חשמל Cell-מצע עכבת חישה לכימות של האנדותל למניעת הפצת נשק, תפקוד מחסום, ותנועתיות

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשתמש בחישת עכבת מצע של תאים חשמליים המכונה eis כדי לאפיין התנהגויות תאיות. זה מושג על ידי גידול תאים על אלקטרודות במערך וביצוע מדידות במצבים שונים כדי לכמת את היווצרות מחסום האנדותל, התבגרות ומניפולציות תפקוד כגון פציעה חשמלית והוספת ממריצים נעשות לאחר מכן כדי לבדוק את תנועתיות התאים ותפקוד המחסום. מתקבלות תוצאות המתארות התקשרות תאים, התפשטות, נדידה, זיהוי חדירות אנדותל והערכה של מגעים בין תאים, תאים ומצע תאים על סמך esis.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגי של התא, כגון מתן הפקה מקוונת של נתונים כמותיים, אפיון תאים במצב המפגש הטבעי שלהם בתנאי תרבית התאים הסטנדרטיים שלהם. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו מתקשים מכיוון שהתיאוריה הבסיסית נראית מורכבת ואתה צריך להיות מודע למספר שיקולים בסיסיים לפני שאתה מתחיל בניסוי. כדי להתחיל, יש לנקות ולייצב את המערכים כדי למנוע סחיפה של אלקטרודות, לשפר את יכולת השחזור ולהגדיל את יחס עוצמת האות.

לכן, הוסף 200 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי EL ine לכל באר של מערך שמונה בארות לאחר 15 דקות בטמפרטורת החדר, הסר את ציסטין EL עם שתי שטיפות מים טהורות במיוחד, לא מאגרי פוספט. כמו כן, אל תחשוף את האלקטרודות לתמיסות המכילות סרום לפני הציפוי מכיוון שהן עלולות להפריע לספיגת החלבון. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטר ג'לטין מחומם 1% לכל באר ודגרו על המערך למשך חצי שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס.

כדי להסיר את הג'לטין, השתמש במים טהורים במיוחד ואל תאפשר למשטחי האלקטרודה להתייבש. לאחר מכן מלאו את הבארות ב -400 מיקרוליטר של מדיום תרבית שלם, שיכול להכיל כעת סרום. טען את המערך לתוך המחזיק.

בדוק את תשעת ריבועי הזהב. עליהם ליצור קשר עם סיכות POGO. אבטח בזהירות את המערך במקומו ביד, והדק את בורג הכוונון במחשב.

פתח את תוכנת המדידה. לחץ על הגדרה ולאחר מכן בדוק תחת הקטע איסוף נתונים כדי לבצע מדידת עכבה מהירה של כל באר בתדר ברירת המחדל של 4,000 הרץ. הערכים יאוחסנו במקטע ההערות.

ודא שהבדיקה בחרה במדויק את סוג מערך ה-EISs בשימוש תחת סעיף תצורת הבאר בתרשים המערך. אדום וירוק מציינים את הפונקציונליות של החיבורים. אם הניקוי והקידוד היו מוצלחים, שמונה מערכי W אחד E sys צריכים לרשום כחמישה עד שישה מערכי NANOFARAD ושמונה מערכי W 10 E.

התנגדות בסיסית של 50 עד 60 ננו-פאראד לפני זריעת התאים היא אפוא כ-2000 אוהם. כדי לדגמן את הנתונים באמצעות RB אלפא וס"מ, התחל הקלטת MFT עם המערך הבינוני שנכשל. קח 15 דקות של נתונים ללא תאים וסיים את הניסוי כדי להוסיף את התאים.

כעת הסר את המערך וזרע 400 מיקרוליטר של תרחיף תא בודד לכל באר. כדי לחקור זרעי גידול תאים, 10,000 תאים לסנטימטר רבוע כדי להתחיל עם זרע אוכלוסייה כמעט משולב, 60,000 תאים לסנטימטר מרובע. לאחר טעינת המערך למחזיק, תחת סעיף תצורת הבאר, בחר את הבארות למדידה.

לאחר מכן עבור לאפשרויות איסוף הנתונים ובחר מצב מדידה עבור סדרת זמן בתדר קבוע בחר SFT, ובחר את תדר המדידה למדידת כיסוי האלקטרודות ודגם RB ואלפא בחר MFT והמכשיר יבצע מדידות אוטומטית בכל התדרים הזמינים. הפעל את המדידה במצב רב תדרים במידת האפשר. זה דורש נתונים בכל התדרים הזמינים ובכך מספק את מירב התובנות.

לניתוח מיקרו תנועה, בחר RTC והתאם את תדירות הדגימה. הרזולוציה הזמנית הסטנדרטית היא הרץ אחד, אך ניתן להגדיל אותה כדי לעקוב אחר שינויים מהירים בעכבה. ניתן להגדיל את הערך ל-25 הרץ עבור ה-z תטה.

כדי למדוד מיקרו תנועה ברצף מבארות רבות, בחר בתפריט העזרה. לאחר מכן בחר הצג פריטי תפריט סרגל כלים מומחה ורכוש RTC מרובה בארות. בסעיף איסוף נתונים, הקפד לציין את מגבלת הזמן בשעות.

בעת שימוש בהגדרה זו, התוכנה תבקש את מספר המחזורים לאחר תחילת רכישת הנתונים. בעת איסוף נתונים באמצעות SFT או MFT, בחר את מרווח הזמן בין המדידות שצוין בשניות. לרכישת נתונים מרבית, השאר אפשרות זו לא מסומנת.

