באמצעות RNA-התערבות לחקר התגובה החיסונית המולדת בהמקרופאגים עכבר

המטרה הכללית של הליך זה היא להשתמש בהשתקת RNA (RNA interference) כדי לחקור את ההשפעה של גנים מועמדים על התגובה החיסונית המולדת. כדי לבצע זאת במקרופאגים של עכבר, קווי תאים של מקרופאגים של עכבר עוברים טריפסינציה ומעבדים יחד עם תמיסת טרנספקציה ו-siRNAs רלוונטיים; התערובת מועברת לאחר מכן ללוח nucleoVETTE בעל 96 בארות, ומערכת טרנספקציה Maxa 96 Well משמשת להחדרת ה-siRNA אל המקרופאגים. לאחר דגירה עם מצע תרבית תאים, מתווספים LPS או מפעילים אחרים של מערכת החיסון המולדת למקרופאגים שעברו טרנספקציה כדי לעורר אותם. לבסוף, מבוצעות בדיקות ELISA כדי לנטר את ייצור הסייטוקינים ולהעריך את השפעת הטיפול ב-siRNA על התגובה החיסונית המולדת.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני טרנספקציה מתווכת ליפידים הוא שהבדיקה שלנו היא חסונה וניתן ליישמה על גנים רבים בתהליך של סריקה רחבה (high throughput). המפתח לשיטה זו הוא עבודה עם תאים בריאים, טיפול עדין בהם ועבודה יעילה במהלך תהליך הטרנספקציה. כפי שנראה, פרוטוקול זה משתמש בקו התאים של מקרופאגים מעכבר מסוג RAW 264.7, אשר גודל כפי שמתואר במסמך המצורף.

כהכנה ללוח הטרנספקציה של ה-INA, זורעים את התאים בצפיפות של 20% וגדלים אותם במשך יום או יומיים עד שהתאים אינם עולים על 80% צפיפות. חשוב לזכור להשתמש בתאים שנמצאים בין מעברים 3 ל-10. לאחר ההפשרה, התחילו את הפרוצדורה על ידי תכנות מערכת ה-shuttle של 96 הבארים שבה ייעשה שימוש לטרנספקציה.

כדי לבצע זאת, הפעל את תוכנת ה-96 well shuttle במחשב המחובר למכשיר דרך תפריט הקבצים (file) בפינה השמאלית העליונה. בחר ב-new parameter file. סמן את הבארים שיועברו טרנספקציה בשרטוט של פלטת 96 הבארים המוצגת על המסך.

תיבה ירוקה תסמן את הבארות הנבחרות. בחרו את התוכנית התואמת את שורת תאי המקרופאגים שבה נעשה שימוש עבור תאי raw 2 64 0.7. בחרו DS 1 36 ולאחר מכן לחצו על apply.

שימו לב כי לאחר בחירת תוכנית, הבארות בלוח הסכימטי ייצבעו. עיגולים ריקים בצבע כחול כהה מציינים בארות שלא הוקצתה להן תוכנית ולא יועברו זעזוע (shock). לאחר מכן, הכינו את תמיסת ה-nucleo effector לעבודה על ידי ערבוב של תמיסת nucleo effector לבארות 96 של שורת התאים SF עם כל התוכן של מבחנת התוסף המצורפת.

יש לאפשר לריאגנטים המעורבבים להגיע לשיווי משקל בטמפרטורת החדר. יש לחמם את ה-D-M-E-M-R-P-M-I 1640 0.25%tripsin EDTA ואת ה-PBS ל-37 degrees Celsius. הכין את פלסמיד הבקרה S-I-R-N-A-P max GFP הניסויי או את ה-siRNAs המסומנים פלואורסצנטית על ידי הפשרתם על קרח, כדי לנתק מקרופאגים דבקים מקימי תרבית התאים.

