בידוד של CA1 גרעיני שברים מועשרים מSlices בהיפוקמפוס לחקר פעילות תלויה גרעיני יבוא של חלבונים Messenger synapto-גרעיניים

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לאינדוקציה של הגברה לטווח ארוך באזור CA1 של ההיפוקמפוס והבידוד הבא של שברים מועשרים גרעיניים מאזור tetanized של הפרוסה. גישה זו יכולה לשמש כדי לקבוע פעילות יבוא חלבון גרעיני תלוי בדגמים סלולריים של למידה וזיכרון.

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לחקור את ההעברה הנוקליאו הציטופלזמית התלויה בפעילות של חלבונים באמצעות פרוסות היפוקמפוס חריפות שבהן הקישוריות והתפקוד העצביים נשמרים היטב כדי להשיג מטרה זו, ההיפוקמפוס של חולדה זכר בוגר מבודד תחילה ומכינים פרוסות רוחביות חריפות כשלב שני. פרוסות ההיפוקמפוס מועברות לתא ההקלטה והצורה המאוחרת של LTP מושרה באטום רדי שכבה אחת של CA. לאחר מכן, הפרוסות המחוזקות והבקרה נקלעות קפואות, והאזורים המגורים מנותחים על מנת לבודד את השבר המועשר הגרעיני להמשך ניתוח כתמים חיסוניים.

תוצאות המבוססות על ניתוח Western Blotting מראות הבדלים ברמות הפוספופרוטאין הגרעיני בין פרוסות הפוספו-פרוטאין החזקות והביקורת 30 דקות לאחר השראת LTP. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו משתי סיבות. ראשית, הכמות הנמוכה של דגימת רקמה, ושנית, מסגרת הזמן הקריטית שחוזרת על עצמה עבור ליזה של הדגימות במאגר ליזה היפוטוני, המאפשרת שחרור של הגרעינים הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שהכנת חיי ההיפוקמפוס ובידוד אזור C one דורשים דיסקציות מהירות ומדויקות מאוד, אך ישנם טריקים מסוימים.

כדי להקל על זה יהיה צורך לעקוב אחר הוראות כתובות וחזותיות להכנת המקטע המועשר הגרעיני מאזור C אחד של ההיפוקמפוס. הדגמת ליזה של ההליך תבוצע על ידי מעבדת הדואר של פינון. היא תראה כיצד להכין ליזה חריפה בהיפוקמפוס ולגרום ל-LTP.

לאחר הניתוח של אזור C אחד דרך Berra g סטודנט מהמעבדה שלנו יראה לך כיצד לבודד גרעין והרס. התחל הליך זה על ידי בידוד מוח החולדה וטבול אותו בתמיסת המבט הקר של הקרח המוגז מראש. לאחר מכן, הסר את המוח הקטן וחלק מקליפת המוח האנטרלית.

הפרד את חצאי הכדור בקליפת המוח עם חתך אמצע סגיטלי. לאחר מכן, בצע חתך של 50 עד 70 מעלות לאורך הקצה הגבי של כל חצי כדור. לאחר מכן הניחו כל המיספרה על המשטח המדיאלי שלה, הדביקו כל המיספרה עם המשטח הטרי שנחתך על משטח החיתוך של הוויברטו.

לאחר מכן כסו את הפלטפורמה בתמיסת המבט הקר כקרח לפני קרבוגן. חותכים פרוסות של 350 מיקרומטר המכילות את תצורת ההיפוקמפוס קליפת המוח התת-קרקעית והאנטרלית מהצד הקדמי לאחורי עם הוויברם. לאחר מכן, העבירו את הפרוסות לחממה בצורת U ושקועה ודגרו אותן לפחות שעתיים בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס עם קרבוגן A CSF.

כעת העבירו פרוסת היפוקמפוס לתא ההקלטה השקוע המותקן מתחת למיקרוסקופ. טפטפו את הפרוסה ב-A CSF מוגז בשישה מיליליטר לדקה למשך 30 דקות לפחות ב-32 מעלות צלזיוס. לאחר 30 דקות, מלאו את המיקרו אלקטרודות הנימים מזכוכית ב-CSF.

הנח מיקרו אלקטרודה בסיבים הצדדיים של שייפר לגירוי, ועוד אחד באטום המוכן לשכבה אחת לרישום EPSPs בשדה במרחק של 300 מיקרומטר זה מזה. לאחר מכן עורר את ה-SSPs של השדה EP על ידי העברת שלושה עד ארבעה וולט על ידי פולסי זרם מלבניים פאזיים לסיבי הביטחונות של שפר. בצע את בדיקת הגירוי המקסימלי על ידי מדידת יחס פלט הקלט והגדר את עוצמת הגירוי כ-40% מערך השיפוע המרבי של EPSPs בשדה.

לאחר מכן, רשמו את קו הבסיס למשך 15 דקות לפחות על ידי מדידת התגובות לגירוי הבדיקה בכל דקה במהלך הניסוי. כדי לגרום ל-LTP מאוחר, החל טיין בתדר גבוה כדי להגדיל את ה-EPSPs של השדה המעורר באזור אחד. יש למרוח חמישה מיקרומולר על ידי COE על A CSF שתי דקות לפני הטטין ולשטוף מיד לאחר הטטנוס האחרון.

