Name: תאי חוט Tetrode הקלטה במוח של חופשיות הליכה חרקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-01T16:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 28 s
Description: למדו שיטה מתקדמת להקלטת פעילות עצבית במוח חרקים נעים באמצעות טטרודות גמישות. השיטה מאפשרת תיאום בין נתונים עצביים להתנהגות תנועתית ומספקת מסגרת למחקרי מדעי המוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים ניק Kathman לקבלת הצעות ולעזור בהכנות לכתב היד. טכניקה זו פותחה בשיתוף עם נתמכת על ידי AFOSR תחת מענק FA9550-10-1-0054 והקרן הלאומית למדע תחת גרנט לא IOS-1,120,305 לRER עבודה.

<ol><li>Strauss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+central+complex+and+the+genetic+dissection+of+locomotor+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The central complex and the genetic dissection of locomotor behaviour.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 12, 633-638 (2002).</li>
<li>Pick, S., Strauss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goal-driven+behavioral+adaptations+in+gap-climbing+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Goal-driven behavioral adaptations in gap-climbing Drosophila.</a> Curr. Biol. 15, 1473-1478 (2005).</li>
<li>Triphan, T., Poeck, B., Neuser, K., Strauss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+targeting+of+motor+actions+in+climbing+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Visual targeting of motor actions in climbing Drosophila.</a> Curr. Biol. 20, 663-668 (2010).</li>
<li>Heinze, S., Gotthardt, S., Homberg, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+polarized+light+information+in+the+central+complex+of+the+locust%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuorosci%22%5BJournal%5D)">Transformation of polarized light information in the central complex of the locust.</a> J. Neuorosci. 29, 11783-11793 (2009).</li>
<li>Heinze, S., Homberg, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maplike+representation+of+celestial+E-vector+orientations+in+the+brain+of+an+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Maplike representation of celestial E-vector orientations in the brain of an insect.</a> Science. 315, 995-997 (2007).</li>
<li>Heinze, S., Homberg, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroarchitecture+of+the+central+complex+of+the+desert+locust%3A+Intrinsic+and+columnar+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuroarchitecture of the central complex of the desert locust: Intrinsic and columnar neurons.</a> J. Comp. Neurol. 511, 454-478 (2008).</li>
<li>Heinze, S., Homberg, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+the+input+to+the+output%3A+new+sets+of+neurons+complement+the+polarization+vision+network+in+the+locust+central+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Linking the input to the output: new sets of neurons complement the polarization vision network in the locust central complex.</a> J. Neurosci. 29, 4911-4921 (2009).</li>
<li>Heinze, S., Reppert, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sun+compass+integration+of+skylight+cues+in+migratory+monarch+butterflies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sun compass integration of skylight cues in migratory monarch butterflies.</a> Neuron. 69, 345-358 (2011).</li>
<li>Brill, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+processing+via+a+dual+olfactory+pathway+in+the+honeybee%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parallel processing via a dual olfactory pathway in the honeybee.</a> J Neurosci. 33, 2443-2456 (2013).</li>
<li>Guo, P., Ritzmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+activity+in+the+central+complex+of+the+cockroach+brain+is+linked+to+turning+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural activity in the central complex of the cockroach brain is linked to turning behaviors.</a> J. Exp. Biol. 216, 992-1002 (2013).</li>
<li>Ritzmann, R. E., Ridgel, A. L., Pollack, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-unit+recording+of+antennal+mechanosensitive+units+in+the+central+complex+of+the+cockroach%2C+Blaberus+discoidalis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Multi-unit recording of antennal mechanosensitive units in the central complex of the cockroach, Blaberus discoidalis.</a> J. Comp. Physiol. A. 194, 341-360 (2008).</li>
<li>Buzsáki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+recording+of+neuronal+ensembles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale recording of neuronal ensembles.</a> Nature Neurosci. 7.5, 446-445 (2004).</li>
<li>Huston, S. J., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+sensorimotor+integration+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Studying sensorimotor integration in insects.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 21, 527-534 (2011).</li>
<li>Bender, J. A., Pollack, A. J., Ritzmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+activity+in+the+central+complex+of+the+insect+brain+is+linked+to+locomotor+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural activity in the central complex of the insect brain is linked to locomotor changes.</a> Curr. Biol. 20, 921-926 (2010).</li>
<li>Harrison, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wireless+Neural%2FEMG+telemetry+systems+for+small+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE%22%5BJournal%5D)">Wireless Neural/EMG telemetry systems for small freely moving animals.</a> IEEE. 5, 103-111 (2011).</li>
<li>Straw, A. D., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motmot%2C+an+open-source+toolkit+for+realtime+video+acquisition+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Source+Code+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Motmot, an open-source toolkit for realtime video acquisition and analysis.</a> Source Code Biol. Med. 4, 5(2009).</li>
<li>Strausfeld, N. J., Miller, T. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTyrer%2C+NM+%22Neuroanatomical+Techniques.+Insect+Nervous+System%22">Neuroanatomical Techniques. Insect Nervous System</a>. , Springer Verlag. (1980).</li>
<li>Daly, K., Wright, G., Smith, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+features+of+odorants+systematically+influence+slow+temporal+responses+across+clusters+of+coordinated+antennal+lobe+units+in+the+moth%2C+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophsyiol%22%5BJournal%5D)">Molecular features of odorants systematically influence slow temporal responses across clusters of coordinated antennal lobe units in the moth, Manduca sexta.</a> J. Neurophsyiol. 92, 236-254 (2004).</li>
<li>Branson, K., Robie, A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+ethomics+in+large+groups+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput ethomics in large groups of Drosophila.</a> Nat Methods. 6, 451-457 (2009).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שום ניגוד עניינים.

