שימוש בתג אתר איגוד α-bungarotoxin ללמוד GABA קולטן ממברנה לוקליזציה וסחר

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא למדוד את הלוקליזציה על פני השטח ואת האנדוציטוזיס של קולטני gabaa בנוירונים של ההיפוקמפוס. דבר זה מושג תחילה על ידי טרנספקציה של נוירוני היפוקמפוס עם תת-יחידה מתויגת של קולטן gabaa, ומתן אפשרות לנוירונים בתרבית להתפתח באינקובטור. השלב השני הוא סימון קולטני gabaa על פני השטח באמצעות alpha bungalow toxin המשוייך לצבע פלואורסצנטי מסוג Alexa dye.

בשלב הבא, מדגרירים את הנוירונים לנקודות זמן שונות על מנת לאפשר אנדוציטוזה של הרצפטורים המסומנים. השלב הסופי הוא קיבוע הדגימות בנקודות הזמן המתאימות וביצוע צביעה אימונו-היסטוכימית באמצעות anti GFP כדי לצפות במאגר הרצפטורים המסומנים הכולל. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להראות שינויים בלוקליזציה על פני השטח ובאנדוציטוזה של רצפטורי gabaa המסומנים, תוך שימוש בגישות של דימות תאים מקובעים או תאים חיים.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום של תעתוע רצפטורים (receptor trafficking), כגון מהי ההשפעה של קישור ליגנד על קצבי האנדוציטוזה וההחדרה של הרצפטור, והאם ליגנדים ומודולטורים שונים יכולים להשפיע על מיחזור ופירוק הרצפטור. למרות ששיטה זו שימשה למחקר של תעלות יוניות מקושרות לליגנד ורצפטורים המ sprzęגים ל-G בעיקר בהקשר של מערכת העצבים, ניתן להחילה אותה גם למחקר של הלוקליזציה הדינמית והתעתוע של חלבוני ממברנה אחרים בתרביתי תאים ובתאים ראשוניים מרקמות מגוונות. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקלו בשתי קשיים עיקריים.

ראשית, כדי ליצור קונסטרוקטים פונקציונליים, ושנית, כדי לרכוש את התרגול והניסיון הדרושים לעיבוד של מספר נקודות זמן בו-זמנית. להתחלה, הכינו ארבעה עד חמישה כיסויי זכוכית עגולים מצופים ב-poly de lysine בתוך כל צלחת לתרבית רקמות בנפח 3.5 סנטימטר, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, בצעו טרנספקציה של נוירונים שפורקו זה עתה ביום התרבית, עם 1 עד 4 מיקרוגרם של DNA של קונסטרוקט בשיטת maxi prep.

הנוירונים שעברו טרנספקציה נמצאים על לבישי זכוכית מצופים ב-poly-D-lysine בצפיפות סופית של כ-200,000 נוירונים למנה של 3.5 סנטימטרים. יש להחליף את המצע 4 עד 24 שעות לאחר הכנת תרביות הנוירונים. לאחר מכן, יש לאפשר לנוירונים להתפתח באינקובטור עד ליום ה-14 עד ה-17 in vitro, או עד לשלב הרצוי לביצוע בדיקת האנדוציטוזיס.

ראשית, כוון מכשיר קירור וחימום שולחני ל-16 °C. קרר תמיסת HEPES buffered saline או HBS ל-16 °C באמבט מים. העבר את צלחות הנוירונים לפלטת אלומיניום בטמפרטורה של 16 °C וקרר למשך חמש דקות.

הסר את המצע והחלף אותו ב-1 ml של HBS בטמפרטורה של 16 °C בתוספת 150 µM של two Bo Rine למשך שתי דקות. לאחר מכן, העבר את המצע למכל פסולת מסומן והחלף אותו ב-1 ml של HBS בטמפרטורה של 16 °C בתוספת two bo kerine ו-alpha bungalow toxin Alexa 594, תוך דגירה בטמפרטורה של 16 °C למשך 15 דקות.

לאחר הדגירה, העבירו את המצע למכל פסולת מסומן ושטפו את הצלחות שלוש פעמים עם 2 mL של HBS בטמפרטורה של 16 °C עבור ניסויי סדרות זמן של דימוי חי לאחר אנדוציטוזה של רספטורים, תוך שימוש בצלחת תרבית עם תחתית זכוכית בקוטר 3.5 cm. העבירו את הצלחת לבמה מחוממת במיקרוסקופ והתחילו בדימוי באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי או מיקרוסקופ turf. הגדירו את המערכת עבור כיסויי זכוכית מקובעים.

העבירו את לביבות הזכוכית של נקודת הזמן T=0 לצלחת המכילה 4% para formaldehyde ו-4% sucrose בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות; עבור נקודות זמן אחרות, החליפו את ה-HBS במדיום מאוזן בטמפרטורה של 37 degrees Celsius, והחזירו לאינקובטור לצורך אנדוציטוזה ב-37 degrees Celsius בנקודות הזמן הנדרשות. הוציאו את הצלחות מהאינקובטור ושטפו במהירות פעמיים עם two milliliters של DPBS (delcos phosphate, buffered saline) בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, קבע את הדגימה ב-4% paraform aldehyde ו-4% sucrose למשך 20 דקות. לאחר קיבוע של 20 דקות, העבר את ה-4% paraform aldehyde ו-4% sucrose למכל הפסולת, ושטוף את הצלחות פעמיים עם שני מיליליטר של DPBS בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, דגור את הזכוכיות המכסות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

תמיסת חסימה לאימונופלואורסצנציה המכילה 0.2% Triton X 100 כדי להחדיר את החומר לנוירונים ולאפשר צביעה אימונוהיסטוכימית של anti GFP של מאגר הרצפטורים התוך-תאיים ו/או סימון של חלבונים אחרים בעלי עניין. לאחר מכן, יש להסיר את תמיסת החסימה המאפשרת חדירה ולהדגיר את כיסויי הזכוכית (cover slips) בתמיסת חסימה לאימונופלואורסצנציה ללא Triton X 100 למשך 20 עד 30 דקות. בצע הדגרה של כיסויי הזכוכית עם נוגדן ראשוני בתמיסת חסימה למשך מספר שעות בטמפרטורת החדר או למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס לאחר ההדגרה.

