Name: Bioenergetics וחמצוני פרץ: הפרוטוקולים לבידוד ולהערכה של לויקוציטים אדם וטסיות הדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-27T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: למדו לבודד לויקוציטים וטסיות דם אנושיות ולהעריך את הפונקציה המיטוכונדריאלית ותגובת החמצון באמצעות טכנולוגיית XF. שיטה זו מאפשרת הערכת בריאות ביו-אנרגטית בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות על התרומה הטכנית של גלוריה נאווידס. עבודה זו נתמכה על ידי איגוד הלב האמריקאי 13PRE16390001 (SR), NIH T32HL07918 (PAK), NIH T32HL007457 (TM), P30DK056336 (BKC), סיבוכי NIDDK סוכרתיים Consortium (DiaComp, www.diacomp.org) DK076169 מענק (VDU subaward), וDK079337 אובריאן מרכז P30 (VDU).

כל הפרוטוקולים שתוארו בכתב היד הזה לאיסוף דם, בידוד וניתוח כבר נבדקו ואושרו על ידי דירקטוריון סקירה המוסדי באוניברסיטת אלבמה בבירמינגהם. 1. בידוד תא (השתנה מHistopaque סיגמא אולדריץ פרוטוקול מס 1119 וMiltenyi יוטכנולוגיים microbead חיובי ופרוטוקולי סלקציה שליליים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דם צנטריפוגה כולו (שנאסף בACD או צינורות EDTA) בשעה XG 500 במשך 15 דקות בצנטריפוגה עם הרוטור מתנדנד דלי (תאוצה = 5-6, ולא בלם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את השכבה העליונה המכילה פלזמה העשירה טסיות (PRP) עם טפטפת העברה עד 1 סנטימטר נשאר מעל שכבת התאים (מעיל כדורית אדומה / באפי). מניח בצד PRP בטמפרטורת חדר לעיבוד מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את המעיל באפי לצינור חרוטי 50 מיליליטר סטרילי, לדלל ל24 מיליליטר עם RPMI הבסיסי או לפחות 4x מתחיל באפי מעיל הנפח. הערה: חיצו העליון של שכבת RBC עשוי have להיכלל אם כי זה יגרום להגדלת נפח RPMI באופן יחסי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את שיפוע הצפיפות באמצעות צפיפות נמוכה Ficoll עם משקל סגולי של 1.077 (1077) לשכבה העליונה וFicoll צפיפות הגבוהה עם משקל סגולי של 1.119 (1119) לשכבה התחתונה בשלושה צינורות 15 מיליליטר חרוטי (3 מיליליטר כל אחד). כדי לבצע שלב זה, להוסיף ראשון 1077 לצינור אחד. בעזרת פיפטה צרה 5 מיליליטר להוסיף 1119 לחלק התחתון של הצינור על ידי הצבת קצה פיפטה מתחת 1077 ולאט לאט לשחרר מגיב ללא ערבוב עם השיפוע העליון. סכום כולל של 6 מיליליטר של תקשורת שיפוע צפיפות צריך להיות נוכח בשלב זה עם שלב גלוי של הפרדה בסימן מיליליטר 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פיפטה אוטומטית, להוסיף 8 מיליליטר של דם מדולל (משלב 1.3) בעדינות על צינור אחד שיפוע באמצעות הגדרת צריכת החשמל הנמוך כדי למנוע מלהפריע לשכבות הצבע. הנפח הכולל צריך להיות 14 מיליליטר בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות צנטריפוגה ב XG 700 ל30 דקות בטמפרטורת חדר (acceleמנה 6, לא בלם). הערה: בשלב זה, שלוש להקות תא נפרדות צריכים להיות (איור 1 א) מאליו. הלהקות העליונות (בין 1077 ופלזמה) מכילה תאים חד גרעיניים (MNC) וטסיות דם, והלהקה באמצע (בין 1007 ו1119) מכיל תאי polymorphonuclear (PMNs) ורצועה תחתונה (מתחת 1119) מכיל תאי דם אדומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את MNC וPMN בנפרד באמצעות טפטפות זכוכית סטרילית מבלי להפריע להקות תא האחרות. לשלב את אוכלוסיית MNC מצינור לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר סטרילי. חזור על פעולה זו עבור אוכלוסיית PMN גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 כרכים של RPMI על צינור אחד המכיל את השברים MNC וPMN בהתאמה לדלל את שיפוע הצפיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות צנטריפוגה ב XG 700 ל10 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה resuspend MNC תא ותא גלולה PMN בRPMI 1 מיליליטר מכיל 0.5% אולטרה טהור שומן נטול חומצת BSA (RPMI-BSA) ולהעביר לסטרילי 1.5 צינורות מיליליטר. גלולה התאים באמצעות picofuge המעבדתיים ל30שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend כל גלולה תא ב80 μl RPMI-BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של נוגדן שכותרת antiCD14 חרוז המגנטי לצינור המכיל את חלק MNC לסלקציה חיובית של מונוציטים. לצינור המכיל את החלק היחסי של תאי PMN, להוסיף 20 μl של נוגדן שכותרת antiCD15 חרוז המגנטי לסלקציה חיובית של נויטרופילים. דגירה כל השעיה תא ל15 דקות ב 4 º C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף כל השעיה תא עם 1 מיליליטר תקשורת RPMI-BSA וגלולה כמו קודם וresuspend כל גלולה ב500 μl RPMI-BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי שכותרתו