Name: בידוד של CA1 גרעיני שברים מועשרים מSlices בהיפוקמפוס לחקר פעילות תלויה גרעיני יבוא של חלבונים Messenger synapto-גרעיניים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: חקור בידוד שברים גרעיניים מועשרים מ-Hippocampus לאחר אינדוקציה של LTP באזור CA1. שיטה זו מאפשרת ניתוח רמות פוספופרוטאינים גרעיניים וחקר מנגנוני זיכרון ולמידה במוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), מענק DIP (MRK), EU FP7 MC-ITN NPlast (MRK), המרכז למדעי המוח ההתנהגותיים (CBBS, Sahsen-Anhalt), (AK ו-SB), MM הוא זוכה מלגה ארוכת טווח של הארגון האירופי לביולוגיה מולקולרית (EMBO) (EMBO ALTF 884-2011) ומארי-קירי IEF.

.1 הכנת אקוטית בהיפוקמפוס פרוסות ממוח חולדה למבוגרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי חולדות עם isoflurane. זהירות: בצע את ההליך באמצעות exicator סגור, לא לשאוף isoflurane. ודא כי בעל החיים הוא מורדמים לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף את העכברוש, במהירות לבודד את המוח, ולטבול אותו בprecarbonated (95% O 2/5% 2 תערובת גז CO) קר כקרח הפתרון של הגיי (הרכב במ&quot;מ: 2H 2 O 130 NaCl, 4.9 KCl, 1.5 CaCl 2 · , 0.3 MgSO 4 · 2H 2 O, 11 MgCl 2 · 6 שעות 2 O, 0.23 KH 2 PO 4, 0.8 Na 2 HPO 4 · 7H 2 O, גלוקוז 5 · H 2 O, 25 HEPES, 22 NaHCO 3, pH 7.32) ל30 דקות 1,2,10,16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח הקטן וחלק של קליפת המוח entorhinal. הפרד את ההמיספרות בקליפת המוח עם חתך באמצע sagittal, ואז למקם את כל חצי הכדור על המשטח המדיאלי שלה. לאחר מכן להפוך את50-70 ° חתך (רוחבי 50-70 °) לאורך קצה הגב של אונה כל 13,14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדבק כל חצי הכדור עם משטח שזה עתה נקצץ על פלטפורמת החיתוך של מערכת חתך. הפלטפורמה צריכה להיות מכוסה על ידי הפתרון של הגיי קר כקרח precarbogenated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך 350 מיקרומטר 50-70 ° פרוסות רוחביים מקדמיים לאחוריים צד באמצעות vibratome המותאם ללמזער תנודת ציר z. ההיווצרות בהיפוקמפוס, הקורטקס subicular וentorhinal, כמו גם את קליפת המוח שממוקם דורסולטרלי להיפוקמפוס תהיה חלק מהפרוסות המשמשות לניסויים 13,14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את פרוסות בהיפוקמפוס לU-צורה וחממת סוג שקועה ודגירה של לפחות שעה 2 ב 32 מעלות צלזיוס עם מלאכותי נוזל השדרתי carbogenated (ACSF המכיל במ&quot;מ: 110 NaCl, KCl 2.5, 2.5 CaCl 2 · 2H 2 O, 1.5 MgSO 4 · 2H 2 O, 1.24 KH 2 PO 4, 10 גלוקוז · H 2O, 27.4 3 NaHCO, pH 7.3) 1,2,10,16. </li></ol> .2 מיקום של אלקטרודות, Baseline הקלטה, ואינדוקציה של LTP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הפרוסה בהיפוקמפוס לתא הקלטת הסוג שקוע רכוב תחת מיקרוסקופ. Perfuse (6-7 מ&quot;ל / דקה) עם ACSF carbogenated לפחות 30 דקות ב32 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן microelectrodes נימי זכוכית מלא ACSF (התנגדות קצה היא 3-5 MΩ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח microelectrodes זכוכית מלא ACSF בסיבי CA1 שפר-בטוחות לגירוי ובradiatum שכבת CA1 לfEPSP הקלטת 1,2,10 (איור 2). המרחק בין האלקטרודות צריך להיות על 300 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר שדה פוטנציאלים מעוררים Postsynaptic (fEPSPs) על ידי גירוי של סיבי שפר-טחונות עם פולסים biphasic מלבניים הנוכחיים (200 אלפיות שני / קוטביות) בטווח של 3-4 V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את בדיקת הגירוי המקסימלי על ידי מדידת inpמערכת יחסים וut-פלט להגדיר את כוח הגירוי כ40% מערכי fEPSP-שיפוע מרביים שהושגו ולשמור אותו קבוע לאורך כל הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין ההקלטה הבסיסית לפחות 15 דקות לאחר בדיקת הגירוי המקסימלי. מדוד את התגובות לגירויים לבדוק בכל דקה לאורך כל הניסוי. לבצע הקלטות תחילת המחקר עם גירוי בתדר נמוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את הבסיס לדקות לפחות 30. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזירוז המאוחר LTP להחיל בתדירות גבוהה 100 tetanization הרץ בהרכב של שלוש רכבות גירוי 1 שניות ב 100 הרץ עם מרווח intertrain 5 דקות. כדי להגדיל את השדה של גירוי בתוך אזור 5 bicuculline מיקרומטר CA1 ניתן לכבס ב2 דקות לפני tetanization ויש לשטוף מייד לאחר tetanization האחרון. </li></ol> .3 אוסף של פרוסות לאחר האינדוקציה של LTP והקפאת ההצמדה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Stop LTP הקלטת 2 דקות או 30 דקות אחרי שלוש רכבות של גירוי tetanic גרימה המאוחר LTP. </li><li&gt; הסר את אלקטרודות ובמהירות להעביר את הפרוסה על גבי פלטפורמת מתכת precold הניחה על קרח יבש. חזור על התהליך עבור פרוסת שליטה נשמרת בחממה בצורת U. זהירות: כפפות שימוש תוך כדי עבודה עם קרח יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף כל פרוסה בצינור 1.5 מ&quot;ל ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol> .4 בידוד של שברים מועשרים גרעיניים מאזור CA1 של ההיפוקמפוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 1.5 צינורות מ&quot;ל אפנדורף עם פרוסות קפואות מ-80 מעלות צלזיוס ולשמור אותם על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל של פרוטאז הטרי הקר TBS מאגר המכיל (PI) ומעכבי phosphatase (PS), לתוך הצינור. דגירה של 2-3 דק &#39;ולהעביר לסטראו. זהירות: כפפות מגן שימוש וחלוק מעבדה תוך כדי עבודה עם PI וPS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את אזור pyramidale שכבת CA1 של ההיפוקמפוס באמצעות שתי מחטים. השתמש במחט אחת להחזקת הפרוסה תחת סטראו והמחט השנייה לחיתוך אזור CA1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את CA גזור1 אזורים מ5 פרוסות (לכל קבוצה) לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל חדש המכיל 50 מאגר תמוגה μl (1X חיץ hypotonic תמוגה מכיל מ&quot;מ: 10 HEPES, 1.5 MgCl 2, 10 KCl, pH 7.9, עם PI וPS). שים לב שסכום זה של חומר יהיה מספיק כדי לרוץ 2-3 immunoblots. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize רקמות שנאספו על ידי pipetting למעלה ולמטה זהירים. השתמש בפיפטה 200 μl. דגירה lysate על קרח למשך 5-7 דקות, כדי לאפשר לתאים להתנפח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 2 μl של lysate, לרדת בשקופית מיקרוסקופית, ולדמיין את הנפיחות של התאים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. עם נפיחות תקינה של תאי הגרעינים מופיעים כעגולים מבנים בשלמותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 20 μl של מדגם לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל טרי כמו &quot;שבר homogenate &#39;. הוסף 8 μl של denaturing חיץ מדגם SDS 4x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysates שנותר ב11,000 סל&quot;ד במשך דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את supernatant בזהירות מהחלק העליון (&quot;חלק cytosolic &#39;), TRansfer לתוך צינור חדש ולהוסיף 20 μl של חיץ מדגם 4x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב60 μl של חיץ hypotonic ולהוסיף 20 μl של חיץ מדגם 4x. חלק זה נקרא &quot;חלק גרעיני מועשר&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenate, cytosolic, ושברים מועשרים גרעיניים יכולים להיות מאוחסנים ב-20 מעלות צלזיוס או -80 מעלות צלזיוס במשך immunoblotting מאוחר יותר. </li></ol> .5 Immunoblotting Semiquantitative לחלבוני synapto-גרעיניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Defreeze הדגימות ולהרתיח אותם במשך 5 דקות ב95 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 5 μl כל חלק מן ולקבוע את ריכוז החלבון על ידי amido מבחן שחור או מבחן BCA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעון כמות שווה של דגימות חלבון מhomogenate, שברים מועשרים cytoplasmic והגרעיניים על SDS-PAGE. דוגמאות משליטה ופרוסות LTP צריכים להיות ממוקמות באותו ג&#39;ל להשוואה ישירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הליך סופג מערבי סטנדרטי (העברה רטובה מומלצת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחקור את הקרומים עם t<html> הוא הנוגדנים של בחירה. בהמשך לכך באותו כתמים (או אותו דגימות להריץ במקביל) יכולים להיות נחקרים עם הסמן cytoplasmic - enolase2 נוירון ספציפי (NSE2) וסמן גרעיני - NeuN ונוגדן -actin כביקורת טעינה. </li></ol> ניתוח .6 נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יעילות של האינדוקציה LTP יכולה להיות מנותחת על ידי תוכנת Clampfit. השיפוע הממוצע של הקלטות תחילת המחקר היה בהשוואה למדרונות לאחר tetanization באמצעות דו כיוונית ANOVA, p &lt;0.05 נחשבו שונים באופן משמעותי. ערכי מדרון fEPSP תוארו בתרשימים כממוצע ± SEM </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכימות של immunoblots, לסרוק או סרט autoradiographic ולנתח את הצפיפות המשולבת של להקות חלבון על ידי ImageJ או להקות הקרינה עם מערכת Licor. ערכים של להקות immunoreactive צריכים להיות מנורמלים לטעינה מלאה וסופג. לשם השוואה של השליטה וקבוצות LTP עשוי לשמש Mann-Whitney U-מבחן nonparametrical. </li></ol><table border="0"</html style=";text-align:right;direction:rtl">cellpadding = cellspacing &quot;0&quot; = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> שם של החיץ </td><td> מגיב </td><td> ריכוז (מ&quot;מ) </td><td> הסכום </td><td> תגובות / תיאור </td></tr><tr><td> הפתרון (pH: 7.3 ~ 7.4) של הגיי </td><td> NaCl </td><td> 130 </td><td> 7.6 גרם </td><td> סינון סטרילי </td></tr><tr><td> 1,000 מ&quot;ל </td><td> KCl </td><td> 4.9 </td><td> 0.37 גרם </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> 1.5 </td><td> 0.22 גרם </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 4 MgSO · 2H 2 O </td><td> 0.3 </td><td> .0739 גרם </td><td></td></tr><tr><td></td><td> MgCl 2 · 6 שעות 2 O </td><td> 11 </td><td> 2.24 גרם </td><td></td></tr><tr><td></td><td> KH 2 PO 4 </td><td> 0.23 </td><td> .0313 גרם </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Na 2 HPO 4 · 7H 2 O </td><td> 0.8 </td><td> .2145 גרם </td><td></td></tr><tr><td></td><td> גלוקוז · H 2 O </td><td> 5 </td><td> .9909 גרם </td><td></td></tr><tr><td></td><td> HEPES </td><td> 25 </td><td> 5.96 גרם </td><td></td></tr><tr><td></td><td> NaHCO 3 </td><td> 22 </td><td> 1.85 גרם </td><td></td></tr><tr><td> ACSF (pH: 7.3 ~ 7.4) </td><td> NaCl </td><td> 110 </td><td> 6.428 גרם </td><td> סינון סטרילי </td></tr><tr><td> 1,000 מ&quot;ל </td><td> KCl </td><td> 2.5 </td><td> .1865 גרם </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> 2.5 </td><td> 0.368 גרם </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 4 MgSO · 2H 2 O </td><td> 1.5 </td><td> 0.370 גרם </tד&gt; <td></td></tr><tr><td></td><td> KH 2 PO 4 </td><td> 1.24 </td><td> 0.169 גרם </td><td></td></tr><tr><td></td><td> גלוקוז · H 2 O </td><td> 10 </td><td> 1.9817 גרם </td><td></td></tr><tr><td></td><td> NaHCO 3 </td><td> 27.4 </td><td> 2.3 גרם </td><td></td></tr><tr><td> 1x hypotonic חיץ (pH: 7.9) </td><td> HEPES </td><td> 10 </td><td> 0.23 גרם </td><td></td></tr><tr><td> 100 מ&quot;ל </td><td> MgCl 2 · 6 שעות 2 O </td><td> 1.5 </td><td> .0304 גרם </td><td></td></tr><tr><td></td><td> KCl </td><td> 10 </td><td> .07455 גרם </td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 1 חוצצים.