כעת לחץ על התחל וציין היכן יש לאחסן את הנתונים. הריצה נעצרת על ידי לחיצה על סיום. על ידי לחיצה על השהיה, איסוף הנתונים ייפסק, אך שעון הניסוי ימשיך לפעול.

כעת הסר את המערך ומתחת למכסה המנוע הלמינר, תפעל את הבארות. לאחר החזרת המערך למחזיק, לחץ על בדוק חיבור כדי לאמת חיבורים חשמליים ולאחר מכן המשך את הניסוי כדי להמשיך באיסוף הנתונים. אם התאים אינם צריכים להיות סטריליים לאחר מניפולציה, ניתן להוסיף גירוי כמו טרומבין ישירות לבאר במהלך רכישת הנתונים.

ניתן לסמן וריאציות כאלה בשעון הניסוי על ידי לחיצה על סימון והוספת הערה. אפשרות נוספת היא לפצוע חשמלי את התאים. ההגדרות לכך זקוקות לכוונון מסוים כדי להגיע לזמן פציעה קצר וזה לא יעיל יותר מדי זמן, ואתה יכול לפגוע באלקטרודות.

פשוט התחל עם הגדרות ברירת המחדל שהתוכנה מספקת והמשך משם. עבור לסעיף הגדרת מצעד האלקטרו של הפצע ואפשר פצע. כעת בחר את הבארות להתפתל בתצורת באר.

רק הבארות שנבדקו ייפצעו. לחיצה על הפעלה מעלה חלון מוקפץ כדי לבקש פציעה. לאחר הפציעה, בדוק שהאות יורד לערך של אלקטרודה כמעט נטולת תאים.

אם זה לא חזר על הפציעה באופן כללי כדי לעבוד עם הנתונים, השתמש באפשרות ייצוא נתונים ובחר ל- Excel. עם זאת, ניתן לבצע מודלים של RB ואלפא מתוך התוכנה. מנתוני MFT, זכור כי מידול תקף רק בשכבות תאי מפגש.

ואל תשכח להוסיף את ההפניה נטולת התאים. התחל בבחירה אוטומטית של הפניה נטולת תאים באמצעות פונקציית החיפוש תחת סעיף מידול וניתוח סריקת תדרים. קבל את הערך עם set.

לאחר מכן לחץ על הדגם כדי להתחיל בחישובים. אל תיבהל אם זה לוקח כמה דקות. במהלך ניסוי טיפוסי, תאים עוברים משלב גדילה לשלב מישור.

כאשר הם מגיעים למפגש, התמונות נרכשות ישירות מהאלקטרודה במהלך תהליך זה. השלב הבא הוא היווצרות והבשלה של מחסום ה-EC. לאחר מכן משתמשים בפציעה חשמלית לחקר נדידת תאים.

ירידה אופיינית של האות לקו הבסיס מלווה בהקמה מחדש של מצב המפגש. לבסוף, התגובה לגירויים מתבצעת בזמן אמת. כאן הוחל תרומבין של חומר כלי הדם.

זה גרם להתכווצות תאית ובכך לפתיחה חולפת של מרווחים קטנים במחסום, מה שגרם לירידה בהתנגדות העכבה ומדידות הקיבול מניבות מידע משלים על הידבקות התאים והתנגדות הצמיחה במדידה הרגישה ביותר. התדר מייצג את האיכות והתפקוד של מחסום התא ולוקח בחשבון את ההתנגדות לזרימת זרם פרא-תאית וטרנס-תאית. כאשר תאים מתחברים לאלקטרודות, הם מגבילים את זרימת הזרם והקיבול יורד באופן פרופורציונלי.

שלב זה מספק מדידה כוללת של כיסוי האלקטרודות והוא מכומת בצורה הטובה ביותר בעת רישום קיבול בתדר גבוה מ-40 קילו-הרץ. עמידות נותנת מושג ברור כיצד תאים טובים יכולים לחסום את זרימת הזרם ומכאן את איכות מחסום התא. לכן, לתאים ממעברים שונים וסוגים שונים יש עמידויות שונות.

ה-RB והאלפא שלנו עוזרים להבחין בין הידבקויות של תאי תאים ומטריצת תאים. RB היא ההתנגדות של מגעי תאי התא לזרימת הזרם, או מדידה הפוכה של חדירות. אלפא הוא מדד לתרומות עכבה מצומתי האלקטרודות של התא.

ניתן לחשב את ערכי ה-RB והאלפא מתוך תוכנת ISIS. תנודות קטנות באות ההתנגדות יכולות לנבוע מתנועות עדינות בשכבת תאי המפגש או תנועת מיקרו. ניתן למדוד אותם עם מערכי E אחד בתדר הרגיש ביותר ולנתח אותם על ידי טרנספורמציה מהירה של פורייה בתוך ה- EISs ניתן לבצע מניפולציות תוכנה שנותנות תובנה לגבי התנהגות תאית בדיוק.

לדוגמה, אפשר ליצור פצע חשמלי של 250 מיקרון שייסגר תוך מספר שעות כדי לחקור נדידת תאים. ספקטרוסקופיה של עכבה מתאימה גם לניתוח ההשפעה של חומרים מוספים. כפי שצוין קודם לכן, תרומבין הופך את מחסום התא לחדיר יתר על ידי הורדת מתח תאי הבסיס עם מעכב ARO קינאז, ניתן להפחית את השפעת התרומבין בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור ש-ESIS רגיש ביותר לשינויים בסביבת התא כמו טמפרטורה, pH, דלדול בינוני וכן הלאה.

אחרי הפיתוח שלו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הלוגיקה לחקור את המגמות וההשפעות של חומרים ואזואקטיביים על תרביות תאי מפגש בזמן אמת.