Name: Encapsulation של תמלול נטול סלולרי ומכונות בתרגום לשלפוחית לבניית מחקה סלולרי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-21T20:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: למדו כיצד לבנות מחקים סלולריים מאפס באמצעות הכלאת מנגנוני שעתוק ותרגום בשלפוחיות ליפידיות. שיטה זו מאפשרת מעקב אחרי ייצור חלבונים במיקרוסקופיה ומספקת בסיס ליישומי ביולוגיה סינתטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים קרן Armenise-הרווארד, מארי קירי טרנטינו COFUND (ACS), המחוז האוטונומי של טרנטו (Ecomm), וCIBIO למימון.

1. הכנת תבנית ה-DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את הפלסמיד מזן מעבדה סטנדרטי של א &#39; coli, כגון א &#39; coli DH5a או נובה כחולה עם ערכה מסחרית. לחלופין, מוצר ה-PCR ליניארי יכול להיות מטוהר באופן דומה עם ערכה מסחרית. Elute DNA עם O H 2 בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנול, כלורופורם לחלץ את פתרון ה-DNA 26. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את ריכוז ה-DNA ובטהרה, לדוגמה על ידי ספיגת קרינת UV או שיטות מתאימות אחרות. חשוב להשתמש בדנ&quot;א טהור ביותר ליעיל שעתוק-תרגום. </li></ol> 2. הכנת סרט יפידים הדק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל אבקת שומנים בדם היבשה ומתמוסס בממס. עבור 1-Palmitoyl-2-oleoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (POPC), פתרונות מניות מוכנים בכלורופורם בריכוז של 40 מ&quot;ג / מ&quot;ל. הערה: ממסים אורגניים חייבים תמיד להיות מטופלים עם pipettes הזכוכית ובקבוקים. במילים אחרות, לא חייב להיות בשימוש פלסטיק. של החנותפתרונות טוק בבקבוקי אוויר חזק, ממס עמיד ענבר זכוכית ב -20 ° C, עדיף תחת ארגון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot μmol POPC 12 (220 μl של פתרון מניות מ&quot;ל 40 מ&quot;ג /) לתוך בקבוק תחתית עגול 5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאדות הממס עם מאייד סיבובי (איור 1) על מנת ליצור את סרט השומנים בדם הדק. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאובטח לצרף בקבוק תחתית העגול לצינור הזיקוק עם קליפ מעגלי ולהתחיל את הסיבוב של הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום את זרימת מים דרך סליל המעבה. שימוש באמבט חום הוא לא הכרחי, כי כלורופורם יש נקודת רתיחה נמוכה של 61.2 מעלות צלזיוס בלחץ אטמוספרי רגיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי המערכת אינו פתוחה לאטמוספרה על ידי בדיקת שהסתום פתוח. הפעל את משאבת הוואקום ולסגור את הברז כדי להחיל את הוואקום למערכת לאט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרט שומנים דק מופקד על קירות בקבוקון תחתית העגול במהלך אידוי סיבובי ויוצר סרט אטוםכי הוא גלוי על ידי העין. בואו נמשיך לאידוי הסיבובי 0.5-2 שעות. כדי לעצור את התהליך, לאט לאט לשחרר את לחץ הוואקום, להפסיק את הסיבוב, ולהסיר את בקבוק תחתית העגול. </li></ol></li></ol> 3. Resuspension שומנים בדם והשלפוחיות Homogenization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל 18.2 MΩ H 2 O לסרט השומנים הדק ישירות בבקבוק תחתית העגול. במרץ מערבולת הפתרון במהירות המרבית, כ 3,200 סל&quot;ד, עד שסרט השומנים מתנתק מהזכוכית, אשר נצפית על ידי העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את פיזור השומנים לתוך צינור microcentrifuge 2 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת טבעת עומדת להחזיק homogenizer עם טיפ 5 מ&quot;מ. הנח דוכן microcentrifuge מתחת homogenizer להחזיק היטב את פיזור השומנים בדם. יש לשטוף את אלמנט פיזור של homogenizer ידי טבילה בקצה 18.2 MΩ H 2 O והפעלתו במשך כמה שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את אלמנט פיזור ישירות לפיזור השומנים הבטחת הבקצה לא נוגע בחלק התחתון של צינור microcentrifuge. Homogenize דקות 1 ברמת העצמה 4 או 14,000 סל&quot;ד. </li></ol> 4. חול שלפוחית ​​וlyophilization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את החלקים של אגוז מקדמה כי בתים דו קרום טפלון פנימי תומך, שתי טבעות אטימות, ומסב טפלון אחד מיני מכבש (איור 2), אשר מורכב ממעטפת חיצונית ו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שתי טבעות האטימות לתוך החריצים של תומך בממברנה הפנימי. מסנני Prewet שני וקרום אחד 400 ננומטר. את המסננים יוצבו נגד הטפלון פנימי של טבעות O-עם הקרום ביניהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הקרום תומך למעטפת החיצונית מכבש עם הקרום מוקף בשני מסננים בין הטבעות האטימות. הנח את נושא הטפלון בתוך המעטפת ולצרף את האום המייצבת ולהדק ביד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את שני מזרקים ולמלא אחד עם 18.2 MΩ מים. הכנס את מחטי המזרק לתוך שעות קטנותOles בטפלון על כל צד של ההרכבה מכבש. המחטים צריכה להחליק בקלות, אל תכריחו את המחטים. אבטח את מכבש עם המזרקים לתוך דיור מכבש ולהדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את המים דרך מכבש על ידי דחיפת המים לאט ממזרק אחד לתוך השני. זה מייצג את מעבר אחד. חזור על פעולה עבור סכום כולל של שלושה קטעים להבטיח כי אין נזילות בהווה. הוצא את המזרק במים ולסלק את המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מזרק אחד עם המדגם, לצרף למכבש, ולהעביר את פתרון השלפוחית ​​לאט דרך הקרום כמתואר לעיל בשלב 4.3. חזור על 10x עבור סכום כולל של 11 קטעים. ככל שמתקדם תהליך שחול, המדגם יהיה פחות עכור ויותר קל לדחוף על פני הקרום. ירידה פתאומית בהתנגדות, לעומת זאת, בדרך כלל מצביעה על פקיעת של הקרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את פתרון השלפוחית ​​הנמתח ולעשות 40 aliquots μl של שלפוחית ​​לצינורות microcentrifuge.פלאש להקפיא כל aliquot באו קרח יבש או בחנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyophilize כל aliquot עם מאייד צנטריפוגלי לילה בשעה 30 ° C. אחסן את שלפוחית ​​ריקה lyophilized ב -20 ° C. </li></ol> 5. Encapsulating מכונות תמלול-תרגום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את המרכיבים של תגובת שעתוק-התרגום ולהוסיף 20 יחידות של מעכב RNase. דגירה על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את תבנית ה-DNA. לתגובת שליטה, 250 ng של mVenus קידוד פלסמיד או חלבון פלואורסצנטי דומה מאחורי אמרגן T7 תעתיק וא חזק אתר מחייב הריבוזום coli מומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא את הנפח הסופי ל -25 μl עם מים RNase חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מימה aliquot של שלפוחית ​​lyophilized (משלב 4.6) עם 10 μl של התגובה התאסף בשלב 5.3. מערבולת בקצרה את התערובת עד שהשלפוחית ​​היא resuspended. זה אמור לקחת פחות מ -30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התגובה על קרח 30 דקות, כדי לאפשר את שלפוחית ​​להתנפח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את תערובת השלפוחית ​​פי 20 לנפח סופי של 30 על ידי הוספת 1.5 μl μl של שלפוחית ​​ל27.0 μl של 50 מ&quot;מ טריס-HCl, 50 מ&quot;מ NaCl, pH 7.4 ו 1.5 μl של 20.2 מ&quot;ג / מיליליטר proteinase ק DNase וRNase ניתן גם להוסיף בשלב זה כאלטרנטיבה לproteinase K להשפיל חומר extravesicular. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של לפחות 2.5 שעות ב 37 ° C. </li></ol> 6. מיקרוסקופיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון את שלפוחית ​​ואת ההתקדמות של ייצור חלבון פלואורסצנטי בנקודות זמן שונים. שלפוחית ​​תהיה בקוטר גדול יותר מאשר 400 ננומטר נקבובית בגודל של קרום שלפוחית ​​משמש להבלטה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מדגם קאמרי על ידי הצבת spacer מ&quot;מ 20 X 5 סיליקון לשקופית מיקרוסקופ רגיל. פיפטה μl 10 של שלפוחית ​​לתוך תא המדגם. במקום להחליק כיסוי זכוכית siliconized על קאמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לשלפוחית ​​עם פיזור שמן o 63Xמטרה דומה על ידי R שדה בהיר ומיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות מערכת הסינון המתאימה לחלבון פלואורסצנטי ניצלו. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Forster, A. C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+synthesis+of+a+minimal+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards synthesis of a minimal cell.</a> Mol. Syst. Biol. 2, 1-10 (2006).</li>
<li>Noireaux, V., Maeda, Y. T., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+artificial+cell%2C+from+self-organization+to+computation+and+self-reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Development of an artificial cell, from self-organization to computation and self-reproduction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 3473-3480 (2011).</li>
<li>Harris, D. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+biology%3A+Exploiting+the+interface+between+synthetic+biology+and+synthetic+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Cell-free biology: Exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry.</a> Curr. Opin. Biotech. 23, (2012).</li>
<li>Nishikawa, T., Sunami, T., Matsuura, T., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Evolution+of+Proteins+through+In+Vitro+Protein+Synthesis+in+Liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Directed Evolution of Proteins through In Vitro Protein Synthesis in Liposomes.</a> J. Nucleic Acids. 2012, 1-11 (2012).</li>
<li>Forlin, M., Lentini, R., Mansy, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+imitations%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular imitations.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 586-592 (2012).</li>
<li>Chiarabelli, C., Stano, P., Anella, F., Carrara, P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+chemical+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Approaches to chemical synthetic biology.</a> FEBS Lett. 586, 2138-2145 (2012).</li>
<li>Noireaux, V., Shin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Eng%22%5BJournal%5D)">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> J. Biol. Eng. 4, 1-9 (2010).</li>
<li>Fujiwara, K., Nomura, S. -iM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condensation+of+an+Additive-Free+Cell+Extract+to+Mimic+the+Conditions+of+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Condensation of an Additive-Free Cell Extract to Mimic the Conditions of Live Cells.</a> PLoS ONE. 8, e54155(2013).</li>
<li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat. Biotechnol. 19, 751-755 (2001).</li>
<li>Hosoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Study+of+the+Structure+of+Multilamellar+Giant+Liposomes+As+a+Container+of+Protein+Synthesis+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Quantitative Study of the Structure of Multilamellar Giant Liposomes As a Container of Protein Synthesis Reaction.</a> Langmuir. 24, 13540-13548 (2008).</li>
<li>Sunami, T., Matsuura, T., Suzuki, H., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Functional+Protiens+Within+Liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Functional Protiens Within Liposomes.</a> Methods Mol. Biol. 607, 243-256 (2010).</li>
<li>Murtas, G., Kuruma, Y., Bianchini, P., Diaspro, A., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+in+liposomes+with+a+minimal+set+of+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis in liposomes with a minimal set of enzymes.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 363, 12-17 (2007).</li>
<li>Pereira de Souza, T., Stano, P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Minimal+Size+of+Liposome-Based+Model+Cells+Brings+about+a+Remarkably+Enhanced+Entrapment+and+Protein+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">The Minimal Size of Liposome-Based Model Cells Brings about a Remarkably Enhanced Entrapment and Protein Synthesis.</a> ChemBioChem. 10, 1056-1063 (2009).</li>
<li>Caschera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+Vesicle+Fusion+Triggers+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Programmed Vesicle Fusion Triggers Gene Expression.</a> Langmuir. 27, 13082-13090 (2011).</li>
<li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Godefroy, J., Salman, H., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+an+artificial+cell+based+on+gene+expression+in+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Biol%22%5BJournal%5D)">Toward an artificial cell based on gene expression in vesicles.</a> Phys. Biol. 2, P1-P8 (2005).</li>