מופרדים בשדה המגנטי של תא מגנטי מיון הפעיל מפריד (MACS). הכן את עמודות LS MACS (אחד לכל השעיה תא) על ידי הצבת הטור על מפריד MACS וכביסה עם 3 מיליליטר של RPMI-BSA לפני הוספת ההשעיה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר החלת השעיות תא, לשטוף כל עמודה 3x עם 3 מיליליטר של תקשורת RPMI-BSA (לוודא לתת דראי התקשורתn בין שוטף לחלוטין). אסוף את ההשעיה תא זרימה דרך שטיפות עמודה לתוך צינור סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבודד מונוציטים ונויטרופילים, להסיר את העמודה מהשדה המגנטי לאחר לשטוף הסופי וelute התאים חיובי שנבחרו לתוך צינור סטרילי עם 5 מיליליטר של RPMI-BSA באמצעות בוכנת העמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבודד ימפוציטים גלולה שבריר זרימה דרך השטיפה של MNCs מצעד 1.15 XG 300 10 דקות. בטל supernatant ו resuspend התא גלולה ב μl 80 RPMI-BSA. הוסף 20 μl של נוגדני CD61 וCD235a דגירה תא השעיה ל15 דקות ב 4 º C. חזור על הפרדת MACS כמו קודם ולאסוף את הזרימה למרות שמכיל לימפוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי גלולה מונוציטים, נויטרופילים, ושברים לימפוציטים, צנטריפוגות כמו קודם (שלב 1.9) וזורקים supernatants. כדורי תא צריכים להיות מושעים ב 1 מיליליטר תאי שטף תקשורת (XF-DMEM) לספירה. &lt;br /&gt; הערה: 8 מיליליטר של דם מלא צריך לגרום 1-5 x 10 6 מיליליטר מונוציטים / ו5-20 x 10 ימפוציטים 6 ונויטרופילים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבודד טסיות דם, PRP צנטריפוגה (שלב 1.2) עבור 8-10 דקות ב 1,500 XG בטמפרטורת חדר. הסר את הפלזמה ולשטוף תא גלולה פעם אחת עם 5 מיליליטר סטרילי PBS בתוספת 1 ​​מיקרוגרם / מיליליטר PGI 2, repellet ולהשעות גלולה סופית ב 1 מיליליטר של PBS-PGI חיץ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע ספירת הטסיות על ידי turbidimetry פעם טסיות מושעות ב-PBS-PGI חיץ 2 על ידי ספקטרופוטומטר כפי שתוארו על ידי Walkowiak אח&#39; באמצעות המשוואה הבאה: [6.23 / (2.016 - אבס 800)] - 3.09 גורם לדילול x = # x 10 8. טסיות דם / מיליליטר 12. </li></ol> 2. ציפוי של התאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Cell-Tak (דבק תא): הוסף דבק תא 90 μl 180 μl diH 2 0, 540 μl של 0.1 N דו נתרןקרבונט (pH 8.0), ולהתאים את ה-pH ל 7.2-7.8 באמצעות 1 N NaOH. הכן את צלחות XF (24 גם, V7 microplates) על ידי ציפוי היטב עם כל 30 μl של דבק תא מוכן. הערה: דבק התא צריך להיות מוכן טרי לכל שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחת על 37 º C ל20-30 אז דבק תא לשאוב דקות ולשטוף בארות עם PBS פעמיים (1 מיליליטר / טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ספירת תאים במונוציטים המבודדים, לימפוציטים, נויטרופילים וטסיות דם ומביא לנפח מתאים באמצעות XF-DMEM כדי לאפשר צפיפות זריעה של 250k תאים / גם למונוציטים, לימפוציטים, נויטרופילים ו, ו25 x 10 6 / גם לטסיות דם. לחלופין, כדי למדוד את תגובת פרץ חמצוני, ניתן זורעים הנויטרופילים ב125k תאים / היטב. זריעת הנפח הסופי עבור כל השעיה תא צריך להיות 200 μl / טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצלחת ב XG 200 ל1 שניות ללא בלם. סובב את הצלחת 180 ˚ ו צנטריפוגות שוב עם בלם לא ב300 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא כרך גם סופיUme ל660 μl עם XF-DMEM ולדגור על 37 º C למשך 30 דקות לפני assay XF. הערה: Photomicrographs של תאים מצופים לפני ואחרי assay יכול לשמש כדי להבטיח ציפוי הולם ולשלול ניתוק תא. </li></ol> 3. הכנת 24 גם פלייט התאי השטף Assay (XF24) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מימה XF בדיקות עם פתרון calibrant למינימום של 2 שעות לפני assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10x מניות של 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר oligomycin, 0.6 מיקרומטר FCCP, ו10 מיקרומטר antimycin בXF-DMEM ועומס 75 μl של פתרונות מניות ליציאות הזרקת דיו בצו הנ&quot;ל. אם מדידות פרץ חמצוני הן שיתקבל, הזרקה של 10x המניה של 100 PMA מיליליטר / ng ניתן להזריק אחרי antimycin-. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל את מחסנית התייבשות וטעונה ולבצע את assay XF. השיטות מפורטות לניתוח ופרשנות של שינויים הן את צריכת החמצן וחומציות תוארו בפרסומים קודמים 9,13,14 ואינם דiscussed בפירוט כאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר assay XF, לשאוב את כל אבל 50 μl האחרון של XF-DMEM אחרי assay כדי למנוע אובדן של תאים מהצלחת ולהוסיף 50 מאגר תמוגה תא μl הריף ולבצע assay חלבון לנורמליזציה. </li></ol>

