Name: Interferometry Bio-שכבה למדידת קינטיקה של חלבונים אינטראקציות והשפעות יגנד allosteric (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-18T14:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 57 s
Description: למד מדידת קינטיקה של אינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות אינטרפרומטריית Bio-layer. השיטה מאפשרת חקר אפקטים אלוסטריים של ליגנדים קטנים על ATP synthase מסוג F בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים FortéBio למתן גרפיקה המשמשת באיור 1. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH GM083088 לTMD

<html> 1. תכנות המכשיר לAssay BLI הפעל את המכשיר לפחות שעה אחת מראש כדי לאפשר את המנורה כדי להתחמם, זה הכרחי כדי למזער את הרעש ולהיסחף באותות אופטיים במהלך הניסוי. הגדר את הטמפרטורה הרצויה באמצעות כרטיסיית המכשיר לprewarm מדגם בעל הצלחת. ואז להגדיר את עיצוב הניסיון בתוכנת רכישת נתונים. בחר &quot;ניסוי החדש קינטיקס&quot; בכרטיסייה אשף הניסוי. זה מציג תפריט עם לשוניות עם כל הצעדים שחייבים להיות מוגדר. 1.1. הגדרת פלייט הגדר את העמודות כדי לשמש על צלחת מדגם 96 היטב. הקצאת עמודות להכיל חיץ, חלבון משותק או שותף מחייב. לכל עמותה גם, הזן את הריכוז מחייב שותף לשמש. הערה: יש לו את הגדרת הצלחת שמוצגת באיור 2 אפשרויות למבחנים שונים. 1.2. הגדרת assay ontent &quot;&gt; הגדר את כל נחוצים עבור assay הצעדים. אלה כוללים Baseline (ט) (מספר), (ii) טוען, (iii) התאחדות וכן (iv) דיסוציאציה מחייב שותף. ואז, כפי שיתואר להלן, לקשר צעדי assay פרט עם עמודות של בארות על צלחת המדגם על ידי בחירת צעד assay ולאחר מכן לחיצה כפולה על העמודה המתאימה. תוכניות זה החיישנים שעברו מטור אחד של בארות למשנהו במהלך assay. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Baseline להתחיל בצעד קצר בסיסי (≥ 60 שניות), עם חיישנים במאגר assay (איור 2, טור 1), להקים אותות BLI ראשוניים בצלחת 96 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוען (לשתק את חלבון biotinylated על החיישנים) הקצאת חיישנים לבארות שיכילו חלבון biotinylated (איור 2, עמודת 2). השתמש בפונקצית הסף כדי להשיג רמה קבועה מראש של מחייב (ראה מבוא). הגדר את אפשרות הסף, כך שכל החיישנים יהיו מהלךד לטור הבא של בארות, כאשר כל אחד מהחיישנים מגיע לסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Baseline כולל צעד בסיסי אחר במאגר (איור 2, טור 3, בדרך כלל&gt; 5 דקות) כדי לשטוף חלבוני biotinylated nonimmobilized מהחיישנים ולהקים אותות בסיס חדשים, יציבים. עבור מבחני מחייב / ניתוק בסיסיים בלבד (כמו באיור 3), כולל צעד נוסף בסיסי (60 שניות) עם חיישנים בבארות חדשות של חיץ (איור 2, טור 4) לפני השלב האגודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האגודה (של השותף מחייב את החלבון המשותק) עבור assay בסיסי מחייב / דיסוציאציה (כמו באיור 3), בחר טווח ריכוזים של שותף מחייב לשמש לחיישנים / בארות שונות (איור 2, בטור 5). התאם את זמן צעד, כך שלפחות ריכוז להרוות של שותף המחייב צריך גישת שיווי משקל מחייב אות. עבורassay כדי לבדוק את השפעות allosteric של ligands הקטן על ניתוק של מתחם חלבונים (כמו באיור 5), בחר ריכוז אחד גבוה של שותף מחייב (~ פי 10 מעל המוערך K D) לשימוש בכל בארות העמותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיסוציאציה (של שותף המחייב) עבור assay בסיסי מחייב / ניתוק בלבד (כמו באיור 3), לייעד את החיישנים כדי לחזור לעמודת 4 (איור 2), אותו בארות המאגר כמשמש לבסיס הנוסף לפני האגודה. עבור assay כדי לבחון השפעות allosteric של ligands הקטן, במקום לייעד חיישנים כדי לעבור לעמודה 6 (איור 2), שבו כל אחד גם יכול להכיל חיץ בתוספת ligands allosteric שונה. </li></ol> 1.3. הקצאת חיישן לציין את מיקומם במגש החיישן שיכיל חיישני prewetted עבור assay. זהה את כל עמדות ריקות מאז הניסוי FAIl אם אין חיישנים נאספים. 1.4. ניסוי ביקורת דמיינו את כל הצעדים המתוכננים כדי לבדוק טעויות ולחזור כדי לתקן אותם. 1.5. הפעל ניסוי הזן את פרטים דרושים, ובכלל זה מיקום של קבצי הנתונים. הזן את הטמפרטורה הרצויה לצורך הניסוי. אם חיישנים עדיין דורשים prewetting, בחר את האפשרות לדחות את תחילת הניסוי. לבסוף, לאחר כל הכנת המדגם היא מלאה (שלב 2) והן את צלחת המדגם ומגש חיישן נטענות במכשיר, לחץ על כפתור Go כדי להפעיל את assay. 2. לדוגמא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ assay מתאים. המאגר משמש לניסויים מוצגים באיורים 3 ו -5: 20 מ&quot;מ מגבים (3 - חומצה (N-morpholino) propanesulfonic), טריס (טריס (hydroxymethyl) אמינו מתאן) (הוסיפו לכדי להתאים את pH 8.0), 50 מ&quot;מ KCl. כולל ארגון ה-BSA (אלבומין בסרום שור, חומצות שומן חופשי, 0.5מ&quot;ג / מיליליטר סופי) במאגר עבור כל שלבי assay ולתמיד דילולים של חלבון biotinylated או השותף מחייב למזער ספציפי מחייב של חלבונים לחיישנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את חלבון biotinylated (ε) במאגר assay לריכוז מתאים (ראה מבוא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילולים של שותף המחייב (F 1 (-ε)) במאגר assay (ראה דיון לטווח של ריכוזים להשתמש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prewet חיישני streptavidin המצופה לפחות 10 דקות כדי להסיר ציפוי סוכרוז המגן שלהם. הסר את המדף המכיל חיישן ממגש החיישן ולהכניס את צלחת 96 היטב בחלקו התחתון של המגש, הזזה פינה אחת של הצלחת לתוך החריץ המכוון על המגש. לטור של חיישנים כדי לשמש, להוסיף 200 μl של חיץ assay לכל טוב באותה עמודה של צלחת 96 היטב. להחזיר את המתלה של חיישנים למגש בכיוון הנכון (עם כרטיסיות בחריצים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפי שהוקצה במהלך תכנות בשלב 1, למלא בארות oו צלחת המדגם עם חיץ assay או דילולים החלבון המתאימים, כמו באיור 2. למנוע החדרת בועות, כפי שהם יכולים לגרום לרעש באותות אופטיים. כולל בארות התייחסות אחת או יותר שמשמיטות או חלבון (i) biotinylated או (ii) שותף מחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הדלת של המכשיר והכנס את מגש החיישן על הבמה (משמאל), עם הכרטיסיות של המגש מוכנסות לתוך החריצים של הבמה. הכנס את צלחת המדגם לבעל הצלחת (מימין); לוודא כי הצלחת יושבת שטוחה ובכיוון הנכון, כפי שמצוין על בעל הצלחת. סגור את הדלת ולהתחיל assay מתכנית רכישת נתונים (שלב 1.5). </li></ol> 3. עיבוד נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר assay יש לרוץ, לפתוח את תוכנת ניתוח נתונים ולטעון את התיקייה המכילה את הנתונים. לחץ על הלשונית &quot;עיבוד&quot; כדי לראות תפריט צעד חכם עיבוד (בצד השמאל) ואת הנתונים הקינטית הגלם, עם כל חיישן (AH) שהוקצה בצבע שונה (ראהאיור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &quot;נתונים לבחירה&quot;, לחץ על הכפתור &quot;חיישן לבחירה&quot;. על &quot;מפת פלייט לדוגמא&quot;, לייעד את הבארות לחיישני 1 או 2 שליטה (G, H בassay של איור 3) כמו בארות התייחסות. בתפריט העיבוד, סמן את תיבת &quot;חיסור&quot; ובחר באפשרות &quot;הפניה ולס&quot; להחסיר אות ייחוס (בודדת או בממוצע) מהאותות של כל חיישן אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את כל העקבות לY = 0 על ידי שימוש בצעד &quot;יישור Y הציר&quot;. בחר &quot;Baseline&quot; כצעד היישור (זה להיות הבסיס האחרון לפני השלב האגודה). עבור &quot;טווח זמן&quot;, הזן שעברה 10 שניות של בסיס ש( כלומר 50-60 שניות לתחילת מחקר 60-sec, כמו באיור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את תיבת &quot;Inter-צעד תיקון&quot; כדי למזער משמרות אות בין צעדי האיגוד ודיסוציאציה. בחר ליישר קו בסיס או דיסוציאציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פונקצית סינון Savitzky-Golay ברוב המקרים ולחץ על &quot;נתונים בתהליך!&quot; כדי להמשיך. ראייה לבדוקעיבודים הסופיים (פנל ימני תחתון). עם מבחני המיועדים לניתוח נתונים הגלובלי (כמו באיור 4), אם עקבות אות מראות שינוי משמעותי בין האיגוד וצעדי דיסוציאציה, לשנות את הבחירה של דיסוציאציה או Baseline ל&quot; תיקון אינטר הצעד &quot;ולעבד מחדש את הנתונים לפני שתמשיך לנתונים ניתוח. </li></ol> 4. ניתוח נתונים לחץ על הלשונית &quot;ניתוח&quot; בניתוח נתונים כדי להתחיל. הערה: בדוגמא על השלבים להלן לניתוח הגלובלי של עקומות מחייב / ניתוק מרובים (כמו באיור 3). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל&quot; צעד כדי לנתח &quot;, בחר איגוד ודיסוציאציה. עבור &quot;דגם&quot;, בחר 1:1. הערה: אפשרויות מוגבלות אחרות זמינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל&quot; התאמה &quot;, לבחור גלובלי (מלא). עבור &quot;קיבוץ לפי&quot; בחר צבע (כמו בגרף). בחר &quot;מקסימום R לא צמוד על ידי חיישן&quot; כדי לאפשר התאמה עצמאית של מקסימום R (תגובת אות מקסימלי על להרוות מחייב של הנקובtner לחלבון המשותק). הערה: אנחנו עושים את זה עבור רוב מבחני, כמו חיישנים להשתנות מעט בכמות החלבון המשותקת (ראה איור 3, טוען). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטבלה המוצגת, ודא שיש כל עקבות החיישן להיות מנותחים באותו צבע, ולכן הם ינותחו כמערכת גלובלית. במידת צורך, בחר חיישן אחד או יותר עקבות להשמיט ממדידה העולמית: תחת העמודה &quot;כלול&quot;, לחץ לחיצה ימנית על מיקום החיישן הרצוי ובחר &quot;תכלול ולס&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;Curves Fit!&quot; כדי להתחיל את ניתוח רגרסיה ליניארית. לבחון את התוצאות מתאימות, הכוללות כיסוי (i) של עקומות רגרסיה עם עקבות נתוני חיישן (כמו באיור 4), (ii) מגרשים של שאריות הולמת, וכן (iii) טבלה עם ערכי פרמטרים שנקבעו (קבועי קצב, R מקסימום, K D) ונתונים סטטיסטיים (סטיות התקן עבור פרמטרים, צ&#39;י בריבוע, R 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &quot;יצוא נתונים&quot;, לשמור את התוצאות מתאימות על ידי לחיצה על &quot;יצוא טבלה ל. קובץ CSV&quot;. לgrapהינג או ניתוח נוסף של הנתונים / עקומות מצוידות בתוכנה אחרת, לחץ על &quot;התאמת תוצאות יצוא&quot; כדי לשמור את הנתונים של כל חיישן ועקומה מצויד בקובץ טקסט. </li></ol>

