שיטות להקלה על גידול חיידקים בזרמי פסולת של טחנות עיסת ואפיון פוטנציאל הפירוק הביולוגי של חיידקים מתורבתים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לקבוע את יכולתו של מיקרואורגניזם או קונסורציום של מיקרואורגניזמים לנצל את פסולת העיסה Black Liquor לצמיחה, את מרכיבי המשקאות השחורים המשמשים לצמיחה ואת המוצרים המיוצרים על ידי חילוף חומרים מיקרוביאלי של פסולת עיסת זו. זה מושג על ידי איסוף פסולת העיסה ליקר שחור והכנתו לשימוש כמרכיב מדיום תרבותי. כשלב שני מופקים רכיבי ליגנוצלולוזה, המשמשים לקביעת דרישות מקור הפחמן של המיקרואורגניזמים.

המדיה הבאה מוכנה, מחוסנת ומנותחת לגידול חיידקים על מנת לקבוע את יכולתם של המיקרואורגניזמים לגדול על משקאות חריפים ומרכיביו. התוצאות מראות ניצול של משקאות חריפים שחורים כמקור הפחמן היחיד לגידול וסינתזה של מוצרים מטבוליים על ידי הבידוד הסביבתי המיקרוביאלי המבוסס על צמיחתו המומחשת על לוחות אגר מדיה מינימליים, ועל ידי GCMS. הרעיון לשיטה הזו עלה לנו לראשונה כשדנו באפשרות שמיקרובים יוכלו לגדול על תוצרי פסולת של עיסת נייר, ושאולי נוכל לבודד את המיקרובים האלה ישירות מטחנת עיסת.

היתרון העיקרי של טכניקת מיצוי ציגנל צלוז על פני השיטה הקיימת כיום, כמו הלבנת נתרן הידרוקסיד, הוא שהלבנת הנתרן הכלורי מציעה טוהר גבוה ומוגבר. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית. מכיוון ששלבי הכנת דגימת תיאו תאית ו-GCMS קשים ללמידה, וזה נובע ממספר השלבים הנדרשים ובגלל הנחישות החזותית הדרושה כדי לאמת את השלמת התהליך.

שיטה זו לא רק יכולה לספק תובנה לגבי פירוק מיקרוביאלי של משקאות חריפים שחורים, היא גם יכולה להיות מיושמת על זרמי פסולת תעשייתיים המכילים חומרי תאית מגנו כגון שאריות יבולים, שאריות יער ופסולת עירונית מוצקה. כדי להתחיל בהליך זה, אסוף את דגימת המשקאות השחורים משסתום היציאה המחובר למעכל המלאכה ובקבוק זכוכית סטרילי, ואפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר לפני שתמשיך לשלב הבא. לאחר מכן מוסיפים 100 מיליליטר מדגימת המשקאות השחורים לכוס של 500 מיליליטר המצוידת במוט ערבוב ומערבבים את הדגימה במהירות בינונית.

נטרל את המשקאות השחורים על ידי הוספת חומצה זרחתית עד שהוא הופך לצמיג. לאחר ציטוט זה כל תמיסת המשקאות השחורים לצינורות חרוטיים של 50 מיליליטר וצנטריפוגה את הדגימות ב-9, 300 גרם למשך 30 דקות. כדי להפריד את הפחמימות, הניחו חמישה גרם של עשב מתג טחון מילימטר או קטן יותר ומוט ערבוב לבקבוק של 500 מיליליטר.

לאחר מכן מוסיפים 200 מיליליטר מים מזוקקים, 7.5 גרם נתרן כלוריט ו -2.5 מיליליטר חומצה אצטית קרחונית מניחים את הבקבוק באמבט שמן המונח על גבי צלחת ערבוב בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן הוסיפו לבקבוק עוד 7.5 גרם נתרן כלורי ו -2.5 מיליליטר חומצה אצטית קרחונית

המשיכו לערבב בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לאחר שחזרו על השלב הקודם פעמיים. הניחו לתמיסה להתקרר לטמפרטורת החדר. לאחר מכן סנן אותו דרך משפך בוכנר תחת ואקום כדי לבודד את החומר המוצק.