<ol><li>Behnisch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+translocation+of+Jacob+in+hippocampal+neurons+after+stimuli+inducing+long-term+potentiation+but+not+long-term+depression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression.</a> PLoS One. 6 (2), e17276(2011).</li>
<li>Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+degradation+by+the+proteasome+is+required+for+synaptic+tagging+and+the+heterosynaptic+stabilization+of+hippocampal+late-phase+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protein degradation by the proteasome is required for synaptic tagging and the heterosynaptic stabilization of hippocampal late-phase long-term potentiation.</a> Neuroscience. 169 (4), 1520-1526 (2010).</li>
<li>Chapman, C. A., Perez, Y., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+GABA%28A%29+inhibition+on+the+expression+of+long-term+potentiation+in+CA1+pyramidal+cells+are+dependent+on+tetanization+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Effects of GABA(A) inhibition on the expression of long-term potentiation in CA1 pyramidal cells are dependent on tetanization parameters.</a> Hippocampus. 8 (3), 289-298 (1998).</li>
<li>Ch'ng, T. H., Uzgil, B., Lin, P., Avliyakulov, N. K., O'Dell, T. J., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+transport+of+the+transcriptional+coactivator+CRTC1+from+synapse+to+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent transport of the transcriptional coactivator CRTC1 from synapse to nucleus.</a> Cell. 150 (1), 207-221 (2012).</li>
<li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caldendrin-Jacob%3A+a+protein+liaison+that+couples+NMDA+receptor+signalling+to+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Caldendrin-Jacob: a protein liaison that couples NMDA receptor signalling to the nucleus.</a> PLoS Biol. 6 (2), e34(2008).</li>
<li>Fainzilber, M., Budnik, V., Segal, R. A., Kreutz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+synapse+to+nucleus+and+back+again--communication+over+distance+within+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">From synapse to nucleus and back again--communication over distance within neurons.</a> J. Neurosci. 31 (45), 16045-16048 (2011).</li>
<li>Hardingham, G. E., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+versus+extrasynaptic+NMDA+receptor+signalling%3A+implications+for+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic versus extrasynaptic NMDA receptor signalling: implications for neurodegenerative disorders.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11 (10), 682-696 (2010).</li>
<li>Ivanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+role+of+synaptic+and+extrasynaptic+NMDA+receptors+in+regulation+of+the+extracellular+signal-regulated+kinases+%28ERK%29+activity+in+cultured+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Opposing role of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in regulation of the extracellular signal-regulated kinases (ERK) activity in cultured rat hippocampal neurons.</a> J. Physiol. 57, 789-798 (2006).</li>
<li>Jordan, B. A., Kreutz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleocytoplasmic+protein+shuttling%3A+the+direct+route+in+synapse-to-nucleus+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nucleocytoplasmic protein shuttling: the direct route in synapse-to-nucleus signaling.</a> Trends Neurosci. 32 (7), 392-401 (2009).</li>
<li>Karpova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+and+transducing+the+synaptic+or+extrasynaptic+origin+of+NMDA+receptor+signals+to+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus.</a> Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).</li>
<li>Kim, M. J., Dunah, A. W., Wang, Y. T., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+NR2A-+and+NR2B-containing+NMDA+receptors+in+Ras-ERK+signaling+and+AMPA+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential roles of NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors in Ras-ERK signaling and AMPA receptor trafficking.</a> Neuron. 46, 745-760 (2005).</li>
<li>Lai, K. O., Zhao, Y., Ch'ng, T. H., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importin-mediated+retrograde+transport+of+CREB2+from+distal+processes+to+the+nucleus+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Importin-mediated retrograde transport of CREB2 from distal processes to the nucleus in neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (44), 17175-17180 (2008).</li>
<li>Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LTP+in+cultured+hippocampal-entorhinal+cortex+slices+from+young+adult+%28P25-30%29+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats.</a> J. Neurosci. Methods. 130 (1), 19-32 (2003).</li>
<li>Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+activity-dependent+cyclic+AMP-responsive+element-binding+protein+phosphorylation+during+long-lasting+long-term+potentiation+in+area+CA1+of+mature+rat+hippocampal-organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures.</a> Neuroscience. 131 (3), 601-610 (2005).</li>
<li>Perlson, E., Hanz, S., Ben-Yaakov, K., Segal-Ruder, Y., Seger, R., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin-dependent+spatial+translocation+of+an+activated+MAP+kinase+in+injured+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Vimentin-dependent spatial translocation of an activated MAP kinase in injured nerve.</a> Neuron. 45 (5), 715-726 (2005).</li>
<li>Xiang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+maintenance+of+mature+hippocampal+slices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro.</a> J. Neurosci. Methods. 98 (2), 145-154 (2000).</li>
<li>Zhao, M., Adams, J. P., Dudek, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern-dependent+role+of+NMDA+receptors+in+actin+potential+generation%3A+consequences+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pattern-dependent role of NMDA receptors in actin potential generation: consequences on extracellular signal-regulated kinase activation.</a> J. Neurosci. 25 (30), 7032-7039 (2005).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השלבים המתוארים בפרוטוקול לעיל לספק הדרכה כיצד להכין חריף בהיפוקמפוס פרוס מחולדות צעירות או מבוגרים, לעורר והשיא LTP, במהירות לנתח אזור מגורה של הפרוסה, ולהכין חלק מועשר גרעיני ללימוד דינמיקת חלבון תלוי פעילות. גישה זו נובעת משילוב של מספר שיטות שונות המשמשות באופן עצמאי אחד מהשני. אנו מותאמים זרימת עבודה ולספק פירוט מספיק למתחילים כדי להגדיר את הניסויים שלהם ללמוד חלוקה מחדש subcellular של חלבונים על אינדוקציה של LTP. כדוגמא אנו מראים כי הצורה המאוחרת של LTP גורמת הצטברות הגרעיני...

