Name: הניצול של לוע התחתון Intratracheal PAMP מנהל ושטיפה ברונכואלוואולרית כדי להעריך את תגובת מארח חיסון של עכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: למדו להעריך תגובת חיסון מארח בעכברים באמצעות ניהול LPS דרך הלוע והשטיפה הברונכואלוואולרית. שיטה זו מאפשרת הערכה מדויקת של דלקת ריאות מקומית ושינויים היסטופתולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים למכללה האזורית VA-MD ברפואת וטרינרית למתן תמיכת ליבה וטכנית עבור פרויקט זה. עבודה זו נתמכת על פיתוח קריירה פרס NIH (K01DK092355) על ידי.

<ol><li>Matute-Bello, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+official+American+Thoracic+Society+workshop+report%3A+features+and+measurements+of+experimental+acute+lung+injury+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals.</a> Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).</li>
<li>Egger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+bleomycin+via+the+oropharyngeal+aspiration+route+leads+to+sustained+lung+fibrosis+in+mice+and+rats+as+quantified+by+UTE-MRI+and+histology%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology.</a> PloS one. 8, (2013).</li>
<li>Rayamajhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsurgical+intratracheal+instillation+of+mice+with+analysis+of+lungs+and+lung+draining+lymph+nodes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Nonsurgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-invasive+intratracheal+inoculation+method+for+the+study+of+pulmonary+melioidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Cell.+Infect.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis.</a> Front. Cell. Infect. Microbiol. 2, 164(2012).</li>
<li>Allen, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+NLRP3+in+the+development+of+allergic+airway+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of NLRP3 in the development of allergic airway disease in mice.</a> J. Immunol. 188, 2884-2893 (2012).</li>
<li>Allen, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+NLRP12+during+the+in+vivo+host+immune+response+to+Klebsiella+pneumoniae+and+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Characterization of NLRP12 during the in vivo host immune response to Klebsiella pneumoniae and Mycobacterium tuberculosis.</a> PloS one. , (2013).</li>
<li>Allen, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+function+of+NPSR1%2FGPRA+in+the+lung+before+and+after+induction+of+asthma-like+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell.+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression and function of NPSR1/GPRA in the lung before and after induction of asthma-like disease.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 291, 1005-1017 (2006).</li>
<li>Kebaier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+alpha-hemolysin+mediates+virulence+in+a+murine+model+of+severe+pneumonia+through+activation+of+the+NLRP3+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus alpha-hemolysin mediates virulence in a murine model of severe pneumonia through activation of the NLRP3 inflammasome.</a> J. Infect. Dis. 205, 807-817 (2012).</li>
<li>Roberts, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+murine+immune+response+to+pulmonary+delivery+of+precisely+fabricated+nano-+and+microscale+particles%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Analysis of the murine immune response to pulmonary delivery of precisely fabricated nano- and microscale particles.</a> PloS one. 8, (2013).</li>
<li>Willingham, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLRP3+%28NALP3%2C+Cryopyrin%29+facilitates+in+vivo+caspase-1+activation%2C+necrosis%2C+and+HMGB1+release+via+inflammasome-dependent+and+-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">NLRP3 (NALP3, Cryopyrin) facilitates in vivo caspase-1 activation, necrosis, and HMGB1 release via inflammasome-dependent and -independent pathways.</a> J. Immunol. 183, 2008-2015 (2009).</li>
<li>Kline, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+airway+responsiveness+to+inhaled+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Med%22%5BJournal%5D)">Variable airway responsiveness to inhaled lipopolysaccharide.</a> Am. J. Respir. Crit. Med. 160, 297-303 (1999).</li>
<li>Cressman, V. L., Hicks, E. M., Funkhouser, W. K., Backlund, D. C., Koller, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+of+chronic+mucin+secretion+to+airway+disease+in+normal+and+CFTR-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The relationship of chronic mucin secretion to airway disease in normal and CFTR-deficient mice.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19, 853-866 (1998).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

השלבים הקריטיים ביותר להערכת התגובה החיסונית המארחת בריאות עכבר בהצלחה הוא כדלקמן: 1) לבחור את הזן המתאים עכבר ומין עבור הדגם נבדק; 2) לייעל את משלוח PAMP לריאות; 3) בצורה נכונה לאסוף ולעבד את בלף; ו -4) לתקן כראוי ולהכין של הריאות להערכות histopathological. הבחירה של זן עכבר היא גורם חשוב בהערכת התגובה החיסונית המארחת. C57Bl / 6 עכברים בדרך כלל נחשבים רקע העכבר האופטימלי לחקר חסינות מולדת עקב תגובת העיקום וחזקה ...