<li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox%3A+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth.+Biol%22%5BJournal%5D)">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> ACS Synth. Biol. 1, 29-41 (2012).</li>
<li>Kobori, S., Ichihashi, N., Kazuta, Y., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+controllable+gene+expression+system+in+liposomes+that+includes+a+postive+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">A controllable gene expression system in liposomes that includes a postive feedback loop.</a> Mol. Syst. Biol. 9, 1282-1285 (2013).</li>
<li>Martini, L., Mansy, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-like+Systems+with+Riboswitch+Controlled+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Cell-like Systems with Riboswitch Controlled Gene Expression.</a> Chem. Commun. 47, 10734-10736 (2011).</li>
<li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+cell-free+genetic+circuit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Principles of cell-free genetic circuit assembly.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12672-12677 (2003).</li>
<li>Sunami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Association+and+Fusion+of+Giant+Vesicles+Using+a+Fluorescence-Activated+Cell+Sorter%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Detection of Association and Fusion of Giant Vesicles Using a Fluorescence-Activated Cell Sorter.</a> Langmuir. 26, 15098-15103 (2010).</li>
<li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Resolved+Tracking+of+a+Minimum+Gene+Expression+System+Reconstituted+in+Giant+Liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Time-Resolved Tracking of a Minimum Gene Expression System Reconstituted in Giant Liposomes.</a> ChemBioChem. 10, 1640-1643 (2009).</li>
<li>Lentini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Proteins+and+in+Vitro+Genetic+Organization+for+Cell-Free+Synthetic+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Proteins and in Vitro Genetic Organization for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synth. Biol. , (2013).</li>
<li>Du, L., Villarreal, S., Forster, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multigene+Expression+In+Vivo%3A+Supremacy+of+Large+Versus+Small+Terminators+for+T7+RNA+Polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Multigene Expression In Vivo: Supremacy of Large Versus Small Terminators for T7 RNA Polymerase.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 1043-1050 (2011).</li>
<li>Trochilin, V. P., Weissig, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrochilin%2C+VP+%22Liposomes%3A+A+Practical+Approach%22">Liposomes: A Practical Approach</a>. , 2nd edn, Oxford University Press. (2003).</li>
<li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+vesicles%3A+preparations+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Giant vesicles: preparations and applications.</a> ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%22">Molecular Cloning</a>. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17669-17674 (2004).</li>
<li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Functional+Protein+in+Liposome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Functional Protein in Liposome.</a> J. Biosci. Bioeng. 92, 590-593 (2001).</li>
<li>Caschera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+vesicles+composed+of+monocarboxylic+or+dicarboxylic+fatty+acids+and+trimethylammonium+amphiphiles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Stable vesicles composed of monocarboxylic or dicarboxylic fatty acids and trimethylammonium amphiphiles.</a> Langmuir. 27, 14078-14090 (2011).</li>
<li>Pereira de Souza, T., Steiniger, F., Stano, P., Fahr, A., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+crowding+of+ribosomes+and+proteins+inside+vesicles%3A+a+possible+mechanism+for+the+origin+of+cell+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Spontaneous crowding of ribosomes and proteins inside vesicles: a possible mechanism for the origin of cell metabolism.</a> ChemBioChem. 12, 2325-2330 (2011).</li>
<li>Niederholtmeyer, H., Xu, L., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+mRNA+Measurement+during+an+in+Vitro+Transcription+and+Translation+Reaction+Using+Binary+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth.+Biol%22%5BJournal%5D)">Real-Time mRNA Measurement during an in Vitro Transcription and Translation Reaction Using Binary Probes.</a> ACS Synth. Biol. 10, (2012).</li>
<li>Stögbauer, T., Windhager, L., Zimmer, R., Rädler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiment+and+mathematical+modeling+of+gene+expression+dynamics+in+a+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Experiment and mathematical modeling of gene expression dynamics in a cell-free system.</a> Integr. Biol. 4, 494-501 (2012).</li>
<li>Lazzerini-Ospri, L., Stano, P., Luisi, P., Marangoni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+emergent+properties+of+a+synthetic+quasi-cellular+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Characterization of the emergent properties of a synthetic quasi-cellular system.</a> BMC Bioinformatics. 13, 1-10 (2011).</li>
<li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Replication%2C+Synthesis%2C+and+Assembly+of+the+Bacteriophage+T7+in+a+Single+Cell-Free+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction.</a> ACS Synth. Biol. 1, 408-413 (2012).</li>
<li>Zhu, T. F., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Large+Monodisperse+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Preparation of Large Monodisperse Vesicles.</a> PLoS ONE. 4, 1-4 (2009).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