בעוד שהמחקרים קודמים על אלקטרו CC או אזורים אחרים של מוח החרק סיפקו לנו תובנות השליטה המרכזית של התנהגות, רובם בוצעו בשתי הכנות מאופקות 9,11 או קשורים אלה 10,14. כתוצאה מכך, של החיה חוויה חושית ומצב פיסיולוגי יכול להיות שונה מאוד מאלו בסביבה טבעית. יתר על כן, המשימות התנהגותיות שבעלי החיים יכולים לבצע מוגבלות למישור אחד במצבים אלה. כאן אנו הצגנו שיטה להקליט מCC במקקים מתנהגים בחופשיות. יש לקוות, שאנו מספקים את כל המידע הדרוש שאתה צריך כדי ללכוד את קלטות אלקטר...

מאמר זה מתאר מערכת מוצלחת להקלטה מתא העצב במתחם המרכזי (CC) של המקק, discoidalis Blaberus, כחרק הולך בזירה ועוסק באובייקטים שגורמים לו להסתובב, מנהרה מתחת, או לטפס מעל מכשולים. יכול גם להיות מחוברים לחוטי ממריץ לעורר פעילות בneuropil שמסביב עם שינויים התנהגותיים וכתוצאה מכך. בעשור האחרון תשומת לב רבה מופנה לתפקידים שמילאו אזורים שונים במוח בשליטה על התנהגות חרקים. חלק גדול ממיקוד זה כבר מופנה לneuropils מוח קו האמצע, כי הם יכונו מורכבים המרכזיים (CC). הושגתי התקדמות כתוצאה מזנים רחבים של טכניקות מיקוד שאלות על תפקידה של CC בהתנהגות. טכניקות אלה נעות בין מניפולציות neurogenetic, בעיקר בדרוזופילה, בשילוב עם behaviניתוח אוראלי 1-3, לטכניקות אלקטרו העוקב אחר פעילות עצבית בתוך CC והניסיון להתייחס לפעילות שפרמטרים רלוונטיים התנהגותית. טכניקות אלקטרו כוללות הקלטה תאית מתא העצב בודד מזוהה 4-9 והקלטה תאית, לעתים קרובות עם בדיקות רבת ערוצי 10,11. שתי טכניקות אלה הן ללא תשלום. הקלטה תאית עם אלקטרודות חדות או תא כל תיקון מספקת נתונים מפורטים מאוד על נוירונים שזוהו, אך מוגבלת לתא אחד או שניים בכל פעם, דורשת תנועה מוגבלת או לא, ויכולה להישמר לתקופות זמן קצרות יחסית. ניתן להגדיר בקלות את הקלטות תאיים, אינו דורשות איפוק, ויכולות להישמר במשך שעות. עם tetrodes רב ערוצים וחיתוך אשכול, אוכלוסיות גדולות למדי של תאי עצב ניתן לנתח בו זמנית 9,12. בעוד patc תא כולושעות כבר השתמשו בהצלחה בחרקים קשורים 13, אנחנו מרגישים שיש גם צורך בטכניקות המאפשרות לנו להקליט פעילות עצבית במוח לפרקי זמן ארוכים במתנהגים חרקים באופן חופשי כפי שהם להתמודד עם חסמים לתנועה קדימה. את הצורך ברישום כמהלכי חרקים וקופץ למעלה ולמטה דחף אותנו לכיוון שיטות הקלטה תאית. היו לנו הקלטת הצלחה טובה בהכנות מאופקות עם בדיקות סיליקון 16 ערוצים זמינים מסחרי 11, עם זאת גודלו הקטן של אפילו מקקים גדולים אומר שהבדיקות צריכים להיות מותקנת מחוץ לגוף. זה, בשילוב עם העדינות של שיני הבדיקה, הפך אותם לבלתי ראוי להכנת הליכה חופשית. בשני פרויקטים קודמים, השתמשנו צרורות של חוטים עדינים ויוצרים tetrode להשיג מאפייני הקלטה דומים, אבל בהסדר חזק יותר. חבילות tetrode אלה אפשרו לנו להקליט ממקקים קשוריםd מתייחס פעילות יחידת CC לשינויים במהירות הליכה 14 והפיכת התנהגות כתוצאה ממגע מחושים עם מוט 10. שימושי כמו הכנות קשורות אלה היו וימשיכו להיות, הם עושים להציג כמה מגבלות. ראשית, ההתנהגויות שהחרקים יכולים לבצע מוגבלות למישור אחד. כלומר, אנחנו בקלות יכולים לעורר שינויים במהירות הליכה או מפנה, אבל פעולות טיפוס ונהור לא היו אפשריות, לפחות להסדר לקשור הטיפוסי. שנית, ההכנות קשורות שלנו הן &quot;לולאה פתוחה&quot;. כלומר, הם אינם מאפשרים למשוב תנועה קשורים נורמלי למערכת. לכן, כפי שהמקק מופעל לקשור שלנו, העולם החזותי שלה לא שונתה בהתאם. אפשר לבנות מערכות לקשור לולאה סגורות להציג את משוב מסוג זה. עם זאת, הם מוגבלים על ידי המורכבות של תכנות והחומרה של הסביבה החזותית מדומה. Neverthelesים, הרגשנו שאנחנו יכולים לשפר את שיטות ההקלטה קשורות הקיימות שלנו על ידי הקלטה מבעלי החיים כפי שהוא הלך בחופשיות בזירה או מסלול ואובייקטים נתקלו כפי שהוא היה בסביבתו הטבעית. למרות שמערכות אלחוטיות להקלטת פעילות מוח 15 תהיה אידיאלית, יש מערכות נוכחיות יש מגבלות במספר ערוצי הקלטה, הזמן של רכישת נתונים, אורך חיי סוללה ומשקל. אנו, אפוא, העדפנו לנסות ולהתאים את מערכת ההקלטה קשורה שלנו לשימוש במעבר הכנות באופן חופשי. כמו מערכות אלחוטיות טובות יותר תהיינה זמינות, בטכניקה זו ניתן להתאים בקלות למכשירים כאלה. המערכת מתוארת במאמר זה היא קל משקל, עובדת טוב מאוד ונראה שיש השפעה מזיקה קטנה בהתנהגות של המקק. עם מצלמה במהירות גבוהה זולה ותוכנת חיתוך אשכול, פעילות בתאי עצב במוח אדם יכולה להיות קשורה לתנועה. כאן אנו מתארים את preparע חוטי tetrode וההשתלה שלהם לתוך מוחו של החרק, כמו גם טכניקות הקלטה עבור פעילות חשמלית ותנועה, ואיך נתונים אלה יכול להיות הביא יחד לניתוח שלאחר מכן.

