באמצעות RNA-התערבות לחקר התגובה החיסונית המולדת בהמקרופאגים עכבר

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בהפרעות RNA כדי לחקור את ההשפעה של גנים מועמדים על התגובה החיסונית המולדת. במקרופאגים של עכברים כדי לעשות זאת, קווי תאי מקרופאגים של עכבר עוברים טריפסים ומשולבים עם תמיסת טרנספקציה ו-SI RNAs מעניינים, לאחר מכן התערובת מועברת לצלחת VETE של 96 באר גרעין ומערכת טרנספקציה של מקסה 96 באר משמשת להעברת siRNA למקרופאגים ולאחר דגירה עם תרבית תאים, מדיום, LPS או מפעילים אחרים של חסינות מולדת מוחלים על המקרופאגים שעברו טרנספקט כדי לעורר אותם. לבסוף, אלייזה מבוצעת לאחר מכן כדי לנטר את ייצור הציטוקינים ולהעריך את השפעת הטיפול ב-siRNA על התגובה החיסונית המולדת.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני טרנספקציה מתווכת שומנים הוא שהבדיקה שלנו חזקה וניתנת ליישום על גנים רבים במקצוע תפוקה גבוהה. המפתח לשיטה זו הוא לעבוד עם תאים בריאים, לטפל בהם בעדינות ולעבוד ביעילות במהלך תהליך הטרנספקציה. כפי שנדגים, פרוטוקול זה משתמש בקו תאי המקרופאגים הגולמי 2 64 0.7 עכבר, אשר מתורבת כמתואר במסמך הנלווה.

כהכנה לצלחת הטרנספקציה של INA, התאים בשטף של 20% וגדלים יום או יומיים עד שהתאים אינם מתכנסים יותר מ-80%. חשוב לזכור להשתמש בתאים שנמצאים בין מעברים 3 ל-10. לאחר ההפשרה, התחל בהליך זה על ידי תכנות מערכת מעבורת 96 הבארות שתשמש לטרנספקציה.

לשם כך, הפעל את תוכנת מעבורת 96 בארות במחשב המחובר למעבורת מתפריט הקובץ השמאלי העליון. בחר קובץ פרמטר חדש. הדגש את הבארות שיועברו בסכימת צלחת 96 הבאר המוצגת.

תיבה ירוקה תציין את הבארות שנבחרו. בחר את התוכנית המתאימה לקו התאים של המקרופאגים המשמש עבור 2 64 0.7 תאים גולמיים. בחר DS 1 36 בחר החל.

שימו לב שלאחר בחירת תוכנית, הבארות בצלחת הסכמטית יהיו צבעוניות. עיגולים ריקים בצבע כחול כהה מצביעים על בארות שלא הוקצתה להן תוכנית ולא יזדעזעו. לאחר מכן, הכן את תמיסת אפקטור הגרעין העובד על ידי ערבוב תמיסת אפקטור נוקלאו קו תאי SF 96 באר עם כל התוכן של צינור התוסף הכלול.

אפשר לריאגנטים המעורבים להתייצב בטמפרטורת החדר. לחמם את ה-D-M-E-M-R-P-M-I 1640 0.25% טריפסין EDTA ו-PBS ב-37 מעלות צלזיוס. הכן את פלסמיד בקרת ה-S-I-R-N-A-P max GFP הניסיוני או siRNAs המסומנים בפלואורסצנט על ידי הפשרתם על קרח כדי לנתק מקרופאגים דבקים מכלי תרבית התאים.

שאפו את המדיום ושטפו את התאים פעמיים עם 10 מיליליטר PBS. לאחר מכן, לאחר הסרת ה-PBS, דגרו על התאים עם מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין EDTA שהוזהר מראש לכל צלחת עד שהתאים מתחילים להתנתק. זה לוקח דקה עד שתיים.

הקש בעדינות על הצלחת והזיז את התמיסה במהלך הדגירה כדי למקסם את הטריפסין. לאחר שהתאים מתנתקים, הוסיפו תשעה מיליליטר של DMEM בתוספת FBS ערבבו בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה, ואז אספו את התאים על ידי פיפטינג לתוך צינור סטרילי. ספרו את מספר המקרופאגים המבודדים באמצעות Hema Cytometer.

צפו לכ-10 מיליון מקרופאגים לכל צלחת של 10 סנטימטרים. חשב את המספר הכולל של מקרופאגים הדרושים לכל באר במעבורת 96 הבארות דורשת 200,000 תאים. פיפטה את מספר התאים המחושב לתוך צינור צנטריפוגה.

סובב את התאים במשך 10 דקות בחום של 150 גרם בטמפרטורת החדר לצלחת תחתונה עגולה 96 היטב, מה שמקל על הערבוב תוך מזעור אובדן ריאגנטים. הוסף שני מיקרוליטר מכל IRNA לכל באר להעברה שימו לב שבהתאם למספר ה-siRNAs, ניתן להשיג זאת במהלך שלב הצנטריפוגה של המקרופאגים.

ההיבט הקשה ביותר בהליך זה הוא האלקטרופורציה, המפתחות המטפלים בתאים בעדינות רבה ועובדים מהר מאוד. ברגע שהתאים נמצאים בתמיסת טרנספקציה רעילה, שאפו את המדיום מתאי הצנטריפוגה, ולאחר מכן השעו אותם בעדינות בתמיסת אפקטור גרעין. SF המכיל את תמיסת התוסף.

