בידוד של תאי גזע סרטני מדגימות אדם סרטן הערמונית

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתאר את הבידוד של תאי גזע של סרטן הערמונית מרקמה אנושית באמצעות פקס. זה מושג על ידי עיבוד ראשון של רקמת סרטן הערמונית שנקצרה מדגימות כירורגיות. בשלב השני נוצר תרחיף תאים מקטעי הרקמה והתאים מסומנים בנוגדנים פלואורסצנטיים.

בשלב האחרון, תאי הגזע של סרטן הערמונית ממוינים לפי עובדות. בסופו של דבר, ניתן לאפיין את התכונות המולקולריות והתפקודיות של התאים המבודדים על ידי השתלת זרים ופרופיל ביטוי גנים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום סרטן הערמונית על ידי הקלה על האפיון המולקולרי והתפקודי של תאי גזע סרטניים מדגימות אנושיות.

מדגימים את ההליך סמואל וידאל, דוקטורנט לרפואה איידן קווין, סטודנט לתואר שני, וג'ניה. המחקר שלנו מהמעבדה מתחיל בקצירת רקמות עודפות בתפזורת מדגימות הסרטן שאינן נחוצות לאבחון קליני לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר המכיל 15 מיליליטר מדיה. אחסן מיד את הצינור בארבע מעלות צלזיוס לעיבוד תוך 24 שעות מהכריתה, ולאחר מכן עבד בארון בטיחות ביולוגית עם אזמל סטרילי ומלקחיים.

השג קטעי רקמה אופקיים בעובי של שניים עד ארבעה מילימטרים מגושי הגידול המקרוסקופיים בתוך דגימת רקמת הסרטן. הנח חלקים אלה בצינור חדש של 50 מיליליטר המכיל מדיה. לאחר מכן הפרד חלק ותקן אותו בפורמלין של 10% לניתוח היסטולוגי כדי לאשר נוכחות של רקמת סרטן הערמונית כדי ליצור תרחיפי תאים מרקמת הגידול.

לאחר מכן, העבירו כל אחד מחלקי הרקמה של שניים עד ארבעה מילימטר לצלחת תרבית בגודל 60 על 15 מילימטר המכילה מיליליטר אחד של PBS סטרילי טריטר מכני את הדגימות באמצעות אזמל סטרילי ומלקחיים ואגד את מתלי התאים המתקבלים לצינור חרוטי סטרילי יחיד של 50 מיליליטר. הוסף עוד מיליליטר של PBS לצלחת הדגימה, וחזור על האיטרציה שלוש עד ארבע פעמים נוספות עד שכל קטע רקמה מנותק לחלוטין. ואז השתמש בפיפטה של חמישה מיליליטר כדי לערבב את תמיסת התא.

מערבולת את תמיסות התאים במהירות מקסימלית למשך דקה אחת, ולאחר מכן מסננים את תמיסת התאים המתקבלת דרך מסננת תאים של 35 מיקרומטר לצינור חרוטי סטרילי שני של 50 מיליליטר. סובב את התאים המסוננים למשך 10 דקות ב -450 פעמים G בטמפרטורת החדר. לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של מאגר ליזה של כדוריות דם אדומות.

לאחר חמש דקות, סובב שוב את התאים. Resus משהה את הכדור החופשי של כדוריות הדם האדומות בכמות קטנה של PBS בתוספת 5% FBS לספירה על ידי אי הכללה של טריאן כחול. לאחר כימות מספר התאים בני הקיימא, יש לדלל את התאים לאחד כפול 10 עד שישה תאים לתרחיף מיליליטר, ולאחסן אותם על קרח לא יותר משעה.

כדי לבודד את סרטן הערמונית, תאי גזע מתחילים בתיוג חמישה צינורות חרוטיים של 15 מיליליטר כפי שהוכח כדי להוציא את התאים ההמטופויאטיים והאנדותליים במהלך המיון. חלקו את תרחיף התאים שנוצר מקטעי רקמת הגידול בין חמשת הצינורות, ולאחר מכן דגרו על התאים עם הנוגדנים המתאימים בדילול של 1 עד 250 למשך 30 דקות על קרח. לאחר מכן, סובבו את התאים ולאחר מכן שטפו את הכדורים ב-PBS סטרילי בתוספת 10% FBS לאחר הכביסה, דגרו את הכדורים ב-10 מיקרוגרם למיליליטר DPI וסננו את התמיסות הסופיות דרך מכסי מסננת של 35 מיקרומטר לצינורות פוליסטירן בגודל 12 על 75 מילימטר.

השתמש בארבעת הצינורות הראשונים כדי להגדיר את השערים לפיזור צד פיזור קדימה dpi, fite ו-pe. לבסוף, השתמש בשפופרת חמש כדי לאסוף את האוכלוסיות החיוביות של HLA Class One ו-HLA Class One לתוך צינורות חרוטיים סטריליים בודדים של 15 מיליליטר המכילים שני מיליליטר RPMI בתוספת 10% FBS. לאחר מכן סובב את תרחיפי התאים הממוינים והשהה מחדש את הכדורים ב-200 עד 500 מיקרוליטר של מדיה לכימות התאים ברי הקיימא על ידי אי הכללה כחולה טריאן.

הפרוטוקול המודגם מקל על בידוד תאי גזע שליליים של סרטן הערמונית מסוג HLA מדגימות כירורגיות אנושיות. תמונות אלה ממחישות את גושי הגידול המקרוסקופיים הנראים לעין שניתן לעבד ולאחר מכן לאשר על ידי מיקרוסקופיה. כפי שהוכח, התאים ברי הקיימא מבודדים על ידי צביעת הדאפי השלילי שלהם, לאחר מכן ניתן לקבוע את תדירות תאי הגזע השליליים של סרטן הערמונית מסוג HLA.

מספר תאי הגזע השליליים של סרטן הערמונית מסוג HLA משתנה בין חולים, אך בדרך כלל מהווה 0.5 עד 8% מכלל האוכלוסייה החיה לאחר הליך זה. ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו פרופיל ביטוי גנים והשתלת זרים על מנת לאפיין טוב יותר את המנגנונים התורמים לעמידות לכימותרפיה ולהתקדמות המחלה.