<table><tbody><tr><td>חוט ניכרום&nbsp;</td><td>טכנולוגיית חימום</td><td>Sandvik Kanthal RO-800</td><td>שימוש עבור</td></tr><tr><td>צינורות פוליאתילן ביו-רפואיים</td> טטרודה <td>A-M Systems</td><td>800700</td><td>שימוש עבור צינורות טטרודה</td></tr><tr><td>Lynx-8</td><td>Neuralynx</td><td></td><td>השתמש להקלטה מרובת יחידות</td></tr><tr><td>צ'יטה 32</td><td>Neuralynx</td><td></td><td>השתמש להקלטה מרובת יחידות</td></tr><tr><td>מצלמה במהירות גבוהה</td><td>Basler</td><td>A602f</td><td>השתמש להקלטת וידאו עבור ניסויי הליכה</td></tr><tr><td>מצלמה במהירות גבוהה</td><td>Casio</td><td>EX-FC150</td><td>שימוש להקלטת וידאו לניסויי טיפוס</td></tr><tr><td>WINanalyze</td><td>Winanalyze</td><td>גרסה 1.4 תלת מימד</td><td>שימוש למעקב וידאו&nbsp;</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>MATLAB R2012b</td><td>שימוש ליצירת דופק TTL וניתוח נתונים לא מקוון</td></tr></tbody></table>

תאי חוט tetrode הקלטה במוח של חופשיות הליכה חרקים

Extracellular Wire Tetrode Recording in Brain of Freely Walking Insects

עניין גובר בתפקיד של פעילות המוח בשליטה מוטורית חרקים מחייב אותנו להיות מסוגל לפקח על פעילות עצבית בזמן חרקים לבצע התנהגות טבעית. אנחנו פיתחנו בעבר טכניקה להשתלת חוטי tetrode לתוך המתחם של מוח של המקק שאיפשר לנו להקליט פעילות מתא העצב מרובה בו זמנית המרכזי תוך מקק קשור פנה או מהירות הליכה שונה. בעוד התקדמות גדולה, הכנות קשורות לספק גישה להתנהגויות מוגבלות ולעתים קרובות חוסר תהליכי משוב המתרחשים במעבר בעלי חיים באופן חופשי. כעת אנו מציגים גרסה שונה של טכניקה המאפשרת לנו להקליט מהקומפלקס של לנוע בחופשיות מקקים כשהם הולכים בזירה ולהתמודד עם מחסומים על ידי סיבוב, טיפוס או מנהור המרכזי. יחד עם וידאו במהירות גבוהה וחיתוך אשכול, עכשיו אנחנו יכולים להתייחס פעילות מוח לפרמטרים שונים של התנועה של חרקים מתנהגים בחופשיות.

