Name: הדמיה כחכחה מערכות ביולוגיות שלמות ברמה תאית על ידי 3DISCO (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: למדו את שיטת 3DISCO להדמיית דגימות ביולוגיות שלמות ברמה תאית ללא חיתוך היסטולוגי. טכניקה זו מאפשרת מיפוי חיבורים עצביים במוח ובחוט השדרה לחקר נוירודגנרציה ושלמות עצבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לג Højer לקריאה ביקורתית של כתב היד, ב &#39;ינגול (Genentech) להשתתפות בקריינות תסריט, נ&#39; ביין-Ly על שיתוף החוויה של הדמיה כלי דם משופרת עם הזרקה לוריד זנב של צבע לקטינים, ו-M Solloway (Genentech ) לעכברים משמשים בהדמיה לבלב. שורת ה-GFP-M נוצרה על ידי ג &#39;יי סאנס (אוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס) ועכברי CX3CR1-GFP על ידי ר&#39; ליטמן (NYU). העבודה נתמכת על ידי Genentech, Inc

כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם לתקנות IACUC (הוועדה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש) על עכברים ~ ישנים 3-5 חודשים. המחבר מצהיר שום אינטרסים כלכליים מתחרים. 1. בעלי החיים זלוף והכנת רקמה עיתוי: 30-60 דקות לכל עכבר + לפרסם קיבעון-(כמה שעות עד לילה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את בעלי החיים ולהרדים באמצעות קטמין (80-200 מ&quot;ג / קילוגרם) ו xylazine (7-20 מ&quot;ג / קילוגרם) או Avertin 2.5% (0.5 משקל גוף ml/25 g-IP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן מספר דקות להרדמה ייכנס לתוקף מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצבוט את הבוהן והזנב של בעלי החיים על מנת לוודא כי בעל החיים הוא בהרדמה מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse החיה הראשון ב RT עם 0.1 M פוספט חוצץ (PB) או 0.1 M פוספט הצפת מלוח (PBS) עבור 5-10 דקות עד הדם נמחק לחלוטין מהרקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור זלוף לפתרון מקבע: PFA 4% ב 0.1 M PB (או 0.1 M PBS) ולהמשיך זלוףעם PFA 4% עבור 30-40 דק &#39;במהירות של 3 מיליליטר / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את האיבר / s של עניין בזהירות מבלי לפגוע, למשל, להימנע מניקוב ולסחוט את הרקמות שנמצא בגזורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרקמה נוספת המקיפה את האיברים (רקמת חיבור, קרומי המוח או עניין הדורה) בצלחת פטרי מלאה PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוסט לתקן את האיברים PFA 4% במשך כמה שעות או הלילה ב 4 º C. הימנע הודעה קיבעון ארוך בגלל PFA עלול להרוות את האות או להגדיל את שעות נוספות autofluorecense 10 במיוחד עבור ערוץ ה-GFP (אשר מהווה בעיה פחותה בערוצים אדומים אדומים וכה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את האיברים 2-3x עם PBS ב RT ממש לפני שמתחיל את הליך הסליקה. </li></ol> 2. סליקת רקמות עיתוי: 2-3 שעות לאיברים קטנים ו1-4 ימים לאיברים גדולים. הערות: ניאון התיוג של הרקמות על ידי ביטוי transgene, transfection הנגיפי, התחקות צבע או אנטיתיוג הגוף אמור להסתיים לפני ניקוי. כל צעדי סליקת הרקמה מבוצעים ב RT. פתרונות הסליקה THF, DBE, באב (בנזיל אלכוהול חלק 1 ותכשיר 2 חלק) וdichloromethane הם רעילים ושאיפה יש להימנע (ניסויי התנהגות במנדף מאוורר כראוי) ומגע ישיר עם עור (כפפות nitrile שימוש). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50% (כרך / כרך), 70%, ודילולי THF 80% במים מזוקקים בבקבוקי זכוכית נפרדים כדלקמן: לTHF 50%, למשל, לערבב 25 THF מיליליטר ו25 מיליליטר של מים מזוקקים בבקבוק זכוכית עם נפח של גדול מ50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות על ידי פתרונות רועדים את הבקבוק לדקות 1-2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית בקבוק הזכוכית בצורה ברורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאובטח לסגור את הבקבוקים ולשמור על פתרונות העבודה בארון חשוך. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, אל תשתמשו בפתרוני עבודה באותו זמן רב יותר מאשר 1-2 שבועות. לכן, להורות על פתרונות הסליקה כמו הנפח הקטן ביותר העומד לרשות להיות ריאגנטים המניה טריים שימוש מסוגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">למלא את צלוחיות זכוכית (למשל, מיליליטר 2-3) עם פתרון הסליקה הראשון, 50% THF, ולהעביר את האיברים מPBS לתוך צלוחיות זכוכית להתחיל סליקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאובטח לסגור את צלוחיות זכוכית עם המכסים שלהם ולהשתמש מסובב (למשל, stirrer גלגל) לערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בנייר אלומיניום כדי לכסות ולשמור על צלוחיות זכוכית בחושך. התחל המסובב לעורר דגימות בצלוחיות הזכוכית לזמן המצוין (טבלת 1) במהירות קבועה (~ 30V סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון הסליקה ולהוסיף את הבאה בפרוטוקול כאשר הזמן בטבלה 1 הושלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את פסולת הסליקה לתוך מכולות פסולת זכוכית שנשמרות במכסת מנוע. חזור על שלב קודם עבור כל פתרון סליקה בפרוטוקול ועד הסוף. השתמש פיפטה פסטר חדשה כאשר פתרון סליקה חדש נוסף (למשל, שינוי מTHF לDBE). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הסליקה הסופי עם באב או DBE, ניתן להאריך פעמים הדגירה או shortened עד הדגימות להיות שקופות לחלוטין באור הנראה (או צהבהבים / שקופה אם זה הוא רקמה גדולה מאוד כמו מוח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את האיברים פינו בפתרון הסליקה הסופי בכל העת, כולל צעדי ההדמיה. </li></ol> 3. הכנת איברים הותרו להדמיה עיתוי: 5-15 דקות. הערה: תמונת האיברים פינו בהקדם סליקה מלאה מושגת. לשם כך, בצע את השלבים הבאים כדי להכין את הדגימות במיקרוסקופ אור גיליון (למשל, Ultramicroscopy) או הדמיה מיקרוסקופיה confocal / רב פוטון. הערה: איברים כחכחו יהיו רופפים כוח פלואורסצנטי שלהם לאורך זמן (במיוחד חלבוני ניאון למשל, GFP, תיוג נוגדן הוא עמיד יותר ואולי אפילו לתת תוצאות טובות יותר עם ​​incubations יותר). עבור הדמיה, ניתן להשתמש בם כל עוד טכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטי שונות כמו טיפול נאות של האיברים בקליאהפתרון טבעת מושגת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למיקרוסקופ אור גיליון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום או הר המדגם כראוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את האיבר פונו על ידי סיבוב הבורג של בעל מדגם 4 באופן ידני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים את הדגימה לחדר ההדמיה (רצוי מזכוכית) של מיקרוסקופ thelight גיליון כי הוא מלא באב או DBE, מה שיהיה בשימוש בצעד הסליקה הסופי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למיקרוסקופיה פוטון / confocal הרב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר את המדגם על שקופיות הדמיה (או חדר הדמיה) עם פתרון ההדמיה הסופי כדי להיות מסוגל תמונה עם פוטון רב או confocal, אשר משתמשים בשמן או מטרות מים שקועים בדרך כלל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בדבק דנטלי כדי להפוך את גבול מסביב לרקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את הבריכה עם באב או DBE ממש לפני מלט שיניים מקבל נוקשה באופן מלא. הערה: מלט השיניים מתמצק במהירות; לתרגל כמה פעמים כדי להכיר אותו לפני שאתה מנסה את הדגימות בפועל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד למקוםהמדגם פינה באמצע הבריכה ולכסות אותו עם כיסוי זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על מכסה הזכוכית עד שהוא אטום לחלוטין על ידי מלט שיניים ונוגע על פני השטח של האיבר מסומן, אשר יאפשר להגיע לעומק המרבי הדמיה על ידי מיקרוסקופית רב פוטון / confocal. הערות: הדבר מבטיח כי אין פתרון סליקה יישפך במהלך ההדמיה. הימנע מטבילת עדשת ההדמיה ישירות לתוך פתרון סליקה, אשר יכולה לפגוע בעדשה, אלא אם כן הוא עמיד בפני באב / DBE או שיש כיסוי מגן. </li></ol></li></ol> איברים 4. הדמיה כחכחו עיתוי: 15-45 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף Z-סריקה מכסה את הרקמה כולה פינתה (אם העדשה בשימוש מאפשרת) ברזולוציה הטובה ביותר שיכול לספק המיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרב על האזורים של עניין כדי לאסוף תמונות ברזולוציה גבוהות יותר. </li></ol> 5. בחינה של נתונים עם תוכנת עמירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את תמונת סרייהשל תוכנת עמירה עם מודול ResolveRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את גדלי voxel הנכונים בחלון &quot;תמונה קראו פרמטר&quot; ולחץ על אישור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;Multi פלנר תצוגה&quot; תת היישום. לאחר מכן השתמשתי במחוון &quot;עובי&quot; כדי לבחור את הסף האופטימלי לערכים האפורים, התאמת ערכי 2D and 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיין את המדגם על ידי גלישה בפרוסות באורינטציות 2D שונות ובאמצעות מודול יבול פינה בתצוגת 3D. הערה: ניתן למצוא מדריך לפתרון בעיות מפורט בפרוטוקול באל Ertürk et 4. </li></ol>

