Name: נוקלאוזידים triphosphates - מ - סינתזה ביוכימיה באפיון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-03T16:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 22 s
Description: למד סינתזה של נוקלאוזידים triphosphates מסומנים בביוכימיה באמצעות תגובת ארבע שלבים בכלי אחד. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לייצר תרכובות טהורות ליישומים בכימיה של חומצות גרעין.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן השוויצרית הלאומית למדע (מענקי N ° PZ00P2_126430 / 1 וPZ00P2_144595). פרופ &#39;ג Leumann הוא הודה בהכרת תודה למתן חלל המעבדה וציוד, כמו גם לתמיכה המתמדת שלו. הגב &#39;סו Knecht הוא הודה לדיונים פוריים.

1. סינתזה של triphosphates נוקלאוזידים השתנה הגישה סינתטית נבחרה להלן השיטה שפותחה על ידי לודוויג ואקשטיין מאחר ושיטה זו היא בדרך כלל אמינה ומובילה למעט מאוד תופעות לוואי (איור 1 א) 39. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coevaporate נוקלאוזידים המוגן 3&#39;-OAC כראוי (בדרך כלל 0.1 מילימול) פעמיים עם פירידין נטול מים (2 מיליליטר) ולאחר מכן יבש תחת ואקום הלילה. במקביל, pyrophosphate היבש tributylammonium (0.13 מילימול) תחת ואקום הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את נוקלאוזידים במינימום של פירידין היבש (0.2 מיליליטר) ולהוסיף dioxane היבש (0.4 מיליליטר) כcosolvent. לבסוף, להוסיף 2-כלורו-1-,3,2 benzodioxaphosphorin-4-אחד (0.11 מילימול) ומאפשר להגיב בטמפרטורת חדר למשך 45 דקות. הערה: ראוי לציין כי טיפול מסוים צריך לקחת עם המגיב ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-2-אחד כלורו-1. ואכן, גם אחסון של המגיב הזה, לפי atmosp גז אינרטיכאן הוא לא מספיק כדי למנוע הפירוק שלה. לפיכך, אפשר וצריך לגרד הלבן מוצקים שנוצר בפירוק זה לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של pyrophosphate tributylammonium בDMF היבש (0.17 מיליליטר) וtributylamine טרי מזוקק (58 μl; לא להוסיף מסננות מולקולריות). מוסיף את הפתרון שהתקבל לתערובת התגובה (משקע לבן מופיע אבל מהר נעלם) ומאפשר להגיב בטמפרטורת חדר למשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של יוד (0.16 מילימול) בפירידין (0.98 מיליליטר) ו-H 2 O (20 μl) ולהוסיף לתערובת התגובה על מנת לחמצן Pα (שלישי) במרכז. אפשר הפתרון הכהה שנוצר כדי לעורר בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתמיסה מימית 10% מNAS 2 O 3 כדי להרוות את עודפי 2. הסר את הממס תחת ואקום (הטמפרטורה של אמבט המים של המאייד הסיבובי חייבת להישמר מתחת 30 מעלות צלזיוס). הוספת H 2 O (5 מיליליטר) ולאפשר למילxture לעמוד בטמפרטורת חדר במשך 30 דקות לhydrolyze מחצית אדנוזין המחזורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, קבוצות הגנת מוסרים בדרך כלל (כלומר, 3&#39;-OAC והקבוצות ברשתות בצד של Nucleobase). כתוצאה מכך, להוסיף 4 OH NH (30% H 2 O, 10 מיליליטר) לגולמי ומערבבים ל1.5 שעות בטמפרטורת חדר, ולהסיר את הממס תחת ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר של H 2 O ופיצול ל 2 צינורות. הוספת 12 מיליליטר של פתרון 2% מ4 NaClO באצטון וצנטריפוגה (1,000 XG) במשך 30 דקות. הליך זה חוזר על עצמו עוד פעם אחת. משקעים זה מאפשר את ההפרדה של הממסים וחומרים כימיים המשמשים בסינתזה מאדנוזין (שיזרז), ובכך לפשט את טיהור RP-HPLC שהתפתח באופן משמעותי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי אוויר ייבוש של השאריות שומניות, להקליט ספקטרום P-NMR יום 31 של גולמי (בעקבות הליכים סטנדרטיים, ראה גם רשימה של חומרים ואיור 3) ולפזר ב4 מיליליטר H 2 O. הערה: הליך סינטטי זה מתמקד בעיקר בדור של triphosphates deoxynucleoside שונה, אבל הליך דומה מאוד יכול להיות מיושם לעמיתי RNA שלהם (פשוט על ידי שימוש 2 &#39;, 3&#39;-BIS-acetylated O מבשרים). </li></ol> 2. טיהור HPLC של triphosphates נוקלאוזידים השתנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרון M מניית 1 של יקרבונט triethylammonium (TEAB): 40 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של שומה 1 של triethylamine (139 מיליליטר) ב≈ 600 מיליליטר של H 2 O. מזוקק והמסונן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בועת CO 2 (באמצעות קרח יבש וbubbler גז) לתוך התמיסה תחת ערבוב נמרץ, עד pH של 7.6 הוא הגיע (זה ייקח לפחות 10 hr). פתרון מניות זה ניתן לאחסן במקרר לתקופה של עד חודש אחד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיהור: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שני פתרונות חיץ ממניות 1 M: 2 L של 50 מ&quot;מ TEAB במי ultrapure (eluent)nd 1 ליטר של 50 מ&quot;מ TEAB ב50% MeCN (eluent ב &#39;). דגה גם eluents תחת ואקום וערבוב במשך 20 דקות (נדרש תשומת לב קפדנית על מנת שלא לשנות את רמת החומציות על ידי הסרת ה-CO 2 במהלך degassing). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מדגם אנליטית על ידי המסת 10 μl של אדנוזין הגולמי ב300 μl מזוקק H 2 O ולהזריק לתוך מערכת HPLC מצוידת בעמודה למחצה preparative RP (C18) ובאמצעות שיפוע החל 0-100% B ב40 דקות (איור 4). התאם את תכנית HPLC לפי t R של אדנוזין (שהיא בדרך כלל השיא העיקרי בהכרומתוגרמה) ודיפוספט (שבה יש לא R מעט נמוך יותר). לטהר את התערובת גולמי באמצעות תנאים אלה ועל ידי הסרת שברים מוקדמים שעשויים להכיל כמה דיפוספט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את כל השברים המכילים את המוצר ולהקפיא יבשים (שהוא העדיף אידוי על המאייד הסיבובי על מנת למזער הידרוליזה לdiphosph לא רצויאכלתי). Coevaporate מספר פעמים עם המים ultrapure (כדי להסיר triethylamine שריד מeluents). להעריך את הטוהר של אדנוזין ידי תמ&quot;ג (שני H 1 וNMR 31 בP) וMALDI-TOF על ידי יישום של פרוטוקולים סטנדרטיים (ראה איור 5). תשואות אופייניות מתקבלות על ידי יישום של פרוטוקול זה בדרך כלל לשקר בטווח של 30-70%, בהתאם למצע. </li></ol></li></ol> 3. תגובות הארכת פריימר ופלמור TdT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיוג סוף 5&#39;-של פריימר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 30 pmol של פריימר המתאים (למשל P1, רשימה של חומרים) עם 4 μl של 10x קינאז Polynucleotide חיץ (PNK), 3 μl של γ-[P 32]-ATP, μl 1 של PNK, וDDH 2 O (עבור בסך הכל תגובת נפח 40 μl). דגירה את תערובת התגובה על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ולאחר מכן חום לבטל את קינאז (10 דקות ב 70 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תגובת התיוג להכיןעמודת G10 Sephadex ידי חיבור קצה פיפטה 1 מיליליטר עם צמר זכוכית silanized וממלא את הקצה עם פתרון G10 (10% בDDH 2 O, autoclaved). ספין למטה לשטוף שלוש פעמים עם 500 μl DDH 2 O ולשטוף סופיים אחד עם DDH μl 50 2 O. הפעל את תערובת התגובה דרך G10 (כדי להסיר את תווית רדיואקטיבית חינם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ג&#39;ל לטהר (עמוד 20%) פריימר radiolabeled ולשחזר על ידי יישום של ההתאהבות ולספוג שיטה (elution כלומר עם 500 μl של תמיסה מימית המכילה 1% LiClO 4 ו 1 מ&quot;מ נטה 3 (pH 8) בשעה 72 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות). משקע אתנול וG10 desalt oligonucleotide eluted. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תגובת הארכת פריימר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשל 1 pmol של P1 פריימר radiolabeled, 10 P1 פריימר pmol, ו10 pmol של T1 תבנית (רשימה של חומרים) בחיץ 10x תגובה (המסופק על ידי הספק של פולימראז לשמש) על ידי הצבת tאופה ב( 90-95 מעלות צלזיוס) מים חמים ועל ידי מתן אפשרות להתקרר בהדרגה לטמפרטורת חדר (מעל 45 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הצינור על קרח ולהוסיף (בתורו) קוקטייל dNTP (המכיל גם שונה וtriphosphates הטבעי, 100 מיקרומטר ריכוז סופי) ו1 U של DNA פולימרז (Vent (Exo -), Klenow, PWO או 9 ° N מ &#39;) ולהשלים עם מים (על סך נפח תגובה של 20 μl). דגירה בטמפרטורה האופטימלית העבודה של האנזים (למשל 60 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כאשר Vent (Exo -) נמצא בשימוש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של להפסיק פתרון (פוראמיד (70%), חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA; 50 מ&quot;מ), bromophenol הכחול (0.1%), cyanol קסילן (0.1%)), לחמם את הדגימות (95 ° C, 5 דקות), מגניב למטה (0 מעלות צלזיוס), וליישב בdenaturing ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide. דמיין ידי Phosphorimager. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פילמור TdT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 7 pmol של אחד גדילים, P2 פריימר ללא תווית (רשימת החומרים), pmol 1 של פריימר radiolabeled במאגר TdT μl 1 10x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הצינור על קרח ולהוסיף (בתורו) קוקטייל dNTP (בריכוז נאות המורכב בין 10 200 מיקרומטר) ופולימראז TdT (4 U). לדגור על C ° 37 במשך שעה 1. הוסף 10 μl של להפסיק פתרון, לחמם את הדגימות (95 ° C, 5 דקות), להתקרר (0 מעלות צלזיוס), וליישב בdenaturing ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide (עמוד 15%). דמיין ידי Phosphorimager. </li></ol></li></ol> 4. PCR עם triphosphates נוקלאוזידים השתנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 8 pmol של שני קדימה לאחור פריימרים עם 0.5 pmol של התבנית להיות מוגבר. הוספת 10x חיץ תגובה וקוקטייל dNTP (לצורך ריכוז סופי 200 מיקרומטר) ולשים את הצינור על קרח. הוסף 1 U של פולימראז ה-DNA ולהשלים עם H 2 O להגיע נפח סופי של μl 20. מעביר את התערובת לתוך בקבוקון PCR ולבצע 30 מחזורי ה-PCR.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 6 μl עם 6 μl של חיץ טעינת סוכרוז 2x ולפתור על ידי 2% agarose (מוכתם ברומיד ethidium) אלקטרופורזה. דמיין ידי Phosphorimager. </li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הכללת שינויים בחומצות גרעין היא עניין של יישומים מעשיים רבים, כולל הפיתוח של סוכני antisense וantigene 42,43, תיוג ותיוג פונקציונלי של oligonucleotides 41, ובמאמצים להרחיב את האלפבית הגנטי 44-46. שינויים כימיים וקבוצות פונקציונליות בדרך כלל מוכנסים חומצות גרעין על ידי יישום של פרוטוקולי סינתזה מוצק שלב סטנדרטיים ואוטומטיים. עם זאת, אבני בניין phosphoramidite צריך להיות עמיד לתנאים הקשים למדי שהוטלו על ידי מתודולוגיה זו, אשר בתורו מטילה הגבלות חמורו...