למרות שביולוגיה סינטטי ללא תא היא עדיין בחיתוליו, התקדמות הניחה בסיס שממנו ניתן לבצע מערכות כמו תאים מורכבות יותר ויותר. הכינון מחדש של מכונות שעתוק-תרגום מוגדר באופן מלא בתוך 9 רכיבים של שלפוחית ​​28 היה משמעותי במיוחד בקידום מאמצים מאוחרים יותר בבנייה מלאכותית מגיב לסביבה cells17, 18. כמו כן, נעשו שימוש במחקרים בתאים מלאכותיים כדי לחקור תהליכים אבולוציוניים 4,29,30, הפרטים מכניסטית של RNA והסינתזה של חלבוני 22,31, את ההשפעות של load32 חילוף חומרים, בת 33, ואת ההרכבה של חלקיקים נגיפיים 34. חשוב מכך, קיים כיום מספיק ידע שהתפקוד הבסיסי של התא ניתן מחדש פנימי של שלפוחית ​​במעבדה בעקבות דוחות קודמים אלו ואת הפרוטוקולים שתוארו במסמך זה. בנוסף להיותו קל, אנקפסולציה תאר יחסי הציבוריש ocedure מספר יתרונות. לדוגמה, רבים aliquots שלפוחית ​​ריק, lyophilized יכול להתבצע מראש ומאוחסן ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר. הפרוטוקול עושה מולקולות ביולוגיות אינו כפופות לממסים אורגניים, שינויי טמפרטורה קיצוניות, או תקופות ארוכות של דיאליזה. אנו מצפים כי עדינותו של הנוהל תאפשר שילוב של רכיבים נוספים לפי צורך. יש לנו גם לא נצפו תופעות לוואי לשינוי בהרכב השומנים של הקרום על אנקפסולציה או יעילות שעתוק-תרגום. לכן, שומנים נוחים יותר לשילוב של חלבונים בממברנה, מורפולוגיות ספציפיות, או להדמיה יכולים להעלות על הדעת ניתן לנצל. המגבלה העיקרית של השיטה היא שתארה את שלפוחית ​​כתוצאה מכך הם אינם הומוגני בגודל או lamellarity. עבור יישומים רבים, הקשיים אלה לא מפריעים לפרשנות של נתונים. עם זאת, במידת הצורך, ניתן לשלב בצעדים נוספים ל הצרההתפלגות גודל הדואר ולהקטין את השכבות של ממברנות, כגון סבב נוסף של חול לאחר אנקפסולציה, הקפאת הפשרה, או דיאליזה 35. אין ספק ששיטות טובות יותר לעקוף בעיות אלה ואחרות תפותח. עד אז, אנו מוצאים את הפרוטוקול מתואר כאן כדי להיות מתאים גם לבניית מחקה סלולרי.

