Name: מדידת אורך של תאי מטריקס קשיחות במודלי גידול 3D באמצעות Microrheology מעקב חלקיקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-10T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: למדו מדידת שינויים במכניקת מטריקס חוץ-תאית במודלי סרטן תלת-ממדיים באמצעות מיקרוריאולוגיה מעקב חלקיקים. שיטה זו מאפשרת ניתוח לא הרסני של מכניקת הגידול לאורך זמן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו בתודה להכיר שיתוף הקוד הפתוח של קוד מעקב של חלקיק MATLAB הניתן על ידי מריה Kilfoil <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">(http://people.umass.edu/kilfoil/),</a> יחד עם הקוד קודם לכן IDL ותיעוד מקיף הניתן על ידי ג &#39;ון ג קרוקר ואריק שבועות ר &#39;. עבודה זו התאפשרה על ידי מימון מהמכון הלאומי לסרטן (NCI / NIH), K99CA155045 וR00CA155045 (PI: JPC).

1. Spheroids גידול Culturing <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 10 מיליליטר של מים כיתה תרבית תאים עם 0.1 גרם של agarose כדי להשיג פתרון agarose 1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון agarose חום לעיל 70 מעלות צלזיוס (בערך 14 שניות במיקרוגל רגיל או באמצעות צלחת חימום) לפני aliquoting 40 μl של פתרון agarose לתוך באר בצלחת 96 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 1 ואילו קצירת תאים תוך שימוש בטכניקות סטנדרטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש hemacytometer כדי לקבוע את הריכוז של תאים בתרחיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל השעיה תא ל1,000 תאים / מיליליטר ולהוסיף דילול זה 100 μl הלמכיל גם מיטת agarose נרפאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המדגם על שייקר לילה בחממה שנקבעה על 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדגם מייקר ולהוסיף של תקשורת בתרבות תא 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הספרואידים עד לקוטר רצוי. לדוגמא, לאחר 9 ימים, spheroid יהיה כ 450 מיקרומטר קוטר. במהלך תקופה זו, תקשורת צמיחה טרי ניתן להוסיף לבארות, אך יש להימנע משאיפה שכן זה יגרום להסרה של אליפטית. </li></ol> 2. הכנת spheroids גידול 3D המשובץ בECM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תחנת עבודה עם חומרים הדרושים בתוך הזרימה למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת מדוללת של 1 מיקרומטר בדיקות נותב-הותאם carboxylate קוטר ניאון על ידי הוספת בדיקות מניית 2 חלקים (מוצקי 2%) ל25 חלקי מים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בקבוק 3.1 מ&quot;ג / מיליליטר קולגן שור מהמקרר ומניח אותו על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 125 μl של קולגן לתוך בקבוקון 2 מיליליטר ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של דילול פתרון בדיקה נותב לבקבוקון המכיל קולגן ובקצרה מערבולת להפיץ בדיקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 235 μl של תקשורת בתרבות התא המתאימה המכילה פנול אדום (שיצהיב) עבור נפח כולל של 410 מ&quot;ל ובקצרה מערבולת לפני הסרת 205 מיליליטר (חצי מהנפח הכולל) ולמקם אותו בבקבוקון מיליליטר 2 חדש. 1 הבקבוקון יכיל אליפטית הגידול והבקבוקון 2 יהיה תערובת שליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף ~ 2 μl של 1 M NaOH לבקבוקון 1 להביא את הפתרון בחזרה לpH הניטרלי (תקשורת ותרבות המכילה פנול אדום צריכה לחזור לאדום). שים לב שזה יגרום לתערובת כדי להתחיל בריפוי אם היא לא שמרה על קרח. בקצרה מערבולת לערבב, ולאחר מכן לחזור למדף קרח באופן מיידי. הערה: אליפטית הוא בקושי נראה לעין בלתי מזוינת, לאחר 9 ימים של התרבות והסרתה מהמיטה agarose היא משימה עדינה. שימוש במיקרוסקופ לנתיחה עשוי להיות מועיל עבור חלק מהמשתמשים. השמירה על שלמות אליפטית במהלך ההעברה היא בעל חשיבות עליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פיפטה קצה רחב פה, בעדינות להסיר 40 μl של מדיה מן הבאר מכילה אליפטית הגידול. לשמור על זה 40 μl בעת ביצוע השלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו היטב כדי לראות אם אליפטיתהוסר בשלב הקודם. אם זה היה, להוסיף μl 40 מכיל אליפטית לבקבוקון 1. אם לא, מקום 40 μl חזרה אל תוך הבאר וחזור על השלב הקודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות מערבב 1 יאל (לא להסתכן vortexing, זה עלול לגרום נזק לאליפטית) לפני העברת התערובת ב60 מנות μl לשלוש בארות נפרדות מצלחת 96 היטב. בדוק היטב כל אחד עם מיקרוסקופ לאחר הוספת תערובת כדי לקבוע שגם מכיל את אליפטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף ~ 2 μl 1 M NaOH ו40 μl של תקשורת בתרבות תא לבקבוקון 2 מערבולת לפני aliquotting 60 μl של תערובת זו לריקה גם בצלחת 96 היטב ותיוג כביקורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת באינקובטור 37 C ° לרפא במשך שעה לפחות 1. </li></ol> 3. לבנות רשת של נקודות