הפסק את ההקלטה. שתי דקות או 30 דקות לאחר אינדוקציה מאוחרת של LTP לאחר מכן, הסר את האלקטרודות והעביר במהירות את הפרוסה על משטח מתכת מקורר מראש המונח על קרח יבש. לאחר מכן אוספים כל פרוסה בצינור אורף של 1.5 מיליליטר ומאחסנים בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס.

בשלב זה, הוציאו את הפרוסות הקפואות מ-80 מעלות צלזיוס השליליות ושמרו אותן על קרח. הוסף 0.5 מיליליטר של מאגר TBS קר טרי המכיל מעכבי פרוטאז ופוספטאז לתוך הצינור. דגרו אותם במשך שתיים-שלוש דקות לפני העברתם למיקרוסקופ סטריאו.

לאחר מכן, נתחו את ה-CA אזור שכבה אחת של ההיפוקמפוס על ידי החזקת הפרוסה במחט אחת וחיתוך ה-CA אזור אחד עם השני. לאחר מכן, אסוף את האזורים המנותחים מחמש פרוסות לקבוצה בצינור מיליליטר חדש המכיל 50 מיקרוליטר של מאגר ליזה. לאחר מכן הומוגניזציה של הרקמות שנאספו על ידי פיפטה בזהירות למעלה ולמטה עם פיפטה של 200 מיקרוליטר.

דגרו את הליזאט על קרח למשך חמש עד שבע דקות כדי לאפשר לתאים להתנפח. לאחר מכן, קח שני מיקרוליטר של הליזאט ושחרר אותו על שקופית מיקרוסקופ. דמיין את הנפיחות של התאים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר.

הגרעינים מופיעים כמבנים עגולים ושלמים עם נפיחות מתאימה. כעת, אספו 20 מיקרוליטר של דגימה בשפופרת טרייה של 1.5 מיליליטר כשבר ההומוגני. הוסף שמונה מיקרוליטרים של דנטורציה של ארבעה מאגר דגימת XSDS.

לאחר מכן צנטריפוגה את הליזאט שנותר ב 1100 RCF למשך דקה אחת. לאחר דקה אחת, אספו בזהירות את הסופרנטנט מלמעלה והעבירו אותו לצינור חדש. לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטר של ארבעה x מאגר דגימה.

לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה ב-60 מיקרוליטר של מאגר היפוטוני והוסיפו 20 מיקרוליטר של מאגר דגימה של ארבעה x. שבר זה מכונה שבר מועשר גרעיני. אחסן את השברים ההומוגניים, הציטוזוליים והמועשרים בגרעין במינוס 20 מעלות צלזיוס או שלילי 80 מעלות צלזיוס.

לצורך ספיגה חיסונית מאוחרת יותר בהליך זה יש להפשיר את הדגימות ולהרתיח אותן במשך חמש דקות ב-95 מעלות צלזיוס לפני מדידת ריכוז החלבון על ידי בדיקת AM mito black, או עומס בדיקת BCA, כמות שווה של דגימות חלבון מהשברים ההומוגניים, הציטופלזמיים והמועשרים בגרעין. בדף SDS, יש להניח דגימות ג'ל מהבקרה ופרוסות LTP על אותו ג'ל להשוואה ישירה בכתם המערבי. איור זה מציג כתם חיסוני עבור השברים ההומוגניים, הציטוזוליים והמועשרים בגרעין של ca one lysate שנבדק עם סמנים ציטוזוליים וגרעיניים.

זהו ניתוח כתמים חיסוניים של רמות PJS 180 בהומוגנאט שתי דקות ו-30 דקות לאחר השראת טיין, וזהו ניתוח דם חיסוני של רמות PJS 180 במקטע המועשר גרעיני. שתי דקות ו-30 דקות לאחר האיזציה רמות פוספו ג'ייקוב נותרו ללא שינוי בסך הכל חלבון CA אחד הומוגנטי ובחלק המועשר הגרעיני שתי דקות לאחר האיזציה. אך עלייה משמעותית נמצאה ב- p Jacob, S 180 Immunoreactivity 30 דקות לאחר השראת LTP.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בנפח מתאים של שסתום ליזה היפוטוני. כמו כן, יש לתקן את מסגרת הזמן הקריטית לליזה של הדגימות. בפרט, כאשר שיטה זו מיושמת לבידוד של גרעין ושבר מדגימות רקמת מוח של חולדות או עכברים שאינן היפוקמפוס בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו צביעה חיסונית משלימה עם נוגדנים נגד חלבונים מועמדים המיובאים לגרעין לאחר השראת OTP או מולקולות איתות כמו צורות פעילות של קינאז או פוספטאז, יכולות להועיל לאימות תוצאות אלה.

ניתן לבצע טיפול תרופתי כדי לענות על שאלות נוספות. לדוגמה, אילו מפלי איתות מעורבים בטרנסלוקציה של חלבונים גרעיניים סינפטיים, או כיצד הם משפיעים על תפקוד גרעיני. בנוסף, ניתן לחקור את תפקידם של חלבוני שליח גרעיני סינאפ במחלות המערבות את ההיפוקמפוס.

למשל, מחלת אלצהיימר.