ללא תא, במבחנה תגובות שעתוק-תרגום והדור של שלפוחית ​​משומנים סינטטיים אינם דבר חדש. עם זאת, שילוב של שתיים לתוך הסלולר לחקות הוא באופן משמעותי יותר challenging1-6. א תמציות סלולריים coli עם או בלי RNA פולימראז T7 יכולות לשמש כמקור של מכונות שעתוק-תרגום 7,8. תמציות סלולריים נהנות מהנוכחות של רכיבים סלולריים נוספים שיכול להקל ביטוי חלבון ומתקפל. לחלופין, שילוב של RNA בנפרד מטוהר ומולקולות חלבון, כלומר את מערכת PURE 9, יכול לשמש כדי לתווך סינתזת חלבון intravesicular 4,10-14. מערכת PURE מאפשרת לבניית מחקה סלולרי שהוגדר באופן מלא ואינו סובלת מפעילות nuclease מצאה בתמציות סלולריים. מבחינה מעשית, זה אומר שנדרש הרבה פחות תבנית ה-DNA, ובכך להקל על תהליכים עם יעילות נמוכה אנקפסולציה 11 </sup&gt;. למרות ששימוש בתדירות נמוך יותר, ניתן לבנות מחקה סלולרי עם תמציות תאים שמקורם מcells15 אוקריוטים. עד כה, דווחו מפלים כמוס מקודדים גנטי ומחק סלולריים שלחוש את סביבת 16-18. הדרך הפשוטה כדי לעקוב אחר תגובות שעתוק-תרגום היא למדוד את הקרינה או הארה של אלמנטים גנטי מקודדים. בדרך כלל, גחלילית לוציפראז 19 או GFP משמשים, אם כי במבחנה תגובות נמדדות לעתים קרובות על ידי radiolabeling. גילוי הקרינה בנוסף הוא מאפשר ניטור של אוכלוסיות של שלפוחית ​​20,21 באמצעות שיטות מבוססות cytometry, ובכך מציע כמה תובנות לגבי האופי האקראי של תהליכים דמויי ביולוגיים. שיטות ניטור אלה כבר משמשים להגדרת קבוצה קטנה של כללי עיצוב וספרייה של חלקים ממנו ניתן לבנות, כולל אוסף של חלבוני ניאון התואמים אותיn מבחנת שעתוק-תרגום 22, בהשפעת הארגון על ביטוי גנטי 22, הפעילות של גורמי סיגמא 16, ואת היעילות של Terminators תעתיק 23. עם זאת, יש עדיין הרבה דברים שצריך לעשות כדי להגדיל את היכולת של הבנייה צפויה במבחנה, מכשירים מקודדים גנטי. ישנן שיטות רבות זמינות כדי להפוך שלפוחית. השיטות הנפוצות ביותר תלויות בדור של שומנים בדם סרט דק על משטח זכוכית ואחריו resuspension בsolution24 המימית. אם התמיסה המימית מכילה מכונות שעתוק-תרגום, למשל, אז חלק של שלפוחית ​​שנוצר היה להכיל את כל מרכיבים הדרושים לייצור חלבון. עם זאת, את היעילות של אנקפסולציה שיטות כאלה היא נמוכה, כלומר, רק אחוז קטן של שלפוחית ​​הם פעיל. רבים מהשיטות החלופיות מאופיינים EFF אנקפסולציה הרבה יותר גבוהiciency לנצל את ההמרה של טיפות מים בתחליב שמן לשלפוחית. אמנם סביר להניח כי שיטות כאלה תהיה דבר שבשגרה בעתיד, כיום שיטות אלה סובלים מהצורך של ציוד מיוחד ולתת לי שלפוחית ​​עם קרום קומפוזיציות שהשתנו 25. יתרון בולט מים בתוך שמן של שיטות לשלפוחית ​​הוא הפוטנציאל לשלוט lamellarity הממברנה. השיטה המתוארת במסמך זה מבוססת על פרוטוקול סרט שומנים בדם הדק שתואר על ידי Yomo 11 המעבדה עם שינויים קלים ביניהם צעד homogenization נוסף. שיטה זו היא קלה, זולה, ונותנת שלפוחית ​​חזקה גם מתאימה לאנקפסולציה של מכונות שעתוק-תרגום.

