כימות של הפולשנות תאי סרטן השד תוך שימוש במודל תלת ממדים (3D)

המטרה הכללית של הפרוצדורה הבאה היא להעריך את יכולת הפלישה של תאי סרטן באמצעות בדיקת פלישה תלת-ממדית. הדבר מבוצע תחילה על ידי גידול של תאי סרטן במטריקס של קרומי בסיס. לאחר מכן, הפלישה התאית למטריקס נצפית במשך חמישה ימים או יותר באמצעות מיקרוסקופיה של אור.

בשלב הסופי, התאים מסומנים בנוגדנים פלואורסצנטיים לצורך איתור החלבונים הנבדקים. בסופו של דבר, ניתן לנתח את קצב הפלישה של תאי הסרטן ואת השינויים הנובעים מכך בביטוי החלבונים באמצעות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות, כגון בדיקת פלישה בתא Transwell, הוא שבדיקת פלישה בג'ל תלת-ממדי מדמה טוב יותר את הסביבה in vivo שבה גדל הסרטן.

השלכות טכניקה זו הן עבור טיפול בסרטן, שכן היא מאפשרת לזהות במחקר חלבונים חדשים המעורבים בפלישה סרטנית ובגרורות. לפני תחילת הליך התרבית, הניחו את מטריצת קרום הבסיס (basement membrane matrix), פפית P 200 וטיפים על קרח למשך לילה בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. למחרת, השתמשו בטיפ של הפפית בנפח 200 µL הקרה כדי למרוח 50 µL מהמטריקה בתבנית ספירלה על תחתיתה של צלחת זכוכית למסך קונפוקאלי (confocal number one glass bottom dish).

לאחר מכן, מקמו את הצלחית באינקובטור לתרבית תאים בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide למשך 30 דקות לפחות, בעוד המטריצה עוברת התמצקות. השתמשו בטריפסין על צלחית של תאים בקוטר 100 מילימטר עם התמסכות של 70% עד 80%, ברגע שהתאים החלו להיפרד. נטרלו את הטריפסין באמצעות 10 milliliters של מצע, ולאחר מכן העבירו את תרחיף התאים לשפופרת קונית של 15 milliliters. סבבו את התאים בצנטריפוגה למשך שלוש דקות ב-100 Gs ובטמפרטורה של 4 °C בזמן שהתאים שוקעים.

העבירו מנה (aliquot) של 50 µL מהמטריקס לשפרורט מיקרו-צנטריפוגה של 1 mL עבור כל צלחת של מטריקס קרום בסיס (basement membrane matrix), והניחו את השפרוטות על קרח עם סיום הסבב של התאים. שאבו את העל-משקע (supernatant) מבלי להפריע למשקע, ולאחר מכן השעיקו. השעיקו את התאים ב-1 mL של מצע גידול וספרו אותם לאחר מכן.

העבירו 2.5 times 10 to the fourth תאים למבחנה מיקרו-צנטריפוגה חדשה, והשלימו את תרחיף התאים עם מצע גידול לנפח סופי של 50 µL. לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של מטריצת קרום בסיס קרה מהקרח לתאים ביחס של אחד ለአחד, לנפח סופי של 100 µL. פזרו בעדינות את תערובת המטריצה והתאים על גבי מטריצת קרום בסיס שהתגבשה, והניחו לתאים להטמיע את עצמם במטריצה בתוך אינקובטור לתרביית תאים.

לאחר 30 דקות, כסו את המטריצה בשני מיליליטר של מצע גידול והחזירו את הצלחת לדגרה, והחליפו את המצע מדי יום למשך תקופת הניסוי. השתמשו בעדשה עם הגברה של 10x במיקרוסקופ אור פעם ביום לאורך תקופת הניסוי כדי לצלם 20 תמונות בשיטת ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) של המושבות התלויות במטריצת קרום הבסיס. נתחו את התמונות באופן עיוור כדי לקבוע את תצורת הכוכב (stellate formation) של מושבות התאים.