לדוגמא וקח את וידאו בכל נקודה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את צלחת המדגם מן החממה לבמה מיקרוסקופ. לאפשר 10 דקות למדגם לequilibrate עם טמפרטורת החדר אם במה מחוממת אינה זמינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לדוגמא עם עדשות אובייקטיביות המופעלים נמוכות כדי לוודא שהוא שלם ומוכן להדמיה. לקבוע את מיקום הגידול בתוך הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחליט כמה נקודות מדגם לקחת. בדרך כלל, 20 נקודות דגימה בכל טוב, שהופצו בטבעות קונצנטריות סביב אליפטית תפיק תוצאות מספקת מפורטות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזיז את הבמה לכל מיקום רצוי ולהשתמש בתוכנת מיקרוסקופ התממשקות כדי להקליט את קואורדינטות x ו-y (או רשומת קואורדינטות באופן ידני אם ממשק תוכנה אינו זמין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את המיקרוסקופ לעדשה גבוהה מופעל על מטרה (בדרך כלל 100X), ובחר את קוביית המסנן המתאימה לגל העירור של בדיקות המעקב. השתמש ברשימה של נקודות שנוצרו בשלב 3.4 כדי לעבור לנקודה הראשונה ברשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את המיקוד כדי למצוא את תחתית הבאר, ולאחר מכן להעביר עד למצוא שדה הראייה (FOV) המכיל כמה טראק בפוקוסאה בדיקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב להיסטוגרמה האינטנסיביות ולהתאים את עוצמת החשיפה וזמן לתת הטווח הדינמי הגדול ביותר אפשרי, תוך הבטחה כי התמונה אינה הופכת להיות רווי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג רצף וידאו בקצב פריימים של 20-30 אלפיות שני לכל מסגרת (כ 800 מסגרות או 16-24 שניות באורך מומלץ לספק סטטיסטיקות מספיקות לחישוב MSD חזק מאוזנת עם צורך מזעור זמן רכישה בכל נקודת רשת מרחבית) ולשמור עם אמנה מתאימה. במהלך ההקלטה, אל תיגעו מיקרוסקופ או שולחן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.6-3.9 עבור כל נקודת דגימה ברשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.3-3.10 לכל אחד גם בניסוי. </li></ol> 4. לנתח וידאו נתונים כדי לחשב מאפייני Rheological בכל נקודה לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העתק את כל נתוני וידאו לתיקיית ניתוח (אולי במחשב אחר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני יבוא תמונה לתוך MATLAB או תוכנות ניתוח אחרות. איןTE: תיעוד נרחב לגבי הסט של רוטינות מעקב אחר חלקיקי MATLAB אימצו כאן הוא זמין <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">בhttp://people.umass.edu/kilfoil.</a> השימוש בפונקציה קוראת מותאם אישית לאוטומציה עיבוד של מספר קבצים בעמדות שונות מומלצת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכייל את התוכנה על ידי ניתוח מספר פריימים של וידאו כדי לקבוע כראוי פרמטרים בחירה ודחייה (גודל, bandpass, וכו &#39;) לזיהוי עמדות מרכז בדיקה. רקע נרחב לצעדים חיוניים אלה מתואר על ידי קרוקר וגריר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנה כדי לקבוע באופן אוטומטי כל עמדת בדיקה לכל מסגרות הווידאו ולאחר מכן לקשר את העמדות הללו למסלולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בנתוני המסלול כדי לחשב את התזוזה הממוצעת בריבוע (MSD) כפונקציה של זמן השהיה, להיות בטוח כדי להחיל את גורם כיול המרחבי המתאים (מיקרומטר לפיקסל) לעדשה הספציפית האובייקטיבית, כל binning פיקסל, וכו &#39;(שבוצע בדרך כללבmeta-data). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב * G (באמצעות ביחס סטוקס איינשטיין הכללי לקחו בחשבון את גבולות תחולתה של GSER למדגם מסוים 24,28,43. לחלופין, משתמשים עשויים לרצות לפרש מאפייני ECM ישירות מMSD פשוט על ידי ההשוואה דרוג חוק החשמל, מישור ערכים, מדדים של הטרוגניות או פרמטרים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.2 דרך 4.6 עבור כל שדה ראייה בניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיתוף לרשום נתוני מיקום מצעד 3.4 עם modulii viscoelastic בתדר מסוים של עניין. בהתאם ליצרן של המיקרוסקופ בשימוש, ניתן להקל שלב זה על ידי שגרה מותאמת אישית אשר קוראת metadata מיקרוסקופ או עמדה ניתן נספרו הנתונים באופן ידני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפונקציות אינטרפולציה 3D כדי ליצור מפת rheology המרחבי של ECM. </li></ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

בפרוטוקול זה אנו מציגים אסטרטגיה חזקה וישימה באופן נרחב לאורכי מעקב אחר שינויים מקומיים בקשיחות ECM במודלי גידול 3D. אנחנו מדמיינים שמתודולוגיה זו יכולה להיות מאומצת על ידי ביולוגים בסרטן וBiophysicists מתעניינים בהתנהגות mechanosensitive מעורבת בשיפוץ מטריקס במהלך גידול ותהליכי פלישה. כימות מדויק של קינטיקה השפלה המטריצה ​​יכול להיות בעל ערך במיוחד לאלה שלומדים את הפעילות של metalloproteases מטריקס, מונואמין lysyl או מיני יוכימיים רלוונטיים אחרים במודלי 3D גידול שקשור ישירות לשיפ...