Synaptic N-methyl-D-aspartate-קולטנים (NMDARs) לשחק תפקיד מכריע בפלסטיות הסינפטית והישרדות תא האיתות ואילו הפעלה של NMDARs extrasynaptic יכולים לגרום ניוון מוחיים ומוות של תאים. שינויים אלה תלויים בביטוי גנים תלויים / פעילות מוסדרת לפיקוח הדוק ולכן דורשים תקשורת מתמדת בין הסינפסות מופעלות או דנדריטים והגרעין 7. MAP קינאזות ERK1 / 2 הם effectors במורד הזרם של NMDARs הסינפטי איתות ומעורבות בביטוי גנים הנגרם על ידי NMDAR-הפעלה, ואילו איתות באמצעות NMDAR extrasynaptic יש השפעה מעכבת על ERK1 / 2 פעילות 8,11 לא או. ישנם מספר החלבונים שהוכחו הסעות בין דנדריטים דיסטלי והגרעין. רבים מחלבונים אלו מכילים אות לוקליזציה גרעינית ומועברים באופן פעיל לאורך microtubuli בdynein ואופן importin תלוי לגרעין 6,9. Interestingly, כמה מהשליחים אלה מעבר רק לגרעין בתגובה לגירויים הסינפטי ספציפיים. לדוגמא, תחבורה מדרדר של אלמנט המחזורי AMP תגובה מחייב חלבון 2 (CREB2) היא מושרה על ידי בע&quot;מ הכימי אך לא 12 LTP. גירוי הסינפטי NMDAR תלוי מקומי מניע coactivator מוסדר CREB תעתיק (CRTC1) לתוך הגרעין, תהליך טרנסלוקציה, העוסק בפלסטיות בהיפוקמפוס לטווח ארוך 4. זה היה הראה לאחרונה כי שליח החלבון יעקב translocates לגרעין אחרי שניהם, הפעלת NMDAR הסינפטי וextrasynaptic ומסדיר שעתוק הגנים תלויים CREB 5. המקור הסינפטי או extrasynaptic של האות מקודד בשינוי posttranslational של יעקב. פעילות הסינפטית גורמת ERK1 / 2 זירחון התלוי של יעקב בסרין מכריע בעמדה 180 (pJacobS 180) שבו הוא נחוץ לטרנסלוקציה לאחר הגרעין בתרבות בהיפוקמפוס העיקרית. יתר על כן, אניn נוירונים CA1 של pJacobS פרוסות בהיפוקמפוס חריפה 180 translocates לגרעין לאחר LTP טחונות שפר אך לא בע&quot;מ 1,10. pS180 יעקב מוביל לביטוי מוגבר של גנים הקשורים פלסטיות וביטוי גנים זה הזנות חזרה לתפקוד הסינפטי. בניגוד חד, יעקב שtranslocates לגרעין לאחר הפעלת NMDARs extrasynaptic לא phosphorylated בSer180 ועשויה להיות קשורה לחלבון מורכב שונה בגרעין גורמת ל&#39;CREB לכבות &quot;ונסיגה של קשרים סינפטיים 10. מחקרים שפורסמו ביותר על היבוא הגרעיני של שליח חלבון synapto-גרעיני נעשו בתרבויות עיקריות עצביות ניתק. לכן זה יהיה מעניין לראות אם ניתן לשחזר בממצאים כאלה מבחינה פיזיולוגית יותר רלוונטי תנאי שימוש בפרוסות בהיפוקמפוס בי קישוריות ותפקוד עצביים הם הרבה יותר טוב נשמר. כאן אנו מציגים פרוטוקול מותאם להערכת LTP-deתלוי טרנסלוקציה הגרעינית של שליחי חלבון על ידי immunoblotting. שיטה זו מתאימה גם לניתוח זירחון התלוי פעילות של חלבונים בשבריר גרעיני גולמי. באופן ספציפי, את הפרוטוקול הנוכחי כרוך הכנת פרוסות חריפות בהיפוקמפוס CA1, אינדוקציה, והקלטה של ​​LTP. בשלב הבא, אזור CA1 הוא גזור מיקרוסקופי כדי לבודד את האזור מגורה. שלבנו והותאמנו הפרוטוקול לבידוד גרעיני שסופק על ידי CellLytic גרעיני הפקת ערכה עם שינויים שהוכנסו על ידי זאו ועמיתים 17. הליך אופטימיזציה כולל תמוגה של אזורי CA1 גזורים במאגר hypotonic מאפשרת נפיחות תא ושחרור של גרעינים. תמוגה תא ומורפולוגיה גרעינים ניתן לקבוע על ידי בדיקה מיקרוסקופית. העשרה גרעינית מושגת על ידי צעד צנטריפוגה קצר. Immunoblotting ניתוח עם נוגדנים נגד NeuN וNSE2, סמנים ספציפיים של שברים גרעיניים או cytosolic, מצביע על כך שגישה זו יכולה לשמש כמהירהוהפרוטוקול לשחזור לבודד את השברים subcellular אלה וללמוד שינויי posttranslational מאוד יציבים כמו זרחון חלבון. בנוסף, בשיטה זו יש יתרון לדגימות רקמה קטנות הנובעות מאזורי CA1 גזורים של פרוסות בהיפוקמפוס וניתן להשתמש בו בשילוב לאימונוהיסטוכימיה של פרוסות בהיפוקמפוס.