<ol><li>Mancuso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+cognitive+impairment%2C+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Alzheimer%27s+Dis%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer's disease.</a> Int. J. Alzheimer's Dis. 2009, (2009).</li>
<li>Jin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy%2C+mitochondrial+quality+control%2C+and+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy, mitochondrial quality control, and oncogenesis.</a> Autophagy. 2, 80-84 (2006).</li>
<li>Cordero, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+mitophagy+activation+in+blood+mononuclear+cells+of+fibromyalgia+patients%3A+implications+in+the+pathogenesis+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res.+Ther%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and mitophagy activation in blood mononuclear cells of fibromyalgia patients: implications in the pathogenesis of the disease.</a> Arthritis Res. Ther. 12, R17(2010).</li>
<li>Japiassu, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+failure+of+human+peripheral+blood+monocytes+in+patients+with+septic+shock+is+mediated+by+reduced+F1Fo+adenosine-5%27-triphosphate+synthase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Med%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic failure of human peripheral blood monocytes in patients with septic shock is mediated by reduced F1Fo adenosine-5'-triphosphate synthase activity.</a> Crit. Med. 39, 1056-1063 (2011).</li>
<li>Widlansky, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+mitochondrial+membrane+potential%2C+mass%2C+and+morphology+in+the+mononuclear+cells+of+humans+with+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Transl.+Res%22%5BJournal%5D)">Altered mitochondrial membrane potential, mass, and morphology in the mononuclear cells of humans with type 2 diabetes.</a> Transl. Res. 156, 15-25 (2010).</li>
<li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ageing+and+Alzheimer%27s+disease+on+mitochondrial+function+of+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Effects of ageing and Alzheimer's disease on mitochondrial function of human platelets.</a> Exp. Gerontol. 43, 589-594 (2008).</li>
<li>Avila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+mitochondrial+dysfunction+is+evident+in+type+2+diabetes+in+association+with+modifications+of+mitochondrial+anti-oxidant+stress+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Clin.+Endocrinol.+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins.</a> Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120, 248-251 (2012).</li>
<li>Chacko, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+defining+distinct+bioenergetic+profiles+in+platelets%2C+lymphocytes%2C+monocytes%2C+and+neutrophils%2C+and+the+oxidative+burst+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood.</a> Lab. Invest. 93, 690-700 (2013).</li>
<li>Hill, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+cellular+bioenergetics+with+mitochondrial+quality+control+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy.</a> Biol. Chem. 393, 1485-1512 (2012).</li>
<li>Hultqvist, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+autoimmunity%2C+arthritis%2C+and+encephalomyelitis+in+mice+with+a+reduced+oxidative+burst+due+to+a+mutation+in+the+Ncf1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Enhanced autoimmunity, arthritis, and encephalomyelitis in mice with a reduced oxidative burst due to a mutation in the Ncf1 gene.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12646-12651 (2004).</li>
<li>Rosa-Borges, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-6-phosphate+dehydrogenase+deficiency+with+recurrent+infections%3A+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ped%22%5BJournal%5D)">Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency with recurrent infections: case report.</a> J. Ped. 77, 331-336 (2001).</li>
<li>Walkowiak, B., Kesy, A., Michalec, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplate+reader--a+convenient+tool+in+studies+of+blood+coagulation%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Res%22%5BJournal%5D)">Microplate reader--a convenient tool in studies of blood coagulation.</a> Thromb. Res. 87, 95-103 (1997).</li>
<li>Dranka, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+bioenergetic+function+in+response+to+oxidative+stress+by+metabolic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling.</a> Free Radic. Biol. Med. 51, 1621-1635 (2011).</li>
<li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> J. Vis. Exp.. (46), e2511(2010).</li>
</ol>

VDU הוא חבר של סוסון ים Bioscience המדעי המייעץ.

פרוטוקול זה מייצג את האוסף של כמה טכניקות מנוצלים בדרך כלל לבידוד תאי דם באופן מתאים לניתוח bioenergetics. הטכניקות רציפות שהוצגו הן יתרון לשיטות אחרות בידוד (כלומר ניתוח FACS) ליכולת שלהם לבודד מספר גדול של תאים בתנאי תקשורת מבוקרים עם לחצים מינימאליים מונחים על התאים המבודדים. יש לו את החסרון של בידודים ממושכים גם עם הפרעות מינימליות. פרוטוקול זה משמש כבסיס לבידוד של תאי דם עיקריים מבני אדם, שניתן להסיק להגדרות קליניות ומחקר translational. הפרדת MACS היא טכניקת בידוד תא אמינה שמציעה את האפשרות של בידוד תאים ישירות מדם כולו, עם זאת, שיטה זו דורשת כמויות גדולות יותר של נוגדנים ואינה אופטימלי לבידוד של כל ארבעת סוגי התאים שונים כפי שמתוארים בשיטה זו. שם יש בeen אין ראיות כדי להראות שהסלקציה החיובית של לויקוציטים ידי תוצאות הפרדת MACS בהפעלה באמצעות פרוטוקול הבידוד שלנו. עמודות MACS לפעול באמצעות קיבוע של תאים שכותרתו בשדה מגנטי באמצעות נוגדנים מצומדות כדי 50 חלקיקי פאראמגנטי ננומטר. לאחר מכן תאים שכותרתו eluted את הטור. בחירות חיוביות ושליליות מיושמות בפרוטוקול זה כדי להבטיח בידוד וטוהר מהירים. אם מספרי תא לקויים מתקבלים מבידוד או טוהר הוא בשאלה, ניתן להוסיף יותר נוגדנים למדגם לפי ההוראה של הספק והמעבר שני דרך עמודת LS עלול לגרום לטוהר גבוה יותר (טבלה 2). המעבדה שלנו מצאה טוהר גבוה ויעילות ציפוי באמצעות הפרוטוקול הקיים על ידי ניתוח השעיות תא סופיים על ידי ניתוח FACS 8. יש מנתחי שטף תאיים היכולת לפקח גם צריכת חמצן והחמצת תקשורת בזמן אמת מעל זה של otאלקטרודות. צריכת החמצן כפי שנצפה על ידי תגובת פרץ חמצוני במונוציטים ונויטרופילים היא מונואמין NADPH תלוי כפי שמוצג על ידי עיכוב עם DPI 8. שראינו בהפסד תלוי בזמן בקיבולת פרץ חמצוני עם בידודים ממושכים או מבחני XF מורחבים. פרוטוקול זה תוכנן ופותחו לשימוש בXF24 אבל גם תואם עם XF96 כבשליש עד חצי מהתא XF24 זריעת צפיפות (איור 3). בעיצוב של פרוטוקול זה, היצמדות לפרוטוקולים קיימים עבור כל טכניקה הנדרשת לביצועים אופטימליים עם שינויים שנעשו אך ורק כדי לשלוט בתנאי תקשורת לניתוח bioenergetic. לאחר שליטה בטכניקות, פרוטוקול כזה יכול לשמש במגוון רחב של יישומי translational ומחקר כדי למדוד את הרעילות או יעילות של אסטרטגיות טיפול, לחקור מאפיינים המטבולי של מחלה, וייצור חמצון על ידי מונוציטים וneutrophils במצבים דלקתיים.