<ol><li>Tuchin, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTuchin%2C+V+%22Tissue+optics%3A+light+scattering+methods+and+instruments+for+medical+diagnosis%22">Tissue optics: light scattering methods and instruments for medical diagnosis</a>. , SPIE Press. (2007).</li>
<li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat Methods. 4, 331-336 (2007).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+the+unsectioned+adult+spinal+cord+to+assess+axon+regeneration+and+glial+responses+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury.</a> Nat Med. 18, 166-171 (2012).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Erturk, A., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+of+entire+organs+by+3-dimensional+imaging+of+solvent+cleared+organs+%283DISCO%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO).</a> Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).</li>
<li>Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+fluorescence+intensity+of+selected+leukocyte+surface+markers+following+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A+%3A+the+journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation.</a> Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).</li>
<li>Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ome+sweet+ome%3A+what+can+the+genome+tell+us+about+the+connectome%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Ome sweet ome: what can the genome tell us about the connectome.</a> Curr Opin Neurobiol. 18, 346-353 (2008).</li>
<li>Roh, M. I., Chung, S. H., Stulting, R. D., Kim, W. C., Kim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+peripheral+corneal+clarity+after+surgical+trauma+in+patients+with+Avellino+corneal+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Preserved peripheral corneal clarity after surgical trauma in patients with Avellino corneal dystrophy.</a> Cornea. 25, 497-498 (2006).</li>
<li>Liu, J. K., Chung, C. H., Chang, C. Y., Bond Shieh, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bond+strength+and+debonding+characteristics+of+a+new+ceramic+bracket%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+orthodontics+and+dentofacial+orthopedics+%3A+official+publication+of+the+American+Association+of+Orthodontists%2C+its+constituent+societies%2C+and+the+American+Board+of+Orthodontics%22%5BJournal%5D)">Bond strength and debonding characteristics of a new ceramic bracket.</a> American journal of orthodontics and dentofacial orthopedics : official publication of the American Association of Orthodontists, its constituent societies, and the American Board of Orthodontics. 128, 761-765 (2005).</li>
<li>Perry, V. H., Nicoll, J. A., Holmes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neurology%22%5BJournal%5D)">Microglia in neurodegenerative disease.</a> Nature reviews. Neurology. 6, 193-201 (2010).</li>
<li>Maragakis, N. J., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Disease%3A+astrocytes+in+neurodegenerative+disease.+Nature+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Disease: astrocytes in neurodegenerative disease. Nature clinical practice.</a> Neurology. 2, 679-689 (2006).</li>
<li>Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-reconstruction+of+blood+vessels+by+ultramicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy.</a> Organogenesis. 5, 145-148 (2009).</li>
<li>Spalteholz, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpalteholz%2C+W+%22%C3%9Cber+das+Durchsichtigmachen+von+menschlichen+und+tierischen+Pr%C3%A4paraten%22">Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten</a>. , S. Hirzel. (1903).</li>
<li>Smith, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuroinflammatory+response+in+humans+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+applied+neurobiology%22%5BJournal%5D)">The neuroinflammatory response in humans after traumatic brain injury.</a> Neuropathology and applied neurobiology. 39, 654-666 (2012).</li>
<li>Zotova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+alterations+in+human+Alzheimer%27s+disease+following+Abeta42+immunization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+applied+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Microglial alterations in human Alzheimer's disease following Abeta42 immunization.</a> Neuropathology and applied neurobiology. 37, 513-524 (2011).</li>
<li>Frewin, B., Chung, M., Donnelly, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bilateral+cochlear+implantation+in+Friedreich%27s+ataxia%3A+A+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cochlear+implants+international%22%5BJournal%5D)">Bilateral cochlear implantation in Friedreich's ataxia: A case study.</a> Cochlear implants international. 14, 287-290 (2013).</li>
<li>Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+mapping+of+connections+in+the+intact+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cognitive+sciences%22%5BJournal%5D)">Light microscopy mapping of connections in the intact brain.</a> Trends in cognitive sciences. 17, 596-599 (2013).</li>
<li>Luo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+evaluation+of+retinal+ganglion+cell+axon+regeneration+and+pathfinding+in+whole+mouse+tissue+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional evaluation of retinal ganglion cell axon regeneration and pathfinding in whole mouse tissue after injury.</a> Exp Neurol. 247, 653-662 (2013).</li>
<li>Soderblom, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+fibroblasts+form+the+fibrotic+scar+after+contusive+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Perivascular fibroblasts form the fibrotic scar after contusive spinal cord injury.</a> J Neurosci. 33, 13882-13887 (2013).</li>
<li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat Methods. 6, 131-133 (2009).</li>
</ol>

אין מה לחשוף.