דלקות ריאה הקשורים למיני חיידקים פתוגניים הם גורמים שכיחים לתחלואה ותמותה בעולם. קביעת המנגנונים המניעים את התגובה החיסונית המארחת לפתוגנים אלה יהיו לקדם את הפיתוח של אסטרטגיות חדשניות למניעה וסוכנים טיפוליים שיהיה להחליש את ההשפעה של זיהומים אלה. המטרה הכללית של הפרוטוקול המתואר כאן היא לספק את המשתמש עם שיטה גמישה כדי להעריך את התגובה החיסונית המולדת המארח לזיהום הפתוגן באמצעות דפוס הפתוגן הקשורים מולקולרי (PAMP) כתחליף לחיידקים חיים. רוב המחקרים הקודמים להערכת התגובה החיסונית המולדת לחיידקי המארח התמקדו בדגמי הצפק בשל הקלות היחסית של ביצוע. בעוד מודלים אלה הם שימושיים מאוד והביאו להתקדמות משמעותית בתחום של אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן ודלקת מערכתית, הנתונים המופקים ממודלים אלה לא תמיד מתאימים ללימודים involving מערכת הנשימה. הנה, מודל ריאות של דלקת ריאות חריפה מוצע כהרחבה מעשית ורלוונטית קליני של המודלים הזרקה (IP) intraperitoneal הקלאסיים. הטכניקה המוצעת מאפשרת להערכה המקומית של תגובת החיסון המולדת במערכת מודל ספציפית איברים. השיטות שתוארו כאן נועדו לספק טכניקה פשוטה וחזקה כדי לאפשר למשתמשים להעריך את התגובה החיסונית המארחת לLPS, שהוא PAMP משותף. השיטות מבוססות על intratracheal החדרה (את זה) של LPS, אשר גורם לתגובה חיסונית מולדת חזקה לריאות של עכברים ומחקה רבים מהתכונות pathophysiological נצפו בחולים אנושיים הסובלים מזיהומים בדרכי הנשימה ופציעת ריאות חריפות 1. יתרון עיקרי של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת למשתמש להעריך את התגובה החיסונית המארחת בלי גורמי בלבול וחששות בטיחות הקשורים לביצוע במחקרי vivoשימוש בחיידקים חיים. כמו כן, יש מסלול ממשלו הלוע התחתון של חשיפה שתוארה בפרוטוקול זה יתרונות משמעותיים על פני טכניקות אחרות מנוצלים בדרך כלל, כוללים אפי (ב) ממשל ומנהלו כירורגית. לדוגמא, ממשלו הלוע התחתון מאפשר dosaging מדויק יחסית ותצהיר ריאות בהשוואה בממשל, אשר בדרך כלל סובל מהשתנות מוגברת של תצהיר ריאות עקב האובדן של סוכנים בחלל האף והסינוסים 2-4. מסלול הממשל עוקף חללים אלו ומאפשר גישה ישירה לקנה הנשימה ודרכי הנשימה. כמו כן, גישתה כירורגית היא שיטת ממשל באופן משמעותי יותר חולנית ודורשת הכשרה מקיפה להורים. הפרוטוקולים המתוארים כאן כוללים גם תיאור טכניקות הנפוצות וסמנים פונדקאיות המשמשים להערכת התקדמות דלקת ומסתיים בפרוטוקול המתאר את הטכניקות המתאימות להכנת luNGS להערכות histopathology. פרוטוקולים אלה התמקדו במזעור מספר העכברים הנדרשים לכל מחקר על ידי למקסם את הנתונים המופקים מבעלי חיים הבודדים. הפרוטוקולים שתוארו הם גמישים ביותר וניתן לשנות בקלות להעריך PAMPs מגוון רחב ודפוסי נזקים הקשורים מולקולריים (damps). יתר על כן, עם כמה שינויים נוספים, יכולים להיות מיושמים גם בפרוטוקולים אלה למחקרים להערכת התקדמות מחלה בדרכי הנשימה אלרגיות או אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן עם חיידקים חיים, וירוסים או פטריות 5-10.

