ספקטרוסקופיה התפלגות מושרה לייזר: גישה חדשה למיפוי של Nanoparticle וכימות ברקמות איברים

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להציע שיטה פשוטה ואמינה למיפוי וכימות של יסודות אורגניים ואנאורגניים ברקמה ביולוגית באמצעות מכשור שולחני התואם באופן מלא למיקרוסקופיה אופטית קונבנציונלית. דבר זה מושג על ידי מיקוד פולס לייזר על הדגימה הרלוונטית כדי ליזום את פירוק החומר והיווצרות ניצוץ. הפלזמה פולטת קרינה אשר מנותחת לאחר מכן באמצעות ספקטרומטר.

השלב השני הוא לבחור ולזהות את קווי הספקטרום המתאימים ליסודות המבוקשים ולסרוק את פני הדגימה. לאחר מכן, בצע מדידות כיול כדי לאפשר קביעה של ריכוזי היסודות. השלב הסופי הוא לבנות את המיפוי היסודי של רקמת הדגימה מכל הספקטרום שהוקלט, תוך שימוש בסולם של עוצמה יחסית או ריכוז.

בסופו של דבר, ספקטרוסקופיה של פריצה מושרית לייזר משמשת להדגמת ההפצה הרקמית של יסודות שונים ללא צורך בסימון. בהשוואה לשיטות קיימות אחרות, כגון מיקרו-פלואורסצנציה של קרני X או טכניקות המבוססות על ספקטרוסקופיית מסות, ספקטרוסקופיה של פריצה מושרית לייזר (LIBS) פשוטה ליישום, פועלת בלחץ אטמוספרי ותואמת את מרבית מערכות המיקרוסקופ האופטי.

בנוסף, היא מאפשרת להגיע לרמת רגישות של PPM עם רזולוציה של מיקרון. שיטה זו עשויה לסייע במתן תשובה לשאלה מרכזית בננוטכנולוגיה המיושמת למחקרים ביולוגיים, כגון התפלגות של ננו-חלקיקים המכילים יסוד מתכתי בתוך דגימת רקמה, ללא צורך בסימון של הננו-חלקיקים. הטכניקה יכולה להתרחב לתחום הפתולוגיה הודות לסף הגילוי הנמוך שלה בזיהוי יסודות מתכתיים חריגים כגון נחושת, ברזל ואלומיניום שעשויים להופיע באיברים שונים בגוף, ובמיוחד במוח. באמצעות שיטה זו ניתן לקבל תובנות לגבי זיהוי ואפיון של ננו-חלקיקים.

ניתן להחיל זאת גם על מערכות אחרות, כגון גילוי של יסודות אנאורגניים ב-TCU או התפלגות אלמנטים הטרוגנית. מדענים שיבצעו ניסויים מעין אלה יצטרכו להתמודד עם הגדרות הרכישה כדי להשיג אות חזק ככל האפשר מבלי לגרום נזק רב מדי לדגימות. התחילו את הניסוי בהכנת שקפיות דגימה לבדיקה עבור פרוטוקול זה.

השג איברים מעכברים בעלי גידולים, שהוזרקו בתמיסת ננו-חלקיקי גדוליניום, לצורך הכנת סליידים. הנח פרוסות של האיברים בעובי 100 µm על גבי סלייד קוורץ או צלחת פטרי. אחסן את הסליידים תמיד בטמפרטורה של 80°C-.

בשלב הבא, הכינו דגימות לכיול. סמנו מספר מבחנות עם הריכוזים, החל מ-0 nanomolar ועד ל-5 millimolar. עבור כל מבחנה, הכינו 100 µL של תמיסת gadolinium במים בריכוז המתאים.

לאחר השלמת שלב זה, הכינו שקופית. מדדו 5 µL מהמבחנה הראשונה וטפטפו אותם על שקופית הקוורץ או על פטרי dish. הקפידו לסמן את הטיפה לשימוש מאוחר יותר.

הזזו שלושה מילימטרים לאורך ההיקף והניחו חמישה מיקרוליטרים של הריכוז הבא על השקף. חזרו על הפעולה עבור כל שאר התמיסות. ייבשו את תכולת השקף במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.

הסדרה זו משתמשת בלייזר נאו-דימיום-YAG (neodymium aluminum garnet) הפועל בפולסים של ננו-שניות ומפיק קרן באורך גל של 1064 ננומטר. השתמש בחלק מהקרן כדי לסנכרן את מערכת הספקטרומטר. כוון את החלק השני דרך מפחית (attenuator) הנשלט באמצעות מחשב, המשמש לכוונון ולייצוב אנרגיית פולס הלייזר לאורך כל הניסוי.

בשלב הבא, כוון את הקרן אל אזור הדגימה שם. מקד את הקרן על במת ההזזה הנשלטת על ידי התוכנה. זו תחזיק את מתקן הדגימה, כאשר מצלמת CCD אחת תנטר את פני השטח של מתקן הדגימה.

