כימות של הפולשנות תאי סרטן השד תוך שימוש במודל תלת ממדים (3D)

המטרה הכוללת של ההליך הבא היא להעריך את היכולת הפולשנית של תאים סרטניים באמצעות בדיקת פלישה תלת מימדית. זה מושג על ידי תרבית ראשונה של תאים סרטניים במטריצת קרום מרתף. לאחר מכן נצפית הפלישה התאית של המטריצה במשך חמישה ימים או יותר באמצעות מיקרוסקופ אור.

בשלב האחרון, התאים מסומנים בנוגדנים פלואורסצנטיים ללוקליזציה של החלבונים המעניינים. בסופו של דבר, ניתן לנתח את קצב פלישת התאים הסרטניים והשינויים הנובעים מכך בביטוי החלבון על ידי מיקרוסקופיה אימונו-פלואורסצנטית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות כגון בדיקת פלישת תא טרנסוול, הוא שבדיקת פלישת הג'ל התלת מימדית מחקה טוב יותר את הסביבה in vivo שהסרטן פותר תוך כדי גידול.

ההשלכה של טכניקה זו היא לטיפול בסרטן, שבו ניתן לזהות חלבונים חדשים במחקר, המעורבים בפלישה לסרטן וגרורות. לפני שמתחילים בהליך התרבות, הניחו את מטריצת קרום המרתף פיפטה P 200 וקצות פיפטה על קרח למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, השתמש בקצה הפיפטה הקרה כקרח של 200 מיקרוליטר כדי לפזר 50 מיקרוליטר של המטריצה בתבנית ספירלית על תחתית תחתית זכוכית קונפוקלית מספר אחת.

לאחר מכן מניחים את המנה באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 30 דקות לפחות בזמן שהמטריצה עוברת התמצקות של עיני טריפסין, צלחת תאים של 70 עד 80% 100 מילימטר לאחר שהתאים החלו להתנתק. השבת את הטריפסין עם 10 מיליליטר מדיום, ולאחר מכן העביר את תרחיף התא לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. צנטריפוגה של התאים למשך שלוש דקות ב-100 Gs וארבע מעלות צלזיוס בזמן שהתאים מסתובבים כלפי מטה.

הכניסו 50 מיקרוליטר של מטריצה לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה אחד של מיליליטר אחד לכל צלחת של מטריצת קרום המרתף, והניחו את הצינורות על קרח כאשר התאים סיימו להסתובב. שאפו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור, ואז החיואו. השעו את התאים במיליליטר אחד של מדיה וספרו אותם לאחר מכן.

העבירו 2.5 פעמים 10 לתאים הרביעיים לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה חדש הממלא את מתלה התא במדיה לנפח סופי של 50 מיקרוליטר. לאחר מכן הוסף את 50 המיקרוליטרים של מטריצת קרום הבסיס הקר כקרח לתאים ביחס של אחד לאחד לנפח סופי של 100 מיקרוליטר. צלחו בעדינות את המטריצה לתערובת התאים על מטריצת קרום הבסיס המוצקה, ואפשרו לתאים להטמיע במטריצה בחממת תרבית התאים.

לאחר 30 דקות, כסו את המטריצה בשני מיליליטר מדיה והחזירו את הצלחת לאינקובטור, החליפו את המדיה כל יום למשך הניסוי, השתמשו במטרה פי 10 של מיקרוסקופ אור פעם ביום למשך הניסוי כדי לקחת 20 הפרעות דיפרנציאליות. תמונות ניגודיות של המושבות התלויות במטריצת קרום המרתף. נתח את התמונות בצורה עיוורת כדי לקבוע את היווצרות הכוכבים של מושבת התא.

מושבה נחשבת כוכבית אם נצפתה הקרנה אחת או יותר מהסטרואידים של התאים. כדי לבחון את המאפיינים המורפוגניים של המושבות התלת-ממדיות, הוציאו את התאים מהאינקובטור והניחו אותם על מגש קרח. שאפו את המדיה ואז שטפו את המושבה שלוש פעמים עם שני מיליליטר PBS קר.

לאחר הכביסה האחרונה, יש לתקן את התאים בשני מיליליטר של 20% אצטון, 80% תמיסת מתנול למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ואז להחזיר את הכלים לטמפרטורת החדר. לאחר שמטריצת קרום המרתף נמצאת בטמפרטורת החדר, שאפו את הקיבוע ושטפו את הצלחת שלוש פעמים עם PBS כפי שהודגם זה עתה. לאחר הכביסה הסופית, חסום כל קשירה לא ספציפית על התאים עם שני מיליליטר של 3% BSA למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן דגרו את התאים בנוגדנים העיקריים המעניינים המדוללים ב-3% BSA בטמפרטורת החדר. לאחר שעה, יש להסיר את תמיסת הנוגדן העיקרית לאחר שטיפת הנוגדן הראשוני הלא קשור שלוש פעמים עם PBS, להוסיף את הנוגדן המשני המומס ב-3% BSA בדילול המתאים ולדגור את התאים למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר שטיפת הנוגדן המשני הלא קשור עם PBS מכתים את גרעיני התאים בשני מיליליטר של hext 3, 3, 2, 5 8 ב-PBS למשך חמש דקות בחושך.

לאחר מכן שטפו את הקס הלא קשור מהתאים חמש פעמים עם PBS. לאחר הכביסה החמישית, הוסף מדיום הרכבה ישירות על המטריצה לתערובת התאים וכסה בזהירות את אמצעי ההרכבה בהחלקת כיסוי זכוכית כדי למנוע הפרעות בשלמות מטריצת קרום המרתף לתערובת התאים. יבש את המנה למשך הלילה בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן רכש תמונות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי באורכי גל הלייזר המתאימים לנוגדנים המשמשים בתמונות אלה.

MDA MB 2 3 1 תאים הפולשים למטריצה תלת מימדית מאוירים. התאים נטמעו במטריצה ביום הראשון והחלו ליצור מבני כוכבים פולשניים ביום השלישי. ביום החמישי ניתן היה להבחין בפלישה מלאה של המטריקס.

לאחר מכן נספר מספר מושבות הכוכבים שנוצרו ובא לידי ביטוי כאחוז מהמספר הכולל של המושבות הפולשות והלא פולשניות למנה. בנוסף, מכיוון שהמדידות הושלמו מדי יום במשך חמישה ימים, ניתן היה להעריך את קצב הפלישה גם בתמונות אימונו-פלואורסצנטיות אלה. מושבות כוכביות פולשניות מייצגות של תאי MDA MB 2 3 1 המציגות אובדן שלמות הממברנה ולוקליזציה מפוזרת של חלבון קרום הבסיס למינין 5 מוצגות בניגוד מוחלט למה שנצפה בתאי סרטן השד MDA MB 2 31.

הלמינין חמש היה ממוקם בשכבת קרום בסיס שלמה הסוגרת את הזיכרון אסינין של תאי MCF 10 A הלא ממאירים הלא מטופלים. לאחר הליך זה, ניתן לבצע תרבית משותפת עם תאי סטרומה כדי לענות על שאלות נוספות כגון האם תאים סרטניים מדברים עם תאי סטרומה במיקרו-סביבה לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האונקולוגיה לחקור פלישה ונדידה של סרטן, שניהם נדרשים להתפשטות גרורתית של תאים סרטניים.