שיטות ניקוי רקמות מטרתם להפחית את הפיזור של ההדמיה אור על ידי מדדי השבירה של שכבות רקמה שונות המתאימות באיברים מסומן. כתוצאה מכך, אור ההדמיה יכול לחדור עמוק לתוך רקמות ולגרות את התאים / מולקולות שכותרתו. הרעיון הישן הזה של רקמת ניקוי 17 זכה לתשומת לב הולך וגדל לאחר היישום הראשון המתוחכם של הטכניקה על מוח עכבר בשלמות על ידי Dodt ועמיתים 2. מאז, יש רשימה הולכת וגדלה במהירות של שיטות סליקה חדשות כולל 3DISCO, SCA / דואר, ClearT2, בהירות וSeeDB 3,4,7,18-20. בעיקרו של הדבר, כל מה שהם שואפים להפוך את האיברים שקופים להדמית רקמות עמוקה על ידי שמירה על תווית הניאון. ביניהם, 3DISCO בולט כאחת השיטות פשוטות ולשעתק ביותר. זה לעומת מהיר יחסית לשיטות אחרות סליקה שהוזכרו לעיל (1-5 ימים לעומת 2-3 שבועות למוחות בוגרים, בהתאמה) 21. זה כבר היה הצלחהמיושם באופן מלא לאיברים שונים כגון המוח, חוט השדרה, בלוטות לימפה, טחול, ריאות, גידולים מוצקים, לבלב, ובלוטות החלב 3,4,9. בנוסף, מספר פרסומים על ידי קבוצות מחקר עצמאיות שכבר השתמשו בשיטה זו כדי להשיג תוצאות ההדמיה 22,23. עם זאת, נהלי סליקת רקמות שונים יכולים להיות יתרון עבור תנאים שונים. לדוגמא, בעוד SCA / דואר וSeeDB חלים הטובים ביותר על רקמות עוברי 6,7, הם שיטות סליקה על בסיס מים, שיכול להיות קל יותר לטפל במהלך הדמיה. לעומת זאת, בהירות היא שיטת סליקה מסובכת ויקרה. אבל זה יכול להיות יתרון בהקשר של תיוג נוגדן, בעיקר ברקמות גדולות כגון מוח 8. השלב הקריטי ביותר כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר מהדמית 3DISCO הוא תיוג רקמות, שנעשה לפני סליקת הרקמות. זה חיוני כדי להתחיל עם אות הניאון החזקה ביותר האפשרית. זה יכול bדואר שהושג בדרכים שונות, כולל ביטוי מהונדס של חלבוני ניאון, התחקות על ידי צבעים סינטטיים, transfection הנגיפי או תיוג נוגדן. יש לזכור כי כל הליך סליקה יפחית את אות הניאון של הרקמות. לפיכך, אם אות הניאון היא לא מספיק חזקה בהתחלה - כלומר הוא לא ניתן לגילוי בקלות לפני הסליקה ההדמיה של הרקמות פינו יספק תוצאות עניות. ישנן מספר מגבלות סליקת שיטות שמחכות לשיפורים. מגבלה קריטית היא שמאז ריאגנטים סליקה לשנות את המבנה של האיברים התפזרו, הם לא יכולים לשמש ברקמה חי. לפיכך, יש לבצע ניסויים כגון עם mEos2 photoactivatable 24 לפני תיקון והסליקה. על הסליקה, הדמיה ברזולוציה סופר של אות הניאון מחלבונים בהירים וphotostable הופכת לאפשרית. בנוסף, בגלל פרוטוקול הסליקה פוחתאינטנסיביות של חלבוני הניאון, לא ניתן לאחסן האיברים פינו לתקופות ממושכות. חשוב לציין כי חלק מהאיברים הם יותר קשים להיות מסומנות. במיוחד, אם האיברים גזורים לשמור על כמויות גבוהות של תאי דם (למשל, טחול, כבד), שהם קשים יחסית כדי לנקות ותמונה. זה גם יחסית קשה יותר להשגת סליקה מלאה לרקמות גדולות, כגון מוח מכרסם מבוגר. רקמות כגון ייתכן שתצטרכנה פעמים דגירה ארוכות יותר, אשר יכולה, מצד שני, להפחית את אות הניאון. בנוסף, פיתוח של שיטות מיקרוסקופית שיכול איברים גדולים ושקופים תמונה בבת אחת ברזולוציה גבוהה הוא צורך מחכה שיפנו אליו. מגבלה נוספת חשובה של הטכניקה היא תיוג רקמות. בעוד אות ניאון חזקה באמצעות ביטוי גנטי או וירוס היא אידיאלית, לא בכל תא או מולקולה יכול להיות מתויג גנטי או באופן ויראלי. מצד השני, תיוג נוגדן של רקמות עבות הוא לא הליך פשוט או אפילו לא פוssible ברוב המקרים. זה אולי צריך פרוטוקולי permeabilization מיוחדים וזמני דגירה ארוכה (מספר ימים עד מספר שבועות) 3. כמו כן, חשוב לזכור כי הרקמות להתכווץ ~ 20% בכל ממד (נמדד לרקמת חוט השדרה) לאחר ניקוי בעיקר עקב התייבשות וdelipidation. הצטמקות זו מתרחשת ratiometrically וצריכה להיות מתוקנת בצעדי כימות. כפי שנצפה בתוצאות שהוצגו, המבנים שכותרתו fluorescently נותרו על כנן, המהווה את אינדיקציה לתקינות חלבון ברקמות מסומנות. בגלל האופי ההידרופובי של הרקמה פינתה הסופית, זה לא יכול להיות מוכתם נוסף עם נוגדנים או מוטבע בפתרונות מים המכילים למשל, Focusclear-המשמש בגליצרול CLARITY-או 80%. לבסוף, זה אתגר לנתח גדלים מכריעות של נתוני הדמיה. לדוגמא, כאשר המוח עכברי כולו נסרק ברזולוציה סלולרית, זה יהיה קשה מאוד להתחקות אחר ולכמת str הרצויuctures (למשל, עצבי או רשתות גליה) ולהשוות על מדגמים שונים באופן אוטומטי. לסיכום, בעוד שחוקרים שואפים לגלות שיטות סליקה חדשות, האתגרים השונים לעיל (קושי בניקוי רקמות מגוונות, הדמיה ברזולוציה גבוהה של אזורים גדולים יותר, וניתוח נתונים מסובך) יש לשפר במקביל. לסיכום, טכניקות ניקוי רקמות שפותחו לאחרונה, כולל 3DISCO, אלגנטיות להוכיח כי 3D הדמיה ברזולוציה גבוהה של איברים שלמים עכשיו זה אפשרי. שימוש בשיטות אלה, מדענים יכולים להשיג מידע האנטומי של תאים ומולקולות באיבר שלם. מחקרי אלה חלוצי 3D הדמיה על איברים שקופים לעורר מספר גדל והולך של חוקרים לפענח אנטומי מורכבות וארגונים מולקולריים של רקמות / איברים בהית ומחלות.

