Name: זיהוי גנים הקשורים לרומן אלגינט ייצור ב Pseudomonas aeruginosa שימוש מיני Himar1 Mutagenesis תיווך transposon מרינר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-10T21:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: חקור זיהוי גנים הקשורים לייצור אלגינט ב-Pseudomonas aeruginosa באמצעות מוטגנזה מבוססת טרנספוזון mini-himar1. שיטה זו מאפשרת אפיון רגולטורים חדשים ותרומה להבנת מנגנוני בקרת אלגינט.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית לאווירונאוטיקה וחלל מנהל מערב וירג&#39;יניה שטח גרנט Consortium (נאס&quot;א WVSGC), קרן סיסטיק פיברוזיס (CFF-YU11G0) ו-NIH P20RR016477 וP20GM103434 לרשת רעיון המערב וירג&#39;יניה ביו רפואית מצוינות מחקר. אנו מודים Vonya מ &#39;אייזינגר לסיוע הטכני בעבודה זו.

1. הכנה של זני חיידקים וBiparental נטיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן E. coli SM10/λpir/pFAC ב 5 מיליליטר של מרק לוריא (LB) בתוספת 15 מיקרוגרם / מיליליטר של gentamycin ומקום בחממה רועדת הלילה בשעה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן פ PAO1 aeruginosa המתח ב 5 מיליליטר של LB, ומקום בחממה רועדת הלילה בשעה 42 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד OD 600 של תרבויות לילה ולערבב כמויות שווה של PAO1 וא coli pFAC כך שהנפח הסופי הוא בין 1-1.4 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת צנטריפוגה ב 6,000 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, ייבוש צלחות LB לנטייה: להשאיר צלחות פתוחות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל אבל 50 μl של supernatant מתערובת תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב μl 50 הנותר של supernatant וטפטף על צלחת LB יבשה בטיפה אחת קומפקטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למקם את הצלחת בזהירות במנדף לייבוש (impoהערה RTANT: אל תתנו לתאים משתרעים על פני הצלחת, זה יהיה להקטין באופן משמעותי את היעילות של נטיה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שרביב הוא יבש, להפוך את צלחת LB ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 4-6 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד תערובת התא היא דוגרת, להכין צלחות פיא (150 OD x 15 מ&quot;מ) גדולות עם 300 מיקרוגרם / מיליליטר של gentamycin. לפני השימוש, הסר את כל לחות שיורית על ידי הצבת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15-20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה של תערובת התא היא מלאה, לאסוף את התאים באמצעות לולאת חיסון סטרילי ובצינור microcentrifuge המכיל 1 מיליליטר LB ומערבולת, או פיפטה, לערבב ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים את התאים באופן שווה על גבי צלחות PIA הגדולות מכילות 300 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin. (חשוב: לצעד זה, עדיף להוסיף כמויות הולך וגדל של תערובת התאים להפריד צלחות (למשל פלייט 1: 10 μl, 2 פלייט: 50 μl, צלחת 3: 100 μl, צלחת 4: 500 μl, וכו &#39;) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הלילה בשעה 37° C. </li></ol> 2. זיהוי ובידוד של מושבות רירני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחות מן החממה ולבחון למושבות רירני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד מושבה רירני יחידה ופס לבידוד על צלחות קטנות (100 OD x 10 מ&quot;מ) עם PIA ו300 / מיליליטר מיקרוגרם של