הקלטנו את הפעילות העצבית של 50 יחידות מCC ב27 הכנות לניסויי הליכה. ל15 של הכנות אלה (23 יחידות), ניסויי טיפוס היו גם ביצעו. יחידות בודדות בשם פי מספרי הכנה ויחידה (לדוגמה, יחידה 1-2 מציינת הכנה 1, יחידה 2). תמונות של הווידאו של ניסוי טיפוס אחד מוצגות באיור 4. כל הווידאו זמין בוידאו 1 משלים (הצליל הוא מהיחידה 1-2). ההקלטה נעשתה בגוף בצורת המניפה ימין (FB). המקק הפסיק ללכת...

אנחנו פיתחנו בעבר טכניקה להשתלת חוטי tetrode לתוך המתחם המרכזי של מוח של מקק המאפשר לנו לעקוב אחר פעילות ביחידות בודדות של מקקים קשורים. כאן אנו מציגים גרסה שונה של טכניקה המאפשרת לנו גם כדי להקליט את פעילות המוח במעבר חרקים באופן חופשי.

תאי חוט Tetrode הקלטה במוח של חופשיות הליכה חרקים

Increasing interest in the role of brain activity in insect motor control requires that we be able to monitor neural activity while insects perform ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להקליט פעילות עצבית מורכבת במוח ולסנכרן אותה עם התנהגויות של חרקים הנעים בחופשיות כפי שהוקלטו בווידאו. מטרה זו מושגת תחילה על ידי ייצור של טטרוד (tetrode) הקלטה גמיש, הכולל השחזה של חוט דק במיוחד, בדיקה וציפוי של הקצה, ושימוש בחומר לסימון מיקומו ולייצוב החוט בתוך צינור פוליאתילן. השלב השני הוא החדרת טטרוד ההקלטה אל תוך המוח, ייצובו באמצעות אצטט ושעווה, והצמדת לולאת הפחתת מאמץ לראש.בשלב הבא מקליטים את הפעילות העצבית במקביל להקלטת וידאו של התנהגות לוקומוטורית. סנכרנו את הווידאו להקלטה באמצעות פולס סנכרון ל-LED ולמגבר. השלב הסופי הוא שיקוע נחושת באמצעות זרם חשמלי רציף והגברת הצביעה בשיטת Tims כדי להנחית את אתר ההקלטה.בסופו של דבר, טכניקות מיון חוץ-תאיות רב-יחידתיות בצפיפות גבוהה מזהות יחידות עצביות, בעוד שניתוח של סרטוני התנהגות שהוקלטו בו-זמנית מאפשר קורלציה ברמת דיוק גבוהה בין הפעילות העצבית להתנהגות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת להשתמש בפרוצדורות קיימות כדי להקליט פעילות עצבית חוץ-תאית בצפיפות גבוהה ממוחו של חרק בזמן שהוא מבצע התנהגות מורכבת. לאחר מכן היא מאפשרת לנו לזהות היכן במוח שהו ה-Tet roads, וכל זאת ניתן לבצע בעלות נמוכה יחסית.טכניקה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בנורופתולוגיה על ידי הקשר בין התזמון והעוצמה של פעילות עצבית באזורי מוח ספציפיים לבין התנהגותו של בעל חיים הנע בחופשיות. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי בקרה סנסורית-מוטורית, אך ניתן להחילה גם על כל התנהגות הדורשת חרק הנע בחופשיות, כגון למידה, התמצאות או ניווט. באופן כללי, אנשים שאינם מיומנים בשיטה זו יתקלו בקשיים, שכן קשיי ההקלטה הם משמעותיים, והמיקום והייצוב שלהם לצורך הקלטה דורשים טכניקות מיקרו-כירורגיות מדויקות מאוד.ההדגמה החזותית של שיטה זו היא קריטית. נהלי ההכנה וההשתלה של ה-Tero קשים ללמידה כיוון שהם מבוצעים עם חומרים קטנים ושבירים מאוד, ויש להקפיד מאוד על כך שלא לפגוע ברקמת המוח. כדי להכין את חוטי ה-Tet Road, הניחו שני חוטי rom שנמשכו לתוך מכשיר ליפוף מסתובב ממונע.סבבו את ה-tero בכיוון אחד למשך שתי דקות ב-60 סיבובים לדקה, ולאחר מכן פתלו אותו בכיוון ההפוך למשך 30 שניות. לאחר מכן, השתמשו באקדח חום כדי להמיס את החוטים יחד, תוך הקפדה לא לגעת בחוטים עם האקדח. בצעו שלושה מעברים מעלה ומטה מכיוונים משתנים, כאשר כל מעבר נמשך כ-10 שניות.