Encapsulation של תמלול נטול סלולרי ומכונות בתרגום לשלפוחית ​​לבניית מחקה סלולרי

בזאת אנו מתארים שיטות פשוטות להכנה של שלפוחית, אנקפסולציה של שעתוק ותרגום מכונה, והניטור של ייצור חלבון. מערכות תא ללא כתוצאה מכך יכולות לשמש כנקודת התחלה שממנו ניתן לבנות מחקה סלולרי מורכב יותר ויותר.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבנות חיקויים תאיים מאפס באמצעות אנקפסולציה של מכונות תרגום שעתוק בשלפוחיות. זה מושג על ידי הכנת סרט שומנים דק תחילה. לאחר מכן, לאחר יצירת השלפוחית, הרכיבים מורכבים לתרגום שעתוק במבחנה.

השלב האחרון הוא למקם את מנגנון תרגום התמלול בתוך השלפוחית. בסופו של דבר, ניתן לעקוב אחר פעילות החיקוי התאי באמצעות מיקרוסקופיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות אנקפסולציה קיימות אחרות, כגון תחליבי מים ושמן, התקני מיקרו רטיקה, או תהליך המרת מים ושמן לשלפוחית הוא ששיטה זו קלה, זולה ומניבה שלפוחיות חזקות בעלות תכונות חדירות המתאימות היטב לבניית חיקויים תאיים המנצלים פונקציית חלבון מקודדת גנטית.

שיטה זו אינה יכולה לעזור לחקור תחומי מפתח בביולוגיה סינתטית נטולת תאים ומלמטה למעלה, כגון הגדרת הבסיס המינימלי של חיים ופיתוח טכנולוגיות דמויות חיים שאינן חיות. כדי ליצור סרט שומני דק התחל בהמסת POPC בכלורופורם בריכוז של 40 מיליגרם למיליליטר, ולאחר מכן יש להוציא 12 מיקרומול של POPC לבקבוק תחתון עגול של חמישה מיליליטר. לאחר מכן, השתמש בקליפ עגול כדי לחבר היטב את הבקבוק לצינור הזיקוק של מאייד סיבובי.

לאחר מכן באמצעות הגדרה שש, התחל סיבוב חזק ויציב של הבקבוק. לאחר מכן, התחל להזרים את המים דרך סליל הקבל. אין צורך לחמם את המים מכיוון שלכלורופורם יש נקודת רתיחה נמוכה של 61.2 מעלות צלזיוס.

באטמוספירה אחת, ודא שהמערכת פתוחה לאטמוספירה על ידי בדיקה שזין העצירה פתוח כדי להפעיל את הוואקום על המערכת בו זמנית. הפעל את משאבת הוואקום תוך סגירה איטית של זין העצירה. תן לאידוי הסיבובי להימשך 0.5 עד שעתיים לאחר שהכלורופורם כבר לא נראה בעין.

כדי לעצור את התהליך, שחרר לאט את לחץ הוואקום ועצור את הסיבוב. הסר את הבקבוק וסרט שומן דק אטום נראה על קירות הבקבוק כדי להשעות מחדש את השומן. התחל בהוספת מיליליטר אחד של 18.2 מגה אוהם מים נטולי יונים לסרט השומן הדק בבקבוק התחתון העגול מערבל במרץ את התמיסה בכ-3, 200 סל"ד עד שסרט השומנים מתנתק מהזכוכית.

זה אמור לקחת בערך דקה. לאחר מכן, העבירו את פיזור השומנים לצינור מיקרו צנטריפוגה של שני מיליליטר. הקימו מעמד טבעת כדי להחזיק הומוגנייזר המצויד בקצה של חמישה מילימטר והניחו מיקרו צנטריפוגה.

עמדו מתחת להומוגניזטור כדי להחזיק היטב את פיזור השומנים. לאחר מכן הנח את אלמנט הפיזור ישירות לתוך פיזור השומנים, וודא שהקצה לא ייגע בתחתית הצינור. הומוגניזציה של פיזור השומנים למשך דקה אחת.

ברמת הספק ארבע, הרכיבו את חלקי המכבש המיני, המורכב ממעטפת חיצונית ואום מחזיק המאכלס שני קרום פנימי של טפלון התומך בשתי טבעות O ומיסב טפלון אחד הנח את שתי טבעות ה-O לתוך חריצי הממברנה הפנימית. תומך כעת בשני מסננים רטובים מראש וממברנת ניתוק אחת של 400 ננומטר ומניחים את המסננים הרטובים כנגד הטפלון בתוך טבעות ה-O. קרום הניתוק של 400 ננומטר ממוקם בין שני המסננים.

הנח את תומכי הממברנה לתוך המעטפת החיצונית של המכבש כשהממברנה מוקפת בשני פילטרים בין טבעות ה-O. הנח את מיסב הטפלון בתוך המעטפת ואבטח אותו עם אום מחזיק ביד. לאחר מכן, שטפו שני מזרקים ומלאו אחד במים של 18.2 מגה אוהם.