gentamycin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הלילה בשעה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.2 על תרבות הלילה הקודמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.2-2.4 עוד פעמיים כדי לקבוע את היציבות של בודד רירני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שלב בודד סופי, לחסן 4.5 מיליליטר של LB עם מושבה רירני יחידה ודגירה שבייקרה לילה בשעה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, תווית 3 microcentrifuge צינורות עבור כל מוטציה רירני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שני 1.25 aliquots מיליליטר של תרבות הלילה ל -2 צינורות להפקת DNA גנומי וזיהוי של אתר הכנסת transposon (ראה פרוטוקול 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנוסף, בארכיון בכל מוטציה רירני ידי pipetting 1 מיליליטר תרבות הלילה לתוך appropriatcryovial איליי שכותרת המכילה נפח שווה של 10% חלב דל שומן. חנות ב -86 ° C. </li></ol> 3. הגבלת gDNA עיכול וקשירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ gDNA ממוטצית רירני באמצעות כל שיטה מועדפת (לדוגמא. פנול, כלורופורם, טור ספין, וכו &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הריכוז של gDNA, לעכל כולל של 2 מיקרוגרם עם 1 μl של endonuclease ההגבלה סאלי, 0.5 μl של אלבומין בסרום שור, 5 μl של חיץ אנזים סאלי (100 mM NaCl, 50 מ&quot;מ טריס-HCl, 10 מ&quot;מ MgCl 2 , 1 מ&quot;מ Dithiothrietol (DTT), pH 7.9 בטמפרטורת חדר), והנפח המתאים של DH 2 O להשיג בנפח כולל של 50 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכל דנ&quot;א לילה בשעה 37 ° C. (חשוב:. בהתאם ליעילות של אנזים ההגבלה, ייתכן שיהיה צורך להוסיף μl 1 נוסף כדי לעכל הלילה ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 1-2 שעות זאת בנוסף לתקציר בלילה.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את DIGEה-DNA STED באמצעות כל שיטה מועדפת (לדוגמא טיהור agarose ג&#39;ל, עמודות ספין) וelute עם 25 μl של חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ולקשור את ה-DNA מתעכל על ידי ערבוב 11 μl של DNA מטוהר עם ריכוז המועדף על ~ 10-20 ng / μl, 1.5 μl של קשירת חוצץ (330 pH מ&quot;מ טריס-אצטט 7.5, 660 אצטט mM אשלגן, מגנזיום 100 אצטט מ&quot;מ, 5 מ&quot;מ DTT), 1.5 μl של 100 מ&quot;מ ATP ואנזים דנ&quot;א μl 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת ל15 דקות בטמפרטורת חדר, ולאחר מכן להשבית את האנזים על ידי דוגרים ל15 דקות ב 70 ° C. (הערה: דוגרים את התערובת בטמפרטורת חדר למשך זמן ארוך יותר עשוי להגדיל את ההצלחה של קשירה). </li></ol> 4. PCR ההפוך (iPCR) ורצף ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע iPCR על מוצר קשירה באמצעות הפעולות הבאות קדימה לאחור פריימרים וthermocycling תנאים: קדימה פריימר (Gm3OUT): GGGCATACGGGAAGAAGTGA -ההפוך פריימר (Gm5OUT): GACTGCCCTGCTGCGTAACA Thermocycler קונדיtions: 1. C ° 94 דקות 1. 2. C ° 94 דקות 1. 3. C ° 58 למשך 2 דקות. 4. C ° 72 למשך 2 דקות. 5. C ° 72 במשך 8 דקות. 6. אחיזת C ° 10. חזור על השלבים 2-4 ל34 מחזורים. (הערה: ניתן לאחסן מוצרי Amplified iPCR ב 4 ° C.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose כדי לאשר הגברה iPCR מוצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע רצף על מוצר iPCR באמצעות פריימרים Gm3OUT וGm5OUT. אתר ההכנסה ואת הכיוון של himar1 ממופים החוצה. </li></ol>

