Bioenergetics וחמצוני פרץ: הפרוטוקולים לבידוד ולהערכה של לויקוציטים אדם וטסיות הדם

בפרוטוקול הבא תודגם מדידת הפרופילים הביו-אנרגטיים ותגובות ההתפרצות החמצונית של מונוציטים בדם אנושי, לימפוציטים, נויטרופילים וטסיות דם. זה מושג על ידי איסוף תחילה של מעיל באפי ושברי פלזמה עשירים בטסיות דם מדם טרי. כשלב שני, אוכלוסיית תאי הדם הלבנים ההטרוגנית מופרדת לשכבות תאים חד-גרעיניים ופולימורפו-גרעיניים על ידי שיפוע צפיפות.

לאחר מכן, אוכלוסיות הנויטרופילים והלימפוציטים המונוציטים הטהורים מבודדות עוד יותר על ידי הפרדה מקסימלית ולאחר מכן מצופות לשטף חוץ-תאי או ניתוח XF. בסופו של דבר, ניתן למדוד את המדידה הרגישה והניתנת לשחזור של תפקוד המיטוכונדריה במונוציטים, לימפוציטים וטסיות דם, כמו גם את הפרץ החמצוני של שיעורי צריכת החמצן של מונוציטים ונויטרופילים על ידי טכנולוגיית XF. היתרון של הטכניקה שאנו הולכים להראות לכם היום הוא שאתם יכולים להכין מדגימת דם קטנה את כל התאים העיקריים שנמצאים בדם של המטופל.

אלה טסיות דם ולויקוציטים בצורה מושבתת טהורה ומודדים את תפקודם המיטוכונדריאלי. זה, לדעתנו, יכול לשקף מחלות ומצבים שונים בתוך המטופל בזמן אמת. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הנוגעות לחילוף חומרים, כגון מה תפקיד אורח החיים, התזונה והלחץ הפתולוגי על תפקוד המיטוכונדריה.

פרוטוקול זה משלב טכנולוגיות מרובות לבידוד וקביעת ביו-אנרגטיקה תאית באוכלוסיות לויקוציטים שונות ובטסיות דם. שלב זה של הפרוטוקול הוא קריטי מאוד מכיוון ששיפוע הצפיפות וההפרדה המגנטית דורשים פיפטינג מדויק. בנוסף, אתה צריך להיות מודע היכן נמצאות אוכלוסיות התאים במהלך הפיצול.

נדגים את הבידוד של תאי דם היקפיים וניתוח ביו-אנרגטיקה תאית על מנתח השטף החוץ-תאי 24 בארות או XF 24. עם זאת, ניתן לבצע שיטה זו גם ב-XF 96, לפחות שעתיים לפני תחילת ההליך. לחות את בדיקות מחסנית חיישן ה-XF עם תמיסת חריץ XF.

לאחר מכן סובב את הדם המלא הטרי למשך 15 דקות ב 500 פעמים G וטמפרטורת החדר בצנטריפוגה עם רוטור דלי מתנדנד. השתמש בפיפטת העברה כדי להסיר את השכבה העליונה המכילה את הפלזמה העשירה בטסיות עד שנשאר סנטימטר אחד של פלזמה מעל שכבת ציפוי האפית אריתרוציטים והניח את הפלזמה בצד בטמפרטורת החדר לעיבוד מאוחר יותר. לאחר מכן העבירו את הפרווה של באפי לצינור חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר ודללו את תאי הדם הלבנים ל-24 מיליליטר.

עם RPMI הבסיסי הבא, הוסף שלושה מיליליטר של צפיפות נמוכה, האטום שלו 1.077 לכל אחד משלושה צינורות חרוטיים של 15 מיליליטר. לאחר מכן הניחו את קצה הפיפטה הצרה של חמישה מיליליטר בתחתית כל צינור. בתורו ולשחרר לאט לאט שלושה מיליליטר של צפיפות גבוהה, האטום שלו 1.119.