זה ברור מגוף הולך וגדל של ראיות בספרות שתאי הסרטן, כמו בתאי האפיתל של יונקים שאינם ממאירים, הם רגישים מאוד לתכונות מכאניות וbiophysical של מטריקס סביב תאי (ECM) ורכיבי המיקרו אחרים 1-9. מחקרים מכניסטית אלגנטיים סיפקו תובנות לתוך התפקיד של קשיחות תאית כשותף איתות mechanosensitive מורכב המווסת את ההתנהגות ממארת צמיחה והמורפוגנזה 2,3,10,11. עבודה זו כבר בהנחייתם בפרט על ידי הפיתוח של 3D במודלי גידול מבחנה שלשחזר ביולוגי ארכיטקטורת רקמה רלוונטית וניתן לגדל בחומרי פיגום עם מכניקה מתכונן וצלמו ידי מיקרוסקופיה אופטית 12-19. עם זאת, הצד השני של הדו שיח הזה בין mechanoregulatory גידול והמיקרו, שדרכו תאי הסרטן בתורו לשנות את rheology של סביבתם האחר, נותר במידה מסוימתקשה יותר ללמוד. לדוגמא, במהלך תהליכי פלישה, תאים בפריפריה של גידול עשויים לעבור אפיתל למעבר mesenchymal (EMT) ולהגדיל את הביטוי של metalloproteases המטריצה ​​(MMPs) שגורמים להשפלה מקומית של 20-22 ECM, אשר בתורו משפיע mechanosensitive צמיחת התנהגות של תאים סרטניים הפרוקסימלי אחרים. באמצעות מגוון רחב של תהליכים ביוכימיים, תאים סרטניים לחייג הרף הקשיחות המקומית של הסביבה שלהם למעלה ולמטה כדי להתאים את התהליכים שונים בזמנים שונים. המתודולוגיה שתוארה כאן היא מונעת על ידי הצורך בכלים אנליטיים הלדווח על שינויים מקומיים בנוקשות והציות של ECM בצמיחה, שיכול להיות משולב עם מודלים גידול 3D וקורלציה אורכים עם שינויים ביוכימיים ופנוטיפי ללא הפסקת התרבות. בחיפוש טכניקה מתאימה ליישום בהקשר זה, microrheology חלקיקי המעקב (PTM) מתגלה כמועמד חזק.בשיטה זו, הייתה חלוצה במקור על ידי מייסון וייץ 23,24, משתמש בתנועה של בדיקות מעקב מוטבעות בנוזל מורכב לדווח מודולוס התדירות תלויה מורכב הגזירה viscoelastic, G * (ω) בקני מידת אורך מיקרון. גישה כללית זו פותחה עם וריאציות מרובות מתאימות ליישומים שונים בעניין, קולואידים, ביופיסיקה-מרוכז רכה ופיסיקה פולימר 25-31. יש PTM יתרונות מסוימים ביחס לשיטות אחרות, שכן מונה המציין viscoelasticity המקומי מסופק על ידי וידאו הדמיה שאינה הרסנית של בדיקות מעקב ביוכימית פעילה המשולבות בעת הכנת התרבות ולהישאר במקום לאורך תקופות ממושכות של צמיחה. זאת בניגוד למדידות תקן זהב עם rheometer oscillatory גזירה בתפזורת, שבהכרח דורש הפסקת התרבות ומדווח rheology מקרוסקופית התפזורת של המדגם ולא מדידות נקודה בתוך microenvir גידול 3D המורכבonment. ואכן מספר מחקרים הדגימו את התועלת של פרשנות מדידות של תנועות חללית נותב או סביב תאים סרטניים או שאינו סרטניים למדוד עיוותים הקשורים לתא הגירה 32, לחץ מכאני הנגרם על ידי אליפטית