<html> triphosphates 5&#39;-נוקלאוזידים ((ד) NTPs) מייצג סוג של ביומולקולות חיונית כי הם מעורבים בתהליכים אינספור פונקציות הנעים מלהיות המטבע האוניברסלי של אנרגיה לרגולטורים של חילוף חומרים בתא. בנוסף לתפקידם בשינויים הביולוגיים הבסיסיים אלה, עמיתים השונים קידמו כפלטפורמה תכליתית וקלה לכניסתה של קבוצות פונקציונליות לoligonucleotides, המתודולוגיה שיפה משלימה את הסינתזה מוצק שלב האוטומטי המיושמת בדרך כלל 1,2. ואכן, בתנאי NTPs (ד) יכול לפעול כמצעים לpolymerases RNA ו-DNA 3, עושר של קבוצות פונקציונליות כוללים חומצות אמינו 4-13, חומצות boronic 14,15, nornbornene 16, שאריות כמו diamondoid 17, תופעות שרשרות ל organocatalysis 18, חומצות מרה 19, ואפילו oligonucleotides 20 יכול להיות מוחדר oligonucleotides. _content &quot;&gt; מעבר לייצוג וקטור נוח לfunctionalization של חומצות גרעין, יכול להיות מעורב dNTPs שונה בSelex ושיטות אחרות הקשורים קומבינטורית של בחירה במבחנה לייצור חומצות גרעין שונה קטליטי 21-30 וaptamers ליישומים מעשיים שונים 10, 31-36. צד רשתות נוספות שהוצגו על ידי פילמור של dNTPs שונה הם חשבו להגדיל את השטח הכימי שניתן לחקור בניסוי בחירה ולהשלים את הארסנל התפקודי עני למדי של חומצות גרעין 37. עם זאת, למרות אלה תכונות אטרקטיביות וההתקדמות האחרונה שנעשתה בפיתוחם של שני סינטטי ושיטות אנליטיות, לא ישימה באופן אוניברסלי והליך תשואה גבוהה קיימים לצורפות של triphosphates נוקלאוזידים הותאם 2,38. מטרת הפרוטוקול נוכחי זה היא לשפוך אור לתוך (לפעמים) לא מובילים הליכים מורכביםo הסינתזה והאפיון ביוכימי של אבני הבניין הופעל אלה (איור 1). דגש מיוחד יינתן על כל הפרטים סינטטיים שלעתים קרובות קשים למצוא או נעדרים בסעיפי ניסיוני, אבל הם עדיין חיוניים להשלמה המוצלחת של המסלול הסינתטי שהובילה לבידודה של NTPs הטהור (ד) (איור 1).

