Interferometry Bio-שכבה למדידת קינטיקה של חלבונים אינטראקציות והשפעות יגנד allosteric
18 בפברואר 2014
הפרוטוקולים כאן לתאר מבחני הקינטית של חלבונים אינטראקציות עם Interferometry Bio-השכבה. ה-ATP synthase F-הסוג, שהוא מעורב בחילוף חומרים של אנרגיה בתאים, יכול להיות מעוכב על ידי מקטע ε בחיידקים. יש לנו להתאים Interferometry Bio-שכבה כדי לחקור אינטראקציות של קומפלקס קטליטי עם התחום בטרמינל C-המעכב של ε.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא למדוד קינטיקה של חלבון, אינטראקציות בין חלבונים והשפעות אלוסטריות של ליגנדים קטנים על אינטראקציות אלו באמצעות אינטרפרומטריית שכבת ביולוגית, BLI. דבר זה מושג על ידי הכנת אחד החלבונים עם ביוטין ספציפי וקיבועה במקביל על פני שטח של חיישנים ביולוגיים מצופים בסטרפטאווידין.
כשלב שני, החלבון הקשור לחיישן נחשף לתמיסת באפר המכילה את השותף לקשירה שלו, והקשירה נמדדת בזמן אמת על ידי השפעתה על ההתאבכות האופטית על פני השטח של החיישן. לאחר מכן, כל חיישן מועבר לתמיסת באפר ללא השותף לקשירה כדי למדוד את הדיסוציאציה של החלבון בזמן אמת. קומפלקסים של חלבונים.
התוצאות שהתקבלו מאפשרות קביעה של קבועי הקצב הקינטיים של הקישור והדיסוציאציה של החלבונים המתרחפים, ובכך את זיקת הקישור שלהם. תוצאות נוספות מראות כי BLI יכולה לזהות את השפעתם של ליגנדים קטנים על קצב הדיסוציאציה של קומפלקס החלבון-חלבון. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון תהודה פלזמונית עיטפתית (surface plasma resonance), הוא ש-BLI אינה רגישה יתר על המידה לשינויים במקדם השבירה.
לפיכך, שלבי הקישור והאסוציאציה יכולים לכלול שינויים בליגנדים קטנים כדי לבחון את השפעתם על אינטראקציות בין חלבונים בזמן אמת. עם זאת, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי קינטיקה של אינטראקציה בין חלבונים. ניתן ליישם אותה גם על שילובים שונים, כגון קישור של חלבון ל-DNA או RNA מקובעים, או קישור של ליפוזום לחלבון מקובע. התחילו את הניסוי על ידי הגדרת מכשיר ה-BLI כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.
לאחר מכן, הגדירו את תכנון הניסוי בתוכנה לרכישת נתונים. בחרו ב-new kinetics experiment בלשונית אשף הניסויים (experiment wizard). פעולה זו תציג תפריט עם לשוניות הכולל את כל השלבים שיש להגדיר בלשונית הראשונה.
הגדירו את העמודות שבהן תשתמשו. בלוחית הדגימות בעלת 96 הבארות, הקצו עמודות עבור הבאפר, החלבון שיוטמע (immobilized) או השותף לקשירה (binding partner).
עבור כל אסוציאציה, נזין את ריכוז שותף הקישור שבו נשתמש. בלשונית השנייה, נגדיר את כל השלבים הדרושים למסיי. אלו כוללים טעינת קו בסיס, אסוציאציה ודיסוציאציה של שותף הקישור.
שלבי בדיקה בודדים מקושרים לעמודות של בארות בפלטת הדגימות על ידי בחירת שלב הבדיקה ולחיצה כפולה על העמודה המתאימה. פעולה זו מתכנתת את החיישנים לעבור מעמודה אחת של בארות לבאה אחריה. במהלך הבדיקה, התחילו בשלב Baseline קצר המקושר לעמודת הבארות הראשונה עם באפר בדיקה (assay buffer) כדי לקבוע אותות BLI ראשוניים בפלטת 96 הבארות.