הרחבת 33, rheology תאיים 34,35, ו למפה לחצים מכאניים וזנים ברקמות מהונדסות 36, ויחס בין גודל הנקבובית ומהירות פלישת 37. טכניקות אחרות מתאימות לmicrorheology, כגון מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ניתן ליישם, אבל בעיקר לחיטוט נקודות במדגם השטח וגם עלולות להוות בעיות עקרות התרבות שתסבכנה מדידות אורך 38. כאן אנו מתארים פרוטוקול מקיף הכולל שיטות לצמיחה של הספרואידים גידול 3D מתאימים להעברה לECM עם בדיקות ניאון משובצות לשיטות וידאו חלקיקי מעקב וניתוח לאופן מהימן מיפוי מרחבישינויים בmicrorheology לאורך זמן בתרבות. ביישום הנוכחי, מודלים 3D גידול גדלים בפורמט multiwell עם נוף לכיוון שילוב של מדידות microrheology עם מבחני אחרים מסורתיים (למשל, cytotoxicity) שהפורמט הזה הוא תורם ל. באיור נציג זה של במבחנה הספרואידים זה אנו המתודולוגיה תרבות 3D באמצעות PANC-1 תאים, שורת תאי סרטן לבלב הוקמה הידועה כדי ליצור הספרואידים 39, אבל כל המדידות שתוארו במסמך זה הן החלים רחב ללמוד בגידולים מוצקים תוך שימוש במגוון של שורות תאים מתאים לתרבות 3D. מכיוון שהוא מבוססת הדמיה בשיטה זו המיסוד הוא אידיאלי לשיתוף רישום של נתונים microrheology ברזולוציה גבוהה עם שדות מועברים האור גדולים של דעה כי לדווח על שינויים בצמיחת תאים, הגירה ופנוטיפ. יישום PTM משולב עם מיקרוסקופ אור להעביר בדרך זו מניחה מיצוב לשחזור של Wh הבמה מיקרוסקופich הוא בדרך כלל זמין במיקרוסקופים ביולוגיים epifluorescence widefield המסחרי ממונעים. הפרוטוקול שפותח בהמשך יכול להיות מיושם עם כל מיקרוסקופ ביולוגי הקרינה אוטומטית מצויד באופן סביר. זוהי שיטה עתירת נתונים מיסודו, שדורשת רכישה של ג&#39;יגה בייט של נתונים במיקרוסקופ וידאו דיגיטליים לעיבוד מקוון. בפרוטוקול הבא, פרוטוקול 1 נוגע להכנה הראשונית של הספרואידים גידול אשר מתואר כאן על ידי שימוש בכיסוי agarose אבל יכול להיות תחליף עם מגוון רחב של שיטות אחרות כגון ירידה תלויה 40, או תרבות סיבובית 41 טכניקות. פרוטוקול 2 מתאר את התהליך של הטבעת הספרואידים בפיגום קולגן אם כי לחלופין, במבחנה גידולי 3D יכולים להיות גדלו באנקפסולציה או הטבעה של תאי resuspended בECM 12,15, ולא הספרואידים אינם חסיד מראש יצרו אחת. הפרוטוקולים הבאים מתארים נהלים לobtaining מדידות microrheology זמן נפתר על ידי הרכישה ועיבוד של נתונים במיקרוסקופ וידאו, בהתאמה. עיבוד נתונים מתואר באמצעות MATLAB, מה שהופך את השימוש בגרות קוד פתוח לPTM הבנוי על אלגוריתמים שתוארו במקור על ידי קרוקר וגריר 42, שיש גם פותחו בהרחבה לפלטפורמות תוכנה שונות (ראה http://www.physics.emory.edu/ ~ שבועות / IDL /).

