מדידת אורך של תאי מטריקס קשיחות במודלי גידול 3D באמצעות Microrheology מעקב חלקיקים

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד שינויים לאורכיים בתכונות המכניות של המטריצה החוץ-תאית במודלים תלת-ממדיים של סרטן. זאת מושג תחילה על ידי קצירת תאי סרטן והצמחת הספרואיד הגודלי בשיטה מתאימה עד להגעה לגודל הרצוי. השלב השני הוא הטמעת הספרואיד הגודלי בקולגן או במטריצה חוץ-תאית מתאימה אחרת.

בשלב הבא, נבנית רשת של נקודות דגימה וסרטון מוקלט בכל נקודה. השלב הסופי הוא ניתוח נתוני הווידאו, חישוב וביצוע רישום משותף (coregister) של תכונות לוגיות ממשיות בכל נקודה מרחבית. בסופו של דבר, פרוטוקול זה משתמש בניתוח של מסלולי גששיים (tracer probes) כדי לכמת לאורך זמן שינויים מרחביים במכניקה של המטריצה החוץ-תאית באופן לא הרסני.

הרעיון הוא שעל ידי שילוב של מדידות מבוססות דימיות של רדיולוגיה של המטריצה החוץ-תאית עם מודלים תלת-ממדיים של גידולים in vitro, המשחזרים אינטראקציות של המטריצה החוץ-תאית, גישה זו יכולה לספק תובנה כמותית לגבי שינויים תלויי-זמן במיקרו-סביבה המכנית הנלווים לתהליכי צמיחת גידול, פלישה ותגובה לטיפול. השיטה המוצגת בסרטון זה מאמצת גישת ציפוי aros ליצירת OIDs תלת-ממדיים שאינם נצמדים, מתאי תאי סרטן הלבלב המבוססים על קו התאים המקובל pan one. כדי להתחיל, ערבבו 10 milliliters של מים בדרגת תרבית תאים עם 0.1 gram של aros כדי להוסיף תמיסת aros בריכוז 1%.

חממו את תמיסת ה-aros לטמפרטורה שמעל 70 °C לפני השימוש. לאחר העברת 40 µL מהתמיסה לכל באר בלוח 96 בארות, דגרו את הלוח בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. קצרו את תאי הסרטן באמצעות trypsin והכינו תרחיף של תאים בודדים לפני דילול התרחיף ל-1000 תאים ל-mL. הוסיפו 100 µL מדילול זה לבאר המכילה את שכבת ה-aros המקשורה.

הנח את הדגימה על שייקר למשך הלילה בתוך אינקובטור המכוון ל-37 °C ו-5%CO2 לאחר האינקובציה. הוצא את הדגימה מהשייקר והוסף 100 µL של מצע לתרבית תאים, והמשך להדגיר את הסטרואיד שנוצר עד להגעה לקוטר הרצוי. לדוגמה, לאחר תשעה ימים, סטרואיד אחד יהיה בקוטר של כ-450 microns.

לפני תחילת העבודה, הכינו תחנת עבודה בתוך מבתר זרימה למינרית עם שתי בקבוקונית של שני מיליליטר. בקבוקונית אחת תכיל את הסטרואיד של הגידול והשנייה תשמש כביקורת נטולת תאים. הכינו תמיסה מדוללת של גששים פלואורסצנטיים בעקבה בקוטר מיקרון אחד ששופרו באמצעות קרבוקסילאט, על ידי הוספת שני חלקים של גששים מהמלאי ל-25 חלקים של מים סטריליים.