<table><tbody><tr><td>ערכת הכנה למיני סיבוב מהיר</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרומטר</td><td>NanoDrop 1000</td><td>NDB767ND</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>אוונטי שומנים קוטביים</td><td>770557</td><td>MW 760 גרם/מול טמפרטורת מעבר -2 & מעלות; C CAS# 26853-31-6</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>459836</td><td>נטול מים, >99.5%</td></tr> <tr><td>אלכוהול פנול-כולורופורם-איזואמיל 25:24:1, לשימוש בביולוגיה מולקולרית</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P3803-100 מ"ל</td><td>רווי ב-10 מ"מ Tris, pH 8.0, 1 מ"מ EDTA</td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>ביוטק כיתה פלוקה</td><td>496189-1L</td><td>מכילים אתנול ב-0.5-1.0% v/v כמייצב</td></tr><tr><td>בקבוקי</td> <td>זכוכית ענבר חוםVWR</td><td>89043-518</td><td>55X 48 מ"מ</td></tr><tr><td>מאייד סיבובי</td><td>Buchi Rotovapor R-210/Sigma</td><td>Z563846EU-1EA</td><td>עם שקע ואמבט מים, 29/32 משותף 240 V</td></tr><tr><td>מערבולת אנלוגית מערבל</td><td>VWR</td><td>945300</td><td>מהירות 1,000-3,200 סל"ד</td></tr><tr><td>הומוגנייזר</td><td>IKA T10 בסיסי אולטרה-טורבקס</td><td>3420000</td><td></td></tr><tr><td>מיני מכבש</td><td>אוונטי פולאר ליפידים</td><td>610020</td><td></td></tr><tr><td>מסנני מכבש</td> דיסק ניקוז <td>610014 Whatman</td><td></td><td>10 מ"מ&nbsp;</td></tr><tr><td>ממברנת פוליקרבונט אקסטרודר 400 ננומטר</td><td>Whatman</td><td>61007</td><td>פוליקרבונט גרעיני&nbsp;</td></tr><tr><td>ואקום מהירות</td><td>Labconco</td><td>7970011</td><td>רכז DNA צנטריטראפ</td></tr><tr><td>ערכת PURExpress מעכב</td><td>RNAse NRM #E6800S</td><td></td>ניו <td>אינגלנד</td></tr> (<tr><td>40,000 יחידות / מ"ל)</td> <td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>#M0307S</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאינאז K (20.2 מ"ג/מ"ל)</td> <td>פרמנטס</td><td>#EO0491</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Zeiss Observer Z1 עם a מצלמת</td><td></td><td></td>AxioCam MRm</tr><tr><td>בזמן אמת</td><td>CFX96 מערכת זיהוי PCR בזמן אמת (Biorad)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>לחץ על סיליקון כדי לאטום&nbsp; &nbsp;-טכנולוגיות חיים של בדיקה מולקולרית</td><td></td><td>P18174</td><td>עמיד מ-&nbsp; -25-30 &deg; C</td></tr><tr><td>שקופיות כיסוי עיגול זכוכית סיליקון Hampton</td><td>Research</td><td>HR3-231</td><td>&nbsp; &nbsp; קוטר = 22 מ"מ</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

encapsulation של תמלול נטול סלולרי ומכונות בתרגום לשלפוחית ​​לבניית מחקה סלולרי

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

כמשמרות ריבית ממולקולות בודדות למערכות של מולקולות, מספר גדל והולך של מעבדות ביקשו לבנות מלמטה למעלה מחקה סלולרי שמייצגים טובים יותר את המורכבות של חיים תאיים. נכון להיום יש מספר המסלולים שניתן לנקוט כדי לבנות מחקה סלולרי ממודר, כולל ניצול של תחליבים מים בשמן, התקני microfluidic, ושלפוחית. כל אחת מהאפשרויות הזמינות יש יתרונות וחסרונות מסוימים. לדוגמה, תחליבים מים בשמן לתת יעילות גבוהה אנקפסולציה אבל לא לחקות היטב את מחסום החדירות של תאי חיים. היתרון העיקרי של השיטות שתוארו במסמך זה הוא שהם כולם קלים וזולים ליישום. מכונות תמלול-תרגום היא כמוסות פנימית של שלפוחית ​​פוספוליפידים באמצעות תהליך המנצל את המכשור משותף, כגון מאייד הצנטריפוגלי ומכבש. תגובות מנוטרות על ידי הקרינה ספקטרוסקופיה. הפרוטוקולים יכול להיות מותאם לביטוי חלבון רקומביננטי, הבנייה מחקה סלולרי, החקירה של דרישות המינימום לחיים הסלולר, או ההרכבה של מעגלים גנטיים.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי מגלה הקרינה שנצפתה רק החלק פנימי של שלפוחית, כי החומר הוא extravesicular enzymatically מושפל (איור 3). לביטוי של mVenus, intravesicular הקרינה מתחילה להיות שנצפתה לאחר 1.5 שעות על 37 מעלות צלזיוס ומגיעה לעוצמת הקרינה המרבית בתוך 6 שעות. הטמפרטורה האופטימלית וזמן דגירה יכולות להשתנות בהתאם למבנים הספציפיים בשימוש. לדוגמה, חלבוני ניאון שונים להבשיל באופן שונה לגמרי באופן תלוי בטמפרטורה. במילים אחרות, ההתבוננות של ייצור חלבון היא לא תלויה אך ורק על סינתזה של חלבונים וקיפול, אלא גם על היווצרות chromophore. סינתזה של חלבון באופן כללי יכולה להיות מוגברת על ידי שילוב של חלבון קרום נקבוביות כדי לאפשר לזרם של רכיבים מדולדלים הדרושים לשעתוק ותרגום 27. מומלץ לבצע שעתוק-תרגומים מקבילים<html> תגובת tion בהעדר שלפוחית ​​כדי להבטיח שהמבנה הגנטי ניצלו הוא פונקציונלי. תגובת שליטה זו היא פיקוח בקלות רבה יותר על ידי הקרינה ספקטרוסקופיה ולא מיקרוסקופית. איור 4 מראה בתגובת שעתוק-תרגום חוץ גופית של mVenus קידוד לבנות. תגובות unencapsulated לתת הרבה יותר גבוה עוצמות הקרינה הכולל יותר מאשר תגובות intravesicular דומות. זאת בשל יעילות אנקפסולציה וכי סך נפח intravesicular הוא הרבה פחות מאשר נפח extravesicular (כלומר אפקט דילול). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig1.jpg" width="600px" /> איור 1. המאייד הסיבובי ומשאבת ואקום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig1highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> עבור: לשמור-together.within עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig2.jpg" width="600px" /> איור 2. הדיור ובחלקים מהמכבש מוצגים בנפרד. משמאל לימין, מזרק, אגוז שכר טרחה, ועליו טפלון, הקרום פנימי תומך עם טבעות אטימות שחורות פונות אחד לשני, מעטפת חיצונית מכבש, ומזרק שני. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig3.jpg" width="600px" /> איור 3. תמונות הקרינה של ייצור חלבון בmVenus יפוזומים וC:.. תמונות שדה בהירות של שלפוחית ​​multilamellar לאחר 1.5 שעות ו -2.5 שעות B ו &amp;# 160; D: הייצור של mVenus הוא דמיינו ידי (בצבע הירוק), לאחר 1.5 ו -2.5 שעות, בהתאמה פלואורסצנטי. בר סולם הוא 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig4.jpg" width="600px" /> איור 4. בתגובה שליטה במבחנה של nonencapsulated בשעתוק במבחנה ותרגום של mVenus. עוצמת הקרינה שנמדדה בכל 5 דקות במשך 4 שעות. הנתונים נרכשו עם מכשיר Real-Time PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig4highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