העבירו מיד את התאים לשוקת סטרילית באמצעות פיפטה רב-ערוצית, העבירו 20 מיקרוליטר מתערובת התאים המרחפת לכל באר של צלחת 96 הבארות המכילה את ה-siRNAs מעורבבים בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. לאחר מכן, העבירו 20 מיקרוליטר מתערובת ה-INA של התא לתוך צלחת ה-96 בארות. זה קריטי להימנע מיצירת בועות במהלך שלב זה מכיוון שהדבר יכול לגרום לשגיאות במהלך חיבה גרעינית.

לאחר הנחת כל דגימות הניסוי בצלחת הטרנספקציה, כסו אותה במכסה המצורף והקישו עליה בעדינות רבה על משטח קשה. כדי להסיר בועות כלשהן, הנח את צלחת 96 הבאר במעבורת אפקטור הגרעין של 96 בארות, ובפינה השמאלית התחתונה של מסך התוכנית, בחר העלה והתחל. לאחר מכן עקוב אחר הנחיית התוכנית כדי לשמור את התוצאות במהלך בארות תהליך חיבת הגרעין בהצלחה.

Transfected יוצג על סכמת הבאר 96 על המסך על ידי עיגול ירוק עם סימן פלוס. עיגול אדום עם סימן מינוס מצביע על שגיאה הנובעת ככל הנראה מבועות או פיפטינג של נפח שגוי של ריאגנטים מיד לאחר חיבה גרעינית. השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להוסיף 80 מיקרוליטר RPMI 1640 חם מראש.

בינוני לצד כל אחד. ובכן אפשר למדיום להתערבב לאט לאט עם התאים המועברים, שהם עדינים מאוד בשלב זה. הוספת המדיום מהר מדי תפחית מאוד את הכדאיות.

הנח את צלחת 96 הבאר עם דגימות שהועברו ו-RPMI 1640 לתוך אינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך שתי דקות או יותר. זה קריטי לאפשר לתאים להתאושש לפני מניפולציה נוספת. לאחר הוצאת הצלחת מהחממה, השתמש בפיפטה רב ערוצית כדי להעביר בזהירות את התערובת מכל באר לצלחת תרבית רקמות של 96 בארות.

ואז שוב, בעזרת הפיפטה הרב-ערוצית, הוסף 100 מיקרוליטר DMEM עם FBS לכל אחד. דגירה טובה למשך 24 עד 36 שעות מיד לאחר הטרנספקציה וההתאוששות לבצע ציטומטריית זרימה. כדי להעריך את יעילות הטרנספקציה של SI irna המסומן פלואורסצנטי, יש להעביר יותר מ-99% מהתאים יום לאחר בדיקת טרנספקציה ליעילות הטרנספקציה של פלסמיד GFP, 30 עד 50% מהתאים צריכים לבטא GFP לאחר הדגירה של 24 עד 36 שעות, הכינו LPS או מפעילים אחרים של חסינות מולדת במדיום טרי לדלל את ה-LPS לריכוז סופי של 20 ננוגרם למיליליטר ב-DMEM עם FBS.

לאחר מכן שאפו בזהירות את המדיום מצלחת 96 הבאר והוסיפו את המדיום הטרי המכיל את ה- LPS לתאים. הנח את הצלחת באינקובטור כדי לעקוב אחר התגובה ל-LPS או לגירויים אחרים של חסינות מולדת בזמנים שונים לאחר הגירוי. פיפטה הסופרנטנט מהתאים לתוך צלחת אחסון של 96 בארות לניתוח על ידי אלייזה.

לאחר הסרת הסופרנטנט כדי לנטר את כדאיות התא, הוסף 100 מיקרוליטר של 1 עד 100 פלואורסצאין די אצטט ב-PBS לכל באר דגירה בטמפרטורת החדר למשך דקה עד חמש דקות. עקוב אחר הקרינה בתאים באמצעות קורא צלחות כאשר הוא נחתך על ידי אסטרזות תאיות בתאים חיים. תרכובת זו הופכת פלואורסצנטית כדי להמחיש את התועלת של גישה זו לניטור התגובה החיסונית המולדת.

siRNAs המכוונים לגנים מווסתים חיסוניים מולדים ידועים הועברו לקו תאי המקרופאגים הגולמיים 2 64 0.7. לאחר מכן התאים עוררו באמצעות LPS וייצור הציטוקינים הפרו-דלקתיים. IL 6 ו-TNF alpha נוטרו על ידי אלייזה כפי שמוצג כאן.

עיכוב של קולטן דמוי טול ארבע, הקולטן ל-LPS, אך לא TLRs אחרים. באמצעות SIR, ייצור מופחת מאוד של LPS גרם ל-IL 6 ו-TNF אלפא. שימו לב שעיכוב של IL 6 עם irna הפחית את ייצור IL six, אך לא השפיע על ייצור TNF אלפא.

נתונים אלה מצביעים על יעילות טובה וספציפיות טובה של נוקדאון מתווך siRNA של מווסתים מועמדים של חסינות מולדת. חשוב לזכור שהמפתח לטרנספקציה טובה ולהתאוששות תאים טובה הוא לעבוד עם תאים בריאים מאוד, לטפל בהם בעדינות במהלך תהליך הטרנספקציה וההתאוששות, ולעבוד במהירות ברגע שהתאים נמצאים בתמיסת אפקטור גרעין. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע בדיקות רבות אחרות כולל QPCR לניטור הפלת גנים ובדיקות רבות אחרות כדי לחקור את התגובה החיסונית המולדת.