לאחר מכן, קשרו את שלב הטעינה לבארים שיכילו את החלבון הביוטינילי. השתמשו בפונקציית הסף (threshold) כדי להשיג רמה קבועה מראש של קישור. הגדירו את אפשרות הסף כך שכל החיישנים יועברו לעמודת הבארים הבאה.
כאשר אחד מהחיישנים מגיע לסף, יש להוסיף שלב בסיס (baseline) נוסף בבופר כדי לשטוף חלבונים ביוטיניליים שאינם מקובעים מהחיישנים ולהגדיר אותות בסיס יציבים חדשים. עבור בדיקות בסיסיות לקביעת קבועי קצב קישור ודיסוציאציה גלובליים, יש להוסיף שלב בסיס נוסף עם חיישנים בעמודה חדשה של בארי בופר לפני שלב הקישור (association). בשלב הבא, יש לקשר את שלב הקישור לעמודת הבארים המכילה ריכוזים משתנים של השותף לקשירה.
כווננו את זמן השלב כך שריכוז רווי לפחות של השותף לקשירה יגיע לאות קשירה בשיווי משקל. עבור שלב הדיסוציאציה, הגדירו את החיישנים לחזור לעמודה ארבע, אותן בארות חוצץ ששימשו לקו הבסיס הנוסף לפני האסוציאציה. ניתן להתאים את הזמנים לשלבי האסוציאציה והדיסוציאציה במהלך הניסוי אם הקצבים איטיים או מהירים מהצפוי.
בלשונית שלוש, ציינו את המיקומים במגש החיישנים שיכילו חיישנים שהורטבו מראש עבור הבדיקה. לשונית ארבע מאפשרת סקירה גרפית של התוכנית. בלשונית חמש, הזינו את הפרטים הדרושים, כולל מיקום קבצי הנתונים והטמפרטורה הרצויה.
עבור הניסוי, יש להרטיב מראש את החיישנים המצופים בסטריפטאווידין למשך 10 דקות לפחות. כדי להסיר את ציפוי הסוכרוז המגן, הוצא את המתקן המכיל את החיישנים מתוך מגש החיישנים והכנס פלטת 96 בארות לתחתית המגש, תוך החלקת פינה אחת של הפלטה לתוך חריץ ההכוונה שבמגש.
עבור עמודת החיישנים שבה נעשה שימוש, הוסף 200 µL של באפר תגובה (assay buffer) לכל באר. באותה עמודה בלוחית ה-96 בארות, החזר את מתקן החיישנים למגש בכיוון הנכון כפי שהוקצה במהלך התכנות. מלא את בארות לוחית הדגימות בבאפר תגובה או בדילולים המתאימים של החלבון. הימנע מהכנסת בועות, שכן הן עלולות לגרום לרעש באות האופטי.
כלול באר ייחוס אחת או יותר שבהן הושמט החלבון הביוטינילי או השותף לקשירה. פתח את דלת המכשיר ושים לב לפלט האור מזרוע החיישן. הכנס את מגש החיישן אל הבמה כאשר לשוניות המגש מוכנסות לחריצי הבמה.
הכנס את פלטת הדגימות למחזיק הפלטות. ודא שהפלטה מונחת בצורה שטוחה ובכיוון הנכון כפי שצוין על מחזיק הפלטות. סגור את הדלת והפעל את הבדיקה מתוכנת רכישת הנתונים.
אם החיישנים עדיין דורשים הרטבה מוקדמת, בחרו באפשרות לעכב את תחילת הניסוי. לבסוף, לאחר שכל הכנת הדגימות הושלמה וגם פלטת הדגימות וגם מגש החיישנים הוכנסו למכשיר, לחצו על כפתור ה-go כדי להריץ את הבדיקה. לאחר הרצת הבדיקה, פתחו את תוכנת ניתוח הנתונים וטענו את התיקייה המכילה את הנתונים.
לחצו על לשונית העיבוד (processing) כדי לראות תפריט עיבוד שלב-אחרי-שלב ואת נתוני הקינטיקה הגולמיים, כאשר לכל חיישן מוקצה צבע שונה תחת בחירת הנתונים (data selection). לחצו על כפתור בחירת החיישן במפת פלטת הדגימות. הגדירו בתוך תפריט העיבוד את הבארות עבור חיישן בקרה אחד או שניים כבארות ייחוס (reference wells).
