Interferometry Bio-שכבה למדידת קינטיקה של חלבונים אינטראקציות והשפעות יגנד allosteric

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא למדוד קינטיקה של אינטראקציות חלבון, חלבון וההשפעות האלוסטריות של ליגנדים קטנים על אינטראקציות אלה באמצעות אינטרפרומטריית שכבה ביולוגית, BLI. זה מושג על ידי הכנת אחד החלבונים עם ביוטין ספציפי ושיתוק שלו על פני הסטרפטוק. עדן ציפתה חיישנים ביולוגיים במקביל.

כשלב שני, החלבון הקשור לחיישן נחשף למאגר המכיל את שותף הקישור שלו, והקישור נמדד בזמן אמת על ידי השפעתו על הפרעות אופטיות על פני השטח של החיישן. לאחר מכן, כל חיישן מועבר למאגר ללא השותף המקשר על מנת למדוד דיסוציאציה בזמן אמת של החלבון. קומפלקסים של חלבונים.

התוצאות המתקבלות מאפשרות לקבוע את קבועי הקצב הקינטי לקשירה ודיסוציאציה של החלבונים האינטראקטיביים ובכך את זיקת הקישור שלהם. תוצאות נוספות מראות כי BLI יכול לזהות את ההשפעות של ליגנדים קטנים על קצב הדיסוציאציה של קומפלקס חלבון החלבון. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות כגון תהודה פלזמה על פני השטח, הוא ש-BLI אינו רגיש יתר על המידה לשינויים במקדם השבירה.

אז שלבי הקישור והאסוציאציה יכולים לכלול שינויים בליגנדים קטנים כדי לבחון את השפעותיהם על אינטראקציות חלבון-חלבון בזמן אמת, אם כי, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי קינטיקה של אינטראקציה בין חלבון לחלבון. ניתן ליישם אותו גם על שילובים שונים כגון קשירת חלבון ל-DNA או RNA משותק או קשירת ליפוזום לחלבון משותק. התחל ניסוי זה על ידי הגדרת מכשיר BLI כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

לאחר מכן הגדר את העיצוב הניסיוני בתוכנת רכישת הנתונים. בחר ניסוי קינטיקה חדש בכרטיסיה אשף הניסוי. זה מציג תפריט כרטיסיות עם כל השלבים שיש להגדיר בכרטיסייה הראשונה.

הגדר את העמודות שיש להשתמש בהן. על צלחת הדגימה של 96 באר. הקצה עמודות שיכילו חיץ, החלבון שיש לשתק או השותף המקשר.

עבור כל אסוציאציה, הזן היטב את ריכוז השותף המחייב לשימוש. בכרטיסיה שתיים, הגדר את כל השלבים הדרושים לבדיקה. אלה כוללים שיוך העמסה בסיסית ודיסוציאציה של שותף מחייב.

שלבי בדיקה בודדים מקושרים לעמודות בארות על לוחית הדגימה על ידי בחירת שלב הבדיקה ולאחר מכן לחיצה כפולה על העמודה המתאימה. זה מתכנת את החיישנים להעברה מעמודת בארות אחת לאחרת. במהלך הבדיקה, התחל בצעד בסיסי קצר המקושר לעמודה הראשונה של בארות עם מאגר בדיקה כדי ליצור אותות BLI ראשוניים בלוח 96 הבארות.

לאחר מכן קשר את שלב הטעינה לבארות שיכילו את החלבון הביוטיניל. השתמש בפונקציית הסף כדי להשיג רמת כריכה קבועה מראש. הגדר את אפשרות הסף כך שכל החיישנים יועברו לעמודת הבארות הבאה.

כאשר אחד מהחיישנים מגיע לסף, כלול שלב בסיס נוסף במאגר כדי לשטוף חלבונים ביוטיניליים לא משותקים מהחיישנים וליצור אותות בסיס יציבים חדשים לבדיקות בסיסיות לקביעת קבועי קצב קשירה ודיסוציאציה גלובליים כולל שלב בסיס נוסף עם חיישנים בעמודה חדשה של בארות חיץ לפני השיוך. שלב לאחר מכן, קשר את השיוך. צעד לעמודת הבארות המכילות ריכוזים משתנים של בן הזוג המחייב.