<ol><li>Govan, J. R., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+pathogenesis+in+cystic+fibrosis%3A+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cepacia%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia.</a> Microbiol. Rev. 60, 539-574 (1996).</li>
<li>Chitnis, C. E., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+the+alginate+biosynthetic+gene+cluster+of+Pseudomonas+aeruginosa+shows+evidence+of+an+operonic+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of the alginate biosynthetic gene cluster of Pseudomonas aeruginosa shows evidence of an operonic structure.</a> Mol. Microbiol. 8, 583-593 (1993).</li>
<li>Franklin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+AlgG+is+a+polymer+level+alginate+C5-mannuronan+epimerase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa AlgG is a polymer level alginate C5-mannuronan epimerase.</a> J. Bacteriol. 176, 1821-1830 (1994).</li>
<li>Franklin, M. J., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+analysis+and+cellular+localization+of+the+AlgI%2C+AlgJ%2C+and+AlgF+proteins+required+for+O+acetylation+of+alginate+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Mutant analysis and cellular localization of the AlgI, AlgJ, and AlgF proteins required for O acetylation of alginate in Pseudomonas aeruginosa.</a> J. Bacteriol. 184, 3000-3007 (2002).</li>
<li>Deretic, V., Gill, J. F., Chakrabarty, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+algD+coding+for+GDPmannose+dehydrogenase+is+transcriptionally+activated+in+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Gene algD coding for GDPmannose dehydrogenase is transcriptionally activated in mucoid Pseudomonas aeruginosa.</a> J. Bacteriol. 169, 351-358 (1987).</li>
<li>Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+control+of+the+algT+%28algU%29-encoded+sigma22+for+expression+of+the+alginate+regulon+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+localization+of+its+antagonist+proteins+MucA+and+MucB+%28AlgN%29.%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN).</a> J. Bacteriol. 179, 3711-3720 (1997).</li>
<li>Boucher, J. C., Schurr, M. J., Yu, H., Rowen, D. W., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+in+cystic+fibrosis%3A+role+of+mucC+in+the+regulation+of+alginate+production+and+stress+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis: role of mucC in the regulation of alginate production and stress sensitivity.</a> Microbiology. 143, 3473-3480 (1997).</li>
<li>Martin, D. W., Holloway, B. W., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+locus+determining+the+mucoid+status+of+Pseudomonas+aeruginosa%3A+AlgU+shows+sequence+similarities+with+a+Bacillus+sigma+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a locus determining the mucoid status of Pseudomonas aeruginosa: AlgU shows sequence similarities with a Bacillus sigma factor.</a> J. Bacteriol. 175, 1153-1164 (1993).</li>
<li>Damron, F. H., Goldberg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+regulation+of+alginate+overproduction+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa.</a> Mol. Microbiol. 84 (4), 595-607 (2012).</li>
<li>Browne, P., Barret, M., O'Gara, F., Morrissey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+prediction+of+the+Crc+regulon+identifies+genus-wide+and+species-specific+targets+of+catabolite+repression+control+in+Pseudomonas+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Computational prediction of the Crc regulon identifies genus-wide and species-specific targets of catabolite repression control in Pseudomonas bacteria.</a> BMC Microbiol. 10, 300 (2010).</li>
<li>Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pseudomonas+aeruginosa+sensor+kinase+KinB+negatively+controls+alginate+production+through+AlgW-dependent+MucA+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis.</a> J. Bacteriol. 191, 2285-2295 (2009).</li>
<li>Damron, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Pseudomonas+aeruginosa+regulon+controlled+by+the+sensor+kinase+KinB+and+sigma+factor+RpoN%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Pseudomonas aeruginosa regulon controlled by the sensor kinase KinB and sigma factor RpoN.</a> J. Bacteriol. 194, 1317-1330 (2012).</li>
<li>Qiu, D., Eisinger, V. M., Rowen, D. W., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+proteolysis+controls+mucoid+conversion+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Regulated proteolysis controls mucoid conversion in Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8107-8112 (2007).</li>
<li>Schurr, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Which+bacterial+biofilm+exopolysaccharide+is+preferred%2C+Psl+or+alginate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Which bacterial biofilm exopolysaccharide is preferred, Psl or alginate.</a> J. Bacteriol. 195, 1623-1626 (2013).</li>
<li>Wong, S. M., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+footprinting+with+mariner-based+transposition+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic footprinting with mariner-based transposition in Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10191-10196 (2000).</li>
<li>Lampe, D. J., Akerley, B. J., Rubin, E. J., Mekalanos, J. J., Robertson, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+transposase+mutants+of+the+Himar1+mariner+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hyperactive transposase mutants of the Himar1 mariner transposon.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 11428-11433 (1999).</li>
</ol>