ניטור בריאות bioenergetic של תאים חיסוניים (מונוציטים, לימפוציטים, נויטרופילים) וטסיות דם מהוכר במשך זמן מה ככלי אבחון שעשוי להיות שימושיים כדי להעריך את בריאות bioenergetic הכללית של אדם. יש גוף מתעוררים של ספרות מייחס מספר המחלות כגון סרטן, מחלות לב וכלי דם ומחלות ניווניות ל1,2 תפקוד המיטוכונדריה. זה חשוב מבחינה קלינית מאז תפקוד המיטוכונדריה יכול ליזום סדרה של אירועים הסלולר שיקדמו מסלולי איתות הפרו דלקתיים או להוביל למוות של תאים. מספר מחקרים מאופיינים תפקוד המיטוכונדריה של תאים היקפיים mononuclear הדם וטסיות דם במצבים כגון פיברומיאלגיה, סוכרת, הלם ספטי, והמחלה 3-7 אלצהיימר. לדוגמא, מחקר שנערך לאחרונה העריך את bioenergetics של טסיות דם כסמן לתפקוד המיטוכונדריה ומצא כי טסיות דם מסוג 2 Diabetחולי ic פחתו 7,8 צריכת החמצן במיטוכונדריה. מממצאים אלה ואחרים, ברור שמונוציטים, לימפוציטים, נויטרופילים, וטסיות דם יכולים לשמש כסמנים פונדקאיות כשינויים בbioenergetics תחת מצבים פתולוגיים שכן הם יסקור את מחזור הדם המערכתי ועשויים לשקף שינויים מטבוליים מקומיים והעולמיים. כדי לקבוע אם גישה זו יש ערך פרוגנוסטי או אבחון בשיטת תפוקה גבוהה של ניתוח ושיטה עקבית להכנת תא נדרשת. השיטות כדי למדוד את התפקוד המיטוכונדריה בלויקוציטים וטסיות דם שמעורבים בעבר בידוד של המיטוכונדריה או הערכה של bioenergetics הסלולר בתאים שלמים 4,9. היתרון של הערכת bioenergetic הסלולרית באמצעות שטף תאי מנתח (XF) הוא שהפונקציה של המיטוכונדריה בתאים ניתן להקים עם מצעי אנדוגני ופרמטרי נשימה כגון דליפת פרוטון ונשימה מקסימליקיבולת ניתן לקבוע. אנו ואחרים השתמשו בטכנולוגיה זו כדי להראות שפרופילי bioenergetic בטסיות דם, ניתן להקים מונוציטים ולימפוציטים מבודדים מהדם של בני אדם והשוואה בין סוגי תאים 8. בנוסף, שניהם נויטרופילים ומונוציטים בעלי קיבולת פרץ חמצוני בי oxidases NAPDH מופעלים וצורכים חמצן ליצירת superoxide. חשוב מכך, מסלול זה הוא מרכיב מרכזי של חסינות מולדת, והוא מווסת על ידי דלקת מערכתית. לדוגמא, זה כבר הראה כי שינויים בקיבולת פרץ חמצוני קשורים עם מחלות אוטואימוניות שונות, כגון טרשת נפוצה, דלקת פרקים, וזיהומים חוזרים ונשנים 10,11. כרגע אין מבחני כמותיים תפוקה גבוהה זמינים כדי למדוד את פרץ חמצוני בדגימות קליניות. זה חשוב מכיוון שמאפיין את קיבולת פרץ חמצוני של נויטרופילים ומונוציטים יכולים גם לשמש ככלי אבחונים חשובים מכמה patholoחיס. האתגרים הטכניים המפתח היו רגישות נמוכה למדידה של צריכת חמצן תוך שימוש בטכניקות polarographic קונבנציונליות ואת הצורך להשתמש בתאים מצורפים בעת שימוש בטכניקות fluorometric microplate רגישות יותר. בסרטון מעשי זה, אנו מתארים את הפתרון הטכני לבעיות אלו. אנחנו פירוט השיטות לבידוד, ציפוי והמדידה של bioenergetics של מונוציטים, לימפוציטים, נויטרופילים, וטסיות דם ופרץ חמצוני של מונוציטים ונויטרופילים מהדם אנושי. שיטה זו מתאימה להערכה קלינית של bioenergetics ופרץ חמצוני לחוקרים שיש להם גישה לאוכלוסייה מטופלת ואת היכולת להשיג דגימות דם טריות.

