Name: הכנת עצבית שיתוף תרבויות עם Precision תא בודד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: למדו כיצד ליצור תרביות עצביות משותקות ברמת דיוק של תא בודד באמצעות מערכות מיקרו-זורמיות. השיטה מאפשרת מחקר מדויק של חיבורים עצביים ותקשורת בין תאים במעבדה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לאולריך Marggraf (ISAS) עבור SU-8 ייצור ומריה בקר (ISAS) להדמית SEM. המחקר נתמך כלכלית על ידי (DFG WE3737/3-1), Bundesministerium für מענק Bildung und Forschung (BMBF 0101-31P6541) ועל ידי המיניסטריום החדשנות, Wissenschaft und Forschung des נדס Nordrhein-Westfalen. הודות היקה Hardelauf בית הספר למוסמכי לייבניץ הבינלאומי &quot;מעבדה על שבב מערכות ביולוגיה&quot; לתמיכה כספית.

הפרוטוקולים מיועדים למדעני מוח, ומסוכמים באיור 2. ככזה הוא ממליץ microfabrication של SU-8 אדונים המשמשים לשכפול PDMS הוא במיקור חוץ למתקנים מסחריים או מוסדיים. שני עיצובי מסיכת שכבה זמינים באופן חופשי כמידע משלים (ZIP) בחברה המלכותית של אתר הכימיה 12. חשוב מכך, שכבת SU-8 הראשונה צריכה להיות מפוברק לעומק של 2.5-3.0 מיקרומטר, והשני לעומק של 25-30 מיקרומטר. אלה הם ממדים מרכזיים הנדרשים לעריכת נוירון יעילה. מגבלת גובה 3 מיקרון היא גם הכרחית כדי למנוע נוירונים מועברים או נודדות בין שני התאים 12. 1. שכפול מכשיר microfluidic בPDMS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את prepolymer PDMS ביסודיות עם סוכן הריפוי (184) ביחס של 10:1 ודגה את התערובת בייבוש ואקום לבדרך כלל 20 דקות. לחלופין, לשים את התערובתמכשור בצינור פלקון 50 מיליליטר ולהשתמש g הנמוך צנטריפוגה לdegassing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פרוסות SU-8 microstructured 2 שכבה על פלטה חשמלית 80 מעלות צלזיוס וליישר מסגרות פולימר לכל התקן על פרוסות סיליקון. יוצקים PDMS למסגרות עד לעומק של 5 מ&quot;מ ≥ ולאפשר&gt; 1 שעות כדי להבטיח ריפוי תרמית מוחלט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שנרפא, להסיר את רקיק מהפלטה החשמלית ולהתקרר על משטח שטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללבוש משקפי מגן ולעבוד מפינת אחת (מmicrostructures SU-8) עם אזמל נוקשה לפרד בעדינות את המסגרת וPDMS מפרוסות סיליקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת עובש PDMS מן המסגרת ולהשתמש זוג המספריים כדי לחתוך את המכשיר של PDMS העודף. מהבהבים זה מה שנקרא לעתים קרובות נוצר כאשר השכבה דקה של PDMS מתפשט בין מסגרת הפולימר ורקיק פני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן ליישם PDMS שנותר לכל רקיק ונרפא להגן רקיק במהלך האחסון. להסיר את זה לפני דפוס מכשיר שלאחר מכן, ותוך כדי כך להסיר כל pלבטא את המזהמים מפני השטח. </li></ol> 2. עצרת התקן וחיבורים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את יציאות ממשק 6 באמצעות ביופסיה בקוטר 3 מ&quot;מ. לעבוד על משטח כהה, בתנאי תאורה טובים ועם תכונות microstructured כלפי מעלה כדי לסייע יישור של היציאות עם ערוצי microfluidic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את המכשיר לחלקיקים. הסר אלה באמצעות דבק הפיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעגל microfluidic הוא כמוס באמצעות שכבה דקה PDMS רכוב על coverslip זכוכית: אלה שהוכנו על ידי שפיכת נפח קטן (~ 0.5 מיליליטר) של תערובת סוכן PDMS-ריפוי (10:01, 601) על גבי הבסיס גמיש, צלחת פטרי בכיתה בקטריולוגית. לחץ בעדינות על coverslip על גבי שכבת PDMS, הנח על פלטה חשמלית ותרמית תרופה במשך כמה דקות. במהירות לאחר הקירור, השתמש באזמל כדי לגזור ופרס bilayer coverslip-PDMS מצלחת פטרי. לקצץ במספריים במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אג&quot;ח פלזמה מכשיר PDMSושכבת תמיכה כדי לייצר חותם טוב: תנאים אופטימליים הם מכשיר ספציפי. לדוגמא, תנור פלזמה פועל ב70 W ו40 קילוהרץ באווירת 0.2 mbar חמצן ל40 שניות מייצר אג&quot;ח PDMS-PDMS מצוין. ברגע שהפלזמה שטופלה, לחץ על שני החלקים ביחד ולעזוב לרגע לאג&quot;ח במלואו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בצינורות סיליקון (ID 1.6 מ&quot;מ; 3.2 מ&quot;מ OD) להתממשק עם משאבות ומזרקים. </li></ol> 3. ביולוגי דפוסים ותפעול Microfluidic הפרוטוקולים בדפוסים ביולוגי באתרו, תרבות נוירון וטיפולי fluidic הם באיור 2. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51389/51389fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2. פרוטוקולי microfluidic אילוסטרייטד. א) PL ודפוסי PLL-G-PEG; תוספת של שכבת הדבקת תא (לדוגמא,PL, ירוק), עם אידוי לייצור מסכת מים המיושרים טיפול פלזמה אוויר האטמוספירה של PL נחשף ב &#39;).; שתי סיכות אנטנה נמצאות בשימוש, עם אנטנת ההקדמה פלזמה מאוירת עם כוכב ורוד. C) PBS (שטיפה כחולה) על ידי שאיפה משמש כדי להימנע מלזהם את האזור שטופלה בפלזמה עם PL. D) משלוח PLL-G-PEG (אדום ) על ידי שאיפה למעייל האזורים שטופלו הפלזמה E) הטעינה נייד.; עריכה סימולטנית microfluidic של נוירונים לשני תאי האיגוף על ידי שאיפה, מדיה F) זלוף (ורוד) באמצעות מונע זרימה ההידרוסטטי G) טיפולי fluidic מבודדים.; טיפול היקפי סוכן מבחן (שחור) של נמסר מהכניסה התחתונה איגוף על ידי שאיפה וטיפול המרכזי H) נמסר מהכניסה המרכזית התחתונה על ידי שאיפה. איור ואגדה לשכפל באישור של החברה המלכותית לכימיה(RSC) 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51389/51389fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> פלזמה מייד לאחר מליטה את ערוצי microfluidic PDMS הן הידרופילי מאוד (זווית מגע ≤ 5 מעלות). משטחים כאלה הם מתאימים להדבקה והתרבות של שורות תאים כגון תאים כמו נוירון מובחנים אנושיים SH-SY5Y. עבור vivo התרבות לשעבר של נוירונים עיקרי והתרבות של שורות תאי מבשר עצביות כגון קו לונד תא mesencephalic האנושי (LUHMES) ציפוי polyamine, או polylysine (PL) או polyornithine (PO), נדרש כעוגן של חשמל סטטי. בנוסף חלבוני הידבקות כגון laminin או פיברונקטין נדרשים לעתים קרובות כציפוי התממשקות-integrin. עם זאת, ציפוי PL וPO קלות להיקשר נוירונים, פוגע משלוח microfluidic לאתרי המערך וגם הטלת מאמצי גזירה לא רצויים. כדי לפתור בעיה זו ביולוגי בשבבדפוסים נדרש למקם חומרי הידבקות באתרי המלכודת וmicrochannels תולדה. זה גם מקדם את ההתפתחות של קשרים בין תא ומפחית את ההסתבכות מקומית. הפרוטוקול כרוך גם בתוספת של חומרי PEG לאזורים שכנים כדי להבטיח חלבונים ותאי עצב מוגבלים למקומות הרצויים במהלך התרבות ארוכה. הפרוטוקול הבא מתועד באיור 3: <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51389/51389fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3. מים מיסוך לדפוסים ביולוגי על ידי שכפול פלזמה. א) איור של תהליך מיסוך מים עם micropillars PDMS מצמיד המניסקוס המים במקום לשכפול פלזמה. עקמומיות של המניסקוס במישור האנכי הוזנחה. מסכת B) מים דמיינו עם צבע אדום ואת מיקומו על ידי p המניסקוסתוספת סיבוב. C) ציפוי PL-FITC הדוגמת צילם לאחר שכפול פלזמה. ד &#39;) של חלבון שדחה ודוחה תא PLL-G-PEG-TRITC לציפוי PL-FITC בדוגמת פלזמה. זה שימש לרישום של תאי SH-SY5Y וגם לדפוסי שכבת פיברונקטין נוספת לתאי LUHMES. איור ואגדה לשכפל באישור של החברה המלכותית לכימיה (RSC) 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51389/51389fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיסוך מים באתרו ביולוגי דפוסים ידי פלזמה שכפולה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זמן קצר לאחר פיפטה המליטה הפלזמה 0.5 μl נפח של PL או PO (100 מיקרוגרם / מיליליטר ב1x PBS) ליציאת המרכז התחתונה. בתוך עניין של שניות מעגל microfluidic כל מתמלא על ידי פעולת נימים. השאר לכמה דקות למעייל באופן מלא את משטחי PDMS הידרופילי עם פוליהמוקשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מולקולות