המחבר Hongwei ד יו הוא קצין המדע הראשי ומייסדים של Progenesis טכנולוגיות, LLC.

חשוב לציין כי בשיטה זו ניתן להשתמש במינים Pseudomonas אחרים עם השינויים הבאים: דגירה פ fluorescens ו פ putida ב30 מעלות צלזיוס, ופ stutzeri על 42 מעלות צלזיוס; פ stuzeri צריך להיות מתורבת על צלחות LB בתוספת 150 מיקרוגרם / מ&quot;ל של gentamycin; על צעד 1.11, פ תאי stutzeri צריכים להיות מועברים לתוך 500 μl של LB במקום 1 מיליליטר. בנוסף, יש שני שלבים קריטיים לפרוטוקול זה. ראשית, מתח הנמען צריך להיות מתורבת בטמפרטורה המתא...

היכולת של האופורטוניסטי, הפתוגן גראם השלילי Pseudomonas aeruginosa לoverproduce אלגינט היא גורם מרכזי ביכולתה להקים biofilm. ייצור יתר של אלגינט הוא הפנוטיפ המכונה לעתים קרובות כmucoidy. הבידוד של מושבות רירני מספוטה של אנשים לוקים בסיסטיק פיברוזיס (CF) הוא מעיד על זיהום כרוני, והיא קשור באופן ישיר עם ירידה כללית בבריאותו של החולה 1. נכון לעכשיו, הוא הבין כי הרגולציה וייצור של אלגינט בפ aeruginosa מתרחש בעיקר בשני operons. הראשון הוא אופרון biosynthetic אלגינט, המכיל 12 גנים (algD - alg8 - alg44 - algK - alge - algG - algX - algL - algI - algJ - algF - אצה) שאחראים לסינתזה והיצוא של פולימר אלגינט פני periplasm לenvironme תאיNT 2-5. אופרון השני הוא אשכול גנים החל עם גורם סיגמא האלטרנטיבי algU / T וממשיך בmucA, mucB, וmucD. AlgU / T הוא רגולטור חיובי, בעוד mucAB-D מסווגים כרגולטורים שליליים של ייצור אלגינט 6-8. בנוסף, רגולטורים תעתיק, כגון AlgB, AlgQ, AlgR, וRpoN, כמו גם לאחר תעתיק ושינוי שלאחר translational על ידי שליטת catabolite דיכוי, פעילות קינאז (KinB) וproteolysis intramembrane, יש גם הוכחו להיות מעורבים באלגינט הרגולציה 9-14. וקטור transposon מיני himar1 המכונה pFAC נוצר במקור במעבדה של ד&quot;ר Mekalanos בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד 15. פלסמיד pFAC מורכב מאלמנט transposable המוקף שתי חזרות הפוכות של 27 bps וקלטת gentamycin התנגדות באמצע (aacC1: 534 נ&quot;ב), גן מקודד hyperactive transposase ספן 16, וβ-lactamase גן קידוד (בלה) (איור 1). מידע רצף עבור אלמנט transposable של pFAC זמין במספר הצטרפות GenBank: 13 DQ366300. בpFAC, יש אתר שיבוט מרובה (MCS) מאחורי גן aacC1 המשמש לזיהוי של אתר ההכנסה כרומוזומליות באמצעות PCR ההפוך. אחד יתרונות גדולים בשימוש בtransposon מיני himar1 אין גורמי מארח ספציפיים נדרשים לטרנספוזיציה (mutagenesis). בנוסף, יש שפע גבוה של החדרת אתרי dinucleotide ת&quot;א נמצאים בכל הגנום של פ aeruginosa. לדוגמא, אתרי החדרת dinucleotide ת&quot;א מתרחש 94,404 ו100,229 פעמים בPAO1 (6,264,404 bps, מספר הצטרפות GenBank NC_002516.2) וPA14 (6,537,648 bps; מספר גישת GenBank NC_008463) הגנום, בהתאמה. בגלל השפע של dinucleotide ת&quot;א בגנום, מיני himar1 </em&gt; Transposon יכול לגרום לצפיפות גבוהה וmutagenesis האקראי, שהוא מתאים במיוחד לניתוח של גנים ארסיות והגנים שקבועים בתקנות. באופן תיאורטי, transposon מיני himar1 יכול להכניס לתוך כל גן חיוני בתוך הגנום של פ aeruginosa. זה מספק כ 18 אתרי החדרה ת&quot;א לכל מסגרת קריאה פתוחה בגנום PAO1. כאן אנו מתארים פרוטוקול באמצעות mutagenesis בתיווך transposon מיני himar1 לזהות רגולטורים רומן של mucoidy בפ aeruginosa. באופן ספציפי יותר, אנו biparentally מצומדת וקטור pFAC מכיל transposon מיני himar1 מE. coli SM10/λpir לPAO1 מתח prototrophic nonmucoid. לאחר transposon משולב בגנום, מתח הנמען הוא תרבית על אגר בידוד Pseudomonas טריקלוזן (PIA) המכיל אשר מעכב את הצמיחה של E. coli. לפיכך, ספרייה של מוטציות של <em&gt; פ ניתן לבחור aeruginosa על ידי הגידול בצלחת PIA בתוספת gentamycin ואת הנוכחות של פנוטיפ רירני. שים לב, לעומת מוטציה אינטגרציה בתיווך transposon יהיה אמיתי הפנוטיפ עמיד וcarbenicillin רגיש gentamycin. במחקר זה, כ -80,000 מוטציות החדרת PAO1 היו מבודדות באמצעות ארבעה פעלים נפרדים. אנחנו מכן הוקרנו מבודדים רירני, וקבענו את האתר של הכנסה על ידי עיכול אנזים הגבלה, קשירה והפוכה ה-PCR. ביצענו ניתוח כתם דרום באמצעות קלטת התנגדות gentamycin כמו בדיקה כדי לראות את המספר של החדרה לגנום. אנחנו קבענו כי יותר מ 90% ממוטציות שהושגו לנטיית שימוש בפרוטוקול זה היה עותק אחד בלבד של himar1 בגנום ומוצגים הפנוטיפ עמיד וcarbenicillin רגיש gentamycin. כולל של 32 מבודדים רירני זוהו, 22 שלהם מופו ללוקוסים של פ שונים aeruginosa PAO1כרומוזום. שיעור זה של הכנסה מספק כיסוי הולם לזהות כמה רגולטורים רומן של ייצור יתר אלגינט.