בזאת אנו מתארים שיטות פשוטות להכנה של שלפוחית, אנקפסולציה של שעתוק ותרגום מכונה, והניטור של ייצור חלבון. מערכות תא ללא כתוצאה מכך יכולות לשמש כנקודת התחלה שממנו ניתן לבנות מחקה סלולרי מורכב יותר ויותר.

Encapsulation של תמלול נטול סלולרי ומכונות בתרגום לשלפוחית ​​לבניית מחקה סלולרי

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבנות חיקויים תאיים מאפס באמצעות כליאת מנגנוני תעתוק ותרגום בתוך וסיקולות. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת שכבת ליפידים דקה. לאחר מכן, לאחר יצירת הוסיקולות, מרכיבים את הרכיבים עבור תעתוק ותרגום in vitro.השלב האחרון הוא הכנסת מכניזם התמלול והתרגום לתוך הוזיקולות. בסופו של דבר, ניתן לנטר את הפעילות של הדמיון התאי באמצעות מיקרוסקופיה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות כימוס אחרות קיימות, כגון אמולסיות של מים ושמן, התקני מיקרו-רשת (micro retic devices) או תהליך המרה של מים ושמן לוזיקולות, הוא ששיטה זו היא פשוטה, זולה, ומניבה וזיקולות עמידות עם תכונות חדירות המתאימות היטב לבניית דמיונים תאיים המנצלים תפקוד חלבוני מקודד גנטית.שיטה זו אינה יכולה לסייע בחקירת תחומים מרכזיים בביולוגיה סינתטית ללא תאים (cell-free) ובגישת bottom-up, כגון הגדרת הבסיס המינימלי של חיים ופיתוח טכנולוגיות דמויות-חיים שאינן חיות. כדי להכין שכבה דקה של ליפידים, התחילו בהמסת POPC בכלורופורם בריכוז של 40 mg/mL, ולאחר מכן העבירו מנה של 12 µmol של POPC לבקבוק עגול תחתון בנפח של 5 mL. לאחר מכן, השתמשו בתפסן מעגלי כדי להצמיד את הבקבוק בבטחה לצינור הזיקוק של מאדה סיבובי (rotary evaporator).לאחר מכן, באמצעות הגדרה שש, התחילו סיבוב חזק ויציב של הבקבוק. בשלב הבא, התחילו את סירקולציית המים דרך סליל המעבה. אין צורך לחמם את המים מכיוון שלכלורופורם יש נקודת רתיחה נמוכה של 61.2 °C.בלחץ של אטמוספירה אחת, ודאו שהמערכת פתוחה לאוויר על ידי בדיקה שהברז (stop cock) פתוח, כדי להחיל את הוואקום על המערכת בו-זמנית. הפעילו את משאבת הוואקום תוך כדי סגירה איטית של הברז. המשיכו באידוי הרוטרי למשך 0.5 עד שעתיים לאחר שהכלורופורם אינו נראה יותר בעין.כדי לעצור את התהליך, שחררו לאט את לחץ הוואקום והפסיקו את הסיבוב. הסירו את הבקראקום; שכבה שומנית דקה ועכירה נראית על דפנות הבקראקום לצורך השהיה מחדש של השומן. התחילו בהוספת 1 ml של מים דה-יוניים בעלי התנגדות של 18.2 mega ohm לשכבה השומנית הדקה בבקראקום בעגול, ובצעו ערבול חזק (vortex) של התמיסה במהירות של כ-3,200 RPM עד שהשכבה השומנית תיפרד מהזכוכית.תהליך זה אמור להיארך כדקה אחת. לאחר מכן, העבירו את דיספרסיית הליפידים לפטריה של מיקרו-צנטריפוגה בנפח של 2 mL. הכינו מעמד עם טבעת להחזקת הומוגניזטור המצויד בקצה של 5 mm והניחו את פטירת המיקרו-צנטריפוגה.עמדו מתחת להומוגניזטור כדי להחזיק בביטחון את דספרסיית הליפידים. לאחר מכן, הכניסו את אלמנט הפיזור ישירות לתוך דספרסיית הליפידים, תוך הבטחה שהקצה אינו נוגע בתחתית המבחנה. הומוגניזרו את דספרסיית הליפידים למשך דקה אחת.ברמה 4, הרכיבו את חלקי המיני-אקסטרודר, המורכב ממעטפת חיצונית ומאום קיבוע המכיל שני תומכי ממברנה פנימיים מטפלון, שני טבעות איטם (O-rings) ומיסב טפלון אחד. הניחו את שתי טבעות האיטום בתוך החריצים של תומכי הממברנה הפנימיים. כעת הרטיבו מראש שני מסננים וממברנה אחת עם סף חיתוך של 400 nanometer, והניחו את המסננים הרטובים על הטפלון בתוך טבעות האיטום. ממברנת סף החיתוך של 400 nanometer ממוקמת בין שני המסננים.הניחו את תומכי הממברנה בתוך המעטפת החיצונית של האקסטרודר, כאשר הממברנה מוקפת בשני מסננים בין טבעות ה-O-rings. הניחו את מיסב הטפלון בתוך המעטפת והדקו אותו בעזרת אום קיבוע באופן ידני. לאחר מכן, שטפו שתי מזרקות ומלאו אחת מהן ב-18.2 mega ohm water.החדירו את מחטי המזרקים אל החורים הקטנים בטפלון בשני קצות מכלול האקסטרודר. המחטים צריכות להחליק פנימה בקלות. אין להפעיל כוח בעת הכנסת המחטים.לאחר מכן, הדקו את המכלול בתוך בית הבורג (extruder housing). כעת העבירו את המים דרך הבורג על ידי דחיפה איטית של המים ממזרק אחד אל השני. פעולה זו מהווה מעבר אחד.בצעו שלוש מעברים כדי לבדוק דליפות, ולאחר מכן הסירו את המזרקים. מלאו מזרק חדש בתמיסת הוסיקולות. חברו אותו לאקסטרודר והעבירו לאט את התמיסה דרך הממברנה.חזרו על פעולה זו עבור 11 מעברים בסך הכל. עם התקדמות התהליך, הדגימה הופכת פחות עכורה וקל יותר לדחוף אותה דרך הממברנה. עם זאת, ירידה פתאומית בהתנגדות מעידה בדרך כלל על קרע בממברנה. עם סיום הפעולה, הכינו מנות של 40 µL מתמיס הוזיקולות שהוצא.הקפיאו במהירות כל מנה (aliquot) בקרח יבש או בחנקן נוזלי. לאחר ההקפאה, השתמשו במאייד צנטריפוגלי כדי לבצע ליופיליזציה לכל מנה למשך הלילה. בטמפרטורה של 30 degrees Celsius, ניתן לשמור את הוסיקולות הריקות שעברו ליופיליזציה בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius. התחילו את התהליך של הכלילה (encapsulation) על ידי ערבוב רכיבי תגובת השעתוק והתרגום והוספת 20 units של מעכב RNase.דגרו את הריאקטנטים על קרח, ולאחר מכן הוסיפו את תבנית ה-DNA עבור ביקורת; השתמשו ב-250 nanograms של פלסמיד המקודד ל-m venous, או לחלבון פלואורסצנטי דומה, מאחורי פרומוטור תעתוק T seven ואתר קישור של ריבוזום e coli חזק. השלימו את הנפח הסופי של התגובות ל-25 µL. עם מים נטולי RNase, הידראטו כעת 40 µL של וסיקולות ליופיליזיות ב-10 µL מתערובת התגובה.ערבבו את התערובת קצרה במכשיר vortex עד להשעיה מחדש של הוזיקולות. פעולה זו צריכה להימשך פחות מ-30 שניות. הדגירו את התגובה על קרח למשך 30 דקות כדי לאפשר לוזיקולות להתנפח.בשלב הבא, דללו את תערובת הוסיקולות פי 20 לנפח סופי של 30 µL על ידי ערבוב של 1.5 µL {vesicles} עם 27.0 µL של תמיסת tris chloride ו-1.5 µL של תמיסת stock של proteinase K. כעת, דגרו את תערובת הוסיקולות המדוללת למשך שעתיים וחצי לפחות, בטמפרטורה של 37 °C.הכינו תא דגימה על ידי הנחת ספייסר סיליקון בגודל 20 על 5 מילימטרים על מיקרוסקופ סטנדרטי. העבירו באמצעות פיפטה 10 µL של וזיקולות אל תא הדגימה והניחו זכוכית כיסוי מסליקוניזציה מעל התא. לאחר מכן, צפו בוזיקולות באמצעות עדשה שמאנית 63 x בפיזור שמן או עדשה דומה, במיקרוסקופיה בשדה בהיר ובפלואורסצנציה.שימוש במערכת המסננים המתאימה עבור הפרוטאין הפלואורסצנטי שנבחר במיקרוסקופיית פלואורסצנציה מגלה כי פלואורסצנציה נצפית אך ורק בתוך הוויזקולות. חומר מחוץ לוויזקולות עובר פירוק אנזימטי כדי להבטיח ביטוי של פלואורסצנציה תוך-וויזקולרית בלבד. פלואורסצנציה מתחילה להיראות לאחר 1.5 שעות ב-37 degrees Celsius.mVenus מגיעה לفلואורסצנציה מרבית לאחר שש שעות. כאן היא נצפית לאחר 2.5 שעות. ייצור חלבון זה תלוי בסינתזה ובקיפול של החלבון וכן ביצירת הכרומופור.תגובת שעתוק ותרגום in vitro מקבילה של קונסטרוקט וכיסוי m Venus ללא וסיקולות משמשת כביקורת. לתגובות אלו יש עוצמות פלואורסצנציה גבוהות יותר בשל נצילות האנקפסולציה ואפקט של דילול. לפיכך, הן מנוטרות באמצעות ספקטרוסקופיה ולא מיקרוסקופיה.ניתן להשתמש בפרוצדורה זו כדי לענות על שאלות הנוגעות להשפעות של רגולציה ומעמס מטבולי על פעילות של תאים מלאכותיים. לאחר צפייה בסרטון זה, עליכם להגיע להבנה טובה של האופן שבו בונים חיקויים תאיים באמצעות הכנסה ישירה של מנגנוני שעתוק ותרגום לתוך וזיקולות סינתטיות.

the-encapsulation-cell-free-transcription-translation-machinery

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מתארים הליך ליטוגרפית פשוט לאימוביליזציה של מולקולות DNA ג'ין באורך על משטח, אשר יכול לשמש כדי לבצע ניסויים ביטוי הגן ללא תא biochips.