polyamine מאוגדת על ידי שטיפה מונעת שאיפה עם 1x PBS (ראה איור 2 ג) דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל PBS מהנמלים ולחמם את המכשיר על ידי תאורה עם מיקרוסקופ. זה מגביר את האידוי מהיציאות להיווצרות מסכת מים מהירה. מסכת המים (באיור 3 א ומתועד באיור 3 ב) הוקמה בתוך ~ 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את המכשיר על ידי מיקרוסקופ כדי להבטיח מיסוך מים הוא מלא. שים לב מבני מאגר במעלה הזרם של אתר המערך כלולים בעיצוב המסכה להאריך את היציבות של מסכת המים (~ 15 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס סיכות נירוסטה ליציאות (איור 2). אלה משמשים לזוג הפלזמה שנוצרה על ידי שחרור לחץ אטמוספרי כף יד עטרה או גנרטור טסלה (למשל, הפועלים ב2 MHz, 30 אות ק) 19,20 לערוצי microfluidic הפנויים. כוון את קצה tהוא פלזמת מקור קרוב לקצה של סיכה אחת ופלזמה לטפל microchannel ל≤ 1 שניות. השתמש בתנאי תאורה נמוכים כדי לבחון דפוסים פלזמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את מסכת המים בצעד לשטוף. השתמש בשאיפה מקבילה מ3 יציאות העליונות. השתמש 4 אורכים שווים של צינורות סיליקון מחוברים באמצעות מתאם 4-דרך משאבת שאיפה להשגת שאיפה מקבילה. התחל שאיפה ולוותר PBS לתוך 3 היציאות התחתונה לצייר PBS דרך מעגל microfluidic. באופן זה ניגוד חומר PDMS-polyamine מופק (ראה איור 3 ג). לפנות PBS ממעגל microfluidic ולהשאיר לכמה שעות כדי לשחזר את המצב המקורי, הידרופובי. זה הופך את PDMS באופן מלא שאינו מתירנית להידבקות תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש חומרי הדבקה נוספים, כגון laminin או פיברונקטין, יהיו צורך בצעדים הבאים דרושים וצריך להיעשות מייד לאחר הסרת מסכת המים: פיפטה 10 μl נפח של השתל פולי-L שיתוף פולימר- ליזין-פולי (אתילן גליקול) (PLL-G-PEG, 100 מיקרוגרם / מיליליטר, ב-PBS) לשני ערוצים תחתון איגוף, ואחריו על ידי שאיפה מערוצי האיגוף העליונים למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבלי להפריע לזרימה, להסיר PLL-G-PEG העודף על ידי חליפין עם חיץ PBS. זה סלקטיבי מעילי האזורים שאינן מצופה polyamine עם מחצית PEG פועלת למנוע ספיחת חלבון ותא הידבקות 17,21. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבוני הידבקות כגון laminin או פיברונקטין אז יכולים להיות שותף מקומי עם ציפוי פולי-האמין: פיפטה 10 כרכים μl של חלבוני ECM אלה (בדרך כלל 10 מיקרוגרם / מיליליטר) לכל שלוש יציאות בתחתית. לשאוב משלוש יציאות העליונה עד שההתקן מלא בפתרון החלבון ודגירה עבור שעה 1 כדי לייצר ציפוי באיכות טובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החלבונים עודפים על ידי aspirating PBS מ3 יציאות התחתונה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microfluidic יחיד Neuron עריכה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראש המכשירים עם ההולםאכלתי תקשורת. הוסף 20 כרכי μl ל3 יציאות התחתונה ועל ידי שאיפה במקביל משלוש יציאות העליונות במהירות למלא את מעגל microfluidic עם תקשורת. משתמש במחבר צינורות 4 כיוונים לבני זוג 3 יציאות העליונות דרך צינורות סיליקון שווה באורך למשאבת שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של השעיה תא מפולחת (1 x 10 6 תאים / מיליליטר) לכל אחת מיציאות איגוף המפרצון (0, באיור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצייד את משאבת שאיפה עם זרימת רגולטור או להשתמש במזרק לשאיבה עדינה מ3 יציאות העליונות. עריכת נוירון מלאה בדרך כלל דורשת דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר נוירונים עודפים שנותרו ב4 יציאות איגוף עם טפטפת לעריכה במכשירי microfluidic שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צינורות. למלא את כל היציאות עם תקשורת ולהניח את המכשיר בחממה. תוך כמה שעות הפכו לתאים חסיד באופן מלא על הדפוס ביולוגי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Neuron תרבות, סלקטיבי Fluidic טיפול, אימונוגלובולינnostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליף את התקשורת על ידי זלוף התקופתי באמצעות הזנה ההידרוסטטי (הפרש גובה עמודה 2 מ&quot;מ הוא כראוי איטי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, להטביע את מכשיר microfluidic בתקשורת, החלפת התקשורת מעת לעת (2-3 ימים) כמו עם תרביות תאים סטנדרטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפולי fluidic סלקטיבית לאו תא תרבות נוירון או לתא תולדת neurite המרכזי מושגות כדלקמן: לוותר 20 μl של חומר הבדיקה ליציאה התחתונה של הערוץ של עניין, ולשאוב מהנמל ישירות מעל. לטיפולים ארוכים להפחית את שיעור הזרימה באמצעות זרימת רגולטור ולחדש את חומר הבדיקה כנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקולי Immunostaining להשתנות עבור כל יעד מולקולרי וריאגנטים קשורים. על מנת להתמודד עם הסיכון הפוטנציאלי של נזק נגרם לתאי עצב גזירה קצב זרימה איטי היה בשימוש. כתוצאה מכך פעמים יישום מוגברות לתנקב במערכת באופן מלא, הארכת זמני פרוטוקול רגילים. Hyזלוף drostatic באמצעות יציאות עם גבהים שונים עמודה (למשל, על ידי 2 מ&quot;מ) היה בשימוש, כדי לספק חומרים כימיים. בנוסף מהיר יותר מגיב וההסרה באמצעות משאבה ניתן להשתמש כדי להפחית את לוחות זמנים ניסיוניים. חבר משאבת השאיפה 3 היציאות העליונות לצייר ריאגנטים מ3 יציאות התחתונה. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Campenot, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+control+of+neurite+development+by+nerve+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Local control of neurite development by nerve growth factor.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 74 (10), 4516-4519 (1997).</li>
<li>Campenot, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+sympathetic+neurons+in+compartmentalized+cultures.+I.+Local+control+of+neurite+growth+by+nerve+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of sympathetic neurons in compartmentalized cultures. I. Local control of neurite growth by nerve growth factor.</a> Dev Biol. 93 (1), 1-12 (1982).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+multicompartment+device+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Microfluidic multicompartment device for neuroscience research.</a> Langmuir. 19, 1551-1556 (2003).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat Methods. 2 (8), 559-565 (2005).</li>
<li>Kilinc, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wallerian-like+degeneration+of+central+neurons+after+synchronized+and+geometrically+registered+mass+axotomy+in+a+three-compartmental+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotox.+Res%22%5BJournal%5D)">Wallerian-like degeneration of central neurons after synchronized and geometrically registered mass axotomy in a three-compartmental microfluidic chip.</a> Neurotox. Res. 19, 149-161 (2011).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+controlled+and+multifactor+involved+assay+of+neuronal+regeneration+after+chemical+injury+in+an+integrated+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally controlled and multifactor involved assay of neuronal regeneration after chemical injury in an integrated microfluidics.</a> Anal. Chem. 84 (15), 6444-6453 (2012).</li>
<li>Kim, Y. T., Karthikeyan, K., Chirvi, S., Dave, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuro-optical+microfluidic+platform+to+study+injury+and+regeneration+of+single+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Neuro-optical microfluidic platform to study injury and regeneration of single axons.</a> Lab Chip. 9, 2576-2581 (2009).</li>