<table><tbody><tr><td>טריבוטילאמוניום פירופוספט&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8533</td><td>מוצק היגרוסקופי, שמור תחת Ar</td></tr><tr><td>2-Chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>324124</td><td>פירידין רגיש ללחות</td></tr><tr><td></td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>82704</td><td>מתחת למסננות מולקולריות</td></tr><tr><td>דיוקסאן</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>296309</td><td>מתחת למסננות מולקולריות</td></tr><tr><td>דימתילפורממיד (DMF)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>40248</td><td>מתחת למסננות מולקולריות</td></tr><tr><td>אצטוניטריל&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td></td><td>HPLC</td></tr><tr><td>טריאתילאמין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>90342</td><td></td></tr><tr><td>טריבוטילמין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>90781</td><td></td></tr><tr><td>ddH2</td><td>O Milli-Q</td><td></td><td>מים נטולי יונים ומטוהרים, אוטוקלאב בנוכחות דיאתילפירוקרבונט (DEPC</td></tr><tr><td>)דיאתילפירוקרבונט (DEPC)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>159220</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>מעבדות איזוטופ קיימברידג', בע"מ</td><td>DLM-4-25</td><td></td></tr><tr><td>&#947;-[32P]-ATP</td><td>Hartmann Analytics</td><td>FP-301</td><td></td></tr><tr><td>טבעי dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1420</td><td></td></tr><tr><td>Vent (exo-) DNA פולימראז</td><td>NEB</td><td>M0257S</td><td></td></tr><tr><td>DNA פולימראז I, שבר גדול (Klenow)</td><td>NEB</td><td>MO210S</td><td></td></tr><tr><td>9&deg; Nm DNA פולימראז</td><td>NEB</td><td>MO260S</td><td></td></tr><tr><td>מסוף דאוקסינוקלאוטידיל טרנספראז (TdT)</td><td>Promega</td><td>M828A</td><td></td></tr><tr><td>Pwo DNA פולימראז</td><td>Peqlab</td><td>01 01 5010</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>Thermo Scientific</td><td>EK0032</td><td></td></tr><tr><td>אקרילאמיד/ביסקרילאמיד (19:1, 40%)</td><td>Serva</td><td>10679.01</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Apollo Scientific</td><td>BIA1177</td><td></td></tr><tr><td>G10 Sephadex</td><td>Sigma</td><td>G10120</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Apollo Scientific</td><td>BIU4110</td><td></td></tr><tr><td>Jupiter חצי הכנה RP-HPLC עמודה (5&#956; C18 300 &Aring;)</td><td>Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene Q Thermal Cycler</td><td>Bioconcept</td><td>BYQ6042E</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני PCR</td><td>Bioconcept</td><td>3220-00</td><td></td></tr><tr><td>מערכת HPLC</td><td>Amersham Pharmacia Biotech</td><td></td><td>&Auml; kta בסיסי 10/100</td></tr><tr><td>כל האוליגונוקלאוטידים נרכשו ממיקרוסינת' וטוהרו על ידי PAGE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&#039;-CAAGGACAAAATAC 
CTGTATTCCTT P1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&#039;-GACATGAGAGA 
CATCGCCTCTGGGCTA 
ATAGGACTACTTCTAAT 
CTGTAAGAGCAGATCC 
CTGGACAGGCAAGGAA 
TACAGGTATTTTGTCCTTG T1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&#039;-GAATTCGATATCAAG P2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">מידע נוסף על נהלים וציוד ניסיוני ניתן למצוא במאמרים הבאים: 
Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330 
Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F</td></tr></tbody></table>

נוקלאוזידים triphosphates - מ - סינתזה ביוכימיה באפיון

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

האסטרטגיה המסורתית להקדמה של פונקציות כימיות היא השימוש בסינתזה מוצק שלב על ידי צירוף מבשרי phosphoramidite הותאמו כראוי לרשת המתהווה. עם זאת, תנאי שימוש במהלך הסינתזה וההגבלה לרצפים קצרים ולא לעכב את תחולתה של מתודולוגיה זו. מצד השני, triphosphates נוקלאוזידים שונה מופעלים אבני בניין שכבר מועסק להקדמה קלה של קבוצות פונקציונליות רבות לחומצות גרעין, אסטרטגיה שסוללת את הדרך לשימוש בחומצות גרעין שונה בפלטה רחבה של יישומים מעשיים כגון תיוג ודור תפקודיים של ribozymes וDNAzymes. אחד האתגרים הגדולים מתגורר במורכבות של המתודולוגיה שמוביל לבידוד והאפיון של אנלוגים נוקלאוזידים אלה. במאמר זה וידאו, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לסינתזה של thesדואר שונה אנלוגים באמצעות זרחן ריאגנטים מבוסס (III). בנוסף, ההליך לאפיון ביוכימי שלהם הוא חשף, עם דגש מיוחד על תגובות הארכה תחל ופילמור עוקב TdT. פרוטוקול מפורט זה יהיה שימוש לצורפות של dNTPs שונה והשימוש נוסף שלהם בביולוגיה כימית.