<table><tbody><tr><td>קולגן בקר מסוג 1</td><td>BD Biosciences, סן חוזה, קליפורניה</td><td>354231</td><td></td></tr><tr><td>PANC-1</td><td>תרבית תאים מסוג אמריקאי, Manassas, VA</td><td>CRL1469</td><td>או סוג תא מתאים אחר</td></tr><tr><td>Fluorescent Microspheres</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA</td><td>906906</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences, Bedford, MA</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td><td>C12H18O9</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td><td>NC0480985</td><td></td></tr><tr><td>לוחות הדמיה 96 בארות</td><td>Corning Inc., Corning, NY</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone, Waltham, MA</td><td>SH30243.01</td><td>או מדיה מתאימה לתרבית תאים</td></tr><tr><td>Zeiss AxioObsever Microscope</td><td>Zeiss, Oberkochen, גרמניה</td><td></td><td>כולל מצלמה מהירה ותוכנת הדמיה</td></tr><tr><td>MATLAB תוכנת</td><td>The Mathworks, Natick, MA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

מדידת אורך של תאי מטריקס קשיחות במודלי גידול 3d באמצעות microrheology מעקב חלקיקים

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Microenvironment המכני הוכח לפעול כרגולטור חיוני של גידול בצמיחת התנהגות ואיתות, אשר עצמו שופץ והותאם כחלק מסדרה של יחסי גומלין מורכבים, דו כיוונית mechanosensitive. בעוד שהפיתוח של מודלים 3D גידול ביולוגי רלוונטיים הקל מחקרים מכניסטית על ההשפעה של rheology מטריצה ​​על צמיחת גידול, הבעיה ההפוכה של שינויי מיפוי בסביבה מכאנית הנגרמת על ידי גידולים נותרת מאתגרת. כאן, אנו מתארים את יישום microrheology מעקב חלקיקים (PTM) בשילוב עם מודלים 3D של סרטן לבלב כחלק מגישה חזקה וברת קיימא עבור אורכי ניטור שינויים פיזיים בmicroenvironment הגידול, באתרם. המתודולוגיה שתוארה כאן משלבת מערכת של הכנה במבחנה המודלים 3D המשובץ במטריצה ​​תאית מודל פיגום (ECM) של סוג קולגן אני עם בדיקות שכותרתו fluorescently מפוזרות באופן אחיד לפוsition ומדידות microrheology תלוי זמן לאורך כל הדגימה. במבחנה גידולים הם מצופים ונחקרו בתנאים מקבילים באמצעות צלחות הדמיה multiwell. ציור על שיטות מבוססות, קטעי וידאו של תנועות חללית נותב הופכים באמצעות היחס כלליים סטוקס איינשטיין (GSER) לדווח מודולוס מורכב התדירות תלויה הגזירה viscoelastic, G (ω) *. מכיוון שגישה זו היא מבוסס הדמיה, אפיון מכאני ממופה גם הוא על שדות המרחבית מועבר אור גדולים לדווח בו זמנית שינויים איכותיים בגודל גידול 3D ופנוטיפ. נציג תוצאות מראים מנוגד תגובה מכאנית בתת אזורים הקשורים בשפלה מקומית-Induced פלישת מטריקס, כמו גם כיול מערכת, אימות נתונים מוצגים. תוצאות בלתי רצויות מטעויות ניסיוניות נפוצות ופתרון בעיות בנושאים אלה גם מוצגות. פורמט ציפוי תרבות 96 היטב 3D מיושם בפרוטוקול זה הוא גonducive למתאם של מדידות microrheology עם מבחני מיון טיפוליים או הדמיה מולקולרית כדי לקבל תובנות חדשות על השפעה של טיפולים או גירויים ביוכימיים בmicroenvironment המכני.

כדי לוודא את תוקפו של G * מדידות (ω) בעמדות מקומיות בתוך microenvironment גידול מודל מורכב, שני ניסויי אימות ראשוניים בוצעו. ראשית, אנו ביקשנו לאמת את המדידות שלנו נגד &quot;תקן הזהב&quot; של rheometry הגזירה תנודתית בתפזורת. הכנו דגימות זהות של מטריצת הקולגן (ללא תאים) בריכוז של 1.0 קולגן מ&quot;ג / מיליליטר. דגימות אלו נבדקו עם rheometer תפזורת (ת&quot;א מכשירי AR-G2, באמצעות 40 מ&quot;מ גיאומטריה צלחת מקבילה) ועל ידי PTM (באמצעות אותם פרמטרים כמו בכל פרוטוקול ...

microrheology מעקב חלקיק יכול להיות בשימוש למי שאינו הרסני לכמת ומרחבית מפת שינויים בתכונות מכאניות מטריצה ​​תאית במודלי גידול 3D.

מדידת אורך של תאי מטריקס קשיחות במודלי גידול 3D באמצעות Microrheology מעקב חלקיקים