שוטפים את החומר המוצק שלוש פעמים עם 100 מיליליטר מים מזוקקים. לאחר מכן, אספו גרם אחד מהחומר המוצק והניחו אותו על דף נייר פילטר נקי. מניחים את המוצק על 50 מעלות צלזיוס לייבוש למשך הלילה.

לאחר הוצאת הדגימה מהתנור למחרת, העבירו אותה לבקבוקון אחסון שכותרתו תא חלול. הוסף את החומר המוצק הנותר לבקבוק של 500 מיליליטר המכיל 250 מיליליטר של 10% נתרן הידרוקסיד, וכסה את הבקבוק עם הפקק. מניחים את התמיסה באינקובטור בחום של 70 מעלות צלזיוס למשך שעה עם ניעור ב -250 סל"ד.

לאחר מכן, אפשר לתמיסה להתקרר לטמפרטורת החדר לאחר 30 דקות, בודד את החומר המוצק באמצעות סינון ואקום באמצעות משפך בוכנר. לאחר שהשאריות המוצקות יובשו למשך הלילה בתנור של 50 מעלות צלזיוס, הניחו אותן בבקבוקון אחסון עם הכיתוב תאית. העבירו את המסנן לבקבוק של 500 מיליליטר והוסיפו 30 מיליליטר חומצה אצטית ו -250 מיליליטר כובע אלכוהול איזופרופיל והניחו את התמיסה המתקבלת על הספסל למשך שמונה שעות לפחות בטמפרטורת החדר.

בסיום, העבירו את כל התמיסה לצינורות חרוטיים של 50 מיליליטר וצנטריפוגה את הדגימה ב-9, 300 גרם למשך 30 דקות. לאחר הצנטריפוגה, פיפטה בזהירות את התמיסה מהצינורות החרוטיים והשליך. לאחר מכן, שטפו את הכדורים עם 30 מיליליטר מים מזוקקים על ידי מערבולת וצנטריפוגה בטמפרטורה של 9, 300 גרם למשך 30 דקות.

חזור על שלב זה 15 פעמים כדי לשטוף היטב את הגלולה. לאחר הצנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט כדי לבודד את הגלולה לייבוש בהקפאה. לאחר שהדגימה יובשה בהקפאה, הנח אותה בבקבוקון שכותרתו תאית המי.

להפרדת ליגנין, הוסף חמישה גרם של עשב מתג טחון מילימטר אחד או קטן יותר לתמיסה של 500 מיליליטר של נתרן הידרוקסיד מולארי נקודה 25, ואתנול 30%. מניחים את התרחיץ באינקובטור בטמפרטורה של 75 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-250 סל"ד למשך שעתיים. לאחר סינון התמיסה הקרירה מוסיפים מוט ערבוב לבקבוק ומניחים אותו על גבי צלחת ערבוב המותאמת למהירות בינונית.

הוסף חומצה הידרוכלורית מרוכזת בטיפה לתסנין עד לקבלת pH של שניים. הניחו לתמיסה לשבת למשך הלילה בטמפרטורת החדר. לאחר שהתמיסה הועברה לצינורות חרוטיים של 50 מיליליטר, צנטריפוגה את הדגימות ב-9,300 GS למשך 30 דקות.

בסיום, פיפטה בזהירות את התמיסה מהצינור החרוטי והשליך. שוטפים את הגלולה עם 30 מיליליטר מים מזוקקים על ידי מערבולת וצנטריפוגה בטמפרטורה של 9, 300 גרם למשך 30 דקות. חזור על שלב זה 15 פעמים כדי לשטוף היטב את הגלולה.