לאחר מכן, הוסיפו צינור תמיכה העשוי מאורך של 30 סנטימטרים של צינור פוליאתילן. השהילו את ה-tetra באיטיות לתוך צינור התמיכה כדי למנוע קפליים. ברגע שהקצה המחובר מופיע בקצה השני של הצינור, משכו אותו כך שיהיה אורך שווה של תיל בשני קצוות צינור ההנחיה.כעת אחזו בפיסוף הנפרד של כל חוט באמצעות הפינצטה, תוך שימוש בבסיס הלהבה של מבער גז. שרפו בזהירות את הבידוד משני או שלושה המילימטרים האחרונים של כל חוט. חממו את החוט עד שיהיה לו זוהר, אך לא עד שיתעקם.בשלב הבא, השתמש בפינצטה כדי לחבר את האלקטרודה למתאם שקעי IC זכר-נקבה המתאים למכשיר ההקלטה. הכנס את הקצה שאינו מבודד של כל חוט לשקע שונה במתאם. הוסף פין פליז כדי לסייע בקיבוע החוטים במקומם.לאחר מכן, השתמשו במלחים בעלת חוד דק כדי למלא את התושבת בהסרט מומס. לאחר מכן, בדקו את החיבורים החשמליים התקינים באמצעות מד עכבה כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. באמצעות מתאם נפרד שאינו בשימוש, צרו תבנית נייר קטנה עם חורים בתחתיתה.עבור פיני הדואר, העבירו את המתאם העובד לתוך הקופסה, כאשר צד הדואר פונה כלפי מטה והפינים בולטים מהקופסה. לאחר הדבקת הקופסה בסרט הדבקה כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, ערבבו במהירות אפוקסי דו-רכיבי ושפכו אותו לתוך הקופסה.כדי לקבע את המתאם ואת כל החוטים, הצמידו את הקצה הקרוב של צינור ההנחיה לצד אחד של הקופסה בעזרת שעוות שיניים, אך השאירו את הצינור פתוח כך שניתן יהיה למשוך את ה-tero חופשית משני הקצוות. לאחר שהאפוקסי התקשח וכל המכלול יבש, השלב הבא הוא להשחיז את ה-tero. התחילו בחיתוך של קצה ה-tero באמצעות להב סקאלפל חד.בשלב הבא, פולש את ה-tero באמצעות כלי רוטטורי קטן המותקן בצורה אנכית עם דיסקי שיוף בעלי גרעיניות בינונית ועדינה. כוון את הכלי הרוטטורי לסבב במהירות מתונה תוך כדי החזקת הצמיג קרוב לקציו. בעזרת פינצטה, הטה את קצה התיל לזווית של 45 מעלות ביחס לדיסק השיוף.קריטי שסבובן של דיסקי השיוף יהיה הרחק מהזווית הרדודה של קצוות התיל. אחרת, עלול להתרחש הפרדה של התילים. התיקו את הצרור בעדינות לדיסק השיוף בעל הגרעין הבינוני למשך אחת עד שתי שניות, ולאחר מכן התיקו אותו לדיסק השיוף בעל הגרעין הדק למשך אחת עד שתי שניות נוספות.חזור על פעולה זו שלוש פעמים נוספות, תוך סיבוב ציר השנימה ב-90 מעלות בכל פעם. עם הסיום, השתמש במיקרוסקופ דיסקציה כדי לוודא שקצה השנימה הוא מחודד, שסכומים קטנים של בידוד הוסרו מקצהו של כל חוט, ושאין פריחה. זאת לאחר בדיקה חוזרת של העכבות (impedances) הן בין החוטים הבודדים והן בין כל חוט ללוח ההארקה.הכניסו את קצה האלקטרודה למס विलयון נחושת גופרתי רווי. פספסו את התיל הראשון בזרם של 2.5 µA. בעזרת מבודד גירויים (stimulus isolator), הזרים את הזרם למשך שנייה אחת. המתינו שנייה אחת וחזרו על תהליך זה שלוש פעמים.לאחר מכן, יש להרכיב את שלושת החוטים הנותרים באותו אופן. לאחר מכן, יש לבדוק שוב את העכבה. התקן את המתאם על ראש המערכת (head stage) של מערכת הקלטה רב-ערוצית.חברו סיכה לחרקים כפופה למיקרו-מניפולטור, והדביקו את קצה תיל הטרו (tero wire) לסיכה באמצעות שעוות שיניים. לאחר הרדמה וקיבוע של תיקן כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, השתמשו בלהב תער כדי לחתוך חלון קטן בין העיניים המורכבות לאחר הסרת הקוטיקולה. השתמשו בפינצטה להסרת רקמות חיבור ושומן כדי לחשוף את המוח. לאחר מכן, מזגו תמיסת סליין לתיקנים לתוך קפסולת הראש כדי לכסות את רקמת המוח ולחשוף אותה מהמעטפת.