<li>Hellman, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+axonal+injury+and+regeneration+in+micropatterned+neuronal+culture+using+pulsed+laser+microbeam+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Examination of axonal injury and regeneration in micropatterned neuronal culture using pulsed laser microbeam dissection.</a> Lab Chip. 10 (16), 2083-2092 (2010).</li>
<li>Kunze, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-pathological+connected+primary+neurons+in+a+microfluidic+device+for+Alzheimer+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Co-pathological connected primary neurons in a microfluidic device for Alzheimer studies.</a> Biotechnol. Bioeng. 108 (9), 2241-2245 (2011).</li>
<li>Liu, W. W., Goodhouse, J., Jeon, N. L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+chamber+for+analysis+of+neuron-to-cell+spread+and+axonal+transport+of+an+alpha-herpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A microfluidic chamber for analysis of neuron-to-cell spread and axonal transport of an alpha-herpesvirus.</a> PLoS One. 3 (6), (2008).</li>
<li>Markus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Varicella-Zoster+virus+%28VZV%29+infection+of+neurons+derived+from+human+embryonic+stem+cells%3A+Direct+demonstration+of+axonal+infection%2C+transport+of+VZV%2C+and+productive+neuronal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Varicella-Zoster virus (VZV) infection of neurons derived from human embryonic stem cells: Direct demonstration of axonal infection, transport of VZV, and productive neuronal infection.</a> J. Virol. 85 (13), 6220-6233 (2011).</li>
<li>Dinh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+construction+of+minimalistic+neuronal+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic construction of minimalistic neuronal co-cultures.</a> Lab Chip. 13 (7), 1402-1412 (2013).</li>
<li>Tan, W. H., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+trap-and-release+integrated+microfluidic+system+for+dynamic+microarray+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A trap-and-release integrated microfluidic system for dynamic microarray applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (4), 1146-1151 (2007).</li>
<li>Frimat, J. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+array+with+cellular+valving+for+single+cell+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture.</a> Lab Chip. 11 (2), 231-237 (2011).</li>
<li>Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+enzyme+concentrations%2C+kinetics%2C+and+inhibition+analysis+using+high-density+hydrodynamic+cell+isolation+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays.</a> Anal. Chem. 78 (14), 4925-4930 (2006).</li>
<li>Frimat, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+network+formation+assay%3A+A+spatially+standardized+neurite+outgrowth+analytical+display+for+neurotoxicity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">The network formation assay: A spatially standardized neurite outgrowth analytical display for neurotoxicity screening.</a> Lab Chip. 10, 701-709 (2010).</li>
<li>Hardelauf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fidelity+neuronal+networks+formed+by+plasma+masking+with+a+bilayer+membrane%3A+analysis+of+neurodegenerative+and+neuroprotective+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">High fidelity neuronal networks formed by plasma masking with a bilayer membrane: analysis of neurodegenerative and neuroprotective processes.</a> Lab Chip. 11 (16), 2763-2771 (2011).</li>
<li>Whitesides, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).</li>
<li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+bonding+by+means+of+a+portable%2C+low-cost+corona+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).</li>
<li>Frimat, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+stencilling+methods+for+cell+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Plasma stencilling methods for cell patterning.</a> Anal. Bioanal. Chem. 395 (3), 601-609 (2009).</li>
<li>Huang, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28L-lysine%29-g-poly%28ethylene+glycol%29+layers+on+metal+oxide+surfaces%3A+surface-analytical+characterization+and+resistance+to+serum+and+fibrinogen+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Poly(L-lysine)-g-poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: surface-analytical characterization and resistance to serum and fibrinogen adsorption.</a> Langmuir. 17, 489-498 (2001).</li>
<li>Li, N., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+topographical+and+biochemical+cues+by+axons+during+growth+on+microfabricated+3-D+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Integration of topographical and biochemical cues by axons during growth on microfabricated 3-D substrates.</a> Exp. Cell Res. 311 (2), 307-316 (2005).</li>
<li>Huang, L. R., Cox, E. C., Austin, R. H., Sturm, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+particle+separation+through+deterministic+lateral+displacement%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Continuous particle separation through deterministic lateral displacement.</a> Science. 304 (5673), 987-990 (2004).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+nanoparticle+functionality+and+toxicity+on+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">A review of nanoparticle functionality and toxicity on the central nervous system.</a> J. R. Soc. Interface. 7, (2010).</li>
<li>Brenneman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+olfactory+transport+of+inhaled+manganese+%28%28MnCl2%29-Mn-54%29+to+the+rat+brain%3A+Toxicokinetic+investigations+in+a+unilateral+nasal+occlusion+model%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Appl.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Direct olfactory transport of inhaled manganese ((MnCl2)-Mn-54) to the rat brain: Toxicokinetic investigations in a unilateral nasal occlusion model.</a> Toxicol. Appl. Pharm. 169 (3), 238-248 (2000).</li>
<li>Magalães, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+neuritic+transport+of+scrapie+prion+protein+coincident+with+infection+of+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Uptake and neuritic transport of scrapie prion protein coincident with infection of neuronal cells.</a> J. Neurosci. 25 (21), 5207-5216 (2005).</li>
<li>Diogenes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+alpha-synuclein+oligomers+modulate+synaptic+transmission+and+impair+LTP+via+NMDA-receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extracellular alpha-synuclein oligomers modulate synaptic transmission and impair LTP via NMDA-receptor activation.</a> J Neurosci. 32 (34), 11750-11762 (2012).</li>
<li>Egger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nat. Protoc. 8 (5), 958-965 (2013).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