<table><tbody><tr><td>ערכת ההתחלה של QuadroMACS כוללת מפריד QuadroMACS ו-MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-833</td><td></td></tr><tr><td>CD235a (גליקופורין A) מיקרו-חרוזים,</td><td>Miltenyi Biotec</td> אנושי <td>130-050-501</td><td></td></tr><tr><td>CD61 MicroBeads, אנושי&nbsp; לטסיות</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-051-101</td><td></td></tr><tr><td>CD14 MicroBeads, אנושי&nbsp; למונוציטים</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>CD15 מיקרו-חרוזים, אנושי&nbsp; לגרנולוציטים</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-046-601</td><td></td></tr><tr><td>עמודות LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer ACD צינורות איסוף דם</td><td>פישר</td><td>02-684-26</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11835-030</td><td>עם L-גלוטמין וללא פנול אדום</td></tr><tr><td>פרוסטגלנדין I2, נתרן מלח</td><td>קיימן</td><td>18220</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל חצי מיקרו קובטות</td><td>Phoenix Research Products</td><td>SC-2410</td><td></td></tr><tr><td>שיפוע צפיפות היסטופאקים, משקל סגולי 1.077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>שיפוע צפיפות Histopaque, משקל סגולי 1.119</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין Fraction V</td><td>Roche</td><td>3117405001</td><td>חומצת שומן נטול במיוחד</td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate</td><td>Sigma</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>XF24 FluxPak</td><td>Seahorse Biosciences</td><td>100850-001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher</td><td>MT90113PB</td><td>ללא גלוקוז, L-גלוטמין, פירובט, פנול אדום וביקרבונט</td></tr><tr><td>L-גלוטמין, 200 מ"מ (100x)</td> <td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>D-גלוקוז</td><td>סיגמא</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>סיגמא</td><td>P8574</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak (דבק תאים)</td> <td>BD Biosciences</td><td>CB-40242</td><td></td></tr><tr><td>אוליגומיצין</td><td>סיגמא</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>אנטימיצין A</td><td>סיגמא</td><td>A8674</td><td></td></tr> <tr><td>(FCCP) קרבוניל ציאניד 4-(טריפלואורומטוקסי) פנילהידרזון</td><td>סיגמא</td><td>C-2920</td><td></td></tr><tr><td>DC מגיב לבדיקת חלבון A</td><td>ביו-ראד</td><td>500-0113</td><td></td></tr><tr><td>מגיב בדיקת חלבון DC S</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0015</td><td></td></tr><tr><td>מגיב בדיקת חלבון DC B</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0114</td><td></td></tr><tr><td></td><td>סוסון ים Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מפריד QuadroMACS ו-MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976 ו-24039</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bioenergetics וחמצוני פרץ: הפרוטוקולים לבידוד ולהערכה של לויקוציטים אדם וטסיות הדם

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

תפקוד המיטוכונדריה ידוע לשחק תפקיד משמעותי במספר מצבים פתולוגיים כגון טרשת עורקים, סוכרת, הלם ספטי, ומחלות ניווניות אך הערכת שינויים בתפקוד bioenergetic בחולים מאתגרת. למרות שמחלות כמו סוכרת או טרשת עורקים הנוכחית קליניות עם ליקוי איבר מסוים, רכיבים מערכתיים של פתולוגיה, כגון היפרגליקמיה או דלקת, יכולים לשנות את תפקוד bioenergetic במחזור לויקוציטים או טסיות דם. תפיסה זו זכתה להכרה לכמה זמן, אבל היישום הנרחב שלה כבר מוגבל על ידי המספר הגדול של תאים ראשוניים הנדרשים לניתוח bioenergetic. מגבלה טכנית זו כבר להתגבר על ידי שילוב ספציפי של הטכניקות מגנטי בידוד חרוז, טכניקות הידבקות תא, המאפשרות לתאים שיצורפו ללא הפעלה לmicroplates, והרגישות של טכנולוגיות חדשות המיועדות למיקרופון תפוקה גבוההrespirometry roplate. דוגמא לציוד זה היא מנתח השטף תאי. מכשור כזה משתמש בדרך כלל בדיקות רגישות חמצן וה-pH למדידת שיעורי השינוי בפרמטרים האלה בתאים חסיד, אז מה שיכול להיות קשור לחילוף חומרים. כאן אנו מפרטים את השיטות לבידוד והציפוי של מונוציטים, לימפוציטים, נויטרופילים וטסיות דם, ללא הפעלה, מהדם של בני אדם והניתוח של תפקוד bioenergetic המיטוכונדריה בתאים אלה. בנוסף, אנו מדגימים כיצד חמצוני פרצו במונוציטים ונויטרופילים יכולים גם להימדד בדגימות אותו. מאז שיטות אלה להשתמש רק 8-20 מיליליטר דם אדם שיש להם פוטנציאל לניטור דור חמצן מגיב מינים וbioenergetics בסביבה קלינית.

כדוריות דם לבנות וטסיות דם יכולים לשמש כסמן לבריאות bioenergetic הכללי של אדם ולכן יש לו את הפוטנציאל לפקח על תהליכים פתולוגיים ואת ההשפעה של טיפולים. כאן אנו מתארים שיטה לבודד ולמדוד את תפקוד המיטוכונדריה ופרץ חמצוני בתאים אלה.

Bioenergetics וחמצוני פרץ: הפרוטוקולים לבידוד ולהערכה של לויקוציטים אדם וטסיות הדם