השתמשו בפינצטה עדינה כדי לתפוס בעדינות את הנרתיק שמעל המוח, והשתמשו בפינצטה עדינה נוספת כדי לקרוע את הנרתיק באזור השבצת התילים. לאחר מכן, השתמשו בסיכת חרקים כדי לפתוח חור קטן בקליפת הראש בחלק הקדמי למוח. הכניסו לחור צמה של 3 תילים מנחושת מבודדים בקוטר 56 micron.כדי לשמש כאלקטרודת קרקע למחקר, הורד את קצה הטטרו אל פני המוח באמצעות המיקרו-מניפולטור ומקם אותו סמוך לאזור העניין. הנח בזהירות שתי פיסות קטנות של דף אצטט דק בגודל 2x1 מילימטר, הגדולות מעט מהחור בקסדה של הראש, קדמית ואחורית לטטרו.הורד לאט את ה-tede ל-150 עד 250 מיקרון מתחת לפני השטח של המוח תוך ניטור איכות ההקלטה. חפש פריקות (spikes) חוץ-תאיות ספונטניות בגודל בינוני עד גדול, המעידות הן על אזור עניין והן על חיוניות כללית של הרקמה העצבית. כאשר מיקום ה-Tero מספק, הזז את שתי לוחות האצטט קרוב ככל האפשר ל-tetro מבלי לגעת בו.חשוב מאוד לנהוג בזהירות רבה במהלך הניתוח וההשתלה כדי למנוע קריעה של החוטים. בעזרת שפכטל קטן שהוכן על ידי פשיטה של קצה מחט היפודרמית, חממו את השפכטל באמצעות מבער אלכוהול. לאחר מכן, הכניסו את השפכטל לשעוות דנטלית כך שיהיה שעווה נוזלית בקצה השפכטל.נגעו בזהירות במומי השעווה הנוזלי בקצה של גיליאצטט המרוחק ביותר מה-tero, כדי לאפשר לשעווה הנוזלית לאטום את הרווח שבין גיליאצטט לבין ה-head cuticle. המשיכו לחמם מחדש את השפכד ולהטיל כמות קטנה של שעווה נוזלית על גיליאצטט. התקדמו בהדרגה לכיוון ה-tero ובסופו של דבר קבעו את ה-tero באמצעות כמות קטנה של שעוות שיניים.הימנעו מהספגת שעווה חמה לתוך החלל ועל המוח. לאחר מכן, קבעו את אלקטרודת הייחוס באמצעות שעווה באופן דומה. כעת חממו את השעווה המחברת את ה-tero למיקרו-מניפולטור כדי לשחרר את ה-tero ממנו.לאחר מכן, השחילו את התיל (tero) לתוך השעווה שעל הראש כדי לספק הגנה מפני מתיחה (strain relief), וכסו את לולאת ההגנה בשעווה. בשלב זה, הסירו בזהירות את האילוצים והעבירו את הדגימה אל צלחת פטרי המוצבת על קרח. קבעו את הדגימה כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה באמצעות סיכות אוכף גדולות. בעזרת אקדח דבק, הצמידו מקל עץ כך שיבלוט מהפרונום (pronoum) מעל הבטן.בשלב הבא, הצמידו את קצה צינור ה-tero לקצה האחורי של המוט באמצעות שעווה דנטלית. לאחר מכן, קבעו את ה-tero ואת אלקטרודת הייחוס לקצה הקדמי של המוט בעזרת שעווה דנטלית. לאחר מכן, משכו את ה-tero מקצה השקע של הצינור ככל האפשר, אך אל תמשכו אותו בעוצמה.קבעו זאת למתאם באמצעות שעווה כדי לשלול את הסיכוי שהחיה תפגע בחלק החשוף של ה-tero. לאחר הסרת כל האילוצים, חברו את אלקטרודת הייחוס לצינוריית ה-tero בעזרת שעוות שיניים. הגדירו הקלטות עצביות ווידאו תקינות כפי שצוין בפרוטוקול הטקסט לפני תחילת ניסויי ההתנהגות; עבור ניסויי הליכה, אפשרו לתשעה לחקור זירה מפלקסיגלס, ועבור ניסויי טיפוס.השתמשו בזירה ארוכה וצרה עם מכשול בצורת מדף שהחיה יכולה לטפס מעליו או לעבור מתחתיו במנהרה, או לחלופין בבלוק פלקסיגלס שהחיה יכולה לטפס עליו. בעת ההקלטה, ייצרו פולס TTL מהמחשב באמצעות פקודת MATLAB מותאמת אישית. פולס ה-TTL מייצר חותמת זמן עבור מערכת ההקלטה ומדליק או מכבה את תאורת ה-LED עבור ניסויי הגירוי.ניתן להשתמש ברכבות של פולסי זרם בין חוטי ההקלטה כדי לעורר התנהגות לאחר השלמת השלב הניסויי, שכלל העברה של זרם dc בעוצמה של 5 µA למשך חמש שניות דרך אחד מקצות החוטים ואלקטרודת הייחוס, במטרה להשקיע נחושת במוח. כדי לסמן את מיקום קצה החוט, מוצגים כאן עקומות מתח גולמיות מאלקטרודות בודדות בתוך צרור tero אחד. שימו לב להבדלים בעקומות המתח בין האלקטרודות השונות.