טכניקת עריכת microfluidic היא הראשון מסוגו, המאפשר טיפול בתא עצב יחיד דיוק להקמת תרבויות מינימליסטי. יחד עם בשיטת דפוסים ביולוגי באתרו, בגישה רבת עוצמה כדי ליישר דפוסי תא עם מבני microfluidic, יש תרבויות מינימליסטי אלה רמות קישוריות גבוהה intercompartment עם הסתבכות מקומית מופחתת. תכונות אלה יכולות לשמש ללימוד יעיל של העברת בין תא, ועם יש שינויי עיצוב פשוט הפוטנציאל לבודד אקסונים בודדים להדמיה וניתוח כמוני. לדוגמא, בדור הבא עיצובים ניתן להחליף מבני הקלשון עם ערוץ...

<html> רקמה עצבית היא מורכבת ביותר; תערובת סלולרית הטרוגנית שמסודרת מרחבית בתוך שכבות ותאים מוגדרים ועם קישוריות פלסטיק באמצעות אנשי קשר סלולריים ובמיוחד באמצעות צמחי האקסון ודנדריט. טכניקות חדשות נדרשות להעניק חופש ניסיוני יותר כדי לקבל תובנות ומנגנונים לפענח מרכזיים למחלות, פיתוח, ותפקוד בריא יותר עמוקים. קאמרי Campenot 1,2 ו 3,4 התגלמויות microfabricated לאחרונה יכולים לשמש להכנת vivo לשעבר של שיתוף תרבויות עצביות ברשת עם היכולת להפריע באופן סלקטיבי אוכלוסיות גופניות השונות וגם בצמחים neurite שלהם. מכשירי microfluidic אלה למשל נעשו שימוש כדי ללמוד ניוון האקסון והתחדשות הבא axotomy הכימי 5,6 או לייזר 6-8, tauopathy 9, הפצה ויראלית 10,11, ולוקליזציה mRNA באקסונים 4. אף אוזן גרון &quot;&gt; כדי להרחיב את הטווח של neurobiologists, התפתחויות טכנולוגיות נדרשות להכין שיתוף תרבויות עצביות מינימליסטי. זה מאפשר התרת סבך של הרשת העצבית לחקירה של המערכת עם תא בודד ודיוק משנה הסלולר. הדרישה למספרים סלולריים מינימאליים פותחת את האפשרות לנתח את סוגי תאים נדירים, כוללים תאי nigra substantia דופאמין רלוונטיים למחלת הפרקינסון, גרעיני ספירלה מהאוזן, תאי עצב היקפיים, ותאי גזע. מעבר לכך, כלכלה סלולרית היא רלוונטית ליוזמה 3Rs. שימוש בפלטפורמות אלה microfluidic, מסכי רעילות בקנה מידה גדולה או תפוקה גבוהה אחרת, יכולה כעת להיחשב סדרה ניסיונית נתונים עשירים הדורשת נוירונים בבעלי חיים. במאמר זה בפרוטוקולים לייצור ושימוש במכשיר microfluidic מתוארים. עריכת microfluidic בשילוב עם בbiomateri האתר<html> שיטת הדפוסים אל יכול לשמש לרישום של שיתוף תרבויות עצביות ביניהם ביותר באמצעות מספרי תא מינימאליים. עריכת microfluidic מבוססת על זרימת ההפרש גישת 12-15, לפיה מלכודות microstructured ממוקמות בתוך מעגלים נוזליים (מאויר יחד עם תמונות SEM באיור 1). הנתיב 0 → 1 יש התנגדות נמוכה יותר fluidic (R 2&gt; R 1) להובלת נוירונים למערך ליניארי של פתחי microstructured - פתחי הכניסה לערוצי תולדת neurite. תפוסה של המלכודת על ידי תא בודד באופן מקומי מעכבת את הזרימה להסיט המייעלים ללכידת תאים עוקבים במלכודות שכנות. התפוסה מלאה של המלכודות במערך מתגי יחס fluidic (R 1&gt; R 2) להסיט המייעלת לתוך הנתיב מתפתל (0 → 2) כדי לייצר מצב עוקף של ניתוח לסילוק של תאי עצב עודפים. ss = &quot;jove_content&quot; עבור: לשמור-together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51389/51389fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. Microfluidic מעגל. א) מעגל התנגדות ההפרש fluidic לעריכת נוירון בודד עם איגוף תאי תרבות מחוברים על ידי ערוצי תולדה neurite. B, תמונות C) SEM של מערך שיתוף תרבות bilayer נוירון הממודר עם micropillars המניסקוס מצמיד. עם העיצוב הזה, מבני השמנה נוירון בצורת קלשון שימשו כדי לקדם fasciculation של צמחי neurite. איור ואגדה לשכפל באישור של החברה המלכותית לכימיה (RSC) 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51389/51389fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> הכנת רשתות נוירונים micropatterned על מצעים מישוריים בקלות יכולה להיות מושגת (לexampl<html> es מהקבוצה שלנו, רואה Frimat et al. 16 והיקה et al. 17). עם זאת, המתמצת דפוסי חומרים ביו בתוך מכשירי PDMS ועם הדרישה של יישור מיקרומטר בקנה מידה של אלה לערוצי microfluidic מציב אתגר טכני גדול. בסעיף 3.1 פרוטוקול, או באתרם, הכנה של דפוסים ביולוגי מוצג בשבב. דפוסים אלה מאפשרים רישום נוירון בלוחות זמנים ארוכים ולקדם את התרבות בצמחים בין תאים. microstructures המניסקוס-מצמיד משמשים כדי ליישר את מסכת מים מה שנקרא עם נוירון עריכת אתרים וערוצי תולדת neurite. מסכת המים מגנה על ציפוי מולקולת ההידבקות במהלך טיפול בפלזמה, בעוד שמשטחים חשופים הם התפרקו להגדיר את התבנית ביולוגי. בנוסף, פרוטוקולים ניתנים לתרבית תאים ולבידוד fluidic הכרחי לטיפול סלקטיבי של תאי שיתוף התרבות השונים. ve_content &quot;&gt; הפרוטוקולים נועדו למנף את העקרונות ידידותיים למשתמש של ליתוגרפיה הרכה לשכפול של פולי (dimethylsiloxane) (PDMS) מכשירי microfluidic 18. בדומה לכך, בדפוסים ביולוגי באתר הוא פשוט, תוך ניצול תופעות מתח אידוי ולפני שטח, ורק דורש מקור כף יד זול פלזמה. מעגל microfluidic ביעילות טיפולי טעינה סלולרי תוכניות ותא ספציפיים עושים פעולות אלה פשוט עניין של מחלק חומרים ליציאה התחתונה הנכונה ונשיפה מלמעלה. באופן זה, הוא נועד לתת neurobiologists החופש כדי להכין ולהשתמש במכשירי microfluidic במעבדות שלהם.