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

בפרוטוקול הבא, יוצגו מדידות של פרופילים ביו-אנרגטיים ותגובות של פרץ חמצוני (oxidative burst) של מונוציטים, לימפוציטים, נויטרופילים וטבקיות מדם אנושי. הדבר משיג תחילה על ידי איסוף של שכבת ה-buffy coat ושל פלסמה עשירה בטבקיות (platelet rich plasma) מדם שנסוג טרי. בשלב השני, אוכלוסיית תאי הדם הלבנים ההטרוגנית מופרדת לשכבות של תאים חד-גרעיים ותאים רב-גרעיניים באמצעות גרדיאנט צפיפות.בשלב הבא, אוכלוסיות טהורות של מונוציטים, נויטרופילים ולימפוציטים מבודלות באופן נוסף באמצעות הפרדה מקסימלית (max separation) ולאחר מכן מושקעות לצורך ניתוח שטף חוץ-תאי או ניתוח XF. בסופו של דבר, טכנולוגיית XF מאפשרת מדידה רגישה וניתנת לשחזור של התפקוד המיטוכונדריאלי במונוציטים, לימפוציטים וטבקיות, כמו גם את שיעורי צריכת החמצן בפרץ חמצונית של מונוציטים ונויטרופילים. היתרון של הטכניקה שנגלה לכם היום הוא שניתן להכין מדגימת דם קטנה את כל התאים העיקריים הנמצאים בדמו של המטופל.אלו הן טסיות דם ותאי לוקוציטים בצורה מנוטרלת טהורה, ומודדים את התפקוד המיטוכונדריאלי שלהם. אנו סבורים כי הדבר יכול לשקף מחלות ומצבים שונים אצל המטופל בזמן אמת. שיטה זו עשויה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח הנוגעות למטבוליזם, כגון מהו תפקידם של אורח החיים, התזונה ומצבי סטרס פתולוגיים על התפקוד המיטוכונדריאלי.פרוטוקול זה משלב טכנולוגיות מרובות לבידוד ולקביעה של ביואנרגטיקה תאית באוכלוסיות שונות של לוקוציטים ובטסיות. שלב זה של הפרוטוקול הוא קריטי מאוד, כיוון שסבב מדרג הצפיפות וההפרדה המגנטית דורשים פיפטינג מדויק. בנוסף, עליכם להיות מודעים למיקומן של אוכלוסיות התאים במהלך הפרדת הפракציות.נדגים את בידוד תאי דם פריפריים ואת ניתוח הביואנרגטיקה התאית באמצעות אנליזר הזרימה החוץ-תאית בעל 24 בארות (the 24 well extracellular flux analyzer) או ה-XF 24. עם זאת, ניתן לבצע שיטה זו גם ב-XF 96. לפחות שעתיים לפני תחילת הפרוצדורה, יש להשקות את גששיהם של מחסנית החיישנים של ה-XF באמצעות תמיסת XF cran.לאחר מכן, סובבו את הדם השלם שנסבב זה עתה במשך 15 דקות ב-500 ×g ובטמפרטורת החדר בצנטריפוגה בעלת רוטור עם דליים נערעים (swinging bucket rotor). השתמשו בפיפט העברה כדי להסיר את השכבה העליונה המכילה את הפלסמה העשירה בטבקיות עד שנותרה שכבה של סנטימטר אחד של פלסמה מעל שכבת ה-buffy coat של האריתרוציטים, והפרידו את הפלסמה בטמפרטורת החדר לעיבוד מאוחר יותר. לאחר מכן, העבירו את ה-Buffy coat למבחנה קונית סטרילית בנפח 50 מיליליטר ודללו את תאי הדם הלבנים לנפח של 24 מיליליטר.בשלב הבא, עם RPMI בסיסי, הוסיפו שלושה מיליליטר של Hisopaque 1.077 בעל צפיפות נמוכה לכל אחת משלוש פרועות קוניות בנפח 15 מיליליטר. לאחר מכן, הניחו את קצה פטה של פיפטה צרה בנפח חמישה מיליליטר בתחתית כל פרועת. בתורם, שחררו באיטיות שלושה מיליליטר של Hisopaque 1.119 בעל צפיפות גבוהה.כעת, השתמשו בפיפטה אוטומטית בהגדרת עוצמה נמוכה כדי להוסיף בזהירות 8 mL של הדם המדולל לכל גרדיאנט, מבלי להפר את השכבות. צבע כחול הוסף לגרדיאנט בעל הצפיפות הנמוכה לצורך ויזואליזציה של כל שכבות הגרדיאנט. לאחר הפרדת התאים באמצעות סבוב נפרד בצנטריפוגה, אספו את התאים המונונוקליאריים והפולימורפונוקליאריים בעזרת פיפטות זכוכית סטריליות, מבלי להפר את פסי התאים האחרים.אגדו את אוכלוסיות התאים המונונוקלאריים והפולימורפוניוקלאריים מכל מבחנה לתוך מבחנות קוניות סטריליות בנפח 50 milliliter בנפרד עבור כל סוג תא, והוסיפו ארבעה נפחים של RPMI לשתי המבחנות. לאחר סבב נ kemampuan (spin down) של התאים, העבירו את המשקעים למבחנה בנפח 1.5 milliliter, בצעו משקוע מחדש (re-pellet) והמיסו מחדש ב-80 µL של RPMI טרי בתוספת BSA. לאחר מכן, הוסיפו 20 µL של נוגדנים anti CD 14 ו-anti CD 15 המסומנים בחרוזות מגנטיות לfracciones של התאים המונונוקלאריים והפולימורפוניוקלאריים, בהתאמה.דגרו כל תרחיף תאים למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4°C, ולאחר מכן שטפו כל מבחנה עם 1 mL של מצע R-P-M-I-B-S-A וסספנדו מחדש את המשקעים ב-500 µL של R-P-M-I-B-S-A. לאחר מכן, העבירו את תרחיפי התאים לעמודי LS נפרדים שנשטפו ב-R-P-M-I-B-S-A ושטפו כל עמוד שלוש פעמים עם 3 mL של מצע R-P-M-I-B-S-A. אספו את זרימת התרחיפים (flow throughs) ואת שטיפות העמודים למבחנות סטריליות כדי לבודד את המונוציטים והנויטרופילים; הוציאו את העמודים מהשדה המגנטי לאחר השטיפה האחרונה ואלוט את התאים שנבחרו באופן חיובי למבחנה סטרילית עם 5 mL של R-P-M-I-B-S-A. כדי לבודל את הלימפוציטים, השקיעו את פראקציית השטיפה של זרימת התאים מהעמוד, סספנדו מחדש את משקע התאים ב-80 µL של R-P-M-I-B-S-A, ודגרו את התאים עם 20 µL של נוגדנים CD 61 ו-CD 2 35 A למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4°C.