משטח פונקציונלי-הנייח של גנים באמצעות גדיל שקודמים הזחה ליתוגרפיה

אנו מדגימים תרבות תא יחיד של חיידקים בתוך שלפוחיות ענק (GVs). GVs המכיל תאים חיידקיים הוכנו על ידי שיטת העברת droplet היו מקיבוע על קרום נתמך על מצע זכוכית להתבוננות ישירה של גידול חיידקי. גישה זו עשויה להיות גם הסתגלות לתאים אחרים.

תרבית תאים חיידקיים ברמה תא בודד בתוך שלפוחיות ענק

הציגו כאן הם פרוטוקולים ליצירת פפטיד מבוסס unilamellar שלפוחיות קטנות מסוגל לצמיחה. כדי להקל על ייצור vesiculo של פפטיד הממברנה, אלה שלפוחיות מצוידות עם תמלול-תרגום מערכת ו-פפטיד קידוד פלמיד.

ב והשרירים סינתזה של ממברנות פפטיד הפרה עבור הצמיחה שלפוחית אוטונומית

פרוטוקול זה מתאר את השיטה, חומרים, ציוד ושלבים עבור הכנת מלמטה למעלה של RNA וחלבון הפקת תאים סינתטיים. התא הפנימי מימית של התאים הסינתטיים הכיל S30 ליפוסט חיידקי כדורית בתוך bilayer ליפיד (כלומר, ליפוזומים יציבים), באמצעות העברת תחליב המים בשמן שיטה.

הכנת חלבון הפקת תאים סינתטיים באמצעות שולפת תא חינם בקטריאלי, ליפוזומים והעברת אמולסיה

פרוטוקול זה מתאר היווצרות של תאים מחקים שלפוחיות חד-שומנים ורב-שומנים, דו-שכבתי שומנים נתמכים, ושכבות שומנים מושעות. מודלים במבחנה אלה ניתן להתאים לשלב מגוון רחב של סוגי שומנים וניתן להשתמש בהם כדי לחקור מולקולות שונות ואינטראקציות macromolecule.

הרכבה של חיקוי תאים מודלים נתמכים ומושעים של בולי עץ לחקר אינטראקציות מולקולריות

מאמר זה מציג שיטה פשוטה לייצור מהיר של שלפוחיות חד-שכבתיות ענקיות עם חלבוני שלד ציטוסקטליים עטופים. השיטה מוכיחה את עצמה כיעילה לשילוב מחדש מלמטה למעלה של מבנים ציטוסקטליים באינטראקציות כליאה וציטוסקלטון-ממברנה.

אנקפסולציה מהירה של שלד ציטוסקי משוחזר בתוך בועיות יונילאמלריות ענקיות

בכתב יד זה, אנו מדגימים את הטכניקות הניסיוניות לתמצת את השלד הציטוסקולרי F-actin לשלפוחיות ליפידים חד-עיניות ענקיות (הנקראות גם ליפוזומים), ואת השיטה ליצירת שכבת F-actin הביולוגית של קליפת המוח בעלון הפנימי של קרום הליפוזום.

במבחנה שחזור של שלד אקטין ציטוסקלטון בתוך שלפוחית אונילמלרית ענקית

פרוטוקול זה מתאר את שיטת התחליב ההפוך המשמשת לתמצת מערכת ביטוי ללא תאים (CFE) בתוך שלפוחית חד-למלרית ענקית (GUV) לחקר הסינתזה והשילוב של חלבון קרום מודל בדו-שכבתי השומנים.

הרכבה מחדש של תעלת קולטן הגלוטמט החיידקי על ידי אנקפסולציה של מערכת ביטוי ללא תאים

פרוטוקול זה מתאר את מערכת סינתזת החלבונים ללא תאים (CFPS) המשמשת לבניית תאים סינתטיים. הוא מתאר שלבי מפתח עם תוצאות מייצגות במיקרו-תאים שונים. מטרת הפרוטוקול היא לבסס שיטות עבודה מומלצות למעבדות מגוונות בקהילת התאים הסינתטיים, ולקדם את ההתקדמות בפיתוח תאים סינתטיים.

מערכת סינתזת חלבונים ללא תאים לבניית תאים סינתטיים

אנו מציגים פרוטוקול להרכבה מחדש של חלבוני ממברנה ועטיפת אנזימים ורכיבים מסיסים אחרים במים בשלפוחיות שומנים בגודל תת-מיקרומטר ומיקרומטר.

בניית רשתות מטבוליות מחוץ לשיווי משקל בשלפוחיות בגודל ננו ומיקרומטר

מאמר זה מציג שיטה להכנת שלפוחיות ענק חד-תכליתיות (cGUVs) בעלות מבנה שלפוחית בתוך שלפוחית, עם מוליכות חשמלית מותאמת אישית באזורים פנימיים, טבעתיים וחיצוניים. אלקטרופורמציה מסנתזת GUVs פשוטים, שהופכים לסטומטוציטים ו-cGUVs באמצעות הלם אוסמוטי, ומספקים מודל רב ערך לחקר הביופיזיקה של תאים גרעיניים.

סינתזה של שלפוחיות חד-כיווניות ענקיות: מודל ביומימטי של תאים גרעיניים

למדו כיצד לבנות מחקים סלולריים מאפס באמצעות הכלאת מנגנוני שעתוק ותרגום בשלפוחיות ליפידיות. שיטה זו מאפשרת מעקב אחרי ייצור חלבונים במיקרוסקופיה ומספקת בסיס ליישומי ביולוגיה סינתטית.

Encapsulation של תמלול נטול סלולרי ומכונות בתרגום לשלפוחית ​​לבניית מחקה סלולרי

גלה סרטונים נוספים

Encapsulation של תמלול נטול סלולרי ומכונות בתרגום לשלפוחית לבניית מחקה סלולרי