שטפו את זכוכיות הכיסוי על ידי השריה ב-DPBS למשך חמש דקות, בסך הכל שלושה שטיפות. לאחר מכן, דגרו את זכוכיות הכיסוי עם נוגדנים משניים בתמיסת חסימה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. שטפו את זכוכיות הכיסוי שלוש פעמים עם DPBS כפי שבוצע קודם לכן.

בשלב הבא, בצעו את קיבוע כל זכוכית כיסוי על ידי הסרת עודפי נוזל מגבה זכוכית הכיסוי באמצעות נייר ניגוב למעבדה, ולאחר מכן הפכו את זכוכית הכיסוי על ארבעה microliters של תמיסת קיבוע על גבי תבנית זכוכית. בצעו רכישת תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי באופן עיוור לתנאי הניסוי, תוך שימוש בעדשת שיקוע שמן 60 x עם מפתח מספרי (numerical aperture) של 1.49.

באמצעות אותן הגדרות לרכישת תמונות, רכשו תמונות בחתך Z בודד שבהן גוף התא העצבי ומספר שלב dendritic נמצאים במיקוד. כבדו את אות ה-Alexa הפלואורסצנטי וצביעת אימונו-GFP של רעלן alpha bungalow לאורך 20 microns של שלושה עד ארבעה דנדריטים פרוקסימליים לכל נוירון, תוך שימוש באותו סף (threshold) לניתוח של כל נתוני האנדוציטוזה. נתחו נתונים מ-10 עד 12 נוירונים עבור כל נקודת זמן. חזרו על הניסוי עם מספר תרביות נוירונים עצמאיות.

אקסונים GABAergic יוצרים מגעים מעכבים על דנדריטים של נוירונים פירמידיים. טרמינלים מעכבים פרה-סינפטיים מזוהים על ידי ה-vesicular inhibitory amino acid transporter הטוען GABA וגליצין לתוך שלפוחיות סינפטיות. קולטני GABAa ממוקמים בסמיכות לאתרי השחרור של הנוירוטרנסמיטור, כשהם מעוגנים על ידי חלבון הפיגום המעכב הפוסט-סינפטי gephyrin; המוצגות כאן הן נוירונים המבטאים alpha two phg F-P-B-B-S עם קולטני gabaa על פני השטח המסומנים ב-Alexa 594 bungarotoxin, ולאחריהם צביעה אימונו-היסטוכימית של כלל אוכלוסיית הקולטנים עם נוגדן anti-GFP שמוצג בירוק, וכן חלבון הפיגום המעכב הפוסט-סינפטי gephyrin או ה-vesicular inhibitory amino acid transporter.

כאן מוצגת האנדוציטוזה של קולטן GABA A המכיל alpha 2 בנוירונים של ההיפוקמפוס ביום ה-15 in vitro באמצעות רעלן alpha bungalow. מדידות פלואורסצנציה של תהליכים דנדריטיים בודדים, כפי שמוצג בלוחות, נורמלו לרמת ביטוי המבנה באמצעות נוגדני GFP. השוואה סופית של נקודות זמן מבוצעת על ידי נורמליזציה למדידה ב-T equals zero.

כימות של הפנמה של קולטנים לאורך תקופה של 60 דקות, על סמך שינויים באות הפלואורסצנציה לאורך זמן, תואר באופן מיטבי על ידי פונקציה מעריכית בודדת. גישה חלופית היא מעקב אחר אנדוציטוזה של קולטנים בנוירון בודד באמצעות דימות חי בזמן אמת במיקרוסקופיה קונפוקלית. הפלואורסצנציה הנקודתית והחופפת של קולטן GABA A המסומן ב-P-H-G-F-P ושל קולטנים על פני השטח המסומנים ב-alpha bungalow toxin נראית בתחילת הניסוי; במהלך מהלך הזמן, אות קולטן GABA A המסומן ב-alpha bungalow toxin פוחת ככל שהקולטנים עוברים אנדוציטוזה.

בעוד שאות ה-P-H-G-F-P נשאר גבוה בשל השטמעות רצפטורים חדשים, הירידה המינימלית באות ה-P-H-G-F-P נובעת משינויים בהפצת הרצפטורים על פני שטח התא ומדהיית צבע (photobleaching) בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון בדיקות השטמעת רעלן bungalow, כדי לענות על שאלות נוספות כמו שיעורי השטמעת רצפטורים תחת טיפולים שונים. טכניקה זו מאפשרת להעריך כיצד פעילות תאית, דומיינים ספציפיים של חלבונים, אגוניסטים ומודולטורים אחרים יכולים לשנות את מחזור החילופים (turnover) של רצפטורים בנוירונים חיים, בתאים וברקמות אחרות.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו ניתן להשתמש ברעלן alpha bungalow המשויך לצבעי Alexa, בשילוב עם טכניקות אימונופלואורסצנציה סטנדרטיות, כדי לכמת את מיקום הרצפטורים על פני השטח של נוירונים בהיפוקמפוס.