שלוש יחידות מוינו באמצעות MLUs. מוצגת כאן תצוגה תלת-ממדית של אנרגיית גל הצורה כפי שנרשמה בשלוש מארבע האלקטרודות. כל נקודה מייצגת אירוע סף בודד, המקודד בצבע לפי האשכול אליו שויך בסופו של דבר.צילום זה נלקח מסרטון של ניסוי טיפוס; מעל לכל פריים מוצגים המהירות הנורמלית, גובהו של התינוק (cockroach) וקצב הפריקה (firing rate) הרגעי של שתי יחידות ממוינות מהפריים הראשון ועד הפריים הנוכחי. זמן 0 מציין את תחילת הטיפוס; קצב הפריקה נורמל מ-0 עד 1, והמהירות והגובה נורמלו מ-0 עד 0.5 לצורכי תצוגה. הסימנים מתחת לכל פריים מציינים את הפולסים (spikes) של שתי היחידות הממוינות בתוך שנייה אחת מהפריים הנוכחי. הקו הכתום מציין את הזמן המכסה כל פריים, והמלבן הכחול מציין פעמיים את רוחב הגרעין (kernel) ששימש לחישוב קצב הפריקה הרגעי עבור הפריים הנוכחי.הקלטה זו בוצעה בגוף המניפת הימני. קצב הפריקה של יחידה 11 עלה במהלך הטיפוס, והעלייה בקצב הפריקה קדמה לעלייה במהירות. יחידה 12 הייתה שקטה לפני הטיפוס, אך החלה לפרוק לאחר שהטיפוס החל.בצילום רגעים זה מניסוי חקירת הזירה, הקו האליפטי האדום מציין את צורת התוסאח בפריים זה, והקו המקווקו האדום מציין את מיקום מרכז המסה של התוסאח ב-10 הפריים הקודמים. מהירות הפנייה וההליכה קדימה, כמו גם קצב הפריקה המיידי של יחידה 2.1, מוצגים כאן. הספייקים של יחידה 2.1 בטווח של ארבע שניות מהפריים הנוכחי מוצגים מתחת לפריים.כמו קודם, הקו הכתום מציין את משך הזמן המכוסה על ידי כל פריים והמלבן הכחול מציין פי שניים מרוחב הגרעין (kernel) ששימש לחישוב קצב הפריקה הרגעי עבור הפריים הנוכחי. הקלטה זו בוצעה במרכז גוף המאוורר. מיקומו של התיקון והכיוון של גופו בכל פריים הופקו באמצעות תוכנת מעקב כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, ושימשו לחישוב מהירות ההתקדמות ומהירות הכיוון, וכן לקביעת קצב הפריקה הרגעי.קצב הפריקה של יחידה 21 עלה כאשר תיקן השדה החל ללכת והיה במתאם עם מהירות ההליכה. עבור יחידות רבות במתחם המרכזי (central complex), העלייה בקצב הפריקה הייתה מוגבלת למצבי תנועה ספציפיים. לדוגמה, יחידה 2,1 הייתה מכוילת להליכה קדימה ללא קשר למהירות הפנייה.מסלול התנועה של התיקטורן מהסרטון מוצג כאן. הנקודה השחורה הגדולה מציינת את נקודת ההתחלה של התיקטורן, וכל נקודה שחורה קטנה מציינת את מיקום התיקטורן בכל פריים. מסלול התנועה סומן בצבעים כדי להראות את קצב הפריקה הרגעי של יחידה אחת, כאשר הצבעים נעים מכחול המציין קצב פריקה נמוך ועד אדום המציין קצב פריקה גבוה.במפת קצב הפריקה זו של יחידה two one, ציר ה-X הוא מהירות הסיבוב, וציר ה-Y הוא מהירות ההליכה קדימה. מהירות סיבוב חיובית מעידה על סיבוב ימינה ומהירות סיבוב שלילית מעידה על סיבוב שמאלה. מיקום האלקטרודה נקבע לפי משקעי נחושת הנראים לאחר ההליך ההיסטולוגי כפי שמתואר בטקסט.לחלופין, ניתן לצפות את האלקטרודה בצבע פלואורסצנטי ולאתר אותה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. מדובר במערך טכניקות מורכב שגם לאחר השליטה בו נדרש זמן כולל של שעות רבות; מומלץ לחלק את הרכיבים לתתי-קבוצות, לייצר ולבדוק מספר teros לפני תחילת ניסוי השתלה.חשוב לזכור לבצע בדיקה מוקדמת של ה-tero כדי לוודא עכבה תקינה בין החוטים ובכל חוט בנפרד, ולהיות זהירים במיוחד בזמן ההשתלה וקביעת ספי העריכה במוח. ניתן לשלב שיטות כמו מעקב אוטומטי בזמן אמת כדי לפשט את הליך הניתוח. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן הייצור וההשתלה של teros במטרה לתאם פעילות פיזיולוגית עם התנהגויות מורכבות של חרק הנע באופן חופשי.