התאם את זמן הצעד כך שלפחות ריכוז רוויה של השותף המקשר יגיע לאות קשירת שיווי משקל. עבור שלב הדיסוציאציה, ייעד את החיישנים לחזור לעמודה ארבע, אותן בארות חיץ ששימשו לקו הבסיס הנוסף לפני השיוך. ניתן להתאים את הזמנים לשלבי האסוציאציה והדיסוציאציה במהלך הניסוי אם הקצב איטי או מהיר מהצפוי.

בכרטיסייה השלישית, ציין מיקומים במגש החיישנים שיכילו חיישנים רטובים מראש לבדיקה. כרטיסייה ארבע מאפשרת סקירה גרפית של התוכנית. בכרטיסייה חמש, הזן את הפרטים הדרושים, כולל מיקום קבצי הנתונים והטמפרטורה הרצויה.

לניסוי. הרטיבו מראש את החיישנים המצופים סטרפטווידין למשך 10 דקות לפחות. כדי להסיר את ציפוי הסוכרוז המגן שלהם, הסר את החיישן המכיל מתלה ממגש החיישן והכנס צלחת 96 באר בתחתית המגש והחליק פינה אחת של הצלחת לתוך חריץ הכיוון במגש.

לעמודת החיישנים שיש להשתמש בה, הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר בדיקה לכל באר. בעמודה זו של צלחת 96 הבארות החזר את מתלה החיישנים למגש בכיוון הנכון כפי שהוקצה במהלך התכנות, מלא בארות של לוחית הדגימה במאגר בדיקה או בדילול החלבון המתאים. הימנע מהכנסת בועות מכיוון שהן עלולות לגרום לרעש באות האופטי.

כלול באר ייחוס אחת או יותר המשמיטות חלבון ביוטיניל או שותף קשירה. פתח את דלת המכשיר ושים לב לתפוקת האור מזרוע החיישן. הכנס את מגש החיישן על ה-stagה, כשלשוניות המגשים מוכנסות לחריצי הבמה.

הכנס את לוחית הדגימה למחזיק הצלחת. ודא שהצלחת יושבת שטוחה ובכיוון הנכון כפי שמצוין על מחזיק הצלחת. סגור את הדלת והתחל את הבדיקה מתוכנית רכישת הנתונים.

אם חיישנים עדיין דורשים הרטבה מוקדמת, בחר באפשרות לעכב את תחילת הניסוי. לבסוף, לאחר השלמת כל הכנת הדגימה וגם לוחית הדגימה ומגש החיישן נטענים במכשיר, לחץ על כפתור Go כדי להפעיל את הבדיקה. לאחר הפעלת הבדיקה, פתח את תוכנת ניתוח הנתונים וטען את התיקיה המכילה את הנתונים.

לחץ על לשונית העיבוד כדי לראות תפריט עיבוד שלב ואת הנתונים הקינטיים הגולמיים כאשר לכל חיישן מוקצה צבע שונה תחת בחירת נתונים. לחץ על לחצן בחירת החיישן במפת לוחית הדגימה. ייעד את הבארות עבור חיישן בקרה אחד או שניים כבארות ייחוס בתפריט העיבוד.

סמן את תיבת החיסור ובחר בארות ייחוס כדי להפחית אות ייחוס מכל אות חיישן אחר. יישור כל העקבות ל- Y שווה לאפס באמצעות צעד ציר Align Y. לאחר מכן בחר קו בסיס כשלב היישור עבור טווח זמן.

הזן את 10 השניות האחרונות של תוכנית בסיסית זו. לחיצה בתוך שלב הבסיס הזה תציג את היישור. לאחר מכן, סמן את תיבת התיקון בין השלבים כדי למזער את שינויי האות בין שלבי השיוך והדיסוציאציה.