הבדיקה היסטולוגית של רקמות ביולוגיות היא גישה בסיסית בהבנת טבעו של מולקולות / תאים בהקשר הטבעי שלהם. באופן אידיאלי, הדמיה ברזולוציה גבוהה של כל האיבר היא אינפורמטיבי ורצוי ביותר. מכיוון שהאור יש לו עומק חדירה מוגבל, בשל פיזור 1, איברים קבועים צריכים להיות מחולקים על מנת לבצע הדמיה מיקרוסקופית ברזולוציה גבוהה. לפיכך, רוב מחקרי היסטולוגיה מבוצעים על סעיפי רקמות כמה שמייצגים רק חלק קטן מהאיבר. בחלק מהמחקרים, למשל, אלה במטרה לאתר את קשרים עצביים במוח או בחוט השדרה, כל חלקי הרקמות מאברי המטרה נאספים וצלמו לשחזור 3D. עם זאת, יש חתך רקמות וההדמיה הבאה של קטעים בודדים מגבלות שונות. אלה כוללים זמן להיות רב ומובילים לשחזור 3D לא מושלם של הרקמה, עקב עיוותים מכאניות וקשהies ביישור של התמונות שהתקבלו. לאחרונה, איברים שקופים ללא פגע סליקה וההדמיה פותחו כפתרון משמעותי לזה חסרון 2,3. עם הקרחת, כל האיבר הוא שניתנו שקוף המאפשרים את אור ההדמיה לנסוע מקצה לקצה (איור 1) כדי להפיק תמונות ברזולוציה גבוהה של איבר unsectioned באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר כגון מיקרוסקופ או פוטון אור גיליון רב ( איור 2). קבוצות מחקר שונות פיתחו פרוטוקולי סליקת רקמה חדשים כדי להיות מסוגל תמונת רקמת עניין שלהם למטרות שונות. אלה כוללים ממס אורגני 2-5, 6,7 המים ואלקטרופורזה 8 פרוטוקולי סליקה מבוסס. ביניהם, הדמיה 3 ממדים של ממס פינתה איברים או 3DISCO הוא פרוטוקול ישים בקלות על מגוון רחב של דגימות ביולוגיות, כולל מערכת עצבים מרכזית איברים (CNS), איברים חיסוניים וגידולים מוצקים. בadditיון, ניתן לשלב אותו עם שיטות מיקרוסקופיה שונות כגון מיקרוסקופ אור גיליון הקרינה (LSFM), פוטון רב ומיקרוסקופי סריקת לייזר confocal. 3DISCO מבוסס על ניקוי עם חומרים כימיים זמינים ולא יקרים כגון tetrahydrofuran (THF) ואתר dibenzyl (DBE) 4. כל הפרוטוקול יכול לקחת קצר ככל 3-4 שעות. לפיכך, 3DISCO היא טכניקה חזקה ומהירה בהשוואה לשיטות מסורתיות היסטולוגית שעשויים להימשך שבועות עד חודשים כדי להשלים 9.

<table><tbody><tr>עכבר <td></td><td></td><td>Thy-1 GFP (GFP-M)</td><td>ניתן להשיג מג'קסון.</td></tr><tr><td>ניתן להשיג עכבר</td><td></td><td></td> CX3CR1 GFP <td>ממעבדת ליטמן באוניברסיטת ניו יורק.</td></tr><tr><td>ניתן להשיג עכבר</td><td></td><td></td> TgN(hGFAP-ECFP) <td>מג'קסון.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Mallinckrodt</td><td>7917-16</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Mallinckrodt</td><td>7892-04</td><td></td></tr><tr><td>2-2-2 Tribromoethanol</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>2-Methyl-2-butanol</td><td>Sigma</td><td>152463</td><td>בשימוש להכנת תמיסת אברטין.</td></tr><tr><td>מלח</td><td>בראון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טטרהידרופוראן</td><td>סיגמא</td><td>186562-12X100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>דיכלורומתאן</td><td>סיגמא</td><td>270997-12X100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>דיבנזיל אתר</td><td>סיגמא</td>, <td>108014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>בנזיל אלכוהול</td><td>סיגמא</td><td>305197-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>בנזיל בנזואט</td><td>סיגמא</td><td>B6630-250 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>לקטין FITC</td><td>Sigma</td><td>L0401-1MG</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-CC10</td><td>סנטה קרוז</td><td>SC-9772</td><td>0.3888888889</td></tr><tr><td>504001 תרופות</td><td></td><td>Heparin</td> APP <td>משמש בזילוף.</td></tr><tr><td>בקבוקוני זכוכית</td><td>VWR</td><td>548-0554</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>FST</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>מיני מסובב</td><td>VWR</td><td>100498-878</td><td></td></tr><tr><td>רדיד אלומיניום</td><td>פישרברנד</td><td>01-213-104</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקי אחסון מדיה 100 מ"ל</td><td>בקבוקי מדיה קימקס</td><td>EW-34523-00</td><td></td></tr><tr><td>משאבת זלוף אבולוציה מיניפולסית עם ראש משאבת זרימה בינונית MF4*</td><td>Gilson, Inc</td><td>שקופית מיקרוסקופיה F110701 ו-F117606</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>FastWell</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>FW20</td><td></td></tr><tr><td>תלוש כיסוי</td><td>קורנינג</td><td>2940-245</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי זכוכית</td><td>קורנינג פיירקס</td><td>3160-101</td><td></td></tr><tr><td>מלט שיניים</td><td>Lang Dental</td><td>1223PNK</td><td></td></tr><tr><td>בדיקת מי חמצן רצועות</td><td>Sigma</td><td>37206</td><td></td></tr><tr><td>Amira עם RT לפתור מודול מיקרוסקופיה</td> תוכנת <td></td>ניתוח תמונות <td>הדמיה Visage</td> תוכנת <td>ניתוח תמונות</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane הדמיה</td><td>תוכנה</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>freeware</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה כחכחה מערכות ביולוגיות שלמות ברמה תאית על ידי 3disco

Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

ניקוי רקמות והדמיה לאחר מכן של איברים שקופים היא שיטה רבת עוצמה לניתוח תאים ומולקולות עם תווית פלואורסצנטית בתלת מימד, באיברים שלמים. בניגוד לשיטות היסטולוגיות מסורתיות, שבהן הרקמה המעניינת נחתכת להדמיה פלואורסצנטית, הדמיה תלת מימדית של רקמה מנוקה מאפשרת בחינה של תאים ומולקולות מסומנים בדגימה כולה. לשם כך, יש להפוך רקמות אטומות אופטית לשקופות על ידי התאמת המדדים העקשניים בכל הרקמה. לאחר מכן, ניתן לדמות את הרקמה בבת אחת באמצעות מיקרוסקופים סורקי לייזר כדי לקבל תמונה תלת מימדית מלאה ברזולוציה גבוהה של הדגימה. רשימה הולכת וגדלה של פרוטוקולים לניקוי רקמות כולל 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2 ו-SeeDB מספקים דרכים חדשות לחוקרים לדמות את הרקמה המעניינת שלהם בכללותה. ביניהם, 3DISCO היא שיטה הניתנת לשחזור ופשוטה ביותר, שיכולה לנקות סוגים שונים של רקמות וניתן להשתמש בה בטכניקות מיקרוסקופיה שונות. פרוטוקול זה מתאר הליך פשוט זה ומציג את יישומיו השונים. כמו כן, הוא דן במגבלות ובקשיים האפשריים וכיצד להתגבר עליהם.