triphosphates נוקלאוזידים שינוי הינו מפתים מטרות סינתטיות שכן הם מאפשרים להקדמה הקלילה של מגוון רחב של קבוצות פונקציונליות לחומצות גרעין 41. עם זאת, הבידוד והאפיון של אבני הבניין הופעל אלה מתגלים לעתים קרובות להיות מפרכים. כתוצאה מכך, התוצאות הראו במסמך זה נחשבות לספק יד מסייעת לבצע את השלבים השונים בתהליכים ביוכימיים סינטטיים והאמורים (איור 1). בפרט, איור 3 מציג ספקטר...

הפרוטוקול המתואר במסמך זה נועד להסביר ולקצר מספר רב של מכשולים בדרכו של המסלול המורכב המוביל לtriphosphates נוקלאוזידים שונה. כתוצאה מכך, פרוטוקול זה מאפשר גם לסינתזה של אבני הבניין הופעל אלה וזמינותם ליישומים מעשיים.

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

המטרה הכוללת של סרטון זה היא להדגים את ההליך מסינתזה של פוספטים נוקלאוזידים ששונו ועד לאפיון הביוכימי המלא שלהם. זה מושג על ידי המרה ראשונה של מבשר הנוקלאוזיד המוגן כראוי לטרי פוספט המתאים על ידי יישום הליך סיר אחד בן ארבעה שלבים. השלב השני הוא לטהר את הטרי פוספט המתקבל תחילה על ידי משקעים ולאחר מכן על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בשלב הפוך.לאחר מכן, האנלוגי התלת-פוספט מאופיין בתהודה מגנטית גרעינית ובסיוע מטריצה לייזר יינון זמן טיסה או NMR ומלוף כדי להבטיח טוהר גבוה. השלב האחרון הוא תגובות הארכת פריימר ותגובות פילמור דאוקסי נוקלאוטיד טרנספראז או TDT. בסופו של דבר, תוצרי התגובה, ובכך קבלת המצע של הטרי פוספט מנותחים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל.היתרון בשיטה זו בהשוואה לאסטרטגיות סינתטיות אחרות כמו גישת בורגה, הוא שנוצרים פחות תוצרי לוואי, ולכן הטיהור קל יותר. בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו יתקשו מכיוון שמדובר בהליך ארוך ומורכב למדי הדורש ידע במספר תחומים. הרעיון לשיטה זו היה לצלם לראשונה כאשר סינתזנו פוספטים מהונדסים ומצאנו שזה די מאתגר למצוא הליך מפורט.יתרון נוסף של שיטה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי להתמודד עם שאלות אחרות בתחום חומצות הגרעין ששונו. ואכן, ניתן להשתמש בו כדי לבחור אנזימי DNA המזרזים מגוון רחב של תגובות. בנוסף, ניתן להשתמש בשיטה זו לתיוג פונקציונלי של חומצות גרעין.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד שלבי סינתזה וטיהור מכיוון שטרי פוספטים הם נגזרות קוטביות ומופעלות שיש לטפל בהן בזהירות. כדי להתחיל, יש לאדות את הנוקלאוזיד המוגן על ידי שלושה ראשונים פעמיים עם שני מיליליטר של פורין נטול מים לפני ייבוש בוואקום למשך הלילה. במקביל, אמוניום פירופוספט יבש בוואקום למשך הלילה למחרת המיס את הנוקלאוזיד במינימום של 200 מיקרוליטר של פירידין יבש.לאחר מכן הוסף 400 מיקרוליטר דיאוקסאן יבש כממס COS. לבסוף, הוסף את נגזרת הזרחן המחזורית שלוש ואפשר לה להגיב בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות. לאחר מכן, הכינו תמיסה של בוטיל אמוניום פירופוספט יבש ב -170 מיקרוליטר דימתילפורממיד יבש ו -58 מיקרוליטר טרי בוטיל אמין מזוקק.הוסף את התמיסה המתקבלת לתערובת התגובה ואפשר לה להגיב בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות. לאחר מכן הכינו תמיסה של 160 יוד מיקרו-מולרי ב -980 מיקרוליטר פורין ו -20 מיקרוליטר מים. הוסף את התמיסה לתערובת התגובה.