<table><tbody><tr><td>C57Bl/6J</td><td>מלאי מעבדת ג'קסון</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>קומפקטי בקנה</td><td>מידה Ohaus Scale Corporation</td><td>71142845</td><td></td></tr><tr><td>מדחום רקטלי לבעלי חיים קטנים</td><td>Braintree Scientific</td><td>TH 5</td><td></td></tr><tr><td>בדיקה רקטלית למכרסמים</td><td>Braintree Scientific</td><td>RET 3</td><td></td></tr><tr><td>Ear Punch</td><td>Braintree Scientific</td><td>EP-S 901</td><td></td></tr><tr><td>ליפופוליסכריד מ-E. coli 0111:B4</td><td>InvivoGen</td><td>LPS-EB</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate Buffered Saline</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>בקסטר</td><td>40032609</td><td></td></tr><tr><td>מתן תוך-קנה ודוכן ניפוח ריאות</td><td>ICAP ייצור</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>מעמד אינטובציה למכרסמים</td><td>Braintree Scientific</td><td>מספריים RIS 100</td><td></td></tr><tr><td>(קהה/חד)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-806-2</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים (ישר)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-327-379</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים (45&ordm;, מעוקל)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>10-275</td><td></td></tr><tr><td>מספריים (קהה/בוטה)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה (200 ומיקרו; l קיבולת)</td> <td>גילסון</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>סיגמא</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק</td><td>BD רפואי</td><td>301025</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל מזרק</td><td>BD רפואי</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>27 גרם x 0.5 במחט</td><td>BD רפואי</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה מקוררת</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-100-676</td><td></td></tr><tr><td>צינורית קנה הנשימה 1.2 מ"מ עם מתאם לואר</td><td>מנגנון הרווארד 732836</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של האנק</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>14025-076</td><td></td></tr><tr><td>4-0 תפר כירורגי קלוע משי</td><td>Ethicon</td><td>A183</td><td></td></tr><tr><td>ערכות מחבר לואר לצינור</td><td>הרווארד מכשיר</td><td>721406</td><td></td></tr><tr><td>ערכת Luer Stopcock</td><td>מכשיר הרווארד 721664</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tygon Formula E-3603 צינורות מעבדה</td><td>Sigma</td><td>R-3603</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פורמלין, חוצץ ניטרלי, 10%</td> <td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>עכבר IL-1&beta; OptEIA ELISA Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>559603</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>550950</td><td></td></tr><tr><td>עכבר TNF-&alpha; OptEIA ELISA Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>560478</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer כיסוי משקפיים</td><td>Thermo Scientific</td><td>22-021-801</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV3008401</td><td></td></tr><tr><td>Cytology Funnel Clips</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-357</td><td></td></tr><tr><td>Cytology Funnels</td><td>Fisher מדעי</td><td>10-354</td><td></td></tr><tr><td>כרטיסי סינון</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-030-410</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שקופיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי משקפיים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-540A</td><td></td></tr><tr><td>ציטוספין ציטוצנטריפוגה</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>A78300003</td><td></td></tr><tr><td>Diff ערכת צביעה מהירה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td></td><td></td>47733150</tr><tr><td>הרכבה בינונית</td><td>פישר מדעי</td><td>SP15-500</td><td></td></tr></tbody></table>

הניצול של לוע התחתון intratracheal pamp מנהל ושטיפה ברונכואלוואולרית כדי להעריך את תגובת מארח חיסון של עכברים