הנוירונים מקוטבים מאוד תאים עם מורפולוגיה ארוכה מאוד. הפונקציה שלהם תלויה בקשרים שהם יוצרים בין אחד לשני ועם רקמות אחרות. לפיכך, מיפוי המבנה הארגוני של נוירונים הוא מאוד חשוב על מנת להבין איך הם מתפקדים בבריאות ובחוליים. עם זאת, התחקות קשרים עצביים עצומים כאלה ברחבי connectomics כל העצבים בשם מערכת לאחרונה 11 - עדיין נשארת אחד האתגרים הקשים ביותר במדעי המוח. לשם כך, גם באיחוד האירופי 12 ו13 ארה&quot;ב יזמו פרויקטים גדולים למפה המוח האנושי. בעוד 3DISCO יכול להיות מועסק על איברים שונים, זה כבר שימושי במיוחד כדי לעקוב אחר קשרים עצביים ארוכים בחוט השדרה והמוח. לדוגמא, באמצעות סריקות Ultramicroscopy של מגזרי חוט השדרה פינו גדולים, ניתן בעקבות קשרי אקסון מעל סנטימטרים בחוט השדרה של המכרסמים (איור 2). באופן דומה, המוח כולו פינה העכבר (איור 3 א) וההיפוקמפוס (3 ב איור) ניתן הדמיה לעקוב קשרים עצביים במוח. כאשר פוטון מיקרוסקופיה confocal או רב משמשת באיברים מסומן, ההדמיה ברזולוציה ניתן לשפר באופן משמעותי, במיוחד בZ-ממד. לדוגמא, הדמיה פוטון רב של מיתרי השדרה פינו מעכברי ה-GFP-M קו (איור 4 א) משיגה תמונה חלקה לאורך כל העומק (~ 1.5-2 מ&quot;מ) של חוט השדרה. microcopy confocal על חוט השדרה פינה מספק רזולוציה משופרת באופן דומה (4 ב דמויות וג). הדמיה מיקרוסקופית פוטונים רב של מוח פינה מספקת תמונות ברזולוציה גבוהה מאוד כדי להמחיש פרטים קטנים של מבנים עצביים כוללים קוצים הדנדריטים (איור 5). הדגימות ל3DISCO יכולות להיות מתויגות בדרכים שונות, כולל ביטוי transgene, virtransfection אל, התחקות צבע וסימון נוגדן. לדוגמא, ניתן לתייג את כל כלי הדם במוח (6 א דמויות וב) וחוט השדרה (6 ג דמויות וד) באמצעות קליעים נותבים ניאון קטינים מצומדת 4, אשר יכול לשמש כדי לחקור דם למוח, המחסום (BBB ) בבריאות ובחוליים. מיקרוגליה והאסטרוציטים שניהם מעורבים מאוד בפתולוגיה של ניוון מוחיים כולל המחלות אלצהיימר ופציעות טראומטיות 14,15. שימוש 3DISCO, ניתן ללמוד בצפיפות וההפצה בחוט השדרה (איור 7) או במוח שלהם. יכולות גם להיות צילמו רקמות שאינן עצביות. לדוגמא, תאי קלרה הריאות מכרסמים כל ניתן immunolabeled עם נוגדנים וצלמו ללא חתך ברמת תא בודדת (איור 8). באופן דומה, אפשר לנקות ותאי תמונה למשלתאי אלפא ברקמת לבלב unsectioned (איור 9). <img alt="איור 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. סליקת רקמת 3DISCO הופכת רקמות unsectioned שקופות להדמית רקמות עמוקה. (ב) רקמות חוט השדרה בערפול (א) ופינו כפי שניתן לראות באור הנראה. על הסליקה, מיקרוסקופית סריקת לייזר רקמות עמוקות הופך לאפשרי. (ג) רקמות חוט השדרה בערפול ופינו היו הדמיה על ידי מיקרוסקופ 2 פוטונים. סולם ברים ב, b = 0.5 מ&quot;מ ובc = 100 מיקרומטר. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2. ההדמיה 3DISCO של חוט השדרה לעקוב סיומות אקסון. חוט השדרה גזור מן השורה Thy-1 מהונדס GFP עכבר (GFP-M) מחולק לחתיכות קטנות יותר (~4 מ&quot;מ). לאחר ביצוע פרוטוקול סליקה לרקמות קטנות (טבלה 1) מיתרי השדרה השקופים היו דמיינו באמצעות Ultramicroscopy. שחזורי 3D של קטע עמוד השדרה ~ 4 מ&quot;מ אופקי (א), העטרה (ב) והשקפת sagittal (ג). (ד) נציג לייחס אקסונים (אדום) מוצגים בתצוגה שקופה בגווני אפור. (ה) צפה בהגדלה גבוהה של האזור שצוין ב( ד). סולם ברים בA, B, C, D = 0.5 מ&quot;מ ובדואר = 20 מיקרומטר. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3. ההדמיה 3DISCO של מוח וההיפוקמפוס פינה. דוגמאות של מוח והיפוקמפוס של עכברי ה-GFP-M פינה הם צילמו עם אולטרה. פריטים חזותיים 3D של המוח כולו () וההיפוקמפוס (ב) הוכחת netwo העצביRKS ברקמות שקופות הדמיה. סולם ברים ב= 2 מ&quot;מ ובb = 20 מיקרומטר. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4. סליקת רקמות משפרת את הרזולוציה המתקבלת על ידי פוטונים רב ומיקרוסקופיה confocal. מגזרי חוט השדרה שקופים מעכברי ה-GFP-M צילמו ידי פוטונים רב (א) או confocal (ב, ג). שים לב שהניקוי באופן משמעותי משפר את הרזולוציה ועומק הדמיה חושף את המבנה העדין של אקסונים ודנדריטים. סולם ברים ב= 100 מיקרומטר ובb, c = 20 מיקרומטר. <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig5highres.jpg" width="500" /> איור 5. ההדמיה 3DISCO של קוצים הדנדריטים. רקמת מוח שקופה מעכברי ה-GFP-M צילמו ידי פוטונים רב. פריטים חזותיים 3D של אזור קליפת המוח הסרוקים מוצגים בverפרספקטיבות tical (א) ואופקיות (ב). (ג) ~ 50 מיקרומטר הקרנה מהרמות שצוינו ב( a, b). הגדלה (ד) גבוהה באזור מצויינים ב( ג) הממחיש את הפרטים הקטנים של המבנים עצביים כוללים קוצים הדנדריטים (ראשי חץ). סולם ברים ב= 50 מיקרומטר, בb, c = 25 מיקרומטר, בד = 5 מיקרומטר. <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig6highres.jpg" width="500" /> איור 6. 3DISCO של כלי דם. כדי לתייג את כלי דם בכל האיברים, צבע לקטינים-FITC שימש במהלך זלוף (לפני הסליקה) כמתואר 16. ראוי לציין להזכיר כי מצאנו כי הזרקה לוריד זנב של נותב נותנת אות טובה יותר זלוף לב של נותב. לאחר איסוף המוח הקבוע וחוט שדרה, הם פונו ואנימאגד ידי Ultramicroscopy. 3D להדמיה של כלי הדם במוח עכבר כולו בHeatmap (א) ואפורה בקנה מידה (א). (ב) להדמיה 3D של כלי הדם של קטע עכבר חוט השדרה בHeatmap (ג) ואפורה בקנה מידה (ד). Heatmaps נוצרו בהתבסס על עוצמת צביעה לקטינים; כחול: בעצימות נמוכות (ברקע) ואדום: בעוצמה גבוהה (כלי דם). סולם ברים ב= 2 מ&quot;מ, מ&quot;מ b = 1, וג, ד = 250 מיקרומטר. <img alt="איור 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig7highres.jpg" width="500" /> איור 7. 3DISCO של תאי גליה ברקמת מערכת העצבים המרכזית מסומנת. מיתרי השדרה של עכברים הטרנסגניים להביע GFP במיקרוגליה TgH (CX3CR1-EGFP) או האסטרוציטים TGN (hGFAP-ECFP) פונו וצלמו על ידי מיקרוסקופ פוטון רב. 3D טיוח של מיקרוגליה מוצג כהדמית משטח נפח (א) ותצוגה שקופה ( <sטרונג&gt; ב). (ג) היטל אופטי (~ 50 מיקרומטר) מוצג כדי להראות את הפרטים של מיקרוגליה בחוט השדרה. 3D טיוח של האסטרוציטים מוצג כהדמית משטח נפח (א) ותצוגה שקופה (ב). (ו) השלכה אופטית (~ 50 מיקרומטר) מוצגת כדי להראות את הפרטים של האסטרוציטים בחוט השדרה. סולם ברים בA, B, D, E = 100 מיקרומטר ובC, F = 50 מיקרומטר. <img alt="איור 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig8highres.jpg" width="500" /> איור 8. 3DISCO של אונת ריאה כל הר עם מכתים נוגדן של תאי קלרה. למכתים נוגדן כל ההר של אונות ריאה, היו perfused נקבות עכברי BALB / C 10 בן השבוע דרך החדר ממני עם PBS כדי להסיר דם מהריאות. ריאות היו מנופחות לאחר מכן עם PFA 4% וקבועים O / N ב RT במקבע לפחות שלוש פעמים את היקף הדואר רקמות. למחרת, הריאות היו שטופה בקצרה בPBS והאונה הימנית הייתה לשים 5 מיליליטר של 1% טריטון X-100 בPBS עבור permeabilization ל48 שעות או עד שהרקמה צנחה. כל stainings בוצעו ב0.2% טריטון X-100 בPBS המכיל 5% FBS ו BSA 2% ושטיפות היו ב0.2% טריטון X-100 ב-PBS. צביעה עם אנטי CC10 הייתה ל72 שעות ב 4 ° C ואחריו שוטף נרחב למשך כ 6 שעות. ניאון תיוג של הנוגדן הראשוני הושג עם נוגדנים משני נגד עיזים-Alexa פלואוריד-594 לילה ב 4 ° C ואחריו שוטף נרחב עבור שעות 6 עד הלילה. למחרת, פונו אונות מוכתמות דרך 50%, 70%, וTHF 80% ל30 דקות כל אחד ואחריו שלושה שוטף 30 דקות בTHF 100%, ואחריו 20 דקות בDCM, ואחריו 30 דקות בDBE. סולם ברים ובb = 1 מ&quot;מ ובc = 100 מיקרומטר. <img alt="איור 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig9highres.jpg" width="500" /> דמות<html> 9. 3DISCO של לבלב. לאחר טפטוף של עכברים כפי שתואר לעיל בפרוטוקול, הלבלב היה גזור ופינה עם הפרוטוקול הקצר. הקרינה נובעת מרקומבינציה ROSA26 LSL tdTomato הנגרמת על ידי טיפול בטמוקסיפן של עכברים שנשאו transgene BAC 200 kb פורש לוקוס גלוקגון עכבר אנדוגני עם CreERT2 מוכנס לתוך ATG של גלוקגון. ראשי החץ לסמן חלק מתאי אלפא כותרת הניאון באיון. סולם ברים ב= מ&quot;מ, B ו-C 1 ובד = 500 מיקרומטר. <img alt="טבלת 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg" width="600" /> טבלת 1. פרוטוקולי סליקת רקמות לרקמות שונות. דוגמאות לפרוטוקולי סליקת רקמה לרקמות שונות. שים לב כי זמן הסליקה לכל שלב ניתן לקצר או להאריך לפי צורך כדי לשפר את ביצועי הסליקה. המשקל המשוער של רקמות קטנות הוא ~ 20-100 מ&quot;ג והמוח הוא ~ 300-500 מ&quot;ג.ttps :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של השולחן הזה.

כדי לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה של תאים המסומנים בפלורסנט בתוך רקמות גדולות, באופן אידיאלי, יש לדמות את הדגימות הביולוגיות ללא חתך. 3DISCO הוא הליך ניקוי רקמות פשוט המבוסס על דגירה רציפה עם ממיסים אורגניים. עם הניקוי, האיברים הופכים שקופים ומאפשרים סריקת לייזר מקצה לקצה של הדגימה.