סמנו את תיבת ההפחתה (subtraction) ובחרו באבורי ייחוס כדי להפחית את אות הייחוס מאותם של כל שאר החיישנים. יישרו את כל העקומות ל-Y שווה לאפס באמצעות שלב יישור ציר ה-y. לאחר מכן, בחרו בקו בסיס (baseline) כשלב היישור עבור טווח הזמן.
הזינו את 10 השניות האחרונות של קו הבסיס (baseline) הזה. לחיצה בתוך שלב קו הבסיס תציג את היישור. לאחר מכן, סמנו את תיבת התיקון הבין-שלבי (inter step correction) כדי למזער הסטות באות בין שלבי הקישור (association) והניתוק (dissociation).
בחר קו לבסיס (baseline) או לדיסוציאציה (dissociation). ברוב המקרים, בחר בפונקציית הסינון KY gole, ולחץ על process data כדי להמשיך לבדיקה חזותית של נתוני העיבוד הסופיים בפאנל התחתון מימין. כדי לנתח את הנתונים, לחץ על לשונית analysis ב-data analysis, בחר את השלב לניתוח, ובחר association ו-dissociation.
בעבור המודל, בחר one to one עבור התאמה (fitting) ובחר global. עבור group by בחר color, ובחר r max unlinked by sensor כדי לאפשר התאמה עצמאית של תגובת האות המקסימלית בעת קישור רווי של השותף לחלבון המקובע. לבסוף, לחץ על fit curves כדי להתחיל את ניתוח הרגרסיה הבלתי ליניארית.
בחנו את תוצאות ההתאמה, הכוללות חפיפה של עקומות רגרסיה עם עקבות נתוני החיישן, תרשימים של שאריות ההתאמה (fitting residuals), וטבלה עם ערכי הפרמטרים והסטטיסטיקה שנקבעו. כאן מוצגות קינטיקות BLI של קישור ודיסוציאציה בזמן אמת. ניסוי זה התחיל בשלב קו בסיס של 10 דקות מכיוון שהחיישנים הירטבו מראש, באופן קצר בלבד, ולאחר מכן הועמס epsilon biotinylated על החיישנים.
לא נצפתה דיסוציאציה גלאית של epsilon לאורך כל שאר השלבים, כפי שנראה מעקומת הייחוס, לה לא נוסף שותף קישור. חיישן ייחוס שני היה נטול חלבון מנויד והראה קישור לא-ספציפי נמוך של שותף הקישור. ריכוזים שונים של F1 ללא epsilon שימשו בשלב האסוציאציה עבור חיישנים A עד F, וזאת כדי להתאימו את התוצאות באופן גלובלי ולהגיע לערכים המיטביים עבור קבוע קצב האסוציאציה וקבוע הדיסוציאציה בשיווי משקל KD; התוצאות עובדו והניבו את עקומות הנתונים בכחול.
במקרה זה, עקומת חיישן הייחוס הופחתה מעקומות הדגימה כדי לתקן קישור לא ספציפי של השותף לקשירה וסחף באות המערכת. בשלב ניתוח הנתונים, כל העקומות הותאמו גלובלית באמצעות מודל של קשירה אחת לאחת (one-to-one). ההתאמה הגלובלית מניחה דיסוציאציה מלאה של השותף לקשירה.
כאן מוצג ניסוי שונה שבו האנזים נקשר ל-epsilon המקובע על החיישן בנוכחות 1 mM של ATP$\gamma$S. מצב זה גורם למרבית קומפלקסי F1 epsilon לאמץ את הקונפורמציה שאינה מעכבת, המתפרקת בקלות. לאחר מכן, החיישנים הועברו לבארי דיסוציאציה המכילים באפר בדיקה עם ליגנדים שונים. הדבר מדגים את השפעתם של ליגנדים שונים על הקונפורמציה של epsilon.