<table><tr><tbody><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>CED 1401 AD/DA ממיר</td><td>Cambridge Electronics Design, UK</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>a href="http://www.iciba.com/stereomicroscope">Stereomicroscope</a</td><td>>Leica S4E, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibrotome</td><td>Leica VT1000S, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ממריץ דופק מבודד</td><td>A-M מערכות, ארה"ב</td><td></td><td>דגם 2100</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>תרמו מדעי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE מערכת</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cooler</td><td>Julabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שדה בהיר</td><td>Nikon Eclipse TS100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חממת תרבית תאים</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>לואיגס & נוימן, SM-5, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תא ספיגה וספק חשמל</td><td>Hoefer Scientific Instruments, סן פרנסיסקו, קליפורניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תא הקלטה מסוג שקוע</td><td>בהתאמה אישית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בצורת U וחממה מסוג שקוע&nbsp;</td><td>בהתאמה</td><td></td><td></td>אישית</tr><tr><td>מספריים כירורגיות</td><td></td><td></td><td></td>קטנות</tr><tr><td>אזמל</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מרית</td><td></td><td></td><td></td>דקה</tr> פלסטיק <tr><td>פסטר פיפטה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבות פלסטית&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מזרק</td><td></td><td></td><td></td>Bunsen</tr><tr><td><</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>Art.-Nr.3957.1</td><td>&ge; 99.5%, p.a., ACS, ISO</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Roth</td><td>Art.-Nr.6781.1</td><td>&ge; 99.5%, p.a., ACS, ISO</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Merck</td><td>1.02382.0500</td><td>pro analysis</td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 2H2O</td><td>Merck</td><td>5886.05</td><td>pro analysis</td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>AppliChem</td><td>CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946</td><td>לביולוגיה מולקולרית</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>12034.025</td><td>לביולוגיה מולקולרית</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 2 שעות<תת>2</תת>O</td><td>Merck</td><td>1.06574.1000</td> גלוקוז <td>טהור במיוחד</td></tr><tr><td>&middot; H2O</td><td>Roth</td><td>Art.-Nr.6887.1</td><td>לביולוגיה מולקולרית</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Roth</td><td>Art.-Nr.9105.4</td><td>PUFFERAN, &ge; 99.5%, PA</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>1.06329.1000</td><td>פרו אנליזה</td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז רוש</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פוספוסטופ</td><td>רוש</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ביקוקולין</td><td>טוקריס ביוסיינס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>בקסטר</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>נוגדנים</חזק></td></tr><tr><td>נוגדנים ראשוניים</td><td>מספר קטלוגי</td><td>של החברה</td><td>מינים</td></tr><tr><td>pJac-s180</td><td>ארנב ביוגנים</td><td></td><td>(מדולל 1:100)</td></tr><tr><td>עכבר NeuN</td><td>Milipore</td><td>MAB377</td><td>(מדולל 1:1,000)</td></tr><tr><td>NSE</td><td>Cell Signaling</td><td>D20H2</td><td>ארנב (מדולל 1:1,000)</td></tr><tr>עכבר <td>בטא-אקטין</td><td>סיגמא</td><td>A-5441</td><td>(מדולל 1:5,000)</td></tr><tr><td>נוגדנים משניים</td><td>מספר קטלוגי</td> <td>של החברה</td><td>מינים</td></tr><tr><td>IgG HRP מצומד</td><td>DAKO</td><td></td><td>עז נגד עכבר (1:5,000)</td></tr><tr><td>IgG HRP מצומד</td><td>NEB</td><td></td><td>עז נגד ארנב (1:5,000)</td></tr></tbody></table>

בידוד של ca1 גרעיני שברים מועשרים מslices בהיפוקמפוס לחקר פעילות תלויה גרעיני יבוא של חלבונים messenger synapto-גרעיניים

Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins

ביטוי לומד פעילות חלבון תלוי, טרנסלוקציה subcellular, או זירחון הוא חיוני כדי להבין את המנגנונים תאיים הבסיסיים של פלסטיות הסינפטית. הגברה לטווח ארוך (LTP) ודיכאון לטווח ארוך (בע&quot;מ) מושרה בפרוסות בהיפוקמפוס חריפות מקובלים מאוד כמודלים תאיים של למידה וזיכרון. ישנם מספר רב של מחקרים המשתמשים בגישות הדמיה תא או אימונוהיסטוכימיה חיות לדמיין דינמיקת חלבון תלויה פעילות. עם זאת שיטות אלו מסתמכות על התאמתו של נוגדנים לimmunocytochemistry או ביטוי יתר של חלבונים מתויגים הקרינה בתאי עצב בודד. Immunoblotting של חלבונים הוא שיטה חלופית המספקת אישור עצמאי של הממצאים. הגורם המגביל הראשון בהכנה של שברים subcellular מפרוסות בהיפוקמפוס tetanized פרט הוא הכמות הנמוכה של חומר. שני, הליך הטיפול הוא קריטי משום שמניפולציות גם מאוד קצרות וקלות של ליטרiving פרוסות עלולה לגרום להפעלה של מפלי איתות מסוימים. כאן אנו מתארים את זרימת עבודה מותאמת על מנת להשיג כמות מספקת של שבריר מועשר הגרעיני של טוהר מספיק מאזור CA1 של פרוסות בהיפוקמפוס חריפות ממוח חולדה. כדוגמא מייצגת אנו מראים כי צורת ERK1 / 2 פוספורילציה של שליח חלבון synapto-גרעיני יעקב באופן פעיל translocates לגרעין על אינדוקציה של LTP וניתן לאתרם בשבריר מועשר גרעיני מתאי עצב CA1.