על מנת לחמצן את מרכז האלפא זרחן. אפשר לתמיסה הכהה המתקבלת לערבב בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. השתמש בתמיסה מימית של 10% של נתרן תיו סולפט כדי להרוות את עודפי היוד.הסר את הממס בוואקום. לאחר מכן מוסיפים חמישה מיליליטר מים ומניחים לתערובת לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי להידרוליזה של מוטי התלת-פוספט המחזורי. בשלב זה, קבוצות ההגנה מוסרות בדרך כלל.כתוצאה מכך, הוסף 30% אימודיום הידרוקסיד לדגימה הגולמית. מערבבים 1.5 שעות בטמפרטורת החדר לפני שמוציאים את הממס בוואקום. לאחר מכן, הוסיפו שני מיליליטר מים וחלקו את התערובת לצינורות צינור.הוסף 12 מיליליטר של תמיסה של 2% נתרן לכלוראט באצטון ובצנטריפוגה למשך 30 דקות לפני שתחזור על ההליך. עוד פעם. הריאגנטים המשמשים בסינתזה מהטרי פוספט יזרזו יצירת שאריות שמנוניות ויאפשרו הפרדת הממיסים, ובכך יפשטו את טיהור ה-HPLC בשלב ההפוך באופן משמעותי לאחר ייבוש אוויר של השאריות השומניות.רשום ספקטרום תמ"ג P 31 של הדגימה הגולמית על פי נהלים סטנדרטיים. לאחר NMR המיס את שאריות השומן בארבעה מיליליטר מים מזוקקים. התחל בטיהור HPLC עם הכנת 50 מילי-מולרית טריאתיל אמוניום ביקרבונט במים טהורים במיוחד כ-EENT A וב-50% אצטיל ניטריל כ-EENT B כמפורט בפרוטוקול הטקסט, Degas הן EENT בוואקום והן תוך ערבוב במשך 20 דקות.הכן דגימה אנליטית על ידי המסת 10 מיקרוליטר של הטרי פוספט הגולמי ב-300 מיקרוליטר מים מזוקקים. לאחר מכן שימוש בשיפוע שנע בין 0%B ל-100%B תוך 40 דקות. הזרקו את הדגימה למערכת HPLC המצוידת בעמודת שלב C 18 הפוכה למחצה.התאם את תוכנית HPLC בהתאם לזמן השמירה של הטרי פוספט והדיפוספט. טהר את התערובת הגולמית בתנאים אלה ועל ידי הסרת שברים מוקדמים שעלולים להכיל מעט דיפוספט, שלב את כל השברים המכילים את המוצר והקפיא יבש. לאחר מכן התאדה מספר פעמים עם מים טהורים במיוחד.להעריך את טוהר הטרי-פוספט על ידי תמ"ג ומלוף על ידי יישום פרוטוקולים סטנדרטיים. התשואות האופייניות המתקבלות על ידי יישום פרוטוקול זה נעות בטווח של 30 עד 70% בהתאם למצע לחמישה ראשוניים ותיוג הפריימר. מערבבים את הפריימר והריאגנטים כמפורט בפרוטוקול הטקסט ומדגרים את תגובת התיוג ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.במהלך תגובת התיוג, הכינו עמודת cidex G 10 על ידי חיבור קצה פיפטה של מיליליטר אחד עם צמר זכוכית מבודד ומילוי הקצה בתמיסת G 10. יש לסובב ולשטוף שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים ושטיפה אחרונה אחת עם 50 מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים. לאחר הדגירה של תגובת התיוג, החום מנטרל את הקינאז למשך 10 דקות בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, העבירו את תערובת התגובה דרך ה-G 10. כדי להסיר את ג'ל התווית הרדיואקטיבי החופשי, יש לטהר את הפריימר המסומן ברדיו ולהתאושש על ידי יישום שיטת הריסוק וההשרייה, אתנול משקע ו- G 10 ממליח את האוליגונוקלאוטיד החמקמק. לתגובת הארכת הפריימר, שלב שומה אחת של PICA של פריימר עם תווית רדיו, P אחד 10 שומות PICA של פריימר, P אחד ו-10 שומות PICA של תבנית, T אחד ב-10 x מאגר תגובה וכרע ברך במים חמים.לאחר מכן מצננים בהדרגה לטמפרטורת החדר במשך 45 דקות. הניחו את הצינור על קרח והוסיפו את הפוספט הנוקלאוזיד או קוקטייל ה-DNTP ויחידה אחת של קרח ה-DNA פולימראז. השלם את התגובה במים בנפח כולל של 20 מיקרוליטר דגירה בטמפרטורת העבודה האופטימלית של האנזים.