לדוגמה, חשיפה למגנזיום A GP ופוספט האטה באופן דרמטי את הדיסוציאציה נטו, מה שמעיד על כך ש-epsilon שינתה את הקונפורמציה למצב העכביה הקשור היטב. בעת הגדרת בדיקות BLI לראשונה, חשוב לכלול בקרות כדי לבדוק קישור לא-ספציפי של חלבון לחיישנים והאם הקישור הלא-ספציפי משתנה באופן משמעותי בהתאם לריכוזי החלבון שבהם ייעשה שימוש. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן התכנון, התכנות והניתוח של בדיקות BLI למדידת קינטיקה של אינטראקציות בין חלבונים, ולהכיר בכך.
שיטת ה-BLI מאפשרת בדיקה ישירה של השפעת ליגנדים קטנים על אינטראקציות בין חלבונים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקולים למדידת אינטראקציות בין חלבונים באמצעות אינטרומטריה של שכבת ביולוגית (BLI). המיקוד הוא באינטראקציה בין ATP synthase מסוג F לבין תת-היחידה ε שלו, הממלאת תפקיד במטבוליזם של אנרגיה בחיידקים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצב
- ביוכימיה
- אינטראקציות בין חלבונים
רקע
- ATP סינתטאז מסוג F חיוני לייצור אנרגיה תאית.
- תת-היחידה ε יכולה לעכב את פעילות ה-ATP synthase.
- הבנת אינטראקציות אלו חשובה לצורך השגת תובנות על ויסות מטבולי.
- אינטרפרומטריה של שכבות ביולוגיות (Bio-layer Interferometry) מאפשרת מדידה בזמן אמת של אינטראקציות אלו.
מטרת המחקר
- למדידת הקינטיקה של אינטראקציות בין חלבונים.
- לחקירת ההשפעות האלוסטריות של ליגנדים קטנים על אינטראקציות אלו.
- להתאמת שיטת ה-BLI לחקר הקומפלקס הקטליטי של ATP synthase.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת חלבונים עם ביוטין לצורך קיבוע.
- שימוש בחיישנים ביולוגיים מצופים בסטראפטאווידין לבדיקות קישור.
- מדידה בזמן אמת של קישור ודיסוציאציה באמצעות הפרעה אופטית.
- ניתוח של קומפלקסים חלבוניים שנוצרו במהלך האינטראקציה.
תוצאות עיקריות
- מדידה מוצלחת של קינטיקת ההיקשרות בין ATP synthase לבין תת-היחידה ε שלו.
- נתונים בזמן אמת על הדיסוציאציה של קומפלקסים חלבוניים.
- תובנות לגבי הבקרה האלוסטרית של פעילות ה-ATP synthase.
- הדגמה של BLI ככלי בעל ערך לחקר אינטראקציות בין חלבונים.
מסקנות
- BLI יעילה לחקר אינטראקציות בין חלבונים.
- האינטראקציה בין ATP synthase לבין תת-היחידה ε שלו היא קריטית להבנת הבקרה המטבולית.
- מחקרים עתידיים יוכלו להתבסס על שיטות אלו כדי לחקור אינטראקציות בין חלבונים אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
אינטרפרומטריה של שכבה ביולוגית (Bio-layer Interferometry - BLI) מאפשרת ניתוח קינטי בזמן אמת של אינטראקציות חלבון-חלבון והשפעות של ליגנדים אלוסטריים, ובכך תומכת בתיקוף של מטרות בתהליך גילוי תרופות אנטיבקטריאליות. באמצעות מדידת קצבי הקישור והדיסוציאציה של תת-היחידה ε עם קומפלקסים קטליים של ATP synthase, טכניקת ה-BLI מספקת נתונים כמותיים להפחתת סיכונים של היפותזות מנגנוניות ולתיעדוף של תרכובות מובילות. גישה זו מגבירה את רמת הוודאות החיזויית בשלבי הגילוי המוקדמים, על ידי קישור שינויים קונפורמציונליים המושרים על ידי ליגנדים לעיכוב פונקציונלי של מטרה רלוונטית מבחינה קלינית.