לאחר הצנטריפוגה, הסר את הנטנט בשכיבה כדי לבודד את הכדור לייבוש בהקפאה. לאחר ייבוש בהקפאה, הניחו את הדגימה בבקבוקון עם הכיתוב ליגנין. הוסף 50 מיליליטר של מדיה מינימלית M 9 סטרילית לבקבוק סטרילי של 125 מיליליטר.

לאחר מכן הוסף 10% בנפח של המשקאות השחורים למדיה. לחיסון יש להוסיף 0.1% בנפח של תרבית חיידקים למשך הלילה לתערובת, לדגור את התרביות ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור עם ניעור ב-200 סל"ד. בשלב אמצע היומן, העבירו חיידקים לבקבוק סרום אנאירובי סטרילי אטום באמצעות מזרק לאחר צנטריפוגה של תרביות חיידקים מחוסנות ומחוסנות של האו"ם.

לאחר 450 שעות של צמיחה, הוסף 10 מיליליטר מכל סופרנטנט למבחנות זכוכית נפרדות. יש להחמיץ כל סופרנטנט עם חומצה הידרוכלורית מרוכזת המוספת טיפתית ל-pH אחד עד שניים. עבור כל דגימה, הוסף 30 מיליליטר אתיל אצטט לסופרה נטנט.

לאחר סגירת המבחנה, ערבבו את התמיסה על ידי היפוך השפופרת ארבע עד שש פעמים. לאחר מכן הניחו גרם אחד עד שניים של נתרן גופרתי נטול מים במבחנה מזכוכית נקייה. אסוף בזהירות את השכבה האורגנית העליונה על ידי פיפטה עם פיפטת מרעה הזכוכית החד פעמית.

הנח את השכבה האורגנית במבחנה המכילה נתרן גופרתי נטול מים. יש להשקות את השכבה האורגנית על נתרן גופרתי נטול מים על ידי הקשה עדינה על המבחנה כדי לערבב בהדרגה. מוסיפים כמויות קטנות של נתרן גופרתי נטול מים ומערבבים עד שאין גושים גדולים.

לאחר מכן, סנן את התמיסה דרך משפך בוכנר בוואקום, ואז העביר את התמיסה לבקבוק מתאדה ואידה את הסינון באמצעות מאייד סיבובי. בסיום, הניחו שלושה מיליגרם משאריות מיצוי אתיל אצטט לתוך בקבוקון כרומטוגרפיה ענבר של שני מיליליטר. ממיסים את השאריות עם 100 מיקרוליטר של אחד ארבעה דיאוקסאן ו -10 מיקרוליטר פירידין.

לאחר מכן הוסף לבקבוקון 50 מיקרוליטר של תמיסה של B-S-T-F-A עם 1% טרימתיל כלור. מניחים את התמיסה בחממה בחום של 60 מעלות צלזיוס עם ניעור למשך 15 דקות. נתח את המדגם לפי GCMS.

האיסוף והשינוי של משקאות חריפים שחורים שנוצרו בתהליך עיסת המלאכה ישתמשו בפסולת עיסת זו כדי לקבוע את יכולת הפירוק הביולוגי של מבודד חיידקים בודד או תרבית מעורבת. מוצג כאן הצמיחה האירובית הנמדדת על ידי צפיפות אופטית של זן סביבתי שתורבת במדיה LB ומדיה LB בתוספת ליקר שחור מנוטרל ב-10%. תוצאות אלה מצביעות על כך שהחיידק הזה גדל בנוכחות משקאות חריפים שחורים.