אחד נוסף לניטור ענני הפלזמה. נתחו את האור מהפירוק של הדגימה בספקטרומטר מסוג turn turner עם מצלמת ICCD המוחזקת בטמפרטורה של negative 26 degrees Celsius. לצורך המדידה, התחילו בייצוב הלייזר ובקירור המצלמה ל-negative 26 degrees Celsius.

10 דקות לפני הניסוי. כאשר תהיו מוכנים, השתמשו בממתן (attenuator) כדי לנעול את אנרגיית הפולס על 5 mJ. לאחר מכן, הוציאו את שקף הדגימה למחקר והכינו אותו להצבה על במת הדגימה.

הדק את הדגימה על תומך הדגימות הממונע. לאחר מכן, חזור למחשב. כדי למקם את הדגימה, הזז את השולחן כך שחלק מהדגימה יהיה בקרן הלייזר.

כווננו את מוקד הלייזר לכ-100 micrometers מתחת לפני השטח של הדגימה. כאשר פעולה זו הושלמה, הלייזר יוצר מכתשים של 50 micrometers או פחות. השתמשו במחשב כדי להגדיר את ערך חריץ הכניסה של הספקטרומטר ל-40 micrometers ואת פרמטרי ה-ICCD עבור מדידת המיפוי.

כוון את מיקום התפסן כדי למקוד אזור בדגימה. צלם תמונת פנורמה ברזולוציה גבוהה של הדגימה באמצעות מקור אור רחב ספקטרום. לאחר מכן, השתמש בתוכנה ובתמונה שצולמה כדי להגדיר את אזור הסריקה של ה-libs ואת הרזולוציה.

כאן הרשת היא בגודל 100 על 100 עם 100 micrometers בין הנקודות. התחל את הרכישה האוטומטית של הנתונים בכל נקודה על הרשת. ספקטרום נמדד ונשמר בקובץ.

כאשר המדידות מסתיימות תוך כ-30 דקות, צלם תמונה שנייה של פרוסת הדגימה, ולאחר מכן רכז את כל הספקטרומים לקובץ נתונים אחד לשימוש מאוחר יותר. לאחר מכן, הסר את שקופית הדגימה והכן את הדגימות לכיול להרכבה. קבע את שקופית הקוורץ עם דגימות הכיול על במה ההזזה בחזרה במחשב.

מקמו את מרכז דגימת הכיול הראשונה בנתיב הלייזר. שמרו על פרמטרי הניסוי והקליטו ספקטרום. בצעו את אותו התהליך עבור כל אחת מהדגימות בריכוזי הגדוליניום השונים.

אלו הן דוגמאות לספקטרום של מדידה בודדת (single shot) שהוקלטו מאזורים שונים של רקמת כליה. הספקטרום הכחול הוקלט באזור המרכזי של הכליה. הספקטרום האדום תואם לקרום הכליה והספקטרום הירוק מייצג את האזור ההיקפי.

הננו-חלקיקים המוזרקים, המבוססים על גדולניום, מורכבים ממטריצת polys laane עם יון גדולניום הקשור בכילאציה למסביב (ligand) מסוג doca על פני השטח שלהם. בטווח הספקטרלי שבין 286 nanometer ל-320 nanometer ניתן לזהות גדולניום, סידן, ברזל, סיליקון ואלומיניום. שימו לב כי써 העוצמות משתנות באזורים שונים של הדגימה, מה שמעיד על הטרוגניות גבוהה של ריכוזי יסודות אלו; מיפוי של גדולניום, סיליקון וברזל בחתך של כליה של עכבר בוצע באמצעות נתונים מ-libs ברזולוציה של כ-100 micrometers.

עוצמת הסקאלה מבוטאת ביחידות שרירותיות. זוהי תמונה באור טבעי. לצורך השוואה, תוצאות דומות התקבלו מדגימות גידול.

בדומה למפה זו של גדוליניום ורקמת גידול SQ 20 B, סולם צבעים מדמה ה superimposed על תמונת האור הטבעי. בניסוי זה, ננו-חלקיקים הוחדרו ישירות לתוך הגידול. לאחר שעה אחת, הגידול הוסר והוכן לניתוח.

שימו לב כי כמחצית מנפח הגידול מכילה חלקיקים על גבי ה-masters. ניתן לבצע טכניקה זו בפחות משעה עבור דגימות של סנטימטר רבוע אחד ברזולוציה של 100 micrometer, אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע LIBS, חשוב לזכור כי המדידות מתבצעות מתוך פלזמה המושרה בלייזר, וכי זהו דבר מכריע לשלוט בכל הפרמטרים במהלך כל הניסוי בהתאם לפרוטוקול.

ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון אימונוהיסטוכימיה על פרוסות סמוכות, כדי לענות על שאלות נוספות, כמו סוג התא המעורב בתהליך הנחקר לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הננוטכנולוגיה המיושמת בביולוגיה וברפואה לחקור את התפלגותם של תרכובות המכילות יסודות מתכתיים ברקמה ביולוגית. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן השימוש בטכניקות LIBS לצורך מיפוי של מספר יסודות ברקמות ביולוגיות.