הוציאו מהמקרר בקבוק של קולגן בקר בריכוז 3.1 mg/mL והניחו אותו על קרח. העבירו (aliquot) 125 µL של קולגן, ולאחריהם 50 µL של תמיסת גשש (tracer probe) מדוללת אל תוך מבחנה אחת; ערבבו קצרה במכשיר וורטקס (vortex) כדי לפזר את הגששים. לאחר מכן, הוסיפו 235 µL של מצע גידול תאים מתאים המכיל phenol red, לנפח סופי של 410 µL, וערבבו קצרה בוורטקס לפני העברה של 205 µL אל תוך מבחנה שנייה. לבסוף, הוסיפו למבחנה כ-2 µL של נתרן הידרוקסיד (sodium hydroxide) בריכוז 1 M.

לאחר החזרת התמיסה ל-pH ניטרלי, ערבבו קצרות באמצעות וורטקס. לאחר מכן, החזירו מיד למגש הקרח כדי למנוע מהתערובת להתחיל להקשות. הוציאו בעדינות 40 µL מהמדיום מהבאר המכילה את הסטרואיד של הגידול.

שמרו 40 µL אלו בזמן ביצוע השלב הבא. בדקו את הבאר כדי לראות אם הסטרואיד הוסר בשלב הקודם. אם לא, החזירו את ה-40 µL לבאר וחזרו על השלב הקודם.

אם כן, הוסיפו למבחנה את ה-40 µL המכילים את הסטרואיד. ערבבו בעדינות את מבחנה אחת לפני העברת התערובת במנות של 60 µL לשלושה בארות נפרדות של פלטה בעלת 96 בארות. בחנו כל בארה תחת מיקרוסקופ לאחר הוספת התערובת כדי לקבוע איזו בארה מכילה את הסטרואיד. לאחר מכן, הוסיפו למבחנה שתיים כ-2 µL של sodium hydroxide בריכוז 1 M ו-40 µL של מצע גידול תאים, וערבבו במכשיר vortex לפני החלוקה.

העבירו 60 µL מתערובת זו לבאר ריקה בלוח 96 בארות וסמנו אותה כביקורת נטולת תאים. הניחו את הלוח באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת לפחות כדי ליצור רשת של נקודות דגימה. ראשית, העבירו את לוח הדגימות מהאינקובטור לשולחן המיקרוסקופ.

המתינו 10 דקות לאיזון של הדגימה לטמפרטורת החדר אם אין לרשותכם במה מחוממת. בחנו את הדגימה בעזרת עדשות אובייקטיביות בעוצמה נמוכה כדי לוודא שהיא שלמה ומוכנה לדימות. קבעו את מיקום הגידול בתוך הבאר ותעדו זאת באמצעות תמונה באור תC (transmitted light) לצורך רישום מרחבי משותף (spatial co-registration) בהמשך.

בדרך כלל, 20 נקודות דגימה בכל באר, המפוזרות בטבעות קונצנטריות מסביב לספרואיד ה-S, יניבו תוצאות מפורטות מספיק. הזז את הבמה לכל מיקום רצוי והשתמש בתוכנת ממשק המיקרוסקופ כדי להקליט את קואורדינטות ה-XNY. העבר את המיקרוסקופ לעדשה אובייקטיבית בעלת הגדלה גבוהה ובחר את קוביית המסננים המתאימה לאורך גל העירור של גששי המעקב.

באמצעות רשימת הנקודות שנוצרו, עברו לנקודה הראשונה ברשת. התאימו את המיקוד כדי למצוא את תחתית הבאר לפני התקדמות למעלה. זאת כדי למצוא שדה ראייה המכיל מספר גששים עוקבים (tracer probes) במיקוד.

עקבו אחר ההיסטוגרמה של העוצמה וכווןנו את עוצמת החשיפה ואת זמן החשיפה כדי להגיע לטווח הדינמי הגבוה ביותר האפשרי, תוך הבטחה שהתמונה לא תהיה רוויה. השגו רצף וידאו בקצב דגימה של 20 עד 30 milliseconds לכל פריים ושמרו אותו לפי מוסכמת שמיות מתאימה. במהלך ההקלטה, אין לגעת במיקרוסקופ או בשולחן.