<ol><li>Nirschl, M., Reuter, F., Voros, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+Transducer+Principles+for+Label-Free+Biomolecular+Interaction+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Review of Transducer Principles for Label-Free Biomolecular Interaction Analysis.</a> Biosensors. 1, 70-92 (2011).</li>
<li>Homola, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Present+and+future+of+surface+plasmon+resonance+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Present and future of surface plasmon resonance biosensors.</a> Anal. Bioanal. Chem. 377, 528-539 (2003).</li>
<li>Piehler, J., Brecht, A., Gauglitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+Detection+of+Low+Molecular+Weight+Analytes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Affinity Detection of Low Molecular Weight Analytes.</a> Anal. Chem. 68, 139-143 (1996).</li>
<li>Duncan, T. M. The Enzymes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuncan%2C+TM+%22Energy+Coupling+and+Molecular+Motors+Vol%22">Energy Coupling and Molecular Motors Vol</a>. Hackney, D. D., Tamanoi, F. XXIII, Elsevier Academic Press. 203-275 (2004).</li>
<li>Feniouk, B. A., Suzuki, T., Yoshida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+subunit+%CE%B5+in+the+catalysis+and+regulation+of+FOF1-ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The role of subunit ε in the catalysis and regulation of FOF1-ATP synthase.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1757, 326-338 (2006).</li>
<li>Cingolani, G., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+ATP+synthase+catalytic+complex+%28F1%29+from+Escherichia+coli+in+an+autoinhibited+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure of the ATP synthase catalytic complex (F1) from Escherichia coli in an autoinhibited conformation.</a> Nat. Struc. Mol. Biol. 18, 701-707 (2011).</li>
<li>Mirsaeidi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((After+40+years%2C+new+medicine+for+combating+TB%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mycobacteriol%22%5BJournal%5D)">After 40 years, new medicine for combating TB.</a> Int. J. Mycobacteriol. 2, 1-2 (2013).</li>
<li>Shah, N. B., Hutcheon, M. L., Haarer, B. K., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F1-ATPase+of+Escherichia+coli%3A+The+%CF%B5-inhibited+state+forms+after+ATP+hydrolysis%2C+is+distinct+from+the+ADP-inhibited+state%2C+and+responds+dynamically+to+catalytic+site+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">F1-ATPase of Escherichia coli: The ϵ-inhibited state forms after ATP hydrolysis, is distinct from the ADP-inhibited state, and responds dynamically to catalytic site ligands.</a> J. Biol. Chem. 288, 9383-9395 (2013).</li>
<li>Burgess, T. L., Ross, S. L., Qian, Y. -x, Brankow, D., Hu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthetic+Processing+of+neu+Differentiation+Factor%3A+glycosylation%2C+trafficking%2C+and+regulated+cleavage+from+the+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biosynthetic Processing of neu Differentiation Factor: glycosylation, trafficking, and regulated cleavage from the cell surface.</a> J. Biol. Chem. 270, 19188-19196 (1995).</li>
<li>Loo, T. W., Clarke, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Topology+of+a+Cysteine-less+Mutant+of+Human+P-glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Membrane Topology of a Cysteine-less Mutant of Human P-glycoprotein.</a> J. Biol. Chem. 270, 843-848 (1995).</li>
<li>Tsao, K. -L., DeBarbieri, B., Michel, H., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+plasmid+expression+vector+for+the+production+of+biotinylated+proteins+by+site-specific%2C+enzymatic+modification+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A versatile plasmid expression vector for the production of biotinylated proteins by site-specific, enzymatic modification in Escherichia coli.</a> Gene. 169, 59-64 (1996).</li>
<li>Dayne, D. BioLayer Interferometry (BLI) - How Does it Work?. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDayne%2C+D+%22Fort%C3%A9Bio+newsletter+In+Interactions%22">FortéBio newsletter In Interactions</a>. 5, 8-9 (2012).</li>
<li>Wartchow, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensor-based+small+molecule+fragment+screening+with+biolayer+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comput.+Aided+Mol.+Des%22%5BJournal%5D)">Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry.</a> J. Comput. Aided Mol. Des. 25, 669-676 (2011).</li>
<li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor%2C+the+Octet%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377, 209-217 (2008).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