<table><tbody><tr><td>PDMS Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS Elastosil RT 601</td><td>Wacker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>VWR</td><td>630-1590</td><td>130-160 מ"מ</td></tr><tr><td>עובי 3 מ"מ ביופסיה אגרופים</td><td>Kai Medical</td><td></td><td>Handle בזהירות -</td></tr><tr><td>צינורות טיגון חדים</td> במיוחד <td>פישר סיינטיפיק</td><td>S-50-HL</td><td>1.65 מ"מ ID; 3.35 מ"מ</td></tr><tr><td>OD 1 מ"ל מזרק ( Inkjekt ו-Omnifix)</td><td>Braun</td><td>6064204</td><td></td></tr><tr><td>מחבר צינורות 4 כיוונים</td><td>VWR או Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow Regulator</td> מכשיר <td>הרווארד 722645</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סיכות 0.5 מ"מ</td><td>מחלקות</td><td></td><td></td>תפירה</tr><tr><td>PLL-g-PEG</td><td>SuSoS</td><td>PLL(20)-g [3.5]-PEG(5)</td> <td>יציבות באחסון יכולה להיות בעיה</td></tr><tr><td>פולי-D-ליזין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>פוליליזין-FITC</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P3069</td><td></td></tr><tr><td>פוליאורניתין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>פיברונקטין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>למינין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>משאבת שאיפה לדוגמה</td><td>KNF Neuberger, Laboport</td><td>N811KVP</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר פריקת קורונה ידני</td><td>Leybold-Heraeus, ארה"ב</td><td>VP23</td><td>עשוי שלא לעמוד בתקני הבטיחות של המדינה שלך</td></tr><tr><td>תנור פלזמה Femto</td><td>Diener מייבש</td> ואקום אלקטרוני <td></td><td></td></tr><tr><td>או צנטריפוגה</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הכנת עצבית שיתוף תרבויות עם precision תא בודד