<table><tbody><tr><td>Luria Broth</td><td>Difco</td><td>240230</td><td>באמצעות Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Pseudomonas בידוד אגר</td><td>Difco</td><td>292710</td><td>באמצעות פישר סיינטיפיק</td></tr><tr><td>צלחות קטנות (100 OD x 10 מ"מ)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>צלחות גדולות (150 OD x 15 מ"מ)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-757-14</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>חממת טלטול ספסל</td><td>ניו ברונסוויק סיינטיפיק</td><td>אינובה 4080</td><td>שייק ב-200 סל"ד</td></tr><tr><td>חממת ארון</td><td>VWR</td><td>1540</td><td></td></tr><tr><td>ספסל מיקרוצנטריפוגה</td><td>סורוול</td><td>75-003-287</td><td>באמצעות פישר סיינטיפיק</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus ספקטרופוטומטר</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>או שיטה/ספק מועדף</td></tr><tr><td>לולאות חיסון חד פעמיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-363-597</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>2.0 מ"ל בקבוקונים קריוגניים</td><td>קורנינג</td><td>430659</td><td>באמצעות פישר סיינטיפיק</td></tr><tr><td>15 מ"ל שפופרות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>חלב רזה</td><td>דיפקו</td><td>DF0032-17-3</td><td>באמצעות פישר סיינטיפיק</td></tr><tr><td>DNeasy דם ורקמות (250)&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>או שיטה מועדפת/ספק</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>או שיטה מועדפת/ספק</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>או שיטה מועדפת/ספק</td></tr><tr><td>FastLink II ערכת קשירת DNA</td><td>Epicentre Technologies</td><td>LK6201H</td><td>באמצעות Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Accu block Digital Dry Bath&nbsp;</td><td>Labnet</td><td>NC0205808</td><td>באמצעות Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Sal1, הגבלה אנדונוקלאז</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>R0138L</td><td></td></tr><tr><td>EasyStart Micro 50</td><td>Molecular BioProducts</td><td>6020</td><td>באמצעות Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0267L</td><td></td></tr><tr><td>iCycler, Thermocycler</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8740</td><td></td></tr><tr><td>LE agarose</td><td>Genemate</td><td>3120-500</td><td>באמצעות Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Gentamycin Sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP918-1</td><td></td></tr><tr><td>2.0 מ"ל בקבוקונים קריוגניים</td><td>Corning</td><td>430659</td><td>באמצעות Fisher Scientific</td></tr></tbody></table>

זיהוי גנים הקשורים לרומן אלגינט ייצור ב<em&gt; pseudomonas aeruginosa</em&gt; שימוש מיני<em&gt; himar1</em&gt; mutagenesis תיווך transposon מרינר

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Pseudomonas aeruginosa הוא חיידק גראם שלילי, סביבתי עם יכולות מטבוליות צדדי. פ aeruginosa הוא פתוגן חיידקים אופורטוניסטי הקובע דלקות ריאה כרוניות בחולי סיסטיק פיברוזיס (CF). ייצור יתר של פוליסכריד קופסית נקרא אלגינט, הידוע גם mucoidy, מקדם את הקמתה של biofilms רירני שהם עמידים יותר מאשר תאי פלנקטון לכימותרפיה אנטיביוטיקה והגנה מארחת. בנוסף, ההמרה מnonmucoid לפנוטיפ רירני היא סמן קליני לתחילתה של דלקת כרונית בCF. ייצור יתר אלגינט על ידי פ &#39; aeruginosa הוא תהליך endergonic מיסי אנרגיה בתאים כבד. לכן, ייצור אלגינט מוסדר מאוד בפ aeruginosa. כדי להבין טוב יותר רגולציה אלגינט, אנו מתארים פרוטוקול באמצעות mutagenesis transposon מיני himar1 לזיהוי רגולטור אלגינט רומןים בPAO1 זן אב טיפוס. ההליך מורכב משני שלבים בסיסיים. ראשית, העברנו את transposon מיני himar1 (pFAC) מהמארח א coli SM10/λpir לנמען P. aeruginosa PAO1 באמצעות נטיית biparental ליצור ספריית מוטציה הכנסה בצפיפות גבוהה, אשר נבחרו על צלחות אגר בידוד Pseudomonas בתוספת gentamycin. שנית, אנו הוקרנו ובודדנו את מושבות רירני למפה אתר ההחדרה באמצעות PCR ההפוך באמצעות פריימרים DNA מצביעים החוצה מקלטת gentamycin ורצפי DNA. באמצעות פרוטוקול זה, זיהינו שני רגולטורים רומן אלגינט, mucE (PA4033) וkinB (PA5484), בPAO1 מתח עם mucA פראי מסוג קידוד הגורם אנטי סיגמא MucA לרגולטור אלגינט מאסטר AlgU (AlgT, σ 22) . פרוטוקול mutagenesis תפוקה גבוהה זה יכול להיות שונה לזיהוי גנים הקשורים לאלימות אחרים הגורם לשינוי בקולומורפולוגיה ניו יורק.

כפי שמודגם באיור 1, וקטור transposon ספן מיני himar1, pFAC, מכיל שתי חזרות הפוכות 27 נ&quot;ב עם אתרי החדרת ת&quot;א איגוף קלטת התנגדות gentamycin aacC1, עם האמרגן שלה σ 70 תלוי, ואתר מרובה שיבוט (MCS). בנוסף, וקטור pFAC מכיל גנים המקודדים את transposase הפעיל מאוד himar1, β-lactamase (בלה), ואופרון העברת טרה. אתרי החדרת ת&quot;א לאפשר אינטגרציה יעילה לתוך הגנום של פ זני aeruginosa. דיוק בזי...