לאחר מכן מוסיפים 20 מיקרוליטר של תמיסת עצירה ומחממים את הדגימות בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. מגניב, הדגימות יורדות באפס מעלות צלזיוס. לפני הפתרון על ידי דנטורציה של אלקטרופורזה של ג'ל פולי אקרילאמיד.דמיין את הלהקות על ידי הדמיית פוספו לפילמור TDT, לדלל פריימר חד-גדילי ללא תווית P שניים ופריימר עם תווית רדיו במיקרוליטר אחד של מאגר TDT. שים את הצינור על קרח והוסף את קוקטייל ה-DNTP ואת ה-TDT פולימראז ואז דגר ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר הדגירה, הוסף 10 מיקרוליטר מתמיסת העצירה לפני חימום הדגימות ב-95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ולאחר מכן התקרר באפס מעלות צלזיוס.לאחר פתרון הדגימה על ידי דנטורזה של אלקטרופורזה של ג'ל פולי אקרילאמיד, דמיין את הרצועות באמצעות הדמיית פוספו. מוצג כאן ספקטרום P 31 NMR גולמי טיפוסי של DNTP שונה שבו ניתן לצפות באותות האופייניים של מרכזי הזרחן. בנוסף, אותות הנובעים מהצד הדיפוספט והמונופוספט.מוצרים יחד עם פוספטים גבוהים יותר נצפים תמיד בשלב זה. ניתוח HPLC שלב הפוך של התערובת הגולמית מוצג כאן. השיא העיקרי מתאים לחמשת הפוספטים הראשוניים, בעוד שתוצר הלוואי העיקרי, חמשת הפוספטים הראשוניים מציג זמן שמירה מעט נמוך יותר.לבסוף, לאחר שלב הפוך יסודי, טיהור HPLC, ה-DNTP השונה מאופיין ב-NMR ומלדי שמוצג כאן הוא ספקטרום ה-maloff של הסולפה ide, אנלוגי DUTP שונה. ניתן לראות את תוספת הנתרן בטעינת יתר של מסה של 712.54, ואין זכר לדיפוספט. גם ה-P 31 NMR וגם ספקטרום ה-NMR של הפרוטונים חיוניים להערכת הטוהר של ה-dps ששונה.מכיוון שנוכחותם של צבע לא רצוי ומונו פוספטים נותנת אותות ייחודיים המומחשים, הנה התוצאה של תגובות הרחבה ראשוניות עם DUTP שונה DUTP שונה ו-DCTP שונה בחומצה ולרית המשמשים כשינויים בודדים כשילובים של שני DN dps ששונו או יחד, יחד עם DGTP טבעי בודד. לבסוף, תגובות פילמור מייצגות בתיווך TDT עם אנלוגים שונים של DUTP ששונו נותחו עם אלקטרופורזה של ג'ל פולי אקרילאמיד דנטור. בהקשר זה, DUTP מותאם לפרולין cis ו-DUTP ששונה בפפטיד הם המצעים הטובים ביותר ל-TDT.מכיוון שיעילות הזנב דומה או עולה על זו של ה-DTTP הטבעי במקום זאת, DUTP שונה באוריאה הוא מצע גרוע למדי בהקשר זה. מכיוון שמעט פיזור פולי, ניתן לצפות באוליגונוקלאוטידים בגודל ארוך יותר לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשבוע אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי פוספטים ציטריים גרעיניים הם אבני הבניין המופעלות של הטבע, ולכן יש לנקוט בזהירות בעת הטיפול בהם לאחר יצירתם.חוקרים בתחום חומצות הגרעין משתמשים בשיטה זו כדי לחקור בחירות קומבינטוריות ליצירת אברים וחומצות גרעין קטליטיות שונה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לסנתז ולאפיין פוספטים ששונו באמצעות הליך פופ ארבעת השלבים הראשון, ואחריו טיהור HPLC שלב הפוך ותגובות הארכה ראשוניות. כמה פרטי ניסוי שאינם נמצאים בדרך כלל בקטעי ניסוי יתגלו.ניתן להשתמש בשיטה זו בשילוב עם טכניקות אחרות כגון PCR כדי לענות על שאלות נוספות. ואכן, ניתן להשתמש בו כדי להעריך את התאימות של טרי פוספטים ששונו לשיטות של בחירת VIO.