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

התגובה החיסונית המארח לפתוגנים היא תהליך ביולוגי מורכב. רוב במחקרי vivo מועסק קלסי לאפיין אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן לנצל את זריקות intraperitoneal של חיידקים בחרו או דפוסי הפתוגן הקשורים מולקולריים (PAMPs) בעכברים. בעוד טכניקות אלה הניבו נתונים עצומים הקשורים pathobiology מחלות זיהומיות, מודלים זריקת intraperitoneal הם לא תמיד מתאימים ללימודי אינטראקציה המאכסן לפתוגן בריאות. ניצול מודל דלקת ריאות חריף בעכברים, ניתן לבצע ניתוח ברזולוציה גבוה של מארח תגובה חיסונית מולדת ניצול lipopolysaccharide (LPS). כאן, אנו מתארים את השיטות לניהול LPS באמצעות ממשל intratracheal הלוע התחתון לא נזקק לניתוח, לעקוב אחר פרמטרים קליניים הקשורים להיווצרות מחלה, ולנצל את נוזל שטיפת רונכואלוואולרית כדי להעריך את התגובה החיסונית המארחת. הטכניקות המתוארותחלים נרחב ללימוד התגובה החיסונית המולדת המארח למגוון רחב של PAMPs ופתוגנים. כמו כן, עם שינויים קלים, יכולות להיות מיושמות גם בטכניקות אלה במחקרים להערכת דלקת בדרכי הנשימה ואלרגיות ביישומים תרופתיים.

דופן התא של חיידקי גרם שלילי מורכבים מLPS, שהוא נרחב ביותר בסביבה. שאיפה של LPS באוכלוסיות אנושיות רגישות מחריפה תגובתיות דרכי הנשימה ומסוגלת להפעיל response11 חיסונית חזק. LPS גם PAMP נפוץ בשימוש במודלים של עכבר כדי לעורר תגובה חיסונית מולדת חזקה. בפרוטוקול מתואר כאן, העכברים קיבלו מינון זה של LPS מבודד מE. coli (סרוטיפ 0111: B4) באמצעות ממשלו הלוע התחתון. במודלים של חשיפת LPS, גם טמפרטורת הגוף ומשקל הם סמנים פונדקאיות אופייניים לתחלואה בעלי חיים והתקדמות מחלה. אתגר LPS ...

התגובה החיסונית המארחת לזיהום הפתוגן היא תהליך מוסדר היטב. ניצול מודל חשיפת ריאות lipopolysaccharide בעכברים, ניתן לבצע הערכות ברזולוציה גבוהה של המנגנונים המורכבים הקשורים להיווצרות מחלה.

הניצול של לוע התחתון Intratracheal PAMP מנהל ושטיפה ברונכואלוואולרית כדי להעריך את תגובת מארח חיסון של עכברים