כאן אנו מתארים פרוטוקול באמצעות mutagenesis בתיווך transposon ספן מיני himar1 ליצירת ספריית מוטציה הכנסה בצפיפות גבוהה למסך, לבודד ולזהות רגולטורים אלגינט רומן בPAO1 מתח Pseudomonas aeruginosa אב הטיפוס.

זיהוי גנים הקשורים לרומן אלגינט ייצור ב<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; שימוש מיני<em&gt; Himar1</em&gt; Mutagenesis תיווך transposon מרינר

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות גנים חדשים הקשורים לייצור של הפוליסכריד החיצוני אלגינאט (alginate) ב-pseudomonas aerogen באמצעות מוטגנזה מתווכת טרנספוזון מסוג mini hamar one. זאת מושגים תחילה על ידי גידול של שני תרביות נפרדות למשך לילה של זן התורם, e coli Lambda P הנושא את פלסמיד ה-PAC, ותאי המקבל pseudomonas aerogen, PAO one. לאחר מכן, פלסמיד ה-PAC מועבר באמצעות קונז'וגציה על ידי תרבית משותפת של e coli Lambda peer עם pseudomonas aerogen.נבחרים PAO one וקונג'וגטים של טרנספוז על מצע Pseudomonas isolation agar, ולאחר מכן מוביעים קולוניות ומבודדים אותן על צלחות PIA. לבסוף, מזוהים המיקום והאוריינטציה של mini he mar one transposon באתר ההחדרה בתוך הגנום של Pseudomonas aerogen PAO one. בסופו של דבר, השימוש במוטגנזה המתווכת על ידי mini he R one transposon מאפשר לזהות ולאפיין את הגנים הקשורים לייצור אלגינאט ב-Pseudomonas aerogen.שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי המיקרוביולוגיה והגנטיקה של חיידקים, כגון זיהוי לוקוסים גנטיים המעורבים בוויסות של תפקודים תאיים שונים, תוך הדגמה של אופן ביצוע הפרוצדורה. סטודנט לתואר מתקדם מהמעבדה שלי; וקטור ה-P fac המכיל את הטרנספוזון mini he R one כולל רצפים הפוכים של 2 27 זוגות בסיסים עם אתרי הכנסה של TA המקיפים את קסטת העמידות לגנטמיצין A CC one עם הפרומוטור התלוי ב-Sigma 70 שמעלה אתר השבטה מרובה (MCS). וקטור ה-PFAC מכיל גם גנים המקודדים ל-he R one טרנספוזאז בעל פעילות גבוהה, לבטא-לקטאמאז ולמערכת ההעברה TRA.אתרי ההכנסה של ה-TA מאפשרים אינטגרציה יעילה לתוך הגנום של זני pseudomonas aerogen. דיוק בזיהוי ובבחירה של מוטנטים מסוג OID הוא קריטי להצלחה הכוללת בקביעת לוקוסים של גנים המעורבים בבקרת אלגינאט. כדי להכין את זני החיידקים, התחילו בהזרקה של e coli SM 10 Lambda peer P fac לחמישה מיליליטר של lb, בתוספת 15 µg/mL של Gentamycin, והניחו באינקובטור עם ניעור למשך לילה ב-37 °C באותו היום.בצעו אינוקולציה של זן PO one של posa לתוך 5 mL של LB והניחו במנער אינקובטור למשך לילה בטמפרטורה של 42 °C. ביום למחרת, מדדו את ה-OD 600 של תרביות הלילה וערבבו כמויות שוות של PAO one ו-E coli P fac, כך שהנפח הסופי יהיה בין 1 mL ל-1.4 mL. סבבו את התערובת בצנטריפוגה ב-6,000 ×g למשך חמש דקות.בינתיים, ייבשו את פלטות ה-LB לצורך קונג'וגציה על ידי השארתן פתוחות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 עד 15 דקות. הסירו את כל העליון (supernatant) מתערובת התאים, למעט 50 µL. לאחר מכן בצעו רסוספנזיה (Resus).יש להסביב את משקע התאים ב-50 microliters שנותרו של הנוזל העליון ולהעביר בפיפטה לצלחת LB יבשה. יש להניח בזהירות את הצלחת, כאשר התאים נמצאים בטיפה אחת דחוסה, במנדף לצורך ייבוש. אין לאפשר לתאים להתפזר על פני הצלחת.פעולה זו תפחית באופן משמעותי את יעילות הקונזוגציה. ברגע שהטיפה התייבשה, הפוך את צלחת ה-LB והדגר בטמפרטורה של 37 °C למשך ארבע עד שש שעות בזמן שתרבית התאים מדגירה. הכן צלחות pseudomonas isolation agar או PIA עם 300 µg/mL של gentamycin.