צמיחת הבידוד הסביבתי במדיה LB מהירה יותר מאשר בגידול בנוכחות משקאות שחורים, אך הצפיפות האופטית מתחילה לרדת לאחר 62 שעות. ואילו הגידול של הבידוד הסביבתי המיקרוביאלי בנוכחות משקאות חריפים שחורים ממשיך לעלות בצפיפות האופטית עד לאחר 230 שעות של צמיחה. עקומת הצמיחה של הבידוד הסביבתי המיקרוביאלי בנוכחות ליקר שחור מתארת גם צמיחה דו-פאזית, מה שמרמז על כך שהמשקאות השחורים מכילים יותר ממקור פחמן אחד שיכול לשמש את הבידוד הסביבתי המיקרוביאלי, וכי יש העדפה לניצול חומרים מזינים המוצג על ידי החיידק.

יש צורך בניסויים נוספים כדי לקבוע את יכולתו להשתמש במשקאות חריפים שחורים לדרישות גידול. ניתן גם לקבוע גידול של חיידק על משקאות שחורים לא מנוטרלים או לקבוע את ההשפעה של ריכוזים מוגברים של משקאות חריפים שחורים על הצמיחה. לאחר הדגמת צמיחה על משקאות חריפים שחורים, ניתן לקבוע ניצול מקור פחמן באמצעות ניסויי גידול מינימליים של מדיה.

מצעים מסחריים המרכיבים את מרכיבי הליגנוצלולוז יכולים לשמש כמקורות פחמן במדיה המינימלית. פרוטוקול מיצוי LIGNOCELLULOSE המוצג כאן מספק מודל לקביעת דרישות הגידול של החיידק בתמונה הנה גידול של הבידוד המיקרוביאלי הסביבתי ב-M 9. אגר מדיה מינימלי בתוספת כל מרכיב של מיצוי הליגנוצלולוזה.

נוכחותן של מושבות על לוחות אגר המדיה המינימלית מצביעה על יכולתו של המבודד הסביבתי לפרק מושבות הולו, תאית, תאית המי וליגנין הקיימות ב-M 9. מדיה מינימלית עשויה להצביע על יכולתו של המבודד הסביבתי לפרק אגר במקום צלחות. עקומות גידול מדיה מינימליות עבור תרביות נוזליות יכולות לשמש גם כדי לקבוע את קצב הגידול הספציפי על כל שבר ליגנוצלולוז, כך שלא יהיה צורך להוסיף אגר, שיכול להיות מקור פחמן פוטנציאלי.

ניתוח העיניים המופקות והנגזרות, תרביות חיידקים על ידי GCMS חושף את התוצרים המטבוליים המיוצרים. מוצג כאן ספקטרום ה-GCMS של נגזרות TMS הקיימות בדגימה הלא מחוסנת, הספקטרום של נגזרות TMS המיוצרות על ידי הבידוד המיקרוביאלי הסביבתי כאשר גדל באופן אנאירובי ו-M 9, מדיה מינימלית עם 10% משקאות שחורים לא מנוטרלים בתמונה כאן. השוואה בין שני הספקטרומים מגלה הבדלים ברכיבים הקיימים במדיה, מה שמרמז על נוכחות של מוצרי תסיסה והשפלה של רכיבי משקאות חריפים שחורים.

שיא עם זמן שמירה של 39.34 דקות הופיע בדגימה המחוסנת. שיא עם זמן שמירה של 21 נקודות 84 דקות עלה בדגימה המחוסנת. שיא עם זמן שמירה של 25.79 ירד בדגימה המחוסנת.

הספקטרום המוצג כאן הוא זה של תקן גואק, ששימש לזיהוי השיא עם זמן שמירה של 25.79 דקות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לקבוע אם מיקרואורגניזם או קונסורציום של מיקרואורגניזמים יכולים להשפיל משקאות חריפים שחורים. יתר על כן, בעקבות פרוטוקול זה, אתה יכול להשתמש בשיטות אחרות כגון עקומות גדילה כדי לענות על שאלות נוספות לגבי קצב הצמיחה של מיקרואורגניזם או מיקרואורגניזמים על ריכוזים שונים של רכיבי ליקר שחור או תמצית תאית ליגון.