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להדגים את השימוש במתן LPS בדרך האורופרינגיאלית-אינטרטראכאלית ובשטיפה ברונכואלוולארית להערכת התגובה החיסונית של המאכסן בעכברים. דבר זה מושג תחילה על ידי חסון של העכבר ב-LPS באמצעות מתן אורופרינגיאלי. בשלב השני, מוחדרת קנולה טרכאלית, ולאחר מכן נאסף נוזל שטיפה ברונכואלוולארית דרך הקנולה להערכת התגובה הדלקתית המקומית.בשלב הסופי, הריאות מנופחות בפורמלין לצורך הערכה היסטופתולוגית. בסופו של דבר, ניתן לנתח את פרופיל הציטוקינים של המעי ואת ההיסטופתולוגיה של הריאה כדי להעריך את התגובה החיסונית של המארח ל-LPS. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מתן תוך-נחרי או מתן תוך-קנה נשימה כירורגי, הוא שטכניקה זו פשוטה יחסית לביצוע ומאפשרת מינון מדויק והשקעה של החומר בריאות.להזרקה תוך-קשייית (intratracheally), יש להזריק תחילה את ה-LPS. תלה עכבר הרדום על צינור אינטובציה. עמוד לצד שיניו הקדמיות, תוך וידוא שהחיה מקובעת היטב ושהפה והלשון נגישים.קבעו בעדינות את הלשון באמצעות פינצטה ישרה, לאחר מכן אחזו בלשון באמצעות פינצטה זוויתית ומשכו בעדינות את השריר החוצה מהפה עד שתרגישו התנגדות קלה בזמן החזקת הלשון. במצב זה, מזריקו מנה של 50 microliter של LPS לחלק האחורי של הגרון וכסו מיד את נחירי החיה באמצעות אצבע עם כפפה למשך חמש עד 10 נשימות כדי לאסוף את הנוזל לאחר ההקרבה. לאחר מכן, בצעו חתך אופקי לאורך חלל הפריטוניאום וחתך אנכי מחלל הפריטוניאום ועד ללסת התחתונה של העכבר.לאחר מכן, אחזו בשני צדי החתך באמצעות הפינצטה ומשכו בעדינות את העור הרחק מחללי הפריטונאום והבית חזה שמתחתיו. בשלב הבא, בצעו חתך גדול לאורך חלל הפריטונאום, מהאיבריים המיניים ועד לעצם החזה, תוך הקפדה להימנע מחיתוך הסרעפת. לאחר מכן, הזיזו בעדינות את המעיים בתוך חלל הפריטונאום כדי לאפשר גישה לאחת הכליות.חתכו את הווריד הרנאלי המוביל לכליה כדי שישמש כנקודת ניקוז עבור הפרפוזיה. לאחר מכן, חרצו את הסרעפת בעזרת מספריים, תוך הקפדה להימנע מפגיעה בריאות ובלב. כדי לחשוף את הצד השמאלי של הלב, השתמשו במזרק של 10 milliliter המצויד במחט gauge 27 כדי לבצע הפרפוזיה ידנית של הלב עם PBS.יש לאפשר לדם שנותר להתנקז מחתך הווריד הפורטלי. לאחר מכן, השתמש במספריים קהות כדי לחתוך בזהירות את כלוב הצלעות לאורך עצם החזה, תוך הקפדה להימנע מחיתוך הלב והריאות.בודד בעדינות את הלב והריאות, ולאחר מכן גזור בזהירות כל מקטע של כלוב הצלעות בעזרת המספריים הקהות קרוב ככל האפשר לעמוד השדרה. לאחר הסרה מלאה של שני מקטעי הצלעות, הפרד את בלוטות הרוק כדי לחשוף את הקנה, וגזור בזהירות את השרירים המכסים את הקנה מבלי לחתוך את הקנה עצמו. כעת הפרד את עצם הבריח ואחז בעדינות בתימוס, תוך הרמתו הרחק מהלב.לאחר מכן, הסר את התימוס באמצעות מספריים, תוך הקפדה להימנע מחיתוך הלב או הריאות. בשלב הבא, השתמש במספריים זוויתיים חדים כדי לבצע חתך אופקי קטן, הגדול מספיק כדי לקבע בבטחה קנולה בתוך הקנה, טבעת אחת עד שתיים מתחת לגרון. לאחר מכן, הכנס קנולה כך שהקצה המצרף יבלוט לשני עד שלושה טבעות של הקנה.מתחת לחתך, העבירו תפר משי בין הקנה למאכלת, ומתחו את התפר סביב הקנולה כדי לקבע אותה. לאחר מכן, מלאו מזרק של 1 מיליליטר ב-HBSS והחדירו בעדינות את הפיה שלו אל תוך הקנולה בתנועה איטית אך קבועה. בשלב הבא, הזריקו כ-900 µL של HBSS אל תוך הקנה כדי לנפח את הריאות, ולאחר מכן שאבו מיד את ה-HBSS החוצה, והעבירו את הנפח שהושב לשפופרת קונית של 15 מיליליטר.לאחר חזרה על השטיפה פעמיים נוספות כדי לאסוף כ-three milliliters של נוזל, אחסנו את השסתום על קרח לצורך נתיחה של הריאות. לצורך ניתוח היסטופתולוגי, הכניסו מזרק של 10 milliliter למעמד לניפוח ריאות וחברו את הצינורית לפתח החיבור (lure), את ה-lure לברז (stop cock) ואת הברז למזרק; ודאו שהברז נמצא במצב סגור, ולאחר מכן מלאו את המזרק בתמיסת פורמלין ניטרלית ומנוטרלת (neutral buffered formalin solution). כאשר המזרק מלא לחלוטין בחומר הקיבוע, הניחו מגבת סופגת תחת הקצה הפתוח של הצינורית ופתחו את הברז כדי לאפשר לחומר הקיבוע למלא את הצינורית.