מכשירים זמינים כעת עבור BLI לאפשר תפוקה משמעותית וגמישות במבחנים לאינטראקציות biomolecular. דגימות פתרון שונות הם ויתרו בבארות של צלחת microtiter שחורה, ומערכת של חיישני BLI מקבילים מתוכנתות לנוע קדימה ואחורה בין העמודים של בארות על הצלחת. הדגימות הם עוררו על ידי טלטול מסלולית לאורך assay. יש המערכת המשמשת כאן 8 חיישנים ומשתמשת בצלחת דגימת 96 היטב, אבל מערכת אחרת משתמשת 16 חיישנים וצלחת מדגם 384 גם. כך, אינטראקציה בין biomolecule משותק חיישן ושותף המחייב שלה בפתרון, ניתן לבדוק בתנ...

אינטראקציות בין חלבונים חשובות לתהליכים ביולוגיים רבים, ושיטות אופטיות ללא תווית כמו Surface Plasmon תהודה (SPR) היו בשימוש במבחנה ללמוד קינטיקה של מחייב ודיסוציאציה 1. רוב השיטות ללא תווית לשתק biomolecule אחד על משטח חיישן ולהשתמש אות אופטי לאיתור שותף מחייב מפתרון כפי שהוא מקשר עם biomolecule המשותק 1. בעוד SPR הוא שיטה רגישה מאוד, הוא נוטה להפרעות כתוצאה משינויים במדד השבירה של הפתרון זורם על החיישן 2. למרות שלא רגיש כמו SPR, Bio-שכבת Interferometry (BLI) הוא פחות מושפע משינויים בהרכב מדגם 1,3. BLI משתמש biosensors סיבים האופטיים שיש להם ציפוי ביולוגית קניינית בקצה. המערכת משמשת כאן (שמינייה-RED96) מכילה שמונה הספקטרופוטומטרים. אור לבן מוזרם לשורה של בדיקות שתעבורנה על זרוע רובוטית. חיישנים אופטיים סיבי arדואר נאסף על ידי החלליות ועבר לצלחת 96 היטב המכילה דגימות. אחת ממולקולות המטרה הוא משותק על פני השטח biosensor. אז חיישנים מועברים לבארות המכילות שותף המחייב בתמיסה. BLI עוקב אחר קשר של השותף מחייב עם המולקולה המשותקת, ולאחר מכן עוקב אחר ניתוק לאחר שעבר את החיישנים לפתרון ללא שותף המחייב. הכריכה של מולקולות על פני השטח biosensor מובילה לשינויים בהפרעות אופטיות בין גלי אור המשקפים חזרה להספקטרופוטומטרים ממשטח פנימי ומתוך הממשק החיצוני בין החיישן ופתרון. שינויים אלה בהתערבות ניתן לכמת ומשמשים לקביעת שיעורים הקינטית של כריכה, דיסוציאציה, כפי שסוכם באנימציה של איור 1. יש לנו ליישם BLI למדוד אינטראקציות בין המתחם הקטליטית של ה-ATP synthase חיידקים ומקטע ε שלה, אשר יכול אוטומטית מעכב את האנזים. סאי ה-ATPnthase הוא nanomotor סיבובי מוטבע קרום שמזרז סינתזה והידרוליזה של 4-ATP. קומפלקס קטליטי (F 1) יכול להיות מבודד בצורה מסיסה שעובדת כATPase. יש ε המקטע שני תחומים: תחום N-המסוף (NTD) הוא דרוש להרכבה נכונה וצימוד תפקודי של האנזים, אך לא במגע ישיר עם יחידות משנה קטליטי; תחום בטרמינל C-(CTD) יכול לעכב את האנזים על ידי אינטראקציה עם יחידות משנה קטליטי מספר 5,6. רגולציה בתיווך ε זה היא ספציפית לsynthases ה-ATP בקטריאלי ואינו נצפתה בhomologue המיטוכונדריה. ה-ATP synthase התפתחה כמטרה לתרופות אנטיבקטריאליות, כפי שמוצג על ידי אישור ה-FDA לאחרונה bedaquiline לטיפול שבחפת עמידה לתרופות 7. לכן, מיקוד התפקיד המעכב של ε לגילוי סמים יכולים להניב antibacterials שלא לעכב את ה-ATP synthase המיטוכונדריה. עם המתחם המבודד קטליטי (F 1), εהופך למקטע קשור זה. עם זאת, עם ε חייב 1 F, εCTD יכול לעבור שינוי קונפורמציה דרמטי, החדרה באופן חלקי לתוך החלל המרכזי של האנזים ולהרכיב מדינה מעכבת שלא סביר לנתק ישירות 6,8. אנו משתמשים BLI למדוד קינטיקה של F 1 / ε מחייב ודיסוציאציה, ובעקיפין, על מנת לבחון אפקטי allosteric של קטליטי אתר ligands על קונפורמציה של ε. במערכת שלנו, ε נבחר לקיבוע על משטח החיישן מאז אות BLI (כמו SPR) הוא רגיש למסה של המולקולות מחייבות על פני השטח. מקטע ε הוא (~ 15 KDA) קטן יחסית למתחם העיקרי F 1 (~ 347 KDA). לפיכך, אות BLI גדולה יותר תגרום מכריכה של 1 F לε המשותק. על מנת לפקח דיסוציאציה F 1, אשר יכול להיות מאוד איטי, ε חייב להיות חזק משותק. לכן בחרנו biotinylate; ולשתק אותו על biosensors streptavidin מצופה. ניתן biotinylated חלבונים על ידי שינוי (i) אקראי של lysines פני השטח 9, (ii) תגובה של ציסטאין ילידים מהונדס או ייחודי עם מגיב ביוטין-maleimide 10 או (iii) גנטי הוספת הפפטיד יוטין-acceptor ספציפי שbiotinylated אנזימים במהלך בביטוי vivo של החלבון מתויג 11. במערכת שלנו, ε הוא biotinylated באמצעות שיטה (iii) 8. ברגע שε-מתויג ביוטין הוא משותק על חיישני streptavidin, BLI יכול למדוד את הכריכה וניתוק של 1 F כי כבר מדולדל של ε למקטע (F 1 (-ε)). לניסויים שתוארו כאן, מבחני ראשוניים שנעשו כדי לקבוע כמויות סבירות של חלבון biotinylated כדי לשתק בחיישנים. זה יכול להשתנות, בהתאם למשקל המולקולרי של החלבון ושותף המחייב שלה, אבל המטרה היא לקבוע כמות מזערית של חלבון לא משותקיםכובע מספק (i) מקובל אות לרעש לכריכת קינטיקה עם ריכוז נמוך של שותף המחייב (להלן K D) וכן (ii) עיוות מינימאלית של כריכת קינטיקה עם ריכוז להרוות-קרוב של שותף המחייב. כמו כן, הרכב של biotinylation עשוי להשתנות (אך להימנע&gt; ביוטין / חלבון mol mol 1), ולכן חלק assay הראשוני עשוי להיות נחוץ לכל מנה חדשה של חלבון biotinylated כדי לאשר שאות BLI עקבית יכולה להיות מושגת בחוסר התנועה בstreptavidin מצופה חיישנים.