יישומים אסטרטגיים במו and פיתוח של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן השערות טיפוליות על ידי כימות האופן שבו ליגנדים משנים את הקונפורמציה של תת-יחידה ε בין מצבים פעילים למעכבים.
- ערך תפעולי: מאפשר ניטור בזמן אמת של קינטיקת קישור ללא הפרעות של תוויות, ובכך מפחית את השונות במבחן.
- ערך ניבוי: תומך בוודאות לגבי המטרה על ידי קשירת קישור הליגנד לתוצאות תפקודיות במטבוליזם האנרגיה הבקטריאלי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מדידת קבועי קצב הקישור וההתנתקות לאפיון זיקת קישור בתנאים רלוונטיים פיזיולוגית.
- ערך תפעולי: עמידות להרכבי בופר משתנים, המאפשרת סריקה של ספריות ליגנדים מגוונות ללא ארטיפקטים של אות.
- יכולת הרחבה: תאימות לפורמטים של 96 באריים להערכה מקבילית של ריכוזי ליגנדים מרובים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשר נתוני קישור in vitro למכניזמי עיכוב-עצמי ספציפיים לחיידקים הרלוונטיים לפיתוח אנטיביוטיקה.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבהירה את הרגולציה אלוסטרית של ATP synthase, ובכך מפחיתה עמימות באסטרטגיות מעורבות המטרה.
- סנכרון פרה-קליני: תומכת במידול רלוונטי למחלה על ידי התמקדות במטרה אנטי-בקטריאלית מתוקפת (מאושרת על ידי ה-FDA לטיפול בשחפת).
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטת ה-BLI משתלבת ברצף הגילוי, החל מהערכת המעורבות של המטרה ועד לאופטימיזציה של מולקולות מובילות, ובמיוחד בתוכניות אנטי-בקטריאליות המתמקדות במטבוליזם אנרגטי.
- ביולוגיה של גילוי: בוחנת את תקפות המטרה על ידי מדידה של קינטיקה בזמן אמת של אינטראקציות בין חלבונים ושינויים קונפורמציונליים המושרים על ידי ליגנדים.
- סריקה: מספקת ערכים כמותיים של KD, kon ו-koff לתמיכה במעבר משלב הפגיעה לשלב המועמד (hit-to-lead) ובניתוח קשר מבנה-פעילות.
- אנליטיקה: מספקת קריאות של הפרעה אופטית מבוססת חיישנים המאפשרות התאמה גלובלית (global fitting) וניתוח שאריות למידול קינטי רחב.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מנגנון ביוכימי לפנוטיפ אנטיבקטריאלי באמצעות עיכוב של מטרה מאושרת קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר למחקר של אינטראקציות בין חלבונים על פני מספר מטרות ומספר מחלקות של ליגנדים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי של מודולציה של מטרה על ידי זיהוי השפעות אלוסטריות של ליגנדים קטנים על יציבות של קומפלקס חלבונים.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזור באמצעות החסרת רפרנס, יישור קו בסיס ותיקון בין שלבים במהלך עיבוד הנתונים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי אספקת ספי קינטיים למעורבות המטרה (target engagement) ויעילות הליגנד.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרכובות מותאם סיכון בהסתמך על קינטיקת קישור וסלקטיביות קונפורמציונית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביוטינילציה של חלבונים, טיפול בחיישני ביוסנסור של סטראפטאבידין והגדרת מכשיר BLI.
- תלוי בגישה לקוראי פלטות רב-בארים עם בקרת טמפרטורה ויכולות ניטור אופטי בזמן אמת.
- מחייב תה racemic עבודה סטנדרטיים עבור רגנרציה של חיישנים, הכללת באר ייחוס והחסרת נתונים כדי למזער רעשים.
- כולל אופטימיזציה של תזמון ההתאסות (association) וההתנתקות (dissociation) בהתבסס על קינטיקת קישור של הליגנד ויציבות הקומפלקס.
- מוגבל בשל הצורך בשותפי קישור מקובעים (immobilized), דבר שעשוי להשפיע על הקונפורמציה הטבעית של החלבון או על נגישותו.