כעת, השתמש בפיפטה אוטומטית בהגדרת ההספק הנמוך כדי להוסיף בזהירות שמונה מיליליטר של הדם המדולל לכל שיפוע מבלי להפריע לשכבות. צבע כחול נוסף לשיפוע בצפיפות נמוכה להדמיה של כל שכבות השיפוע. לאחר הפרדת התאים על ידי צנטריפוגה בנפרד, אסוף את התאים החד-גרעיניים והפולימורפו-גרעיניים עם פיפטות זכוכית סטריליות מבלי להפריע לרצועות התאים האחרות.

אסוף את אוכלוסיות התאים החד-גרעיניים והפולימורפו-גרעיניים מכל צינור לצינורות חרוטיים סטריליים בודדים של 50 מיליליטר לכל סוג תא, והוסף ארבעה נפחים של RPMI לשני הצינורות. לאחר הסיבוב למטה, התאים מעבירים כדורים לצינור של 1.5 מיליליטר, מחדשים את הכדור ומשעים מחדש 80 מיקרוליטר של RPMI טרי בתוספת BSA. לאחר מכן הוסף 20 מיקרוליטר של חרוז מגנטי המסומן נוגדנים נגד CD 14 ואנטי CD 15 לשברי התאים החד-גרעיניים והפולימורפו-גרעיניים בהתאמה.

דגרו כל תרחיף תאים למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן שטפו כל צינור עם מיליליטר אחד של מדיה R-P-M-I-B-S-A והשעו מחדש את הכדורים ב-500 מיקרוליטר של R-P-M-I-B-S-A. לאחר מכן החל את תרחיפי התאים על עמודי LS שטופים בודדים R-P-M-I-B-S-A ושטוף כל עמודה שלוש פעמים בשלושה מיליליטר של מדיה R-P-M-I-B-S-A אסוף את זרימת תרחיף התאים ושטיפות העמודים לצינורות סטריליים כדי לבודד את המונוציטים והנויטרופילים, הסר את העמודים מהשדה המגנטי לאחר השטיפה הסופית והוציא את התאים שנבחרו באופן חיובי לתוך צינור סטרילי עם חמישה מיליליטר R-P-M-I-B-S-A. כדי לבודד את הלימפוציטים, גלול את הזרימה דרך חלק השטיפה של עמודת התא, השהה מחדש את כדור התא ב-80 מיקרוליטר של R-P-M-I-B-S-A, ודגר את התאים ב-20 מיקרוליטר של נוגדנים CD 61 ו-CD 2 35 A למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן חזור על ההפרדה המקסימלית כמו קודם, ואסוף את הזרימה דרך המכיל את הלימפוציטים כדי לבודד את טסיות הדם, הצנטריפוגה, הפלזמה העשירה בטסיות הדם השמורה, ולאחר מכן הסר את הפלזמה ושטוף את כדור התא פעם אחת עם חמישה מיליליטר PBS סטרילי בתוספת מיקרוגרם אחד למיליליטר של פרוסטגלנדין I שניים משהים מחדש את כדור הטסיות במיליליטר אחד של פרוסטגלנדין PBS טרי I שני חוצצים לצלחת המונוציטים המבודדים, לימפוציטים, נויטרופילים וטסיות דם. ראשית ספרו את התאים והביאו אותם לנפח מתאים במדיום בדיקת XF כדי לאפשר צפיפות זריעה של 2.5 כפול 10 לתאים החמישיים לבאר בנפח של 200 מיקרוליטר. בתרבית תאים XF של 24 בארות מיקרו-צלחת מצופה בתא T לזרעי טסיות 2.5 פעמים 10 לשבעת התאים לבאר בנפח של 200 מיקרוליטר.