<table><tbody><tr><td>Octet-RED96</td><td>Pall/Fort&eacute; Bio</td><td>30-5048</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>סיגמא</td><td>A6003-10G</td><td>ללא חומצות שומן</td></tr><tr><td>Biosensor/Streptavidin</td><td>Pall/Fort&eacute; ביו</td><td>18-5019</td><td>מגש של 96 חיישנים</td></tr><tr><td>צלחת מיקרוטיטר</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>655209</td> שחור, תוכנת רכישת נתונים <td>מפוליפרופילן</td></tr><tr><td></td><td>Pall/Fort&eacute; ביו</td><td>גרסה 6.4</td><td>גרסאות חדשות יותר זמינות</td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח נתונים</td><td>Pall/Fort&eacute; ביו</td><td>גרסה 6.4</td><td>גרסאות חדשות יותר זמינות</td></tr></tbody></table>

interferometry bio-שכבה למדידת קינטיקה של חלבונים אינטראקציות והשפעות יגנד allosteric

Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

אנו מתארים את השימוש בInterferometry Bio-השכבה ללמוד אינטראקציות מעכבות של ε למקטע עם מורכב הקטליטית של ה-ATP synthase Escherichia coli. ה-ATP synthase F-סוג חיידקים הוא היעד של אנטיביוטיקה חדשה, שאושרה על ידי ה-FDA כדי להילחם שבחפת עמידה לתרופות. הבנת חיידקים ספציפיים אוטומטי עיכוב של ה-ATP synthase ידי תחום בטרמינל C-של ε למקטע יכול לספק אמצעי חדש כדי למקד את האנזים לגילוי של תרופות אנטי בקטריאליים. תחום בטרמינל C-של ε עובר שינוי קונפורמציה דרמטי כאשר מעברי האנזים בין המדינות פעילות ולא פעילים, וligands קטליטי האתר יכולים להשפיע על איזה מהתצורות של ε הוא דומיננטי. צעדי assay קינטיקה של מחייב / הניתוק של ε עם מורכב קטליטי, ובעקיפין מאהsures המשמרת של ε בכריכת האנזים ומקונפורמציה המעכבת nondissociable כנראה. אות Interferometry Bio-השכבה אינה רגישה יתר על המידה להרכב פתרון, כך גם ניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר השפעות allosteric של ligands קטליטי האתר על שינויי קונפורמציה של ε.

זמן אמת מחייב וקינטיקה BLI הניתוק מוצגות באיור 3. ניסוי זה נעשה עם חיץ assay בעמותה ודיסוציאציה. ניסוי זה החל בצעד בסיסי 10 דקות מאז החיישנים היו prewet רק לזמן קצר. בשלב בא, ε biotinylated הועמס על החיישנים. אין ניתוק לגילוי של ε התרחש לאורך כל השלבים הנותרים כפי שניתן לראות מעקומת ההתייחסות (G) שלא הייתה לו שותף מחייב הוסיף. חיישן התייחסות שני (H) היה נטול חלבון משותק והראה ספציפי מחייב נמוך של שותף המחייב. ריכוזים שונים של F 1 (-ε) שימשו בשלב העמותה ...