ברגע שהמקבע מתחיל לזרום מהפיתול, סגרו מיד את הברז ומלאו שוב את המזרק עד למעלה במקבע. לאחר מכן, העבירו בעדינות קטע שני של חוט תפירה מתחת לקנה הנשימה, בערך מעל טבעת אחת עד שתיים של הקנה. מתחת לקצה הקנולה, קשרו קשר רופף אחד בחוט התפירה ולאחר מכן הכניסו את הפיתול מנפח העכבר.העמידו את הקנולה במקומה. פתחו את ברז המעצור ואפשרו לריאות להתמלא באמצעות ניפוח בכוח הכבידה. לאחר שהריאות הגיעו לרמת הניפוח המקסימלית שלהן, משכו את התפר בחוזקה וקשרו קשר שני.סגרו את הברז (stop cock) והסירו את הצינורית מהקנולה, ולאחר מכן אחזו בתפר בעזרת פינצטה. משכו את התפר בחוזקה כלפי מטה לכיוון חלל בית החזה ומשכו בעדינות את הקנולה חזרה לכיוון אפו של העכבר כדי להוציאה. לאחר מכן, הרימו בעדינות את הקנה מחלל הצוואר והשתמשו במספריים קהים כדי לחתוך את הקנה עד לתפר המהודק.לאחר שהקנה שוחרר מהרקמות שמתחתיו, התחילו למשוך את הקנה הרחק מהעכבר והרימו בעדינות את הריאות אל מחוץ לחלל בית החזה. לאחר מכן, חתכו בזהירות את רקמת החיבור המחזיקה את הריאות בחלל בית החזה תוך הפעלת כוח קבוע כלפי מעלה, והמשיכו למשוך את הקנה הרחק מגוף העכבר, תוך הקפדה לא לחתוך את הריאות. לבסוף, קבעו את הריאות ב-10 milliliters של buffered formalin.במודלים של חשיפה ל-LPS, שבהם טמפרטורת הגוף והמשקל משמשים כסממנים עקיפים טיפוסיים לתחלואה של בעל החיים ולהתקדמות המחלה, אתגר ה-LPS יגרום לירידה משמעותית בטמפרטורת הגוף בתוך שש השעות הראשונות כפי שמוצג בגרף, כאשר הטמפרטורה תעלה בהדרגה בחזרה לרמת הבסיס במהלך 24 שעות. משקל הגוף, לעומת זאת, יורד באופן עקבי במהלך 24 שעות, נקודה שבה הוא יגיע לשיאו ויחלים בהדרגה במהלך 48 עד 72 השעות הבאות. לפיכך, טמפרטורת הגוף היא סממן מתאים יותר להערכת השלבים המוקדמים של התחלת הדלקת.בעוד שמשקל הגוף מהווה מדד מהימן יותר בשלבים מאוחרים של הפתוגנזה וההחלמה, חשיפה של דרכי הנשימה ל-LPS גורמת להגעה משמעותית של לוקוציטים. בריאות, בתוך שש השעות הראשונות, ניתן להבחין בתאים הקשורים לתגובה החיסונית המולדת של המאכסן בתוך השסתום. הצפיפות התאית ממשיכה לעלות במהלך 24 עד 48 השעות הבאות, כאשר התגובה החיסונית מגיעה לשיאה ולאחר מכן נכנסת לתקופה של דעיכת הדלקת. לאחר 24 שעות, מספר משמעותי של נויטרופילים נוכח בריאות וניתן להבחין בו בשסתום לאחר צביעה דיפרנציאלית.הערכות של תאי השסתום מספקות טכניקה חזקה וכמותית לאפיון התאים הקשורים לתגובת החיסון של המארח בריאות. עלייה זו עולה בקנה אחד עם זרימה משמעותית של נויטרופילים אל דרכי הנשימה, כלי הדם ופרנכימת הריאה. ניתן להעריך ביעילות היסטופתולוגיה של הריאה באמצעות מערכת ניקוד חצי-כמותית, כפי שניתן לראות בתמונה.LPS גורם לעלייה משמעותית בדלקת פרי-כלי דם (perivascular), פרי-סימפוניולרית (peri bronchiolar) ופראנכימלית. מתן LPS גורם לרמות גבוהות של מתווכי דלקת מקומיים ומערכתיים, כולל מספר ציטוקינים הקשורים לתגובת החיסון המולדת כפי שזו נקלטה ב-ELISA. ציטוקינים נפוצים שעולים בריכוזם בריאות לאחר מתן LPS כוללים TNF-α, IL-1β ו-IL-6. ניתן להעריך רמות ציטוקינים מערכתיות גם בסרום באמצעות אותן טכניקות שהודגמו עבור הערכות המעיים.שיטת הקיבוע באמצעות דחיקת כבידה מאפשרת תנאים אופטימליים להערכה היסטופתולוגית בהשוואה לריאות שלא נופחו או לריאות שניפחו ידנית וקובעו באמצעות כבידה. ניפוח מדגים מאפיינים אחידים, המאפשרים דירוג מדויק, הפחתה של נזק אלבולהרי, ויזואליזציה משופרת ורזולוציה גבוהה יותר של הערכות דלקת; ניפוח ידני של הריאות גורם בדרך כלל לאזורי ניפוח שאינם אחידים. אזורים אלו הם לעיתים קרובות מנופחים באופן חלקי, מה שמוביל לקריסת רקמה שלעיתים קרובות נטעית על ידי בוחנים מתחילים כמאפיינים פתולוגיים.ניפוח ידני גורם גם לאזורים בריאות שננפחים יתר על המידה, מה שמוביל לנזק נרחב לחללי הנאולבולי. ריאות שאינן מנופחות מראים חללי נאולבולי קרוסים ואזורים שקשה להבחין בהם ולהעריך אותם ללא הכשרה נרחבת. בדומה לכך, בשל העובדה שהאיבר קרוס, טכניקה זו אינה מאפשרת ויזואליזציה של הריאות כפי שהן נראות in situ.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשרות ולהעריך דלקת ריאות חריפה המתווכת על ידי LPS בעכברים, באמצעות הליך פשוט של מתן תרופה לא פתוח (non-surgical) דרך הפה והקנה וקצירת רקמות.