יש לנו הראינו בעבר כי שליח חלבון synapto-גרעיני יעקב מצטבר בגרעין בעקבות האינדוקציה של LTP אבל לא 1 בע&quot;מ. יתר על כן, טרנסלוקציה של יעקב לאחר גירוי הסינפטי דורשת הפעלה של MAPK ERK1 / 2 וזירחון של יעקב בSer180 (איור 1). פוספורילציה יעקב translocates לגרעין באופן importin תלוי ומדינת פוספורילציה יכולה להישמר על פני תקופות זמן ארוכות על ידי עמותה עם נימה ביניים αinternexin 15 (איור 1). Phospho מדינתו של יעקב היא חשובה לביטוי...

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לאינדוקציה של הגברה לטווח ארוך באזור CA1 של ההיפוקמפוס והבידוד הבא של שברים מועשרים גרעיניים מאזור tetanized של הפרוסה. גישה זו יכולה לשמש כדי לקבוע פעילות יבוא חלבון גרעיני תלוי בדגמים סלולריים של למידה וזיכרון.

בידוד של CA1 גרעיני שברים מועשרים מSlices בהיפוקמפוס לחקר פעילות תלויה גרעיני יבוא של חלבונים Messenger synapto-גרעיניים

Studying activity dependent protein expression, subcellular translocation, or phosphorylation is essential to understand the underlying cellular ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לחקור את התנועה (shuttling) התלויה בפעילות של חלבונים בין הגרעין לציטופלזמה באמצעות פרוסות היפוקמפוס טריות, שבהן הקישוריות והתפקוד הנוירונלי נשמרים היטב. כדי להשיג מטרה זו, תחילה מבודד ההיפוקמפוס של חולדה זכר בוגרת, ובשלב שני מוכנות פרוסות רוחביות טריות. פרוסות ההיפוקמפוס מועברות לתא ההקלטה, ומושרה LTP מהסוג המאוחר ב-CA1 stratum radiatum. לאחר מכן, הפרוסות המועצמות ופרוסות הביקורת עוברות הקפאה מהירה (snap frozen), ואז מבודדים את אזורי ה-CA1 שעוברו גירוי כדי להפיק את הפракציה העשירה בגרעינים לצורך ניתוח immuno-blot בהמשך.תוצאות המבוססות על ניתוח western blotting מראות הבדלים ברמות הפוספו-פרוטאין הגרעיני בין הפרוסות שעברו פוטנציאציה לבין פרוסות הביקורת 30 דקות לאחר השראת LTP. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקלו בקשיים משתי סיבות. ראשית, כמות דגימת הרקמה הנמוכה, ושנית, חלון הזמן הקריטי הנדרש לליזיס של הדגימות בבופר ליזיס היפוטוני, המאפשר את שחרור הגרעינים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן הכנת ההיפוקמפוס חי ובידוד של אזור ה-CA1 דורשים דיסקציה מהירה ומדויקת מאוד, אך קיימים מספר טריקים לביצוע.כדי להקל על התהליך, יש לעקוב אחר ההוראות הכתובות והחזותיות להכנת הפרק המועשר בגרעינים מאזור CA1 של ההיפוקמפוס. הדגמת תהליך הליזיס תבוצע על ידי מעבדת Pinon Postal. היא תראה כיצד להכין ליזיס של היפוקמפוס אקוטי ולהשריץ LTP.לאחר ניתוח של אזור C one באמצעות Berra g, סטודנט מהמעבדה שלנו ידגים לכם כיצד לבודד את הגרעין ואת ההרס. התחילו את הפרוצדורה על ידי בידוד מוח החולדה וטבילו אותו בתמיסת gaze קרה מאוד ומעובדת מקדימה עם פחמן. לאחר מכן, הסירו את המוחון וחלק מהקורטקס האנטרלי.הפרידו את המיספרות הקורטיקליות באמצעות חתך סגיטלי מרכזי. לאחר מכן, בצעו חתך של 50 עד 70 מעלות לאורך הקצה הדורסלי של כל המיספרה. לאחר מכן, הניחו כל המיספרה על פני השטח המדיאליים שלה והדביקו כל המיספרה, כאשר השטח שחתכו זה עתה פונה כלפי מטה, על פלטפורמת החיתוך של הוויברטום.לאחר מכן, כסו את הפלטפורמה בתמיסת גלז (gaze) קרה בקרח שעברה קרבוגנציה מוקדמת. חתכו פרוסות בעובי 350 micrometer המכילות את תצורת ההיפוקמפוס ואת קליפת המוח הסובולרית והאנטרלית, מהצד הקדמי לאחורי, באמצעות הוויברטום (vibram). לאחר מכן, העבירו את הפרוסות לאינקובטור מסוג טבילה בצורת U והדגירו אותן למשך שעתיים לפחות בטמפרטורה של 32 degrees Celsius עם CSF שעבר קרבוגנציה.כעת העבירו פרוסה של ההיפוקמפוס לתא הקלטה מסוג טבול המותקן תחת מיקרוסקופ. בצעו פרפוזיה לפרוסה עם CSF מפחמן בקצב של six milliliters per minute למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורה של 32 °C. לאחר 30 דקות, מלאו את מיקרו-אלקטרודות הנימיות מזכוכית ב-CSF.מקם מיקרו-אלקטרודה בסיבי ה-Schaefer collateral ב-CA1 לצורך גרייה, ואלקטרודה נוספת ב-CA1 stratum radiatum להקלטת field EPSPs, במרחק של 300 micrometers זו מזו. לאחר מכן, עורר את ה-field EPSPs על ידי הגשת פולסי זרם מלבניים פאזיים של שלושה עד ארבעה וולט לסיבי ה-Schaefer collateral. בצע בדיקת גרייה מקסימלית על ידי מדידת קשר הקלט-פלט (input output relationship) והגדר את עוצמת הגרייה כ-40% מערך השיפוע המקסימלי של ה-field EPSPs.בשלב הבא, רשמו את קו הבסיס למשך 15 דקות לפחות על ידי מדידת התגובות לגירויי בדיקה בכל דקה לאורך הניסוי. כדי להשרות LTP מאוחר, החילו גירוי בתדר גבוה כדי להגביר את ה-EPSPs השדות המושרים באזור ca one. הוסיפו five micromolar של COE ל-A CSF שתי דקות לפני הגירוי, ובצעו שטיפה מיד לאחר הגירוי האחרון.