extracellular-wire-tetrode-recording-brain-freely-walking

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מתארים שיטה להקליט פעילות מוטורית, בעיתוי לאותת רשמה חשמלית הקשר tarsal ב חרק קשור, הליכה על משטח חלקלק. זה משמש כדי לחקור את הבסיס העצבי של התנהגות אדפטיבית תחת השפעה מופחתת של אינטראקציה מכני בין הרגליים דרך המצע.

ללמוד את הבסיס העצבי של התנהגות מסתגלת של תנועה בתוך חרקים

הסרטון מדגים הליך להשתלת יחידת אלקטרודה רב-ערוצית דו-ערוצית אלחוטית במוח חולדה כדי להקליט ולעורר רשתות עצביות רב-ערוציות.

השתלת מערכת מיקרואלקטרודות דו-כיוונית אלחוטית במוח של חולדה

הסרטון מדגים רישום חוץ-תאי של פעילות עצבית ממערכת העצבים המרכזית (CNS) של זחלי דרוזופילה. מערכת העצבים המרכזית הטרנסקטיבית ממוקמת בתא הקלטה, והפעילות החשמלית לעצב יורד נרשמת כדי לקבוע את תדר הירי הבסיסי. לאחר מכן מוצג סוכן בדיקה, והשינוי בתדירות הירי נרשם כדי לקבוע את ההשפעה המעוררת או המעכבת של הסוכן.

רישום חוץ-תאי של פעילות חשמלית במערכת העצבים המרכזית של דרוזופילה

אנחנו מדגימים וריאציות של טכניקה רבת יחידת ההקלטה התאית לאפיין תגובות ריח מעורר בשלושת השלבים הראשונים של מסלול ההרחה חסר חוליות. טכניקות אלה יכולים בקלות להיות מותאמות לבחינת פעילות הרכב במערכות עצביות אחרות גם כן.

שיטות הקלטה בעל מספר יחידות לאפיין את הפעילות עצבית בארבה (<em&gt; Schistocerca אמריקנה</em&gt;) מעגלי ריח

מאמר זה מתאר את נתיחת מקק הגחון עצב בחוט והקלטות תאית מן העצב וconnectives cercal. עוררו תגובות מופקות על ידי גירוי חשמלי של עצב cercal או הגירוי מכאני ישיר של cerci.

עצבית במעגל הקלטה ממערכת עצבים מקק שלמה

הקלטות ארוכות טווח תאיים בו זמנית משני neuropiles המוח שונה או שני קטעים אנטומיים שונים הוקמו בדבורי דבש. הקלטות אלה מאפשרות החקירה של היבטים זמניים של עיבוד עצבי על פני אזורים שונים במוח בנוירון הבודד, כמו גם ברמת ההרכב בבעלי חיים מתנהגים.

הקלטות ארוכות טווח בו זמנית בשני שלבים עצביים עיבוד במתנהגים דבורי דבש

שיטה זו יוצרת סביבה מוחשית, מוכרת לעכבר כדי לנווט ולחקור במהלך הקלטות מיקרוסקופיות הדמיה או תא בודד אלקטרו, אשר דורשות קיבוע איתן של ראשו של בעל החיים.

פלטפורמה הרימה-Air-מרוצף שטוחה: שיטה חדשה לשילוב עם התנהגות מיקרוסקופית או אלקטרופיזיולוגיה על Awake לנוע בחופשיות מכרסמים

אנו מציגים שיטות לבניית אלקטרודות לרישום בו זמנית של פעילות עצבית חוץ-תאית ולשחרור חומרים נוירואקטיביים מרובים בקרבת אתרי ההקלטה בעכברים ערים. טכניקה זו מאפשרת ניתוח מפורט של קלטים סינפטיים מקומיים משוערים לנוירון המעניין.

הקלטה תאית של העצבית פעילות משולבת עם Microiontophoretic יישום של חומרי Neuroactive עכברי Awake

אנו מציגים שלוש שיטות חדשות כדי ללמוד קידוד gustatory . בעזרת חיית מחמד פשוטה, המנדוקה סוקה ( Manduca ) , אנו מתארים פרוטוקול לנתיחה, השימוש tetrodes תאיים להקליט את הפעילות של נוירונים קולטן רב גוסטורי, ומערכת לאספקת ומעקב פולסים תזמון מדויק של טעימות.

שיטות חדשות לחקר קידוד גוסטוריאלי

חיבור אלחוטי, מערכת דו-כיווני הקלטות עצבית רב ערוצית גירוי ב להתנהג בחופשיות חולדות הוא הציג. המערכת היא קל וקומפקטי, וכך יש השפעה מינימלית על הרפרטואר ההתנהגותי animal´s. יתר על כן, מערכת דו-כיוונית זו מספקת כלי מתוחכם כדי להעריך את קשרי הגומלין סיבתי בין תבניות ההפעלה מוח והתנהגות.

חיבור אלחוטי, ממשק דו-כיווני ההקלטה In Vivo גירוי של פעילות עצבית להתנהג בחופשיות חולדות

טכניקה אלחוטית הרומן עבור הקלטת אותות עצביים מן המוח של שחייה בחופשיות הזהב מוצג. המכשיר מורכב משני tetrodes, מיקרודרייב, לוגר מידע עצבי, ומקרה עמיד למים. כל החלקים מותאמים אישית למעט לוגר הנתונים והמחבר שלו.

הקלטה אלקטרופיסיולוגית של הנוירונים על ידי להזזה Tetrodes בחינם שחייה דגים

למדו שיטה מתקדמת להקלטת פעילות עצבית במוח חרקים נעים באמצעות טטרודות גמישות. השיטה מאפשרת תיאום בין נתונים עצביים להתנהגות תנועתית ומספקת מסגרת למחקרי מדעי המוח.

תאי חוט Tetrode הקלטה במוח של חופשיות הליכה חרקים

גלה סרטונים נוספים