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד שינויים לאורכיים בתכונות המכניות של המטריצה החוץ-תאית במודלים תלת-ממדיים של סרטן. זאת מושג תחילה על ידי קצירת תאי סרטן והצמחת הספרואיד הגודלי בשיטה מתאימה עד להגעה לגודל הרצוי. השלב השני הוא הטמעת הספרואיד הגודלי בקולגן או במטריצה חוץ-תאית מתאימה אחרת.בשלב הבא, נבנית רשת של נקודות דגימה וסרטון מוקלט בכל נקודה. השלב הסופי הוא ניתוח נתוני הווידאו, חישוב וביצוע רישום משותף (coregister) של תכונות לוגיות ממשיות בכל נקודה מרחבית. בסופו של דבר, פרוטוקול זה משתמש בניתוח של מסלולי גששיים (tracer probes) כדי לכמת לאורך זמן שינויים מרחביים במכניקה של המטריצה החוץ-תאית באופן לא הרסני.הרעיון הוא שעל ידי שילוב של מדידות מבוססות דימיות של רדיולוגיה של המטריצה החוץ-תאית עם מודלים תלת-ממדיים של גידולים in vitro, המשחזרים אינטראקציות של המטריצה החוץ-תאית, גישה זו יכולה לספק תובנה כמותית לגבי שינויים תלויי-זמן במיקרו-סביבה המכנית הנלווים לתהליכי צמיחת גידול, פלישה ותגובה לטיפול. השיטה המוצגת בסרטון זה מאמצת גישת ציפוי aros ליצירת OIDs תלת-ממדיים שאינם נצמדים, מתאי תאי סרטן הלבלב המבוססים על קו התאים המקובל pan one. כדי להתחיל, ערבבו 10 milliliters של מים בדרגת תרבית תאים עם 0.1 gram של aros כדי להוסיף תמיסת aros בריכוז 1%.חממו את תמיסת ה-aros לטמפרטורה שמעל 70 °C לפני השימוש. לאחר העברת 40 µL מהתמיסה לכל באר בלוח 96 בארות, דגרו את הלוח בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. קצרו את תאי הסרטן באמצעות trypsin והכינו תרחיף של תאים בודדים לפני דילול התרחיף ל-1000 תאים ל-mL. הוסיפו 100 µL מדילול זה לבאר המכילה את שכבת ה-aros המקשורה.הנח את הדגימה על שייקר למשך הלילה בתוך אינקובטור המכוון ל-37 °C ו-5%CO2 לאחר האינקובציה. הוצא את הדגימה מהשייקר והוסף 100 µL של מצע לתרבית תאים, והמשך להדגיר את הסטרואיד שנוצר עד להגעה לקוטר הרצוי. לדוגמה, לאחר תשעה ימים, סטרואיד אחד יהיה בקוטר של כ-450 microns.לפני תחילת העבודה, הכינו תחנת עבודה בתוך מבתר זרימה למינרית עם שתי בקבוקונית של שני מיליליטר. בקבוקונית אחת תכיל את הסטרואיד של הגידול והשנייה תשמש כביקורת נטולת תאים. הכינו תמיסה מדוללת של גששים פלואורסצנטיים בעקבה בקוטר מיקרון אחד ששופרו באמצעות קרבוקסילאט, על ידי הוספת שני חלקים של גששים מהמלאי ל-25 חלקים של מים סטריליים.הוציאו מהמקרר בקבוק של קולגן בקר בריכוז 3.1 mg/mL והניחו אותו על קרח. העבירו (aliquot) 125 µL של קולגן, ולאחריהם 50 µL של תמיסת גשש (tracer probe) מדוללת אל תוך מבחנה אחת; ערבבו קצרה במכשיר וורטקס (vortex) כדי לפזר את הגששים. לאחר מכן, הוסיפו 235 µL של מצע גידול תאים מתאים המכיל phenol red, לנפח סופי של 410 µL, וערבבו קצרה בוורטקס לפני העברה של 205 µL אל תוך מבחנה שנייה. לבסוף, הוסיפו למבחנה כ-2 µL של נתרן הידרוקסיד (sodium hydroxide) בריכוז 1 M.לאחר החזרת התמיסה ל-pH ניטרלי, ערבבו קצרות באמצעות וורטקס. לאחר מכן, החזירו מיד למגש הקרח כדי למנוע מהתערובת להתחיל להקשות. הוציאו בעדינות 40 µL מהמדיום מהבאר המכילה את הסטרואיד של הגידול.שמרו 40 µL אלו בזמן ביצוע השלב הבא. בדקו את הבאר כדי לראות אם הסטרואיד הוסר בשלב הקודם. אם לא, החזירו את ה-40 µL לבאר וחזרו על השלב הקודם.אם כן, הוסיפו למבחנה את ה-40 µL המכילים את הסטרואיד. ערבבו בעדינות את מבחנה אחת לפני העברת התערובת במנות של 60 µL לשלושה בארות נפרדות של פלטה בעלת 96 בארות. בחנו כל בארה תחת מיקרוסקופ לאחר הוספת התערובת כדי לקבוע איזו בארה מכילה את הסטרואיד. לאחר מכן, הוסיפו למבחנה שתיים כ-2 µL של sodium hydroxide בריכוז 1 M ו-40 µL של מצע גידול תאים, וערבבו במכשיר vortex לפני החלוקה.העבירו 60 µL מתערובת זו לבאר ריקה בלוח 96 בארות וסמנו אותה כביקורת נטולת תאים. הניחו את הלוח באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת לפחות כדי ליצור רשת של נקודות דגימה. ראשית, העבירו את לוח הדגימות מהאינקובטור לשולחן המיקרוסקופ.