עצרו את ההקלטה. שתי דקות או 30 דקות לאחר השראת LTP מאוחרת, הסירו את האלקטרודות והעבירו במהירות את הפרוסה למסד מתכת שקולל מראש והונח על קרח יבש. לאחר מכן, אספו כל פרוסה לשפרורת Eppendorf בנפח 1.5 milliliter ואחסנו בטמפרטורה של negative 80 degrees Celsius.בשלב זה, הוציאו את הפרוסות הקפואות מהמקפיא בטמפרטורה של 80°C- ושמרו אותן על קרח. הוסיפו למבחנה 0.5 milliliters של תמיסת TBS קרה וטרייה המכילה מעכבי פרוטאז ופוספטאז. דגרו אותן למשך שתי עד שלוש דקות לפני ההעברה למיקרוסקופ סטריאו.בשלב הבא, בצעו דיסקציה של אזור ה-CA1 stratum pyramidale בהיפוקמפוס על ידי החזקת הפרוסה עם מחט אחת וחיתוך של אזור ה-CA1 עם המחט השנייה. לאחר מכן, אספו את אזורי ה-CA1 שבודדו מחמש פרוסות לכל קבוצה לשפרורט חד של 1 mL המכיל 50 µL של lysis buffer. לאחר מכן, הומוגניזו את הרקמות שנאספו על ידי פיפטינג זהיר מעלה ומטה באמצעות פיפט של 200 µL.דגרו את הליזאט על קרח למשך חמש עד שבע דקות כדי לאפשר לתאים להתנפח. לאחר מכן, קחו שני µL של הליזאט וטפטפו אותם על זכוכית כיסוי של מיקרוסקופ. הדגימו את התנפחות התאים תחת מיקרוסקופ בשדה בהיר (bright field).הגרעינים נראים כמבנים עגולים ושלמים עם נפיחות תקינה. כעת, אספו 20 µL מהדגימה לשפופרת 1.5 mL נקייה כחלק ההומוגנאט. הוסיפו 8 µL של בופר דגימה SDS 4X דנטורי.לאחר מכן, סבבו במצנטריפוגה את הליזאט שנותר ב-1100 RCF למשך דקה אחת. לאחר דקה אחת, אספו בזהירות את הסופרנאט מהחלק העליון והעבירו אותו למבחנה חדשה. לאחר מכן, הוסיפו 20 µL של four x sample buffer.לאחר מכן, השביה מחדש את המשקע ב-60 µL של בופר היפוטוני והוסף 20 µL של בופר דגימה בריכוז פי 4. פראקציה זו מכונה פראקציה מועשרת גרעינית. אחסן את ההומוגנאט, את פראקציות הציטוזול והפראקציה המועשרת גרעינית בטמפרטורה של 20°C- או 80°C-.עבור אימונו-בלוטינג (immuno blotting) מאוחר יותר בהליך זה, הפשיר את הדגימות והרתיח אותן למשך חמש דקות ב-95 °C לפני מדידת ריכוז החלבון באמצעות בדיקת AM mito black או בדיקת BCA. טען כמות שווה של דגימות חלבון מההומוגנאט וממהדלויות המועשרות בציטופלזמה ובגרעין. ב-SDS page, יש להניח דגימות של פרוסות ביקורת ופרוסות LTP על אותו ג'ל לצורך השוואה ישירה ב-Western blot. איור זה מציג אימונו-בלוט של ההומוגנאט וההדלויות המועשרות בציטוזול ובגרעין של ליזאט ca one שנבדקו עם סממנים ציטוזוליים וגרעיניים.זהו ניתוח של תסביך חלבונים (immuno blot) של רמות PJS 180 בהומוגנאט שתי דקות ו-30 דקות לאחר השראה של tein, וזהו ניתוח של תסביך חלבונים של רמות PJS 180 בפרקציה המועשרת בגרעינים. שתי דקות ו-30 דקות לאחר ization, רמות phospho Jacob נותרו ללא שינוי בהומוגנאטים של חלבון CA one כולל ובפרקציה המועשרת בגרעינים שתי דקות לאחר ization. עם זאת, נמצאה עלייה משמעותית בתגובתיות החסונית (Immunoreactivity) של p Jacob, S 180 כ-30 דקות לאחר השראת LTP.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשתמש בנפח מתאים של תמיסת ליזיס היפוטונית. כמו כן, יש להגדיר סטנדרט למסגרת הזמן הקריטית לליזיס של הדגימות. בפרט, כאשר שיטה זו מיושמת לבידוד פראקציית גרעינית מדגימות רקמת מוח של חולדה או עכבר שאינן מההיפוקמפוס. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, שיטות אחרות כגון צביעה אימונו-משלימה עם נוגדן נגד חלבונים מועמדים המיובאים לגרעין לאחר השראת OTP או מולקולות איתות כמו צורות פעילות של קינאז או פוספטאז, יכולות לסייע באימות התוצאות הללו.ניתן לבצע טיפול פרמקולוגי כדי לענות על שאלות נוספות. לדוגמה, אילו מסלולי איתות מעורבים בתעתוק של חלבוני גרעין סינפטיים, או כיצד הם משפיעים על תפקוד גרעיני. בנוסף, ניתן לחקור את תפקידם של חלבוני שליח של גרעין סינפטי במחלות המערבות את ההיפוקמפוס.לדוגמה, מחלת אלצהיימר.

isolation-ca1-nuclear-enriched-fractions-from-hippocampal-slices-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים עיכוב בתיווך מיקרו-רנ"א של זרמים סינפטיים מעוררים בפרוסות מוח של עכבר בהיפוקמפוס. תאי העצב CA3 היו נגועים בווקטור נגיפי רקומביננטי בעל מבנה להבעת כתב פלואורסצנטי, תעלת קרום המופעלת על ידי אור, ומיקרו-רנ"א המווסת את הביטוי של תעלות סידן מגודרות מתח. לאחר הנחת פרוסה בתא הקלטה ותיקון תא עצב CA1 עם פיפטת הקלטה, נעשה שימוש בפעימות אור כדי לעורר את התעלה המופעלת על ידי האור, וכתוצאה מכך זרם יונים וליצור פוטנציאל פעולה. היעדר תעלות סידן מגודרות מתח בנוירונים CA3 מעכב שחרור מוליכים...