חזרו על ההקלטה עבור כל נקודת דגימה ברשת. לאחר מכן, המשיכו לחזור על התהליך כדי לבנות רשת עבור כל באר בניסוי, וחזרו על התהליך כולו עבור כל נקודת זמן לאורך תקופת הניטור האורכי.

כדי להתחיל בניתוח הנתונים, העתירו את כל נתוני הווידאו לתיקיית ניתוח. ייבאו את נתוני התמונה ל-MATLAB או לתוכנה אחרת לניתוח נתונים.

כייל את התוכנה על ידי ניתוח של מספר פריימים מהסרטון כדי לקבוע באופן 적절 את פרמטרי הבחירה והפסילה לזיהוי מיקומי מרכז הגשש. לאחר מכן, השתמש בתוכנה כדי לקבוע באופן אוטומטי את מיקומו של כל גשש עבור כל פריימי הסרטון, וקשר מיקומים אלו למסלולים (trajectories). השתמש בנתוני המסלול כדי לחשב את ההעתקה הריבועית הממוצעת או MSD כפונקציה של זמן השיהוי (lag time), תוך הקפדה ליישם את מקדם הכיול המרחבי המתאים עבור העדשה אובייקטיבית הספציפית או עבור כל איחוד פיקסלים (pixel binning).

חשבו את G Star באמצעות יחסי סטוקס-איינשטיין המוכללים, תוך התחשבות במגבלות הישימות של יחסי סטוקס-איינשטיין המוכללים עבור דגימה מסוימת. חזרו על שלבי הניתוח עבור כל שדה ראייה בניסוי. בצעו רישום משותף (coregister) של נתוני המיקום עם המודול הוויסקו-אלסטי (viscoelastic mod I) בתדר ספציפי הנבחר, בהתאם ליצרן המיקרוסקופ שבו נעשה שימוש.

ניתן להקל על שלב זה באמצעות שגרה מותאמת אישית, המקראת את המטא-דאטה של המיקרוסקופ, או שניתן לטבלא את נתוני המיקום באופן ידני. רצפי וידאו נרכשים במיקומים מרחביים מרובים בתוך באר מייצגת המכילה קשרית גידול תלת-ממדית, ומקושרים כדי לספק מפת מיקרו-רדיולוגיה מרחבית של הדגימה כאשר מנטרים לאורכו של זמן אוכלוסיות של תאים בפריפריה של הכלי. סוגי הסטרואידים שבהם נעשה שימוש בדוגמה זו יפרקו באופן ספונטני את סיבי הקולגן הסובבים ויפלו למטריקס החוץ-תאי תוך מספר ימים.

בדוגמה זו, רישום משותף (co-registration) של מיקרוסקופיה מספק קריאה כמותית של הפלישה הברורה למטריקס המתרחשת משמאל לסטרואיד, אך לא מימינו. ניטור אורך של אזורים מרחביים שונים אלו מראה ירידה ברכיב הממשי של מודול הגזירה הוויסקו-אלסטי המורכב בכשלושה סדרי גודל, במקביל לפלישה. נתונים מלאים התלויים בתדר מוצגים תוך השוואת התכונות הרולוגיות של החומר באזור אחד ובאזור שני ביום הרביעי.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי יש לנקוט משנה זהירות כדי להימנע ממכשולים נפוצים במהלך ניתוח מסלולי הגששים (probe trajectories), אשר עלולים להוביל למסקנות שגויות. אנו ממליצים לקוראים לעיין בספרות ה-PTM המצוטטת כאן, העוסקת בשיקולים כגון סחיפת דגימה (sample drift) ופרשנות של הטרוגניות. ניתן לשלב פרוצדורה זו עם דימויי פלואורסצנציה אורכיים או סופיים נוספים כדי לענות על שאלות אחרות, כגון האופן שבו עיצוב מחדש מכני (mechanical remodeling) נמצא במתאם עם אירועי איתות מרכזיים או תגובה ציטוטוקסית להתערבות.