המתינו 10 דקות לאיזון של הדגימה לטמפרטורת החדר אם אין לרשותכם במה מחוממת. בחנו את הדגימה בעזרת עדשות אובייקטיביות בעוצמה נמוכה כדי לוודא שהיא שלמה ומוכנה לדימות. קבעו את מיקום הגידול בתוך הבאר ותעדו זאת באמצעות תמונה באור תC (transmitted light) לצורך רישום מרחבי משותף (spatial co-registration) בהמשך.בדרך כלל, 20 נקודות דגימה בכל באר, המפוזרות בטבעות קונצנטריות מסביב לספרואיד ה-S, יניבו תוצאות מפורטות מספיק. הזז את הבמה לכל מיקום רצוי והשתמש בתוכנת ממשק המיקרוסקופ כדי להקליט את קואורדינטות ה-XNY. העבר את המיקרוסקופ לעדשה אובייקטיבית בעלת הגדלה גבוהה ובחר את קוביית המסננים המתאימה לאורך גל העירור של גששי המעקב.באמצעות רשימת הנקודות שנוצרו, עברו לנקודה הראשונה ברשת. התאימו את המיקוד כדי למצוא את תחתית הבאר לפני התקדמות למעלה. זאת כדי למצוא שדה ראייה המכיל מספר גששים עוקבים (tracer probes) במיקוד.עקבו אחר ההיסטוגרמה של העוצמה וכווןנו את עוצמת החשיפה ואת זמן החשיפה כדי להגיע לטווח הדינמי הגבוה ביותר האפשרי, תוך הבטחה שהתמונה לא תהיה רוויה. השגו רצף וידאו בקצב דגימה של 20 עד 30 milliseconds לכל פריים ושמרו אותו לפי מוסכמת שמיות מתאימה. במהלך ההקלטה, אין לגעת במיקרוסקופ או בשולחן.חזרו על ההקלטה עבור כל נקודת דגימה ברשת. לאחר מכן, המשיכו לחזור על התהליך כדי לבנות רשת עבור כל באר בניסוי, וחזרו על התהליך כולו עבור כל נקודת זמן לאורך תקופת הניטור האורכי.כדי להתחיל בניתוח הנתונים, העתירו את כל נתוני הווידאו לתיקיית ניתוח. ייבאו את נתוני התמונה ל-MATLAB או לתוכנה אחרת לניתוח נתונים.כייל את התוכנה על ידי ניתוח של מספר פריימים מהסרטון כדי לקבוע באופן 적절 את פרמטרי הבחירה והפסילה לזיהוי מיקומי מרכז הגשש. לאחר מכן, השתמש בתוכנה כדי לקבוע באופן אוטומטי את מיקומו של כל גשש עבור כל פריימי הסרטון, וקשר מיקומים אלו למסלולים (trajectories). השתמש בנתוני המסלול כדי לחשב את ההעתקה הריבועית הממוצעת או MSD כפונקציה של זמן השיהוי (lag time), תוך הקפדה ליישם את מקדם הכיול המרחבי המתאים עבור העדשה אובייקטיבית הספציפית או עבור כל איחוד פיקסלים (pixel binning).חשבו את G Star באמצעות יחסי סטוקס-איינשטיין המוכללים, תוך התחשבות במגבלות הישימות של יחסי סטוקס-איינשטיין המוכללים עבור דגימה מסוימת. חזרו על שלבי הניתוח עבור כל שדה ראייה בניסוי. בצעו רישום משותף (coregister) של נתוני המיקום עם המודול הוויסקו-אלסטי (viscoelastic mod I) בתדר ספציפי הנבחר, בהתאם ליצרן המיקרוסקופ שבו נעשה שימוש.ניתן להקל על שלב זה באמצעות שגרה מותאמת אישית, המקראת את המטא-דאטה של המיקרוסקופ, או שניתן לטבלא את נתוני המיקום באופן ידני. רצפי וידאו נרכשים במיקומים מרחביים מרובים בתוך באר מייצגת המכילה קשרית גידול תלת-ממדית, ומקושרים כדי לספק מפת מיקרו-רדיולוגיה מרחבית של הדגימה כאשר מנטרים לאורכו של זמן אוכלוסיות של תאים בפריפריה של הכלי. סוגי הסטרואידים שבהם נעשה שימוש בדוגמה זו יפרקו באופן ספונטני את סיבי הקולגן הסובבים ויפלו למטריקס החוץ-תאי תוך מספר ימים.בדוגמה זו, רישום משותף (co-registration) של מיקרוסקופיה מספק קריאה כמותית של הפלישה הברורה למטריקס המתרחשת משמאל לסטרואיד, אך לא מימינו. ניטור אורך של אזורים מרחביים שונים אלו מראה ירידה ברכיב הממשי של מודול הגזירה הוויסקו-אלסטי המורכב בכשלושה סדרי גודל, במקביל לפלישה. נתונים מלאים התלויים בתדר מוצגים תוך השוואת התכונות הרולוגיות של החומר באזור אחד ובאזור שני ביום הרביעי.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי יש לנקוט משנה זהירות כדי להימנע ממכשולים נפוצים במהלך ניתוח מסלולי הגששים (probe trajectories), אשר עלולים להוביל למסקנות שגויות. אנו ממליצים לקוראים לעיין בספרות ה-PTM המצוטטת כאן, העוסקת בשיקולים כגון סחיפת דגימה (sample drift) ופרשנות של הטרוגניות. ניתן לשלב פרוצדורה זו עם דימויי פלואורסצנציה אורכיים או סופיים נוספים כדי לענות על שאלות אחרות, כגון האופן שבו עיצוב מחדש מכני (mechanical remodeling) נמצא במתאם עם אירועי איתות מרכזיים או תגובה ציטוטוקסית להתערבות.

