שימוש בcaspase ריבוב Assay לקביעת אפופטוזיס בדגם נייד ההיפותלמוס

המטרה הכוללת של סרטון זה היא להדגים מבחן מולטיפלקס בעל תפוקה גבוהה כדי לקבוע את הופעת האפופטוזיס כפי שנמדד על ידי קספאז. שלוש שבע. ראשית, נוירונים היפותלמוסיים מאותגרים עם חומצת שומן רוויה הגורמת לאפופטוטית, חומצה פלמיטית.

לאחר מכן נמדדת כדאיות התא של הנוירונים באמצעות ריאגנט מבוסס פלואורסצנטי וקורא מיקרו-פלטות לאחר הופעת האפופטוזיס. מצע הלומינו, DEVD, שהוא רצף חומצות אמינו שנבקע על ידי קספאז שלוש, מתווסף לתאים. השלב האחרון של ההליך הוא מדידת זוהר באמצעות קורא מיקרו-פלטות כדי לקבוע את פעילות הקספאז, העולה בתאים שעוברים אפופטוזיס.

בסופו של דבר, ניתן להשיג יחס של פעילות קספאז לכל תא בר קיימא תוך פחות מחמש עד שש שעות. בפורמט של 96 בארות. היתרון העיקרי של טכניקה זו של השיטות הקיימות שלנו, כמו כתמים מערביים או ליזה, הוא שמדובר בבדיקה מהירה וזולה שיכולה למדוד ישירות פעילות קספאז שלוש שבע בפורמטים מרובים של בארות.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום, כגון קביעת מודולטורים ראשוניים של אפופטוזיס. התועלת של טכניקה זו היא שניתן להשתמש בריבוב זה כשיטה מדויקת להערכת ציטוטוקסיות וכדאיות. למרות שהבדיקה פשוטה למדי, הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שהיא תבטיח שהבדיקה תושלם בהצלחה.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ניוון עצבי, ניתן ליישם אותה גם על מחלות אחרות ומודלים במבחנה כמו אלה המשמשים בחקר הסרטן. אנשים חדשים בשיטה זו יצטרכו לייעל טכניקה זו מכיוון שנקודות הקצה תלויות בקו התא ובאגוניסט. פעילות קספאזה שלוש שבע היא חולפת.

לכן, בהתאם ליעילות של גורם הלחץ התאי, קביעת התזמון המתאים לבדיקת פעילות בסיס יצוק יכולה לדרוש מאמץ מסוים כדי להתחיל במהירות. הפשרה הקפיאה 12 תאים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. לאחר ההפשרה, צנרת בעדינות את התאים לבקבוק תרבית מאוורר בגודל 75 סנטימטר רבוע והוסף 10 מיליליטר של דלקים חמים, נשרים שעברו שינוי, מדיום או DMEM, דגרו את הבקבוק למשך הלילה בחממת פחמן דו חמצני של 5% ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר 24 שעות, שואבים את המדיום ומחליפים במדיום טרי יכולים להמשיך לגדל תאים עד שבין 70 ל -80% מתקבל מפגש לאחר יומיים-שלושה של צמיחה. כדי לספור את התאים תחילה DMEM חם וטריפסין אחד x, תמיסת EDTA ל -37 מעלות צלזיוס. שאפו את החומר מהבקבוק ושטפו פעמיים במי מלח סטריליים עם פוספט

הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת ניסיון לפני הדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שתיים עד חמש דקות. נתק את התאים מהבקבוק באמצעות מגרד והשהה תאים בחמישה מיליליטר מדיה. העבירו את התאים דרך מסננת תאים לצינור נקי של 50 מיליליטר.

יתכן שיהיה צורך להעביר את התאים דרך המסננת יותר מפעם אחת, אך אל תחזור על הפעולה יותר משלוש פעמים לאחר ספירת התאים באמצעות זרע ציטומטר המו. 6, 000 תאים לבאר בצלחת שחורה או לבנה עם קירות שחורים או לבנים שקופים היטב בנפח סופי של 100 מיקרוליטר מדיום, דגרו את הצלחת ב-5% פחמן דו חמצני ו -37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. העבירו חומצה פלמיטית לבקבוקון זכוכית סטרילי של חמישה מיליליטר והמיסו ב-100% DMSO.

לאחר דילול תמיסת החומצה הפלמיטית מ-1 עד 10 ב-DMSO, הוסף אותה ל-PREWARM DMEM כדי לקבל ריכוז עבודה סופי של 0.1 מילי-מולרית חומצה פלמיטית לאמצעי בקרה, הוסף את אותו ריכוז של DMSO שנוסף למדיה המכילה חומצה פלמיטית. מוציאים את המדיה בכל באר ומחליפים ב -50 מיקרוליטר חומצה טית בינונית פלוס מינוס , ודוגרים את הצלחת ב -5% פחמן דו חמצני ו -37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר מכן הוסיפו חמישה ריאגנטים של שרף מיקרוליטר, ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לאחר הדגירה, טענו את הצלחת על קורא מיקרו-פלייט רב-מצבי והקליטו פלואורסצנטיות באורך גל עירור של 560 ננומטר ואורך גל פליטה של 590 ננומטר.

כדי למדוד את תוצאות אחריות התא מוצגות כיחידות פלואורסצנטיות יחסיות לאותה לוחית. הוסף 55 מיקרוליטר של מגיב יצוק DEVD ודגר בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. שוב באמצעות זוהר רשומת קורא המיקרופלייט למדידת קספאז שלוש שבע תוצאות פעילות מוצגות כיחידות זוהר יחסיות עם זוהר ביחס ישר לקספאז שלוש שבע כדי לנרמל את קספאז שלוש שבע פעילות לספירת התאים, לחלק את כדאיות התאים בקספאז שלוש שבע פעילות.

פרוטוקול זה מתאר תוצאות בריבוב שתי בדיקות נפרדות לקביעת מנגנוני מוות תאים על ידי אפופטוזיס. פעילות הקספאז גדלה באופן משמעותי בתאים מאותגרים עם חומצה פלמיטית. לאחר שעתיים דגירה, שלמות קרום התא משתנה באופן ניכר בנוכחות חומצה פלמיטית.

מוצג כאן המסלול הפוטנציאלי שבו חומצה פלמיטית גורמת לאפופטוזיס. הבנת המנגנונים הבסיסיים של גורם הלחץ המשמש לגרימת אפופטוזיס מסייעת בקביעת משך הזמן לדגירה של גורם הלחץ. מכיוון שיש להפעיל אנזימי קספאז לפני אינטראקציה עם מצע ה-DEVD לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות מחמש עד שש שעות אם היא מבוצעת כראוי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע בדיקת קספאז מולטיפלקס שלוש שבע פעילויות באמצעות מודל תרבית תאים עצביים היפותלמוס במבחנה. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שזמני הדגירה תלויים בסוגי התאים ובגורמי לחץ או אגוניסטים המשמשים. פיתוח טכניקה זו מאפשר לחוקרים בתחום מדעי המוח להשתמש בטכניקה אמינה וחוסכת זמן למחקרים אפופטוטיים בעקבות הליך זה, ניתן לבצע בדיקות פרמקולוגיות נוספות המכוונות לחלבונים ספציפיים בתהליך האפופטוטי על מנת לתאר את המנגנונים הבסיסיים המתחילים מחלות ניווניות.