nucleoside-triphosphates-from-synthesis-to-biochemical

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

מאמר זה מספק הליך מפורט על סינתזה שלב מוצק, טיהור, אפיון של dodecamers של רנ"א שונה ב C2'- O -position. UV- מול וניתוח מעגלי דיכרואי פוטומטרי משמשים לכמת ולאפיין היבטים מבניים, כלומר , גדילים בודדים או פעמיים גדילים.

Protocol עבור שלב מוצק סינתזה של אוליגומרים של רנ&quot;א המכיל 2 &#39;<em&gt; הו</em&gt; שינוי ואפיון של תיאופנילמתיל באמצעות דיכרואיזם מעגלי

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לסינתזה של דו-סוכר נוקלאוזידים מאת regioselective O- גליקוזילציה של ribonucleosides באמצעות הגנה זמנית של שלהם 2', 3'-diol moieties ניצול של אסתר boronic מחזורית. שיטה זו חל על מספר נוקלאוזידים לא מוגן כמו אדנוזין, guanosine, cytidine, uridine, 5-methyluridine 5-fluorouridine לתת נוקלאוזידים דו-סוכר המתאימים.

Regioselective O- גליקוזילציה של נוקלאוזידים via זמני 2', 3'-Diol הגנה על ידי אסתר Boronic לסינתזה של דו-סוכר נוקלאוזידים

NMR-מבוסס על פעילות שפותחה כדי לזהות ולאפיין מעכבי של שני אנזימים ריבוהיהידרוקלז. הפרוטוקולים מסופקים עבור בחני התרכובת הראשונית ב-500 μm ו 250 μm, מינון התגובה בחני לקביעת ערכי IC50 , ניקוי נוזל מונה המסך, לקפוץ-דילול מונה מסך בחני, ו בחני בתאי E. coli שלם.

NMR-מבוסס על פעילות מבוססת על קביעת עיכוב מורכבים, IC50 ערכים, פעילות פרועובדתית, ואת הפעילות התא כולו של נוקלאוטילסייד הריבוליטיות

שיטה מדויקת הניתנת לשחזור לכימות נוקלאוזידים/נוקלאוטידים בצמחים מתוארת כאן. שיטה זו משתמשת ב- HPLC-MS/MS.

הכנת דגימת צמח למדידת תוכן נוקליאוסיד/נוקלאוטידים עם HPLC-MS/MS

אוליגונוקלאוטיד 5′-טריפוספטים הם מרכיבים הנמצאים בכל מקום במסלולים ביולוגיים חיוניים וראו שימוש הולך וגובר ביישומי ביוטכנולוגיה. כאן אנו מתארים טכניקות לסינתזה וטיהור שגרתיים של אוליגונוקלאוטיד 5′-טריפוספטים, החל מאוליגונוקלאוטידים שהוכנו על ידי טכניקות סינתזה אוטומטיות סטנדרטיות.

טריפוספורילציה כימית של אוליגונוקלאוטידים

בידוד ואפיון של תחום שומנים בדם של lipopolysaccharide (LPS) מחיידקי גרם שלילי מספק תובנה מנגנוני תא שטח על בסיס של עמידות לאנטיביוטיקה, הישרדות והכושר בקטריאלי, ואיך כימי שומנים מגוונים מינים מולקולריים דיפרנציאלי לווסת תגובות חיסוניים מולדים מארחות.

בידוד ואפיון כימי ליפידים מחיידקים גראם שליליים

אורגני חיבור פפטיד שיישונים (PTAs) הוא superfamily של peptidomimetics שכולל, אך אינם מוגבלים לפפטידים, peptoids ופפטידים מפוגלים-N. כאן אנו מתארים שיטה סינתטית המשלבת את שניהם מפוצלת וברכה ואסטרטגיות תת מונומר לסנתז ספרייה חד מתחם אחד אגל PTAs.

סינתזה מפוצלת וברכה ואפיון של הספרייה אמידה השלישון פפטיד

סינתזה, הפעלה, ואפיון של חומרי מסגרת מתכת אורגנית במכוון נועדו הוא מאתגרת, במיוחד כאשר אבני בניין הוא הפולימורפים לא תואמים או לא רצויים הם העדיפו thermodynamically על צורות הרצויות. אנו מתארים כיצד יישומים של שער סייע ממס מקשר, עקיפה X-ray אבקה בנימים והפעלה באמצעות CO 2 ייבוש סופר קריטי, יכולים לתת מענה לחלק מהאתגרים האלה.

מסגרות סינתזה ואפיון של פונקציונליות מתכת אורגנית

מטרת כתב היד הזה היא להדגים שיטה פשוטה להכנת ינונים מחומרי התחלה של מלח אציל כלוריד ואשלגן אלקינילטריפלואורובוראט. תגובת הסיר האחד מתקדמת במהירות בנוכחות בורון טריכלוריד ללא אי הכללת אוויר ולחות.

סינתזה נטולת מתכת של Ynones מacyl כלורידים ואשלגן Alkynyltrifluoroborate מלחים

מתחמי phosphine רותניום נמצאים בשימוש נרחב לתגובות קטליטי הומוגנית כמו hydrogenations. הסינתזה של סדרה של מתחמי רותניום tridentate רומן נושאות יגנד N -triphos N (CH 2 PPH 2) 3 מדווחת. בנוסף, התגובה של stoichiometric מורכב dihydride Ru- -triphos N עם חומצת levulinic מתוארת.

הסינתזה, אפיון ותגובתיות של סדרה של רותניום<em&gt; N</em&gt; -triphos<sup&gt; Ph</sup&gt; מכלולים

למד סינתזה של נוקלאוזידים triphosphates מסומנים בביוכימיה באמצעות תגובת ארבע שלבים בכלי אחד. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לייצר תרכובות טהורות ליישומים בכימיה של חומצות גרעין.

נוקלאוזידים triphosphates - מ - סינתזה ביוכימיה באפיון

גלה סרטונים נוספים