לאחר סיבוב התאים על הצלחת, הביאו את נפחי הבאר הסופיים עד 660 מיקרוליטר עם מדיה XF ודגרו את הלוחות ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני בדיקת ה-XF במהלך עומס הדגירה, 75 מיקרוליטר של ריאגנטים לבדיקה בסדר הרשום ליציאות הזרקת מחסנית חיישן XF. אם יש להשיג מדידות פרץ חמצוני, ניתן להזריק PMA לאחר האנטימיצין, טעינת יציאת הזרקה הבאה מניחה את המחסנית על מנתח השטף החוץ-תאי כדי להתחיל בבדיקה. ניתן לקבוע את הפרופילים הביו-אנרגטיים של לויקוציטים וטסיות דם באמצעות מנתח השטף החוץ-תאי XF של סוסון הים, המודד את צריכת החמצן בזמן אמת בתאים באופן לא פולשני.

כל סוג תא מצופה על המיקרו-צלחת XF 24 עם חמישה שכפולים כפי שהודגם זה עתה בטבלה. ערכי פרץ בסיסי וחמצוני מייצגים כפי שנמדדו במהלך הבדיקה וריכוזי החלבון הממוצעים לבאר מודגמים לפי סוג התא ערכי קצב צריכת החמצן מנורמלים לתכולת החלבון הכוללת בבארות המתאימות ומבוטאים כ-p שומות לדקה למיקרוגרם חלבון. קצב צריכת החמצן הבסיסי נקבע לאחר מכן על ידי שלוש המדידות הראשונות.

אוליגו מיצין, מעכב של סינתאז A TP מיטוכונדריאלי מוזרק למדיום XF כדי להעריך את קצב צריכת החמצן יחד עם סינתזת TP ומיוצג כ-TP מקושר ניתן לייחס את קצב צריכת החמצן השיורי פחות קצב צריכת החמצן הלא מיטוכונדריאלי לדליפת פרוטונים. הוספת ה-FCCP הניתוק מאפשרת לקבוע את קצב צריכת החמצן המקסימלי, ואחריו הזרקת אנטימיצין a ומעכב נשימה מיטוכונדריאלית למדידת המקורות הלא מיטוכונדריאלים של צריכת חמצן. קיבולת מילואים היא מדד לכמות העבודה הנוספת שהמיטוכונדריה יכולה לבצע תחת דרישת אנרגיה מוגברת וניתן לחשב אותה כהפרש בין קצב הנשימה המרבי לבזאלי על מנת לקבוע את יכולת ההתפרצות החמצונית של מונוציטים ונויטרופילים.

אגוניסט P-M-A-A-P-K-C מוזרק והעלייה בקצב צריכת החמצן קשורה לייצור חמצון על ידי N-A-D-P-H אוקסידאז לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש שעות בלבד לאחר איסוף הדם, לא כולל הבדיקה עצמה אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לשמור על תנאים סטריליים על ידי ביצוע כל שלב בארון בטיחות ביולוגי ושימוש במאגרים ומדיות סטריליות בטמפרטורת החדר. בעקבות הליך זה, אנו יכולים לבצע פרוטוקולים אחרים, כגון ניתוח פקס כדי לקבוע את טוהר התאים, את מצב ההפעלה של לויקוציטים, וגם כדי לקבוע את הביו-אנרגטיקה התאית בתת-אוכלוסיות לויקוציטים.

אחרי הצפייה בסרטון הזה, עכשיו אמור להיות לכם מושג די ברור לגבי איך להכין טסיות דם, לימפוציטים, מונוציטים ונויטרופילים, ולהכניס אותם לסוס הים ולמדוד את ההתפרצות החמצונית ואת תפקוד המיטוכונדריה מהנתונים האלה. לאחר מכן תוכל לנתח את אוכלוסיות המטופלים שלך ולקבוע כיצד הביו-אנרגטיקה שלהם משתנה בזמן אמת. אל תשכח שעבודה עם דגימות מטופלים אנושיים עלולה להיות מסוכנת ביותר.

לכן, עליך ללבוש ציוד מגן אישי וכן להשתמש בארון בטיחות ביולוגי במהלך הליך זה.