הדמיה כחכחה מערכות ביולוגיות שלמות ברמה תאית על ידי 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לדמות דגימות ביולוגיות שלמות המסומנות פלואורסצנטית ללא חיתוך היסטולוגי. דבר זה מושג על ידי דגירה רצופית של רקמות מקובעות בממסים אורגניים עד להשגת שקיפות מלאה. כשלב שני.הרקמות השקופות מדומות בתלת-ממד באמצעות מיקרוסקופ סריקה לייזר. לאחר מכן, תוצאות הדימות מנותחות וניתן לשחזר בתלת-ממד את המבנים העצביים בעמוד השדרה ובמוח שאינם פרוסים, וזאת מתוך תמונות ה-three disco שנאספו. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום מדעי העצבים בנוגע לאופן מיפוי הקשרים העצביים ו-GAL במוח ובשדרה כולם.ההשלכות של טכניקה זו חוללות את הטיפול בניוון עצבי, שכן כעת ניתן להדמות את השלמות העצבית לאורך כל מערכת העצבים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הארגון של מערכת העצבים, ניתן להחיל אותה גם על איברים אחרים, כגון הריאה או רקמת גידול. לאחר שליטה בטכניקה, היא נמשכת רק מספר שעות עבור איברים קטנים כמו חוט השדרה או הריאה, וכיום או יומיים עבור המוח. התחילו את ההליך על ידי הוספה של שני עד שלושה מיליליטרים של 50%THF שהוכן טרי למבחנה אחת עבור כל רקמה שנספה.לאחר מכן, העבירו את האיברים המקובעים לתוך תמיסת השקיפות וסגרו את המבחנות היטב. הניחו את המבחנות על רוטטור וכסו אותן בנייר אלומיניום, תוך ערבוב הדגימות למשך הזמן המתאים במהירות קבועה של 30 RPM. לאחר מכן, הסירו את תמיסת השקיפות והשתמשו ב-PE חדש או בפיפטה כדי להשעות את הרקמה בתמיסה הבאה.כפי שצוין בטבלה במהלך שלב השקיפות הסופי, השאירו את הדגימות בתמיסה עד שיהיו שקופות לחלוטין עבור מיקרוסקופיה קונפוקלית או מולטי-פוטון. ברגע שהושגה שקיפות מלאה, הרכיבו את הדגימה על שקף דימות למטרה זו. השתמשו בסמנט דנטלי ליצירת מסגרת מסביב לרקמה.מלא את הבריכה בתמיסת ההבהרה הסופית רגע לפני שהצמנט הדנטלי הופך לקשיח לחלוטין, ולאחר מכן מקם מיד את הדגימה המבהירה במרכז הבריכה וכסה אותה בזכוכית כיסוי. לחץ על זכוכית הכיסוי עד שהיא נחתמת לחלוטין על ידי הצמנט הדנטלי ונוגעת לפני השטח של האיבר המובהר לצורך מיקרוסקופיית גיליש אור (light sheet microscopy) ברגע שהושגה הבהרה מלאה, ולאחר מכן סובב ידנית את הבורג של מחזיק הדגימה כדי לקבע את הדגימה. לאחר מכן, טבול את הדגימה לתא ההדמיה של מיקרוסקופ גיליש האור המלא בתמיסת ההבהרה הסופית המתאימה לרקמה המדומית.לאחר מכן, בצעו סריקות Z המכסות את כל הרקמות שעברו הבהרה ברזולוציה הטובה ביותר שהמיקרוסקופ יכול לספק, תוך התמקדות באזורים של עניין כדי לאסוף תמונות ברזולוציה גבוהה יותר. לאחר איסוף התמונות, טענו את סדרת התמונות לתוכנת Amira באמצעות מודול resolve RT. לאחר טעינת הסדרה, הזינו את גדלי הווקסלים הנכונים בחלון פרמטרי קריאת התמונה ולחצו על אישור.בשלב הבא, בחרו באפליקציית המשנה של התצוגה המולטי-פלנרית (multiplanar view). לאחר מכן, השתמשו במכווני ההדלקה (sliders) של ה-primary וה-thickness כדי לבחור את עובי ההקרנה ואת סף ערכי האפור האופטימליים. לבסוף, השתמשו במודול חיתוך הפינה (crop corner) כדי לסקור את הפרוסות באוריינטציות תלת-ממדיות שונות.על מנת להדגים את הדגימות, מיפוי הארגון המבני של נוירונים הוא בעל חשיבות מכרעת להבנת אופן תפקודם במצב בריא ובמצב מחלה. בעוד שניתן להשתמש בשלושה דיסקו באיברים שונים, הוא שימושי במיוחד למעקב אחר קשרים נוירונליים ארוכים בחוט השדרה ובמוח. לדוגמה, באמצעות סריקות מיקרוסקופיה אולטרה של מקטעי חוט שדרה גדולים שעברו שקיפות, ניתן לעקוב אחר קשרים אקסונליים לאורך סנטימטרים בחוט השדרה של מכרסמים, כפי שמוצג בתמונות אלו.באופן דומה, ניתן לדגם את המוח וההיפוקמפוס של עכבר שעברו הבהרה כדי לעקוב אחר קשרים עצביים במוח. כאשר נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית או רב-פוטונית, ניתן לשפר משמעותית את רזולוציית הדמיון, במיוחד בממד ה-Z. לדוגמה, הדמיה רב-פוטונית של שריכים ספונדילאליים שעברו הבהרה מעכברי קו GFPM מאפשרת לקבל תמונה רציפה לאורך כל עומק השריכים הספונדילאליים, שנע בין 1.5 ל-2 מילימטרים.מיקרוסקופיה קונפוקלית של חוט השדרה שעבר הבהרה מספקת רזולוציה משופרת באופן דומה. דימות במיקרוסקופיה רב-פוטונית של מוחות שעברו הבהרה מספקת תמונות ברזולוציה גבוהה מאוד להדמיית פרטים עדינים של מבנים נוירונליים, כולל קוצים דנדריטיים. ניתן לסמן את הדגימות עבור three disco בדרכים שונות.לדוגמה, ניתן לסמן את כל מערכת כלי הדם של המוח וחוט השדרה באמצעות מעקבים פלואורסצנטיים המשוררים ללקטין, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לחקור את מחסום הדם-מוח במצב בריאותי ובמצב מחלה. באמצעות שימוש בשלוש שיטות של disco, ניתן לדגמי גם תאים קטנים ברקמות גדולות. לדוגמה, הן מיקרוגליה והן אסטרוציטים מעורבים במידה רבה בפתולוגיה של ניוון עצבי, כולל מחלת אלצהיימר ופגיעות טראומטיות.באמצעות שימוש בשלוש דיסקאות, ניתן לבחון את הצפיפות והפיזור שלהן בחוט השדרה. ניתן לדמה גם רקמות שאינן עצביות. לדוגמה, ניתן לסמן באופן אימונו-כימי תאי Clara בכל ריאותי המכרסם באמצעות נוגדנים ולדמותם ברמת התא הבודד ללא צורך בחיתוך.באופן דומה, ניתן לבצע שקיפות והדמיה של תאים ברקמת לבלב שאינה מאושרת. לדוגמה, בתמונות לבלב אלו מודמייים תאי אלפא המסומנים פלואורסצנטית לאחר ביצוע השקיפות. הדגמה חזותית של שיטה זו היא חשובה, כיוון שבעוד ששלבי השקיפות וההדמיה הם פשוטים, ניתוח הנתונים עשוי להיות מורכב.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לצלם רקמות שקופות מיד עם השגת שקיפות מלאה, כיוון שהאות הפלואורסצנטי ידעך עם הזמן בתמיסת ההבהרה. פיתוח טכניקה זו סלל את הדרך עבור חוקרים לבחון פרטים ואיברים שלמים, כגון מיפוי רשתות עצביות במוח. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן ההבהרה והדימוג של מבנים תאיים ותת-תאיים באיברים שלמים, ולאחר מכן לגבי הוויזואליזציה והניתוח שלהם.