שאבו את המדיום ושטפו את התאים פעמיים עם 10 milliliters של PBS. לאחר הסרת ה-PBS, דגרו את התאים עם מיליליטר אחד של 0.25%tripsin EDTA שחומם מראש לכל צלחת, עד שהתאים יתחילו להיפרד. תהליך זה אורך דקה עד שתי דקות.

הקש בעדינות על הפלטה והזז את התמיסה במהלך הדגירה כדי למקסם את ה-trypsinization. לאחר שהתאים התנתקו, הוסף בעדינות תשעה מיליליטר של תערובת DMEM פלוס FBS על ידי פיפטינג מעלה ומטה, ואז אסוף את התאים על ידי פיפטינג לשפופרת סטרילית. ספור את מספר המקרופאגים המבודדים באמצעות Hema Cytometer.

צפו לכ-10 מיליון מקרופאגים לכל פלטה של 10 סנטימטר. חשבו את המספר הכולל של המקרופאגים הדרושים; כל באר במעבר של 96 באערים דורשת 200,000 תאים. העבירו בעזרת פיפט את מספר התאים שחושב אל מבחנה לצנטריפוגה.

סובב את התאים למשך 10 דקות ב-150 G בטמפרטורת החדר לתוך פלטת 96 בארות עם תחתית עגולה סטרילית, המקלה על הערבוב תוך מזעור של אובדן ריאגנטים. הוסף שני מיקרוליטרים של כל IRNA לכל באר המיועדת לטרנספקציה. שים לב כי בהתאם למספר ה-siRNAs, ניתן לבצע זאת במהלך שלב הצנטריפוגציה של המקרופאגים.

ההיבט המאתגר ביותר בפרוצדורה זו הוא האלקטרופורציה; המפתחות הם טיפול עדין מאוד בתאים ועבודה מהירה מאוד. ברגע שהתאים נמצאים בתמיסת טרנספקציה רעילה, יש לשאוב את המדיום מהתאים שנצנטריגו, ולאחר מכן לחדד אותם בעדינות בתמיסת nucleo effector SF המכילה את תמיסת התוספים.

העבירו מיד את התאים לתעלה סטרילית באמצעות פיפט רב-ערוצי; העבירו 20 µL של תערובת התאים התלוים לכל באער של פלטת 96 באערים המכילה את ה-siRNAs, תוך ערבוב עדין באמצעות פיפוט מעלה ומטה. לאחר מכן, העבירו 20 µL של תערובת התאים וה-INA לפלטת נוקליאפקציה של 96 באערים. קריטי להימנע מיצירת בועות במהלך שלב זה, שכן הדבר עלול לגרום לשגיאות במהלך הנוקליאפקציה.

לאחר הנחת כל הדגימות הניסוייות בצלחת הטרנספקציה, כסו אותה עם המכסה המסופק והקישו עליה בעדינות רבה על משטח קשיח. כדי להסיר בועות אוויר, הכניסו את פלטת 96 הבארים לתוך ה-96 well nucleo effector shuttle, ובפינה הימנית התחתונה של מסך התוכנית, בחרו ב-upload וב-start. לאחר מכן, פעלו לפי הנחיות התוכנית כדי לשמור את התוצאות במהלך תהליך ה-nucleo affection בבארים בהצלחה.

תאים שעברו טרנספקציה יסומנו בסכמה של 96 הבארים על המסך באמצעות עיגול ירוק עם סימן פלוס. עיגול אדום עם סימן מינוס מעיד על שגיאה, ככל הנראה עקב בועות או פיפטא של נפח שגוי של ריאגנטים מיד לאחר הנוקלאופקציה. השתמש בפיפט רב-ערוצי כדי להוסיף 80 µL של RPMI 1640 שחומם מראש.

מוסיפים מצע לצד כל באר. יש לאפשר למצע להתערבב לאט עם התאים שעברו טרנספקציה, שכן הם עדינים מאוד בשלב זה. הוספה מהירה מדי של המצע תפחית משמעותית את החיוניות.

