז אך התפרקה במהלך השחרור (cleavage). כאשר השחרור מבוצע בתנאי טמפרטורה נמוכה כפי שמתואר לעיל, כמות הפירוק המושרה על ידי TFA מופחתת באופן משמעותי. מנגנון השחרור תואר בספרות קודמת והוא נחשב ככזה העובר דרך תו 중간 של olaine; ניתן לבצע ריצוף של מולקולות PTA באמצעות Ms.MS, ותבנית הפרגמנטציה דומה לזו של פפטידים ופפטידים.

מולקולות PTA שסונתזו עם S two bromo propole acid D four נותנות בדרך כלל פיקים רחבים יותר ב-MS וב-msm. ספקטרא של MS נובעים מנוכחותם של תוצרי Duration חלקיים כגון S two bromo propan, NOIC acid D three, דבר זה יכול לשמש כאינדיקציה לנוכחות של מרכז R Chiral במהלך הליך הריצוף. מולקולות PTA נוטות גם להוות adducts יותר מאשר פפטידים. לכן, עדיף להשתמש במים עם תכולת נתרן נמוכה ובכלים מפלסטיק.

תוצר לוואי פוטנציאלי נוסף הוא האקרילאמיד הנוצר כתוצאה מאלימינציית ברום במהלך האמינציה. ברגע שהאקרילאמיד נוצר, הרצף מסתיים. ניתן לפתור זאת על ידי הורדת ריכוז האמין הראשוני ל-1 molar כדי להפחית את תמיסת התגובה.

ברגע ששולטים בבסיסיות, ניתן להכין ספרייה בגודל נאות בתוך יומיים אם הפרוטוקול מבוצע כראוי. כעת, לאחר שכימיה זו פותחה במלואה והסינתזה יעילה למדי, אני מקווה שחוקרים אחרים יאמצו טכנולוגיה עוצמתית זו ליצירת ממטיקי פפטידים בעלי הגבלה קונפורמציונית לצורך פיתוח תרופות ופיתוח גששים.