לאחר הדגירה, השתמשו בלולאת תדלול סטרילית כדי לאסוף את טיפת התאים הבודדת זו לתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה המכילה מיליליטר אחד של lb, ובצעו ערבוב יסודי באמצעות vortex או פיפטה לפני פריסת התאים באופן שווה על פני לוחות PIA גדולים. הדגירו את הלוחות למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C. הוציאו את הלוחות מהאינקובטור ובדקו את נוכחותן של מושבות OID.בודד מושבה אחת של moid ובצע מריחה לבידוד על פלטות קטנות עם PIA ו-300 micrograms per milliliter של Gentamycin. למחרת, בודד מושבה אחת של moid וחזור על פעולת המריחה. חזור על בידוד המושבה הבודדת פעמיים נוספות כדי לקבוע את היציבות של בידוד ה-moid לאחר הבידוד הראשוני.בצעו הזרקה ראשונית של מושבה בודדת של OID לתוך 4.5 מיליליטר של LB והדגירו במנער למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C. למחרת, סמנו שלושה מבחנות מיקרו-צנטריפוגה עבור כל מוטציה של OID. הכינו שתי מנות של 1.25 מיליליטר מהתרבית של הלילה לצורך מיצוי DNA גנומי וזיהוי של אתר ההחדרה של הטרנספוזון.בנוסף, יש לשמר כל מוטנט OID על ידי העברת מיליליטר אחד של תרבית לילה למבחנה לקריו (cryo vial) מסומנת כראוי המכילה נפח שווה של 10%skim milk. יש לאחסן בטמפרטורה של 86- degrees Celsius. לאחר הפקת ה-GDNA מהמוטנט MOID.באמצעות כל שיטה מועדפת ובדיקת ריכוזו, עובו סך של 2 µg בעזרת 1 µL של an restriction Endonuclease S1 בנפח כולל של 50 µL למשך הלילה בטמפרטורה של 37 °C. לאחר טיהור ה-DNA שעובו בכל שיטה מועדפת לנפח כולל של 25 µL, הכינו תגובת ליגציה באמצעות כ-11 µL של DNA והדגירו את התערובת למשך 15 דקות לפחות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בטלו את פעילות האנזים בטמפרטורה של 70 °C למשך 15 דקות, ובצעו IPCR לתוצר הליגציה באמצעות הפריימרים הקדמי וההפוך ותנאי המחזור התרמי הבאים.לאחר מכן, יש לאמת את ההגברה על ג'ל AROS לפני שימוש סופי בפריימרים GM three out ו-GM five out כדי לרצף את התגובה. דוגמאות לאיזולטים של MOID ואיזולטים שאינם MOID מוצגות באיור זה. בהתבסס על הפרוטוקול המוצג בסרטון זה, כל קונג'וגציה אמורה להניב בנק של כ-20,000 מוטנטים על פני 15 עד 20 צלחות גדולות, וזאת בשל ייצור יתר של alginate.מושבת העובש צריכה להיות שקופה או לבנה בצבעה ובעלת מראה קרמי או רירי. אם המוטגנזה וההגברה של ה-DNA הצליחו, אמור להופיע אמפליקון בודד בגודל המתאים, כפי שמוצג באיור זה. ב-PAO one לא קיים אמפליקון של IPCR.עם זאת, אנו מזהים אמפליקון בודד של כ-1,400 base pairs ובערך 1000 base pairs ב-PA, O one VE two, וב-PA O one VE 13 בהתאמה. גודלם של אמפליקונים אלו תואם להחדרה של הטרנספוזון HE R one mariner לאזור הפרומוטור של PA 4 0 3 3 ב-PA oh one VE two, ובאופן פנימי ב-PA 5 4 84 ב-PA oh one VE 13. ניתן להשתמש ב-PA oh one genomic DNA שעבר עיכול רסטריקציה וליגציה כביקורת שלילית.לכן, לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בתוך שלושה או ארבעה ימים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לדגור את זני החיידקים בטמפרטורה המתאימה לפני הקונג'וגציה של ההורים הביולוגיים.

identification-novel-genes-associated-with-alginate-production

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הייצור של ג elegans Transgenes דרך Recombineering עם GalK לבחירה מרקר

בחיפוש יסודי ביולוגיה של התא היא להגדיר את המנגנונים העומדים בבסיס זהותה של האברונים המרכיבים התאים האיקריוטים. כאן אנו מציעים שיטה לזהות את הגנים האחראים על תקינות מורפולוגית ופונקציונלית של אברונים צמחים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואת הדור הבא של כלים רצף.