הפרוטוקולים כאן לתאר מבחני הקינטית של חלבונים אינטראקציות עם Interferometry Bio-השכבה. ה-ATP synthase F-הסוג, שהוא מעורב בחילוף חומרים של אנרגיה בתאים, יכול להיות מעוכב על ידי מקטע ε בחיידקים. יש לנו להתאים Interferometry Bio-שכבה כדי לחקור אינטראקציות של קומפלקס קטליטי עם התחום בטרמינל C-המעכב של ε.

Interferometry Bio-שכבה למדידת קינטיקה של חלבונים אינטראקציות והשפעות יגנד allosteric

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא למדוד קינטיקה של חלבון, אינטראקציות בין חלבונים והשפעות אלוסטריות של ליגנדים קטנים על אינטראקציות אלו באמצעות אינטרפרומטריית שכבת ביולוגית, BLI. דבר זה מושג על ידי הכנת אחד החלבונים עם ביוטין ספציפי וקיבועה במקביל על פני שטח של חיישנים ביולוגיים מצופים בסטרפטאווידין.כשלב שני, החלבון הקשור לחיישן נחשף לתמיסת באפר המכילה את השותף לקשירה שלו, והקשירה נמדדת בזמן אמת על ידי השפעתה על ההתאבכות האופטית על פני השטח של החיישן. לאחר מכן, כל חיישן מועבר לתמיסת באפר ללא השותף לקשירה כדי למדוד את הדיסוציאציה של החלבון בזמן אמת. קומפלקסים של חלבונים.התוצאות שהתקבלו מאפשרות קביעה של קבועי הקצב הקינטיים של הקישור והדיסוציאציה של החלבונים המתרחפים, ובכך את זיקת הקישור שלהם. תוצאות נוספות מראות כי BLI יכולה לזהות את השפעתם של ליגנדים קטנים על קצב הדיסוציאציה של קומפלקס החלבון-חלבון. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון תהודה פלזמונית עיטפתית (surface plasma resonance), הוא ש-BLI אינה רגישה יתר על המידה לשינויים במקדם השבירה.לפיכך, שלבי הקישור והאסוציאציה יכולים לכלול שינויים בליגנדים קטנים כדי לבחון את השפעתם על אינטראקציות בין חלבונים בזמן אמת. עם זאת, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי קינטיקה של אינטראקציה בין חלבונים. ניתן ליישם אותה גם על שילובים שונים,

bio-layer-interferometry-for-measuring-kinetics-protein-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

אנו מיישמים ללא תווית חלבון אינטראקציה באמצעות ניתוח X100 Biacore לניתוח המבנה והתפקוד של הכריכה של מוטציות ב 'מספר cystatin כדי papain דרך אפיון קינטי. כיול ללא ניתוח ריכוז (CFCA) מודד את הריכוז של חלבון עם פעילות מחייב שמר ללא צורך עקומת סטנדרט. אנו מראים כי אישור של ריכוזי באמצעות CFCA מגבירה את האמינות של הניתוח הקינטית כי קבועים הקינטית יכול להיקבע בצורה אמינה, גם אם את פעילותו של חלבון רקומביננטי מצטמצם.

חשיבותה של ריכוז חלבון נכון עבור קינטיקס וקביעת זיקה בניתוח מבנה פונקציה

בסרטון זה, אנו מדגימים טכנולוגיית אינטרפרומטריה ביו-שכבתית (BLI) כדי לזהות את האינטראקציות הבין-מולקולריות בין ליגנדות ואנליטות מטרה בזמן אמת. BLI מודד שינויים בתבנית ההתאבכות של אור לבן המוחזר משכבה של ליגנדים משותקים על משטח ביו-סנסור בזמן שהם מתקשרים עם אנליטים בתמיסה.

טכנולוגיית אינטרפרומטריה ביו-שכבתית לזיהוי אינטראקציות בין ליגנד לאנליט

פרוטוקול כאן מתאר את האינטראקציות של מטוהרים hEAG1 יון ערוץ חלבון עם מולקולה קטנה השומנים ליגנד phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (פיפ2). המדידה מדגים כי מתה על יכול להיות שיטה אפשרית להקרנה ליגנד ערוץ הרומן יון מולקולה קטנה.