מושבה תיחשב ככוכביתית אם נצפו אחת או יותר מהבלטות מהמרכז התאי. כדי לבחון את המאפיינים המורפוגניים של המושבות התלת-ממדיות, הוצא את התאים מהאינקובטור והנח אותם על מגש קרח. שאב את המצע ולאחר מכן שטוף את המושבה שלוש פעמים עם 2 mL של PBS קר.

לאחר השטיפה האחרונה, קבעו את התאים בשני מיליליטר של תמיסה של 20% acetone ו-80% methanol למשך 20 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן החזירו את הצלחות לטמפרטורת החדר. ברגע שמטריצת קרומי הבסיס הגיעה לטמפרטורת החדר, שאבו את חומר הקיבוע ושטפו את הצלחת שלוש פעמים עם PBS כפי שהודגם זה עתה. לאחר השטיפה הסופית, חסמו קישור לא ספציפי על התאים באמצעות שני מיליליטר של 3% BSA למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, דגרו את התאים עם הנוגדנים הראשוניים הרלוונטיים, המדוללים ב-3% BSA, בטמפרטורת החדר. לאחר שעה, הסירו את תמיסת הנוגדן הראשוני לאחר שטיפה של הנוגדן הראשוני שאינו קשור שלוש פעמים בעזרת PBS, הוסיפו את הנוגדן המשני המומס ב-3% BSA בדילול המתאים ודגרו את התאים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בחשיכה. לאחר שטיפת הנוגדן המשני שאינו קשור בעזרת PBS, צבעו את גרעיני התאים בשני מיליליטרים של hext 3, 3, 2, 5 8 ב-PBS למשך חמש דקות בחשיכה.

לאחר מכן, שטפו את השארית הבלתי קשורה מהתאים חמש פעמים באמצעות PBS. לאחר השטיפה החמישית, הוסיפו מדיום קיבוע (mounting medium) ישירות על תערובת המטריצה לתאים, וכסו בזהירות את מדיום הקיבוע עם זכוכית כיסוי כדי למנוע כל פגיעה בשלמות של תערובת המטריצה של קרומי הבסיס לתאים. ייבשו את הצלחת למשך לילה בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן רכשו תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי באורכי גל הלייזר המתאימים לנוגדנים שנעשה בהם שימוש בתמונות אלו.

מוצגים תאי MDA MB 2 3 1 הפולשים למטריצה תלת-ממדית. התאים הוחדרו למטריצה ביום הראשון והחלו ליצור מבנים כוכביים פולשניים עד היום השלישי. ביום החמישי ניתן היה להבחין בפלישה מלאה של המטריצה.

לאחר מכן נספר מספר המושבות הכוכביות שהיוונו והתוצאה בוטאה כאחוז ממספר המושבות הפולשניות והבלתי פולשניות הכולל לכל צלחת. בנוסף, מכיוון שהמדידות בוצעו מדי יום במשך חמישה ימים, ניתן היה להעריך גם את קצב הפלישה בתמונות אימונופלואורסצנטיות אלו. מושבות כוכביות פולשניות מייצגות של תאי MDA MB 2 3 1, המציגות אובדן של שלמות הממברנה ומיקום דיפוזי של חלבון הממברנה הבזאלית laminin five, מוצגות בניגוד חריף למה שנצפה בתאי סרטן השד MDA MB 2 31.

הלמינין חמישה מוקם בשכבת קרומי בסיס שלמה העוטפת את הזיכרון האסיני של תאי MCF 10 A לא-ממאירים שלא טופלו. לאחר הליך זה, ניתן לבצע תרבית משותפת עם תאי סטרומה כדי לענות על שאלות נוספות, כגון האם תאי סרטן מקיימים תקשורת עם תאי סטרומה במיקרו-סביבה לאחר התפתחותה. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום האונקולוגיה לחקור פלישה ונדידה של סרטן, שניהם נדרשים להפצה גרורתית של תאי סרטן.