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

התגלמויות microfluidic של חדר Campenot משכו עניין רב מהקהילה מדעי המוח. פלטפורמות שיתוף התרבות מחוברות אלה יכולים לשמש כדי לחקור מגוון של שאלות, המשתרע נוירוביולוגיה התפתחותית והתפקודית לזיהום והתפשטות מחלה. עם זאת, מערכות קונבנציונליות דורשות תשומות משמעותיות סלולריות (אלפים רבים לתא), מספיקות לחקר תאי שפע נמוכים, כגון nigra substantia העיקרי דופאמין, גרעיני ספירלה, ונוירונים melanogaster Drosophilia, ולא מעשיות לניסויי תפוקה גבוהה. התרבויות צפופות גם הם הסתבכו מאוד באופן מקומי, עם כמה צמחים (&lt;10%) מקשרות שתי תרבויות. במאמר זה פרוטוקולי microfluidic ודפוסים פשוטים מתוארים בו לטפל באתגרים אלה: (i) נוירון יחיד microfluidic עריכת שיטה, וכן (ii) שיטת מיסוך מים לציפוי בחומר ביולוגי דפוסים פלזמה register נוירונים ולקדם תולדה בין תאים. שיתוף תרבויות עצביות מינימליסטי הוכנו עם קישוריות intercompartment (&gt; 85%) ברמה גבוהה ויכולות לשמש לניסויי נוירוביולוגיה תפוקה גבוהה עם דיוק תא בודד.

מעלליו מיסוך מים על פני השטח את המתח. סובלנות הלחץ בממשק האוויר הנוזלי מאזני הפוך עם רדיוס [עקמומיות <img fo:content-width="1in" src="files/ftp_upload/51389/51389eq1.jpg" width="113" /> , ייצור ממשקים מאוד יציבים בממדי microfluidic. Micropillars יעילות לעגן את מסכת המים במקום. היווצרות מסכת מים היא מונעת על ידי אידוי מנמלי microfluidic, עם השיעור המוגבר על ידי חימום. שימוש בחום נמוכה הגדלה (4X - 10X) מיקרוסקופיה תאורה, את מסכת המים הייתה בדרך כלל בהקמת ≤ 5 דקות. אידוי גם מוביל לחו...

פרוטוקולים לעריכה אחת נוירון microfluidic ומיסוך מים לדפוסי פלזמה בשבב של ציפויים ביולוגי מתוארים. ניתן להכין שיתוף תרבויות מקושרות ביותר באמצעות תשומות תא מינימליות.