הנח את פלטת 96 הבארים המכילה את הדגימות שעברו טרנספקציה ואת ה-RPMI 1640 בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5%CO2 למשך שתי דקות או יותר. קריטי לאפשר לתאים להתאושש לפני המשך הטיפול. לאחר הוצאת הפלטה מהאינקובטור, השתמש בפיפט רב-ערוצי כדי להעביר בזהירות את התערובת מכל באר לפלטת תרבית רקמות של 96 בארים.

לאחר מכן, באמצעות פיפט רב-ערוצי, הוסף 100 µL של DMEM עם FBS לכל באר. הדגר למשך 24 עד 36 שעות; מיד לאחר הטרנספקציה וההתאוששות, בצע ציטומטריה זרימה. כדי להעריך את יעילות הטרנספקציה של siRNA המסומן פלואורסצנטית, למעלה מ-99% מהתאים צריכים להיות שעברו טרנספקציה ביום שלאחר בדיקת הטרנספקציה. עבור יעילות טרנספקציה של פלסמיד GFP, על 30 עד 50% מהתאים להביע GFP. לאחר הדגרה של 24 עד 36 שעות, הכן LPS או מפעילים אחרים של מערכת החיסון המולדת במצע טרי; דלל את ה-LPS לריכוז סופי של 20 ng/mL ב-DMEM עם FBS.

לאחר מכן, שאבו בזהירות את המצע מלוחית 96 הבארים והוסיפו לתאים מצע טרי המכיל LPS. הניחו את הלוחית באינקובטור כדי לעקוב אחר התגובה ל-LPS או למעוררים אחרים של מערכת החיסון המולדת בנקודות זמן שונות לאחר הגירוי. העבירו בפיפט את העליון (supernatant) מהתאים ללוחית אחסון של 96 בארים לצורך אנליזה באמצעות ELISA.

לאחר הסרת הנוזל העליון (supernatant) כדי לבחון את חיות התאים, הוסף 100 µL של fluorescein diacetate בדילול של 1:100 ב-PBS לכל באער, והדגר בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת עד חמש דקות. עקוב אחר הפלואורסצנציה בתאים באמצעות קורא לוחות (plate reader) כאשר התרכובת מנוגשת על ידי אסטראזות תאיות בתאים חיים. תרכובת זו הופכת לפלואורסצנטית כדי להדגים את התועלת של גישה זו לניטור התגובה החיסונית המולדת.

siRNAs המכוונים לגנים ידועים המווסתים את המערכת החיסונית המולדת הועברו (transfected) לקו תאי המקרופאגים raw 2 64 0.7. לאחר מכן, התאים עוררו באמצעות LPS, והייצור של הציטוקינים הפרו-דלקתיים IL six ו-TNF alpha נוטר באמצעות ELISA, כפי שמוצג כאן.

עיכוב של קולטן דמוי-toll ארבע, הקולטן ל-LPS, אך לא של TLRs אחרים. באמצעות SIR, נצפתה ירידה חדה בייצור של IL six ו-TNF alpha המושרים על ידי LPS. שימו לב כי עיכוב של IL six באמצעות irna הפחית את ייצור ה-IL six, אך לא השפיע על ייצור ה-TNF alpha.

נתונים אלה מצביעים על יעילות טובה וספציפיות טובה של השתקה באמצעות siRNA של רגולטורים מועמדים של החסינות המולדת. חשוב לזכור שהמפתח לטרנספקציה טובה ולהתאוששות תאית טובה הוא עבודה עם תאים בריאים מאוד, טיפול עדין בהם במהלך תהליך הטרנספקציה וההתאוששות, ועבודה מהירה מרגע שהתאים נמצאים בתמיסת נוקלאו-אפקטור (nucleo effector solution). לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע בדיקות רבות אחרות, כולל QPCR לניטור השתקת הגנים ובדיקות רבות נוספות לבחינת התגובה החיסונית המולדת.