הכנס את מחטי המזרק לחורים הקטנים בטפלון משני קצות מכלול המכבש. המחטים צריכות להחליק פנימה בקלות. אל תכריח את המחטים.

לאחר מכן מהדקים את המכלול לתוך בית המכבש. כעת העבירו את המים דרך המכבש על ידי דחיפה איטית של המים ממזרק אחד לתוך השני. זה מייצג קטע אחד.

בצע שלושה מעברים כדי לבדוק אם יש נזילות ואז הסר את המזרקים. מלאו מזרק חדש בתמיסת השלפוחית. חבר אותו למכבש והעביר לאט לאט את התמיסה דרך הממברנה.

חזור על כך בסך הכל 11 קטעים. עם הדגימה, בהדרגה הדגימה הופכת פחות עכורה וקל יותר לדחוף אותה על פני הממברנה. ירידה פתאומית בהתנגדות, לעומת זאת, מעידה בדרך כלל על קרע של הממברנה בסיום, בצע 40 מיקרוליטר של תמיסת השלפוחית המוחצנת.

הקפיא כל מנה בקרח יבש או בחנקן נוזלי. לאחר ההקפאה, השתמש במאייד צנטריפוגלי כדי ליופיליזציה של כל אליקוט למשך הלילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס, ניתן לאחסן את השלפוחיות הריקות הליופיליות במינוס 20 מעלות צלזיוס. התחל את האנקפסולציה על ידי ערבוב מרכיבי תגובת תרגום השעתוק והוספת 20 יחידות של מעכב RNA.

דגרו את המגיבים על קרח, ואז הוסיפו את תבנית ה-DNA לבקרה, השתמשו ב-250 ננוגרם של פלסמיד המקודד m ורידי, או חלבון פלואורסצנטי דומה מאחורי מקדם שעתוק T 7 ואתר קשירה חזק של ריבוזום e coli. הביאו את הנפח הסופי של התגובות ל -25 מיקרוליטר. עם מים ללא RNA מלחחים כעת 40 מיקרוליטר של שלפוחיות ליופיליות ב-10 מיקרוליטר מתערובת התגובה.

מערבל בקצרה את התערובת עד לתליית השלפוחיות מחדש. פעולה זו אמורה להימשך פחות מ-30 שניות. דגרו את התגובה על קרח למשך 30 דקות כדי לאפשר לשלפוחיות להתנפח.

לאחר מכן, יש לדלל את תערובת השלפוחית פי 20 לנפח סופי של 30 מיקרוליטר על ידי שילוב של 1.5 מיקרוליטר שלפוחיות עם 27.0 מיקרוליטר תמיסת טריס כלוריד ו-1.5 מיקרוליטר תמיסת מלאי פרוטאינאז K. כעת דגרו את תערובת השלפוחית המדוללת למשך שעתיים וחצי לפחות. ב-37 מעלות צלזיוס.

הכן תא דגימה על ידי הנחת מרווח סיליקון בגודל 20 על חמישה מילימטר על מיקרוסקופ רגיל. החלק פיפטה 10 מיקרוליטר שלפוחיות לתוך תא הדגימה והנח החלקה של מכסה זכוכית סיליקון מעל החדר. לאחר מכן התבונן בשלפוחיות עם פיזור שמן פי 63 או מטרה דומה על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר ופלואורסצנטי.

שימוש בערכת המסננים המתאימה למיקרוסקופ הקרינה של חלבון פלואורסצנטי המנוצל מגלה כי הקרינה נצפית רק בתוך השלפוחית. חומר שלפוחית נוסף מתפרק אנזימטית לביטוי של שלפוחית תוך ורידית. הקרינה מתחילה להופיע לאחר שעה וחצי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

M נוגה מגיע לפלואורסצנטיות מקסימלית בשש שעות. כאן הוא נראה לאחר 2.5 שעות. ייצור חלבון זה תלוי בסינתזה וקיפול של חלבונים וגם ביצירת כרומופור.

תגובת תרגום שעתוק אנלוגית במבחנה של מבנה וציפוי m נוגה ללא שלפוחיות משמשת כבקרה. לתגובות כאלה יש עוצמות פלואורסצנטיות גבוהות יותר עקב יעילות אנקפסולציה ואפקט דילול. לכן, הם מנוטרים על ידי ספקטרוסקופיה, לא מיקרוסקופיה.

ניתן להשתמש בהליך זה כדי לענות על שאלות הנוגעות לוויסות מחדש והשפעות עומס מטבולי על פעילות התאים המלאכותיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבנות חיקויים תאיים על ידי עטיפה ישירה של מכונות תרגום שעתוק לשלפוחיות סינתטיות.