the-utilization-oropharyngeal-intratracheal-pamp-administration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מדידות חוזרות של הפיזיולוגיה מכרסם הנשימה דגימה של תאים דלקתיים בדרכי האוויר רצויות, אבל בדרך כלל לא ריאלי. כאן אנו מתארים את שיטת הדיר עבור בעל פה intubating עכברים המאפשר מדידות חוזרות של דרכי הנשימה ואת hyperreactivity דגימה של תאים דלקתיים בדרכי האוויר.

הפיך, לא פולשני שיטת ההתנגדות מדידות דרכי הנשימה ואת נוזל שטיפה ברונכואלוואולרית דגימה של עכברים

אנו מדגימים לא ניתוחי מסירה של חומרי הבדיקה לריאות של העכברים הרדים דרך קנה הנשימה. שיטה זו מאפשרת חשיפה הריאות לפתוגנים, ציטוקינים חיידקים ווירוסים, נוגדנים, חרוזים, כימיקלים, או צבעים. בנוסף, אנו מתארים קציר ועיבוד של הריאות ניקוז ריאה בלוטות לימפה (LDLNs) עבור cytometry הזרימה.

לא ניתוחי Intratracheal החדרה של עכברים עם ניתוח ריאות וניקוז ריאות בלוטות הלימפה על ידי זרימת cytometry

אנחנו פיתחנו שיטה פשוטה, אמינה, וזולה יחסית לאינטובציה endotracheal בעכברים באמצעות laryngoscopy הישיר באמצעות אוטוסקופ עם ספקולום 2.0 מ"מ. טכניקה זו היא atraumatic ויכולה לשמש למדידות חוזרות בניסויים כרוניים. אנחנו מוצאים את זה מעולה להנשמה או בעבר דיווח טכניקות נזקקה לניתוח.

Endotracheal אינטובציה בעכברים<em&gt; דרך</em&gt; ישיר laryngoscopy באמצעות אוטוסקופ

intratracheal החדרת תיווך אינטובציה (IMIT) של חומרים כימיים היא שיטה מצוינת, לא פולשנית ללימוד מחלות בדרכי הנשימה, כמו גם שיטה להחדרת חומרים כימיים טיפוליים ישירות לתוך הריאות. זוהי שיטה מהירה ושחזור ביותר אשר מתאימה לניסויים פרה-קליניים.