לאחר מכן חזרו על ההפרדה המקסימלית כפי שנעשה קודם לכן, ואספו את השברים העוברים המכילים את הלימפוציטים כדי לבודד את הפלטלטים; סבבו בצנטריפוגה את פלזמה העשירה בטסיות השמורה, לאחר מכן הסירו את הפלזמה ושטפו את משקע התאים פעם אחת עם 5 mL של PBS סטרילי בתוספת 1 µg/mL של prostaglandin I2. השביו את משקע הפלטלטים ב-1 mL של בופר PBS prostaglandin I2 טרי. כדי לזרוע את המונוציטים, הלימפוציטים, הנויטרופילים והפלטלטים המבודדים: ראשית ספרו את התאים והביאו אותם לנפח מתאים במצע XF assay כדי לאפשר צפיפות זריעה של 2.5×10⁵ תאים לבאר בנפח של 200 µL. במיקרופלטה לתרבית תאים מסוג 24-well XF המצופה ב-cell T עבור פלטלטים, זרעו 2.5×10⁷ תאים לבאר בנפח של 200 µL.לאחר סבוב התאים אל הפלטה, העלו את הנפחים הסופיים בכל באר ל-660 µL באמצעות XF media והדגירו את הפלטות בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות לפני בדיקת ה-XF. במהלך הדגירה, טענו 75 µL של ריאגנטי הבדיקה, לפי הסדר המפורט, אל נקודות ההזרקה של מחסית חיישן ה-XF. אם יש להשיג מדידות של פרץ חמצוני (oxidative burst), ניתן להזריק PMA לאחר ה-antimycin, בנקודת ההזרקה העוקבת. לאחר טעינת מחסית ההזרקה, הניחו את המחסית על מכשיר ה-extracellular flux analyzer כדי להתחיל את הבדיקה. ניתן לקבוע את הפרופילים הביו-אנרגטיים של לוקוציטים וטסיות דם באמצעות מכשיר seahorse XF extracellular flux analyzer, המודד צריכת חמצן בתאים בזמן אמת באופן לא פולשני.כל סוג תא נזרע על משטח XF 24 microplate עם חמש חזרות, כפי שהודגם בטבלה. ערכי בסיס וערכי פרץ חמצוניים מייצגים, כפי שנמדדו במהלך הבדיקה, והריכוזים הממוצעים של חלבון לכל באר מוצגים לפי סוג התא. ערכי קצב צריכת החמסן מנורמלים לתוכן החלבון הכולל בבארים התואמות ומבוטאים כ-p moles לדקה למיקרוגרם של חלבון. קצב צריכת החמסן הבסיסי נקבע לאחר מכן על פי שלוש המדידות הראשונות.Oligomycin, מעכב של ATP synthase מיטוכונדריאלי, מוזרק למצע ה-XF כדי להעריך את קצב צריכת החמצן המשויך לסנתזה של ATP. נתון זה מיוצג כ-ATP-linked, בעוד שקצב צריכת החמצן השאריתי פחות קצב צריכת החמצן הבלתי-מיטוכונדריאלי ניתן לייחס לדליפת פרוטונים (proton leak). הוספה של FCCP, חומר מבטל צימוד (uncoupler), מאפשרת קביעה של קצב צריכת החמצן המקסימלי, ולאחריה הזרקה של antimycin A, מעכב של הנשימה המיטוכונדריאלית, כדי למדוד מקורות בלתי-מיטוכונדריאליים של צריכת חמצן. קיבולת רזרבה (Reserve capacity) היא מדד לכמות העבודה הנוספת שהמיטוכונדריה יכולה לבצע תחת דרישה אנרגטית מוגברת, וניתן לחשבה כהפרש בין קצב הנשימה המקסימלי לקצב הבסאלי, וזאת כדי לקבוע את קיבולת הפרץ החמצוני (oxidative burst capacity) של מונוציטים ונויטרופילים.מזריקים אגוניסט של P-M-A-A-P-K-C והעלייה בקצב צריכת החמצן מקושרת לייצור חומרים מחמצנים על ידי N-A-D-P-H oxidase. ברגע שהטכניקה נלמדת, ניתן לבצעה תוך שלוש שעות בלבד לאחר איסוף הדם, לא כולל את הבדיקה עצמה, אם היא מבוצעת כהלכה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לשמור על תנאים סטריליים על ידי ביצוע כל שלב בתוך קבטן בטיחות ביולוגית ושימוש בתמיספים ומצעים סטריליים בטמפרטורת החדר. לאחר הליך זה, ניתן לבצע פרוטוקולים אחרים, כגון אנליזה ב-fax כדי לקבוע את טהרת התאים, את מצב ההפעלה של הלבקוציטים, וכן כדי לקבוע את הביואנרגטיקה התאית בתת-אוכלוסיות של לבקוציטים.לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם תמונה ברורה למדי לגבי אופן הכנת טסיות דם, לימפוציטים, מונוציטים ונויטרופילים, והכנסתם למכשיר ה-seahorse לצורך מדידת הפרץ החמצוני והתפקוד המיטוכונדרי Allowing מהנתונים הללו. לאחר מכן תוכלו לנתח את אוכלוסיות המטופלים שלכם ולקבוע כיצד הביואנרגטיקה שלהם משתנה בזמן אמת. אל תשכחו שעבודה עם דגימות של מטופלים אנושיים עלולה להיות מסוכנת ביותר.לפיכך, עליך להשתמש בציוד מיגון אישי וכן לעבוד בתוך מrepresents קבאלת בטיחות ביולוגית במהלך הליך זה.