עיכוב בתיווך מיקרו-רנ"א של זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים בפרוסות היפוקמפוס עכבר

הלוקליזציה וההפצה של חלבונים מספקים מידע חשוב להבנת הפונקציות הסלולריות שלהם. הרזולוציה מרחבית המעולה של מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) ניתן להשתמש כדי לקבוע את לוקליזציה subcellular של אימונוהיסטוכימיה ניתנה בעקבות אנטיגן. לרקמות של מערכת העצבים המרכזית (CNS), שמירה על שלמות מבנית תוך שמירת antigenicity כבר קשה במיוחד במחקרי EM. כאן, אנו לאמץ נוהל אשר כבר משמש לשימור מבנים ואנטיגנים של מערכת העצבים המרכזיים ללימוד ואפיון חלבונים סינפטיים בCA1 נוירונים ביפוקמפוס עכברוש פירמידה.

תיוג Immunogold לאחר הטבעה של חלבונים בתרבויות Synaptic Slice היפוקמפוס

רשתות קליפת המוח נשלטות על ידי קבוצה קטנה, אך מגוונת של interneurons המעכב. חקירה פונקציונלית של interneurons לכן דורשת הקלטה ממוקדת וזיהוי קפדני. שתואר כאן היא גישה משולבת הכוללת כל תא הקלטות מזוגות בודדים או synaptically מצמידים של נוירונים עם תיוג תאיים, שלאחר הוק מורפולוגיים וניתוח immunocytochemical.

הקלטות תיקון מהדק כל התא מMorphologically- וinterneurons היפוקמפוס זיהה Neurochemically

מאמר וידאו זה מתאר הליכים ניסיוניים לחקר פלסטיות לטווח ארוך ותהליכים אסוציאטיביים שלה כגון תיוג סינפטי, לכידה ותיוג צולב בנוירונים הפירמידליים CA1 באמצעות פרוסות היפוקמפוס חריפות ממכרסמים.

חקירה של Synaptic תיוג / לכידה וצלב-לכידה באמצעות חריפות בהיפוקמפוס פרוסות ממכרסמים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול קרום המוח פרוקציה המייצג תהליך חסון לבודד חלבונים השייכים תאים סינפטית שונים.

קרום המוח Fractation: An<em&gt; אקס ויוו</em&gt; גישה כדי להעריך לוקליזציה חלבון subsynaptic

פרוטוקול זה מתאר את הייצוב של רמת החמצן נפח קטן של מאגר ממוחזר, היבטים מתודולוגיים של הקלטה פלסטיות סינפטית תלויי-פעילות המשוקע פרוסות בהיפוקמפוס חריפה.

הקלטה הפלסטיות הסינפטית בפרוסות בהיפוקמפוס חריפה, בהשתתפות של מיחזור - בנפח מצומצם, זלוף- ומערכת ועלייתו-סוג תא

חשמל התקף (ECS) הוא מודל חיה ניסיוני של נזעי חשמל עבור דיכאון חמור. ECS מעוררת באופן גלובלי פעילות ההיפוקמפוס, המוביל synaptogenesis פלסטיות סינפטית. כאן, אנו מתארים שיטות עבור ה-ECS אינדוקציה בחולדות, fractionation subcellular של hippocampi שלהם כדי לבחון שינויים התקף-induced חלבונים סינפטיים.

חשמל התקפים חולדות ו Fractionation של Hippocampi שלהם כדי לבחון תפיסה-induced שינויים בחלבונים Postsynaptic צפיפות

נוהל לאיתור ואבחון מדויק סינפסות בהיפוקמפוס פרוסות באמצעות immunofluorescence הוא המתוארים במאמר זה.

הערכה של צפיפות סינפסה פרוסות המוח מכרסמים בהיפוקמפוס

פרוטוקול שמפורטות כאן מתאר את ניתוח immunofluorescence, biocytin השחזור של שחזורים באיכות גבוהה של interneurons CA2 בהיפוקמפוס בעקבות את הקלטות אלקטרופיזיולוגיות תאיים במבחנה, ומאפשר עצביים אפיון, בסופו של דבר בסדר אנטומיה עצביים שילמדו.

שחזור Biocytin, שחזורים תלת-ממד של CA2 בהיפוקמפוס מלא Interneurons

מאמר זה נועד לתאר פרוטוקול שיטתי כדי להשיג פרוסות מוח היפוקמפוס אופקי בעכברים. מטרת מתודולוגיה זו היא לשמר את השלמות של מסלולי סיבים בהיפוקמפוס, כגון הנתיב המחורר ודרכי הסיבים הטחובים להערכת תהליכים נוירולוגיים הקשורים לgyrus.

פרוסות היפוקמפוס אופקיות של מוח העכבר

חקור בידוד שברים גרעיניים מועשרים מ-Hippocampus לאחר אינדוקציה של LTP באזור CA1. שיטה זו מאפשרת ניתוח רמות פוספופרוטאינים גרעיניים וחקר מנגנוני זיכרון ולמידה במוח.

בידוד של CA1 גרעיני שברים מועשרים מSlices בהיפוקמפוס לחקר פעילות תלויה גרעיני יבוא של חלבונים Messenger synapto-גרעיניים

גלה סרטונים נוספים