לכידת את האינטראקציה קינטיקה החלבון תעלת יונים עם מולקולות קטנות על ידי וזמינותו אינטרפרומטריה ביו-שכבה

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לנטר את הרכבה ופירוק של הרעלן גחלת באמצעות biolayer אינטרפרומטריה (בלי). בעקבות הרכבה/פירוק על פני ביוסנסור, משתחררים את מתחמי חלבון גדולה מפני השטח עבור פריט חזותי וזיהוי של רכיבי מתחמי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני ו ספקטרומטר מסה, בהתאמה.

ניתוח דינאמי חלבון מתחמי נאסף בנושא ושוחרר מן Biolayer אינטרפרומטריה ביוסנסור באמצעות ספקטרומטר מסה ואלקטרון

אינטראקציות של גורמי שעתוק (TFs) עם RNA פולימראז הם בדרך כלל לומדים באמצעות הנפתח assays. אנו מיישמים טכנולוגיה של ביואולייר אינטרפרומטריה (בלי) כדי לאפיין את האינטראקציה של GrgA עם לא RNA פולימראז. בהשוואה למטה מוסר, בלי מזהה בזמן אמת שיוך ודיסוציאציה, מציע רגישות גבוהה יותר, והוא כמותי מאוד.

יישום של ביואולייר אינטרפרומטריה (בלי) ללימוד אינטראקציות חלבונים-חלבונים בתמלול

מאמר זה מתאר פרוטוקול לחקר אינטראקציות דנ"א-חלבון באמצעות מערכת אינטרפרומטריה ביו-שכבתית מבוססת סטרפטווידין (BLI). הוא מתאר את השלבים והשיקולים החיוניים לשימוש בקינטיקה מחייבת בסיסית או מתקדמת כדי לקבוע את זיקת קשירת שיווי המשקל (KD) של האינטראקציה.

ניתוח אינטראקציות DNA-חלבון עם אינטרפרומטריה ביו-שכבתית מבוססת סטרפטווידין

פרוטוקול פשוט כדי לקבוע את תוכן שומנים הניטרלי של תאי אצות באמצעות הליך מכתים הנילוס אדום מתואר. טכניקה לחיסכון בזמן זה מציעה אלטרנטיבה לפרוטוקולי כימות מסורתיים מבוסס gravimetric שומנים בדם. זה תוכנן עבור היישום הספציפי של ביצועי Bioprocess הניטור.

פשוט ומהיר פרוטוקול למדידת שומנים ניטרלי בתאי אצות באמצעות הקרינה

ניתן להשתמש בננוסקופיה של בדיקה קולואידית במגוון תחומים כדי לקבל תובנה לגבי היציבות הפיזית וקינטיקה של קרישה של מערכות קולואידיות ולסייע במדעי גילוי וניסוח תרופות באמצעות מערכות ביולוגיות. השיטה המתוארת בה מספקת אמצעי כמותי ואיכותי לחקר מערכות כאלה.

בחינה כמותית ואיכותי של אינטראקציות חלקיקי חלקיקים באמצעות קולואיד Probe Nanoscopy

הפרוטוקולים המוצגים מתארים שתי טכניקות מבוססות EIA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) לחקירה מהירה של אינטראקציות ליגנד-רצפטור: האסיי הראשון מאפשר את קביעת קבוע הדיסוציאציה בין ליגנד לרצפטור. האסיי השני מאפשר סינון מהיר של פפטידים חוסמי אינטראקציות ליגנד-רצפטור.

מבוסס ELISA כריכה ותחרות שיטה במהירות לקבוע אינטראקציות ליגנד לרצפטור

כאן אנו מציגים שיטה לסינתזה של ננו-חלקיקי קדמיום גופרתי (CdS) נטולי ליגנד המבוססים על קופולימר גופרית ייחודי. קופולימר הגופרית פועל כממס בטמפרטורה גבוהה ומקור גופרית במהלך סינתזת הננו-חלקיקים ומייצב את הננו-חלקיקים לאחר התגובה.

סינתזה של חלקיקים CDS-חינם ליגנד בתוך מטריקס קופולימר גופרית

למד מדידת קינטיקה של אינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות אינטרפרומטריית Bio-layer. השיטה מאפשרת חקר אפקטים אלוסטריים של ליגנדים קטנים על ATP synthase מסוג F בזמן אמת.

Interferometry Bio-שכבה למדידת קינטיקה של חלבונים אינטראקציות והשפעות יגנד allosteric

גלה סרטונים נוספים