bioenergetics-oxidative-burst-protocols-for-isolation-evaluation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים את הבדיקה כדי לאשר פעילות פגוציטית על ידי תאים בדם אנושי באמצעות ציטומטריית זרימה. הגרנולוציטים והמונוציטים מאשרים את פעילותם הפאגוציטית על ידי הצגת פלואורסצנטיות ירוקה ואדומה, המאשרת את נוכחותם של חיידקים שנבלעו ופעילות התפרצות חמצונית בהתאמה.

בדיקה להערכת פגוציטוזה ופעילות פרץ חמצוני בגרנולוציטים ומונוציטים

כאן אנו מראים טסיות אדם מבודדים יכולים לשמש נגיש vivo לשעבר מודל ללמוד עיבודים מטבוליים בתגובה במתחם שאני מעכב rotenone. גישה זו מעסיקה עקיבת איזוטופי וכימות ביחס ידי ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה הנוזלית וניתן ליישם במגוון רחב של עיצובי מחקר.

ניתוח LC-MS של טסיות האדם כפלטפורמה ללימוד מטבוליזם מיטוכונדריאלי

מטרת כתב היד הזה היא להציג שיטה למדידת פגוציטוזיס מונוציטים וגרנולוציטים ופעילות פרץ חמצוני בדגימות דם אנושיות.

מדידת פעילות פרץ גרנולוציט ו מונוציטים Phagocytosis חמצוני בדם אנושי

חקר חילוף החומרים הופך רלוונטי יותר ויותר למחקר אימונולוגי. כאן, אנו מציגים שיטה אופטימלית למדידת גליקוליזה ונשימה מיטוכונדריאלית בטחול עכברים, ולימפוציטים T ו-B.

פרוטוקול אופטימיזציה כדי לנתח הגליקוליזה מיטוכונדריאלי הנשימה לימפוציטים

כאן אנו מציגים פרוטוקול בידודו של תאים לוקמיה במח העצם חולי לוקמיה וניתוח של מדינתם מטבולית. הערכה של פרופיל מטבולי של תאי סרטן ראשוני יכול לעזור כדי לאפיין טוב יותר את הביקוש של ראשי תאים, עלול להוביל רפואה אישית יותר.

הערכה של פרופיל מטבולי של תאי סרטן ראשוני

אנו מתארים פרוטוקולים הדרגתיים המודדים את הנשימה המיטוכונדריאלית של נויטרופילים עכבריים ואנושיים ותאי HL60 באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי מטבולי.

מדידה בזמן אמת של הפרופיל הביו-אנרגטי המיטוכונדריאלי של נויטרופילים

פרוטוקול זה כולל סדרה של בדיקות פונקציונליות נויטרופילים שישמשו כשיטת סינון לכיסוי פונקציות ממסלולי איתות שונים. הפרוטוקול כולל הערכה ראשונית ופשוטה של כדאיות התא, טוהר, ייצור מיני חמצן תגובתי, נדידה בזמן אמת, פגוציטוזה, והצעה ראשונית של מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים.

סדרה של טכניקות סינון לסקירה מהירה של פונקציית נויטרופיל

תאי דם חד-גרעיניים היקפיים מבודדים יכולים לשמש לניתוח של תפקודים והפרעות חיסוניות, מחלות מטבוליות או תפקודים מיטוכונדריאליים. בעבודה זו, אנו מתארים שיטה סטנדרטית להכנת PBMCs מדם שלם ושימור בהקפאה לאחר מכן. שימור בהקפאה הופך את הזמן והמקום הזה לעצמאיים.

שימור קריוגני והערכה ביואנרגטית של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי

הדור של אניון סופראוקסיד חיוני לגירוי טסיות הדם, ואם אינו מוסדר, קריטי למחלות טרומבוטיות. כאן, אנו מציגים שלושה פרוטוקולים לזיהוי סלקטיבי של אניונים סופראוקסידים ולחקר ויסות טסיות תלוי חיזור.

שיטות חלופיות לאיתור ייצור אניון סופראוקסיד בטסיות הדם 

שימוש לרעה באלכוהול פוגע בחסינות המקרופאגים בנאדיות (AM) עקב דיכוי הנשימה המיטוכונדריאלית והביו-אנרגטיקה. לאחרונה הדגמנו כי חשיפה לאתנול (EtOH) מגבירה את התלות בגלוטמין לנשימה מיטוכונדריאלית ב-AMs. להלן שיטות לקביעת השימוש בגלוטמין לנשימה מיטוכונדריאלית ב-AMs שטופלו ב-EtOH באמצעות ביואנלייזר שטף חוץ-תאי.

הערכת גלוטמין כמקור דלק למקרופאגים בנאדיות שנחשפו לאתנול כרוני באמצעות ביואנלייזר שטף חוץ-תאי

חילוף החומרים של טסיות הדם מעניין, במיוחד בכל הנוגע לתפקיד של היפראקטיביות והיפראקטיביות של טסיות דם בדימום והפרעות פקקת. בידוד טסיות הדם מפלזמה הכרחי לכמה בדיקות מטבוליות; מוצגת כאן שיטה לבידוד מטבוליטים תוך-תאיים מטסיות דם שטופות.

הכנת טסיות דם אנושיות שטופות למחקרי שטף מטבולי כמותי

למדו לבודד לויקוציטים וטסיות דם אנושיות ולהעריך את הפונקציה המיטוכונדריאלית ותגובת החמצון באמצעות טכנולוגיית XF. שיטה זו מאפשרת הערכת בריאות ביו-אנרגטית בזמן אמת.

Bioenergetics וחמצוני פרץ: הפרוטוקולים לבידוד ולהערכה של לויקוציטים אדם וטסיות הדם

גלה סרטונים נוספים