imaging-cleared-intact-biological-systems-at-cellular-level

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מציגים שיטה היסטולוגית ללכיד, סימון, ניקוי אופטי, והדמית ממשק רקמת המוח השלם סביב microdevices המושתל כרוני ברקמת מוח מכרסם. תוצאות מהטכניקות הכוללות בשיטה זו הן שימושיות להבנת ההשפעה של-שתלים במוח חודרניים שונים ברקמות המקיפות אותם.

אפיון היסטולוגית שלם של Microdevices מוח מושתלים-ורקמה סובבת

טכניקות ניקוי אופטי מחוללות מהפכה באופן שבו רקמות נראות. בדוח זה אנו מתארים שינויים בפרוטוקול המקורי של Clear Lipid-Hybridized Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) שמניב תוצאות עקביות יותר ופחות יקרות.

סליקה אופטית של מערכת העצבים המרכזית עכבר שימוש CLARITY הפסיבי

בשל התכנים שומנים גבוהה בדם, מאתגרת רקמת שומן להמחיש היסטולוגית בשיטות מסורתיות. Adipo-ברור הוא רקמה פינוי טכניקה המאפשרת תיוג חזקים, דימות ברזולוציה של פלורסנט הנפחי של רקמת שומן. כאן, אנו מתארים את שיטות הכנת הדוגמא, רעלני, מכתים, ניקוי של הרכבה עבור הדמיה.

Adipo-ברור: רקמה ניקוי שיטה עבור הדמיה תלת-ממדית של רקמת שומן

רומן, חיסוני התאמה לניקוי רקמות הרקמה כמו הדמיה 3D האולטימטיבי של איברים הממס נקי לאפשר הדמיה 3D של זיהום המוח וירוס כלבת הסביבה הסלולרית המורכבת שלה. עבה, נוגדן מתויג פרוסות רקמת המוח נעשים שקופים להגדיל את עומק ההדמיה כדי לאפשר ניתוח תלת-ממד על ידי המיקרוסקופיה סריקת לייזר מיקרוסקופ.

ברזולוציה גבוהה 3D הדמיה של זיהום וירוס כלבת ברקמת המוח נקי ממס

התפשטות הקרדיוציט לאחר הפציעה היא תהליך דינאמי הדורש סימפוניה של רמזים בלתי-מיכיים מאוכלוסיות תאים שאינן מיוציט. ניצול מעקב אחר השושלת, בהירות פסיבית, ושלושה מימדים שלמים של מיקרוסקופ ההרכבה טכניקות, אנחנו יכולים לנתח את ההשפעה של מגוון סוגי תאים על תיקון לב והתחדשות.

לכידת תגובת פגיעה לב של אוכלוסיות תאים ממוקדות באמצעות לב נקי תלת מימדי הדמיה

את כל המבנה תלת-ממדי ואת התוכן התאי של אורגנואידים, כמו גם את הדמיון הפנוטיפיק שלהם לרקמות המקוריות ניתן ללכד באמצעות פרוטוקול הדמיה תלת-ממדי ברזולוציה של תא יחיד המתואר כאן. פרוטוקול זה ניתן להחיל על מגוון רחב של אורגנואידים המשתנים במקור, גודל וצורה.

הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה חד-תאית של אורגנואידים שלמים

פרוטוקול זה מתאר שיטות לביצוע הדמיית תהודה מגנטית, ניקוי ותיוג חיסוני של מוחות עכברים שלמים באמצעות iDISCO+, ולאחר מכן תיאור מפורט של הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה של יריעות אור, וניתוחים במורד הזרם באמצעות NuMorph.

הדמיה וניתוח של כל המוח החד-תאי של מוחות עכברים שלמים של ילודים באמצעות MRI, ניקוי רקמות ומיקרוסקופיה של יריעות אור

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים אופטימליים לניקוי רקמות כדי לדמות את אבי העורקים העכברי בתלת מימד (3D). אנו מתארים נהלים חדישים לצביעה חיסונית, ניקוי אופטי והדמיה מתוך כוונה להגדיר את הקרבה האנטומית של מערכת העצבים ההיקפית עם פלאק טרשת עורקים והאדוונטיטיה בטרשת עורקים.

הדמיה תלת מימדית של רקמות אבי העורקים בטרשת עורקים

פרוטוקול זה מציג שיטה מהירה להדמיית כלי דם תלת מימדית כמותית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור. יעילות השיטה מודגמת באמצעות מערכת עורקי קשת הלוע של מודל עובר האפרוח, עם כוחות המודינמיים המכומתים באמצעות דינמיקת נוזלים חישובית.

הדמיה מהירה ברזולוציה גבוהה של כלי דם של בעלי חיים קטנים למחקרים כמותיים

טכניקות ניקוי אופטי, כגון תמיסות ספיגת מולקולות, מפחיתות את פיזור האור באופן זמני כדי לשפר את ההדמיה הביולוגית ומציעות אסטרטגיות הדמיה in vivo תואמות ביולוגית והפיכות לאיברים משובצים עמוק. פרוטוקול זה מציג נהלי ניסוי מפורטים כמו גם עיבוד תמונה מתקדם להשגת הדמיה דינמית באיכות גבוהה לדינמיקה בזמן אמת בבעלי חיים חיים.

סליקה אופטית חולפת באמצעות מולקולות סופגות להדמיית ex vivo ו-in vivo

למדו את שיטת 3DISCO להדמיית דגימות ביולוגיות שלמות ברמה תאית ללא חיתוך היסטולוגי. טכניקה זו מאפשרת מיפוי חיבורים עצביים במוח ובחוט השדרה לחקר נוירודגנרציה ושלמות עצבית.

הדמיה כחכחה מערכות ביולוגיות שלמות ברמה תאית על ידי 3DISCO

גלה סרטונים נוספים