בחר קו לקו בסיס או דיסוציאציה. בחר את פונקציית הסינון KY gole ברוב המקרים, ולחץ על נתוני תהליך כדי להמשיך לבדוק חזותית את נתוני התהליך הסופיים בחלונית הימנית התחתונה. כדי לנתח את הנתונים, לחץ על לשונית הניתוח בניתוח נתונים לשלב לניתוח, בחר אסוציאציה ודיסוציאציה.

עבור דגם, בחר אחד לאחד להתאמה בחר גלובלי. לקבוצה לפי צבע נבחר, בחר r max לא מקושר על ידי חיישן כדי לאפשר התאמה עצמאית של תגובת האות המקסימלית בעת קשירה רוויה של השותף לחלבון המשותק. לבסוף, לחץ על עקומות התאמה כדי להתחיל בניתוח הרגרסיה הלא ליניארית.

בדוק את תוצאות ההתאמה, הכוללות שכבת-על של עקומות רגרסיה עם עקבות נתוני חיישנים, עלילות של שאריות התאמה וטבלה עם ערכי פרמטרים וסטטיסטיקות שנקבעו. קינטיקה של BLI כריכה ודיסוציאציה בזמן אמת מוצגת כאן. ניסוי זה התחיל בצעד בסיסי של 10 דקות מכיוון שהחיישנים היו רטובים מראש, רק לזמן קצר, אפסילון ביוטיניל הועמס על החיישנים.

לא התרחש דיסוציאציה ניתנת לזיהוי של אפסילון בכל השלבים הנותרים כפי שניתן לראות מעקומת הייחוס, שלא נוספה לה שותפה מקשרת. חיישן ייחוס שני היה נטול חלבון מגויס והראה קשירה נמוכה לא ספציפית של השותף המקשר. ריכוזים שונים של F1 מינוס אפסילון שימשו בשלב האסוציאציה עבור חיישנים A עד F על מנת להתאים את התוצאות הגלובליות ולקבל את הערכים הטובים ביותר עבור קבוע קצב האסוציאציה לקבוע קצב האסוציאציה ותוצאות KD של קבוע דיסוציאציה של קבוע שיווי המשקל עובדו, והניבו את עקבות הנתונים הכחולים.

במקרה זה, עקבות חיישן הייחוס הופחתו מעקבות הדגימה כדי לתקן קשירה לא ספציפית של שותף הקישור וסחיפת אות המערכת. בשלב ניתוח הנתונים, כל העקומות הותאמו באופן גלובלי למודל אחד לאחד, אחד לאחד. ההתאמה הגלובלית מניחה ניתוק מוחלט של בן הזוג המחייב.

מוצג כאן ניסוי אחר שבו האנזים נקשר לאפסילון משותק חיישן בנוכחות מילי-מולר אחד, A-T-P-A-D-T-A. זה נוטה לרוב קומפלקסי האפסילון F1 להניח את האישור הלא מעכב, אשר מתנתק בקלות חיישנים הועברו לאחר מכן לבארות דיסוציאציה המכילות מאגר בדיקה עם ליגנדים שונים. זה מדגים את ההשפעות של ליגנדים שונים על אישור האפסילון.

לדוגמה, חשיפה למגנזיום A GP ופוספט האטה באופן דרמטי את הדיסוציאציה נטו, מה שמצביע על כך שאפסילון העביר את האישור למצב מעכב קשור היטב. כאשר מגדירים לראשונה מבחני BLI, חשוב לכלול בקרות לבדיקת קשירה לא ספציפית של חלבון לחיישנים והאם קשירה לא ספציפית משתנה באופן משמעותי עם ריכוזי החלבון שיש להשתמש בהם. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתכנן, לתכנת ולנתח מבחני BLI למדידת הקינטיקה של אינטראקציות חלבון ולהעריך זאת.

BLI מאפשר בדיקה ישירה של השפעות של ליגנדים קטנים על אינטראקציות חלבון החלבון.