פלואורסצנטי, מיקרוסקופ הקרנת ואת הדור הבא הרצף: כלים שימושיים לזיהוי גנים המעורבים אברון Integrity

(גני גן או epistasis) מסכים שיטתיים, בקנה מידה גדול סינטטיים גנטיים אינטראקציה יכולים לשמש כדי לחקור יתירות ומסלול-הצטלבות גנטית. כאן, אנו מתארים טכנולוגית תפוקה גבוהה כמותית סינטתית גנטית מערך הקרנה, כינת eSGA שפתחנו להבהרת יחסי epistatic ולחקור רשתות אינטראקציה גנטיות...

מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות מערכים גנטיים סינטטיים

sp Enterobacter. YSU גדל במדיום מלחים מינימאליים של גלוקוז. Auxotrophs מופקים על ידי הפיכתה עם transposome שמכניס את עצמו באופן אקראי לגנום המארח. מוטציות נמצאות על ידי ציפוי העתק מבינוני מורכבת עד בינוני מינימאלי. גנים נקטעו מזוהים על ידי הצלת גן ורצף.

דור של Enterobacter Sp. YSU Auxotrophs שימוש transposon mutagenesis

כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט ומשתנה של מודל העכבר של זיהום כדי להעריך את הנחת של זנים מהונדסים גנטית של הפסאודומונס aeruginosa בהשוואה לארצות הברית מינהל המזון והתרופות (FDA)-מאושר es, האנציכיה ליישומים מסחריים.

הדור של המסגרת של גן In-Frame מוטציות מחיקה ב פסאודומונס aeruginosa ובדיקת התקפה אלימה מודל עכבר פשוט של זיהום

אנו מתארים שיטה ליצירת ספריות מוטציה טרנספוסון רוויבחיידקים גראם שלילי והכנה לאחר מכן של ספריות amplicon DNA להמשך תפוקה גבוהה. כדוגמה, אנו מתמקדים בפתוגן ESKAPE, Acinetobacter baumannii, אבל פרוטוקול זה הוא נוח למגוון רחב של אורגניזמים גראם שלילי.

יצירת ספריות הכנסה Transposon בחיידקים גראם שלילי עבור רצף בתפוקה גבוהה

זוהי שיטה מותאמת לזיהוי גורמי קולוניזציה חרקים מועמדים בסימביונט מועיל Burkholderia. מארח חיפושית נגוע בספריית מוטציות אקראית שנוצרת באמצעות mutagenesis טרנספוסון, ומורכבות הספרייה לאחר קולוניזציה מושוות לשליטה גדל במבחנה.

רצף הכנסה טרנספוסון ככלי להבהב גורמי קולוניזציה חיידקיים בבורקהולדריה גלדיולי סימביונט של לגריה וילוסה בילס

כאן, אנו מתארים את הבנייה של מוטציות ריקות של אירומונס בגליקוזילטרנספראזות ספציפיות או באזורים המכילים גליקוזילטרנספראזות, מבחני תנועתיות וטיהור פלגלה שבוצעו כדי לבסס את המעורבות והתפקוד של האנזימים המקודדים שלהם בביוסינתזה של גליקאן, כמו גם את תפקידו של גליקאן זה בפתוגנזה חיידקית.

יצירת מוטציות ריקות כדי להבהיר את תפקידם של גליקוזילטרנספראזות חיידקיות בתנועתיות חיידקית

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בטרנספורמציה בתיווך גידולים אגרובקטריום (AMT) לשילוב גנים בעלי עניין בגנום הגרעיני של המיקרו-אצות הירוקות Chlorella vulgaris, מה שמוביל לייצור טרנספורמנטים יציבים.

Agrobacterium tumefaciens-מתווך גנטי של מיקרו-אצות ירוקות, Chlorella vulgaris

מחקר זה מתאר מסגרת לפיתוח מודל ביופילם פולימיקרוביאלי מצטבר ואופטימיזציה של פרוטוקול מיצוי RNA כדי להעריך את ביטוי הגן Pseudomonas aeruginosa המשקף את סביבת הריאות של סיסטיק פיברוזיס. היישומים כוללים הערכת השפעות אנטי-מיקרוביאליות וחקר חלופות אנטיביוטיות בתנאים הרלוונטיים לסיסטיק פיברוזיס.

מודל ביופילם מצטבר של סיסטיק פיברוזיס לחקר ביטוי גנים רלוונטי לזיהום

חקור זיהוי גנים הקשורים לייצור אלגינט ב-Pseudomonas aeruginosa באמצעות מוטגנזה מבוססת טרנספוזון mini-himar1. שיטה זו מאפשרת אפיון רגולטורים חדשים ותרומה להבנת מנגנוני בקרת אלגינט.

זיהוי גנים הקשורים לרומן אלגינט ייצור ב

גלה סרטונים נוספים