longitudinal-measurement-extracellular-matrix-rigidity-3d-tumor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

הנוקשות של מטריקס תאיים משפיעה התנהגויות רבות של תאים חסיד. קשיחות מטריקס משתנה מרחבית ברחבי רקמה, ועוברת שינוי בתנאי מחלה שונים. כאן אנו לפתח שיטות כדי לאפיין שינויים מרחביים קשיחות ברקמה נורמלית fibrotic ריאות עכבר באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי microindentation.

מיקרו מכונות אפיון רקמת הריאה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

פרוטוקול זה מתאר טכניקה לניטור שינויים בנוקשות מטריצה חוץ-תאית באמצעות מיקרו-ריאולוגיה עוקבת חלקיקים (PTM). זה נעשה על ידי תרבית ספרואידים תלת ממדיים של גידולי לבלב לתוך ECM עם בדיקות פלואורסצנטיות משובצות למעקב אחר חלקיקי וידאו וניתוח.

ניטור מיקרו-סביבה גידולי מבוסס PTM: שיטה למעקב אחר שינויים בקשיחות ECM באמצעות ספרואידים סרטניים

סרטון זה מציג מיקרוסקופ כמותי בהילוך מהיר להערכת הפצת מונוציטוגנים תלויי קשיחות מטריצה חוץ-תאית באמצעות תאי אנדותל. הידרוג'ל רך יותר מאפשר הפצה מהירה יותר של חיידקים דרך תאי אנדותל בהשוואה לעמיתים נוקשים יותר, ומדגיש את ההשפעה של קשיחות מטריצה על הפצת חיידקים.

מיקרוסקופ כמותי בהילוך מהיר להערכת הפצת חיידקים חוץ-תאיים תלויי קשיחות

מאמר זה מציג שיטה לתייג קולגן שניתן להשתמש בו גם תיקון נוסף ולהדמית חיה של תרביות תאי 3D fluorescently. כמו כן אנו מספקים פרוטוקול מותאם לדמיין חלבוני cytoskeletal אנדוגניים של תאים בתרבית בסביבות 3D.

חושף את ארגון cytoskeletal של תאי סרטן פולשני ב-3D

המטריצה ​​תאית עוברת שיפוץ משמעותי בריפוי פצעים, דלקות והיווצרות גידול. אנו מציגים גישה מיקרוסקופית immunofluorescence intravital רומן כדי להמחיש את הדינמיקה של סיבי, כמו גם רכיבי מטריצת רשת כמו עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה באמצעות epifluorescence או שני פוטונים במיקרוסקופ.

לטווח ארוך Intravital Immunofluorescence הדמיה של רקמות מטריקס רכיבים עם Epifluorescence ומיקרוסקופי שני פוטונים

קשיחות מכאנית במייקרו-הסביבה של הגידול ממלא תפקיד מכריע בהתנהגות נהיגה ממארת על ידי הגדלת פעילות invadopodia וactomyosin התכווצות. ג'לים באמצעות polyacrylamide (PaaS), יכולים להיות מנוצלים מבחני invadopodia וכוח המתיחה ללמוד את המאפיינים פולשנית והתכווצות של תאי סרטן בתגובה למטריצת קשיחות.

ג&#39;לים polyacrylamide לInvadopodia וגרירת חיל מבחני בתאי הסרטן

מיקרוריאולוגיה של מעקב אחר חלקיקים חוקרת את הצמיגות של חומרים. כאן, הטכניקה משמשת לקביעת הצמיגות, תאימות הזחילה ותפקידי הצלבה יעילים של רכיבי מטריצה שונים של ביופילם חיידקי. המטריצה מורכבת מחומרים פולימריים המופרשים על ידי החיידקים ומרכיביה קובעים את מבנה הביופילם ואת התכונות המכניות.

במיפוי באתרו של התכונות מכניות של Biofilms ידי Microrheology מעקב חלקיקים

נסביר פרוטוקול למידול במיקרו-סביבה של biophysical שבו crosslinking וקשיחות מוגברת של קרום במרתף (BM) הנגרמת על ידי endproducts גליקציה מתקדמים (גילאי) יש רלוונטיות פתולוגי.

איך ללמוד מרתף ממברנה נוקשות כמפעיל Biophysical הערמונית סרטן ומחלות גיל הקשורות אחרים או מחלות מטבוליות

פיתחנו assay מבוססי לזיהוי של עיצוב רב טוב עבור בודק את ההשפעה של מטריצה חוץ-תאית נוקשות על זיהום חיידקי של תאים חסיד. Assay הזה הוא תואם cytometry זרימה immunostaining, מיקרוסקופ כוח המתיחה, המאפשרות מדידות כמותיים של אינטראקציות biomechanical בין תאים, מטריצה חוץ-תאית, לבין חיידקים פתוגניים.

Assay מבוססי לזיהוי עיצוב רב טוב ללמוד את ההשפעה של מטריצה חוץ-תאית נוקשות על זיהום חיידקי של תאים חסיד

טומוגרפיה אופטית קוהרנטית (אוקטובר), טכנולוגיה הדמיה תלת-ממדית, שימש כדי לפקח, לאפיין את קינטיקה גידול של הגידול multicellular spheroids. כימות הנפחי מדויק של גידול spheroids באמצעות voxel של סופרים ושל הרקמה המתה ללא תווית זיהוי spheroids מבוסס על ניגוד מהותי הנחתה אופטי, היו הדגים.

האורך פיזיולוגיים מורפולוגיים ניטור של Spheroids תלת מימדי הגידול באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מבוסס מכניקה כדי לשבש את צומת הפער קונשין 43 ולמדוד את ההשפעה הבאה זה יש על ביומכניקה של אנדותל באמצעות התבוננות של מעקב ומדגיש התרבות.

Perturbing אנדותל ביומכניקה דרך קונשין 43 מבנית שיבוש

למדו מדידת שינויים במכניקת מטריקס חוץ-תאית במודלי סרטן תלת-ממדיים באמצעות מיקרוריאולוגיה מעקב חלקיקים. שיטה זו מאפשרת ניתוח לא הרסני של מכניקת הגידול לאורך זמן.

מדידת אורך של תאי מטריקס קשיחות במודלי גידול 3D באמצעות Microrheology מעקב חלקיקים

גלה סרטונים נוספים