הכנת עצבית שיתוף תרבויות עם Precision תא בודד

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לסדר נוירונים בודדים בשני תאים מיקרופלואידיים לצורך הכנת קו-קלטורה נוירונלית מחוברת. דבר זה מושג תחילה על ידי יצירת תבנית של ההתקן המיקרופלואידי ב-PDMS וכמיסת ההתקן באמצעות קישור פלזמה. השלב השני הוא תבנית של polylysine בתוך ההתקן המיקרופלואידי.דבר זה מושג על ידי מילוי המכשיר בפוליליזין, אפשור להיווצרות מסת מים באמצעות אידוי, ולאחר מכן שימוש בטיפול בפלזמה להסרת הפוליליזין החשוף כדי ליצור את תבנית הביומטריאל. לאחר מכן, השתמש במזרק כדי לשאוב את הנוירונים דרך המעגל המיקרופלואידי עבור סידור של נוירונים בודדים. המכשיר מוצב באינקובטור לתרביות רקמה כדי לאפשר לנבטי הנויריטים להתרחב ולחבר בין שתי אוכלוסיות הנוירונים.השלב הסופי כולל שימוש במשאבת שאיבה כדי לטפל באופן סלקטיבי במדור אחד ולנטר את התפשטות החומרים והפתולוגיה בתוך המעגל הנוירונלי. את הפרוצדורה ידגימו Yayu Chang ו-sarada ממעבדת ISIS. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תאי רכיבי PDMS הזמינים מסחרית, הוא שתרבית השיתוף (co culture) של הנוירונים מוכנה במיקום של תא בודד לצורך ניתוח של אלגוריתמים עצביים פרטניים.שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחום מדעי המוח. לדוגמה, מהו המכניזם העומד בבסיס התפשטותם של צברי חלבון tau הקשורים להיפר-פוספורילציה במחלת האלצהיימר, או כיצד זיהום באורגניזם מתפשט ברחבי המוח? הטכניקה מתאימה באופן אידיאלי ליישומים של סריקה רחבה (high throughput), שכן נדרשים רק כמה מאות נוירונים עבור כל תנאי ניסויי.התחילו את הפרוצדורה על ידי ערבוב יסודי של ה-PDMS pre polymer עם סוכן הקישור (curing agent) ביחס של 10 ל-1. לאחר מכן, בצעו ניקוי בועות (Degas) לתערובת בתוך דסיקטור ואקום למשך 20 דקות בדרך כלל. לאחר מכן, הניחו את פרוסת ה-SU eight בעלת המבנה המיקרו-מבני הדו-שכבתי על פלטה חמה בטמפרטורה של 80 °C ויישרו את מסגרות הפולימר לכל מכשיר על הפרוסה.שפכו PDMS לתוך המסגרת והמתינו שעה אחת כדי להבטיח פולימריזציה תרמית מלאה. לאחר שהחומר התקשח, הסירו את הפרוסה (wafer) מהפלטה החמה והניחו לה להתקרר על משטח שטוח. לאחר מכן, תוך כדי ענידת משקפי מגן, השתמשו בסקלפל קשיח כדי להפריד בעדינות את המסגרת ואת ה-PDMS מהפרוסה החל מאחת הפינות.הסר את תבנית ה-PDMS מהמסגרת והשתמש במספריים כדי לקצץ את ההתקן. מרח את שארית ה-PDMS על כל שטח ה-wafer כדי להגן עליו במהלך האחסון. בעת קילוף שכבת ה-PDMS הזו מה-wafer, כל מזהמי חלקיקים מוסרים מהפני השטח כדי להכינו ליציקת PDMS חוזרת.כעת הכינו את ששת פתחי הממשק באמצעות מחץ ביופסיה של שלושה מילימטרים, כאשר התכונות בעלות המבנה המיקרוסקופי פונות כלפי מעלה כדי לסייע ביישור הפתחים עם התעלים המיקרופלואידיים. בדקו את ההתקן לאיתור חלקיקים והסירו אותם באמצעות סרט דביק הפיך. לאחר מכן, הכינו שכבת PDMS דקה המותקנת על כיסוי זכוכית על ידי מזיגת כמות קטנה של תערובת סוכן ההקשחה של ה-PDMS אל תוך צלחת פטרי.הדבק זכוכית כיסוי על שכבת ה-PDMS. הנח אותה על הפלטה החמה ובצע פולימריזציה תרמית למשך כ-10 דקות. זמן קצר לאחר הקירור ובזמן הרכבת משקפי מגן, השתמש בסכין מנתח כדי להדליף את זכוכית הכיסוי.שכבה כפולה של PDMS מתוך צלחת הפטרי כדי לכלוף את ההתקן. נדרש קשר P-D-M-S-P-D-M-S תקין. מקמו את השכבה הכפולה של ה-PDMS ואת התקן המיקרופלואידי בתנור הפלזמה למשך 40 שניות.לאחר הטיפול בפלזמה, הצמידו את שני החלקים זה לזה והמתינו להידבקות מלאה; זמן קצר לאחר ההדבקה בפלזמה, טפטפו 0.5 µL של polylysine לתוך הפתח המרכזי התחתון. כל המעגל המיקרופלואידי אמור להתמלא באמצעות פעולת נימיות תוך שניות ספורות. לאחר מכן, השאירו את המערכת למשך מספר דקות כדי לצפות באופן מלא את משטחי ה-PDMS ההידרופיליים ב-polylysine.בשלב הבא, הסר את הפוליליזין שאינו קשור באמצעות שטיפה המונעת על ידי שאיבה. השתמש במחבר ארבע-דרכים כדי לחבר את המשאבה לשלושת הפתחים העליונים באמצעות צינורות באורך שווה והפעל את השאיבה. הוסף PBS לשלושת הפתחים התחתונים ושטוף למשך דקה אחת. לאחר מכן, נתק את הצינורות והסר את שאריות ה-PBS מהפתחים.העבירו את ההתקן למיקרוסקופ וחממו באמצעות התאורה כדי להגביר את האידוי מהפתחים לצורך יצירה מהירה של מסכת מים. בדקו את ההתקן במיקרוסקופ כדי לוודא שהמסוכה מהמים הושלמה. לאחר מכן, הכניסו פיני פלדת אל-חלד לתוך הפתחים לצורך צימוד הפלזמה הנוצרת על ידי מחולל פריקת קורונה ידני לתוך התעלים המיקרופלואידיים הריקים.הכווינו את קצה מקור הפלזמה קרוב לקצהו של אחד הפינים והפעילו פלזמה. טפלו במיקרו-תעלה למשך שנייה אחת. לאחר מכן, הסירו את הפינים וחברו את שלושת הפתחים העליונים למשאבה.התחל בשאיבה והזרם PBS לשלושת הפתחים התחתונים, כדי למשוך את ה-PBS דרך המעגל המיקרופלואידי. הסר את כל ה-PBS מהמעגל המיקרופלואידי והשאר למשך לילה להשלמת תבנית הביומטריאל.כאן התבנית מוצגת באופן ויזואלי באמצעות פוליליזין המסומן בפלואורסצין. בהליך זה, הכינו את המכשיר עם מצע מתאים על ידי הוספת 20 µL לכל אחד משלושת הפתחים התחתונים. לאחר מכן, השתמשו בשאיבה מקבילה משלושת הפתחים העליונים כדי למלא במהירות את המעגל המיקרופלואידי במצע.הוסף 20 µL של תרחיף תאים מפוזרים לכל אחד מהפתחים התחתונים הצדדיים. השתמש במזרק כדי לשאוב בעדינות מהשלושה פתחים העליונים. השלמת תהליך ה-neuron orang דורשת בדרך כלל דקה אחת.לאחר מכן, השתמשו בפיפט כדי לאסוף נוירונים עודפים שנותרו בפתחים עבור טבעת במכשירים מיקרופלואידיים עוקבים. דוגמה זו מראה כיצד נוירונים מסודרים בדיוק של תא בודד. לאחר מכן, טבלו את המכשיר במצע גידול והניחו אותו באינקובטור למשך מספר שעות, כדי שהתאים יהפכו למודבקים באופן מלא לתבנית הביומטריאל.בדומה לתרביות רגילות, יש לחדש את המצע באופן תקופתי כדי לטפל באופן סלקטיבי במדור תרבית הנוירונים או במדור הצמיחה העצבית המרכזי. יש להעביר 20 µL של החומר הנבדק אל הפתח התחתון המחובר לתעלה הרצויה, ולשאוב מהפתח שנמצא ישירות מעליו. בדוגמה זו, הוחל טיפול סלקטיבי על המדור המרכזי, ובדוגמה זו, בוצע טיפול במדור הצד.הטיפולים הוקמו תוך דקה אחת ונמשכו במשך 60 דקות. לאחר מכן ניתן לנטר את תרביות השיתוף (co-cultures) של הנוירונים כדי למדוד את התפשטותם של חומרים או פתולוגיות. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להכין מכשירים מיקרופלואידיים רבים בבוקר אחד.לאחר צפייה בסרטון זה, תגבשו מושג טוב לגבי האופן שבו ניתן להכין תרביות נוירונליות מינימליסטיות במעבדותיכם, ולהשתמש בהן כדי לחקור מנגנוים העומדים בבסיס התפשטות של חומרים ומחלות במוח.