Intratracheal החדרת תיווך אינטובציה (IMIT): מערכת לא פולשני, ריאות ספציפי משלוח

בעוד שמחקר במבחנה של אינטראקציות מארח-פתוגן מאפשר אפיון של תגובות חיסוניות ספציפיות, מודלים in vivo נדרשים כדי להתבונן בהשפעות של תגובות מורכבות. באמצעות חשיפה לקנדידה אלביקנס ואחריה זיהום ריאות בתיווך Pseudomonas aeruginosa, הקמנו מודל עכברי של אינטראקציות מיקרוביאליות המעורבות בפתוגניות של דלקת ריאות הקשורה למכונת הנשמה.

לומד קהילות חיידקים<em&gt; In vivo</em&gt;: דגם של אינטראקציה בתיווך בין מארח<em&gt; קנדידה אלביקנס</em&gt; ו<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; באיירווייס

אנו מדגימים את ההליך לחיסון תוך קנה הנשימה של המופילוס אינפלואנזה לדרכי הנשימה התחתונות של עכברים. זהו כלי שימושי מאוד לחקר מסלולי איתות המווסתים דלקת בדרכי הנשימה במודלים של עכברים.

מנהל Intra-קנה נשימה של<em&gt; אינפלואנזה המופילוס</em&gt; בעכברי מודל לחקר Airway דלקת

אנו מפרטים כאן את המתודולוגיה שננקטה כדי להשוות את יעילות ההגנה והתגובה החיסונית של הריאות הנגרמת על ידי חיסון תוך-אף ותת עורי עם BCG במודל עכבר. התוצאות שלנו מראות את היתרונות של חיסון ריאתי ומצביעות על תפקיד לתגובה בתיווך IL17 בהגנה הנגרמת על ידי חיסון.

מגן היעילות ריאתי החיסונית בתגובה תת עורי ואת אפי BCG מינהל עכברים

מספר שיטות תוארו בספרות למידול דלקת ריאות חיידקית בעכברים. בזאת, אנו מתארים לא פולשנית, לא יקר, שיטה מהירה גרימת דלקת ריאות באמצעות שאיפה (כלומר, שאיפה) של בידוד חיידקי pipetted לתוך הלוע התחתון. שיטות Downstream להערכה של התגובה החיסונית המולדת ריאתי הם גם מפורטות.

שיטה לא פולשנית הטכנית ללא עתירי עבור אינדוקצית phenotyping של דלקת ריאות חיידקית הניסויית עכברים

מצב בריאותי של הריאה משתקף על ידי סוג ומספר של תאים חיסוניים הנמצאים bronchioles של הריאה. אנו מתארים טכניקת שטיפה ברונכואלוואלית המאפשרת בידוד ומחקר של תאים לא דליקים וגורמים מסיסים ממערכת הנשימה התחתונה של עכברים.

ברונכאלווולאר של ריאות Murine כדי לנתח דלקת תאים דלקתית

כאן אנו מציגים פרוטוקול אלגנטי ויוו הערכה של חיסון היעילות ומנחה תגובות מערכת החיסון. פרוטוקול זה ניתן להתאים מודלים חיסון ללמוד ויראלי, חיידקי, או טפילים פתוגנים.

הערכה של פתוגן-פונדקאי תגובות והיעילות החיסון בעכברים

כאן, אנו מציעים פרוטוקול להעברת ליפופוליסכריד תוך טרכאלי (LPS) באמצעות אינטובציה אנדוטרכאלית אורופרכאלית לא פולשנית. שיטה זו ממזערת את הטראומה של ההליך הכירורגי עבור החיה ומעבירה LPS מדויק לקנה הנשימה ולאחר מכן לריאות.

החדרת ליפופוליסכריד תוך טרכאלי לא פולשני בעכברים

למדו להעריך תגובת חיסון מארח בעכברים באמצעות ניהול LPS דרך הלוע והשטיפה הברונכואלוואולרית. שיטה זו מאפשרת הערכה מדויקת של דלקת ריאות מקומית ושינויים היסטופתולוגיים.

הניצול של לוע התחתון Intratracheal PAMP מנהל ושטיפה ברונכואלוואולרית כדי להעריך את תגובת מארח חיסון של עכברים

גלה סרטונים נוספים