preparation-of-neuronal-co-cultures-with-single-cell-precision

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

וידאו זה מציג את הליך ליצירת תרביות נוירונים מעובר מאוחר ועכבר מוקדם קליפת המוח לאחר הלידה. תרבויות אלו יכולים לשמש immunocytochemistry, ביוכימיה, electrophysiology, סידן ונתרן הדמיה לספק פלטפורמה ללימוד פיתוח העצבית של חיות טרנסגניות שנושאים מוטציה לאחר הלידה הגן הקטלני.

הכנת ניתק תרבויות עכבר קליפתיים Neuron

פיתחנו רומן רב תא שיתוף תרבות נוירון פלטפורמה עבור microsystem ב CNS מחקר במבחנה אינטראקציה האקסון, גליה. פלטפורמה המסוגלת לנהל עד שישה ניסויים עצמאיים במקביל היה מפוברק באמצעות פיתח מאקרו / מיקרו שיטת ייצור כלאיים.

תא Multi-CNS-Neuron גליה שותף תרבות Microfluidic רציף

כאן אנו מספקים פרוטוקול עכברוש נוירונים בקליפת המוח culturing בנוכחות שכבה מזין גליה. נוירונים בתרבית להקים הקוטביות וליצור סינפסות, והוא יכול להיות מופרד גליה לשימוש ביישומים שונים, כגון electrophysiology, הדמיה סידן, מבחני הישרדות התא, immunocytochemistry, ו-RNA / DNA / בידוד החלבון.

Bilaminar משותף התרבות של נוירונים בקליפת המוח עכברוש ראשי גליה

סרטון זה מדגים שיטה להתמיין תאי אב עצביים אנושיים (NPCs) לנוירונים. ה-NPCs מוכנסים לתרבית משותפת של נוירונים קורטיקליים אסטרוציטים-חולדות בעכברים, ומקדמים התמיינות NPC לנוירונים. ההתמיינות מאושרת על ידי הדמיה של התאים תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.

טכניקת תרבית משותפת להבחנה של תאי אב עצביים אנושיים לתאי עצב

סרטון זה מדגים שיטה לביסוס תרבית משותפת עקיפה של נוירון-אסטרוציטים באמצעות גישה ממודרת. במערך זה, נוירונים ואסטרוציטים מופרדים מרחבית אך חולקים תווך מותנה. גורמים נוירוטרופיים המשוחררים על ידי אסטרוציטים מקדמים התמיינות נוירונים ויצירת קשרים סינפטיים, דבר המצביע על אינטראקציות נוירון-גליה.

טכניקה עקיפה של תרבית נוירון-אסטרוציטים לחקר אינטראקציות נוירון-גליה

תאים אנושיים neuroprogenitor (NPCs) הורחבו בתנאים מתרבים. NPCs היו מובחן לתרבויות נוירון, עשיר בנוכחות שילוב של neurotrophins. סמנים עצביים זוהו על ידי מכתים immunofluorescence. כדי לבודד אוכלוסייה טהורה של נוירונים, NPCs הובדל בשקופיות קרום PEN וmicrodissection ללכוד לייזר בוצע.

Microdissection לכידת לייזר של נוירונים מהתאים מובחנים Neuroprogenitor אדם בתרבות

מתואר פרוטוקול ליצירת מערכת תרבית משותפת המורכבת מתאי עצב שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), נוירונים ראשוניים בקליפת המוח ואסטרוציטים. מערכת קו-תרבית זו מאפשרת לזהות היווצרות של מגעים ומעגלים סינפטיים בין נוירונים חדשים שמקורם ב-iPSC לבין נוירונים קיימים בקליפת המוח המבטאים channelrhodopsin-2.

גישת optogenetic להערכת יצירת קשרים עצביים במערכת Co-תרבות

מחקר זה מציג טכניקה לבידוד של נוירונים מ WT עכברים neonatal. זה דורש דיסקציה זהיר של חוט השדרה מן העכבר הילוד, ואחריו הפרדת הנוירונים של רקמת חוט השדרה דרך מחשוף מכני אנזימטי.

נוירונים חוט השדרה בידוד ותרבות מ עכברים ניאונטליים

פרוטוקול זה מתאר תרבית מיקרוגליה-נוירונים שנוצרה מתאים עצביים ראשוניים שבודדו מעוברי עכברים בימים עובריים 15-16 ומתאי מיקרוגליה ראשוניים שנוצרו ממוחם של עכברים ילודים בימים 1-2 שלאחר הלידה.

יצירה וטיפוח משותף של תאי מיקרוגליה ראשוניים של מורין ונוירונים קורטיקליים

טכניקת amperometric מודדת שחרור דופאמין מתא בודד על ידי גילוי נוכחי חמצונים המיוצרים על ידי חמצון דופמין ספונטני. מהדק המתח סימולטני ומתודולוגיה amperometry לחשוף את מערכת היחסים בין מכניסטית "הפעילות" הכוללת של טרנספורטר דופאמין ותפקיד הרגולציה של פעילות זו על ההובלה ההפוכה של דופמין.

מדידת תא בודדה של שחרור דופמין במתח-clamp וAmperometry סימולטני

למדו כיצד ליצור תרביות עצביות משותקות ברמת דיוק של תא בודד באמצעות מערכות מיקרו-זורמיות. השיטה מאפשרת מחקר מדויק של חיבורים עצביים ותקשורת בין תאים במעבדה.

הכנת עצבית שיתוף תרבויות עם Precision תא בודד

גלה סרטונים נוספים