תמליל והמטבוליט Profiling להערכת של טבק ועץ צפצפה כחומר גלם לתעשייה המבוססת על ביו

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבסס ולייעל נתוני ריצוף מטבוליט ו-RNA מחומר עלי עץ טבק להערכות מוכוונות ביולוגיה של מערכות. זה מושג על ידי איסוף תחילה של החומר הביולוגי של סדרת עלים התפתחותית. השלב השני הוא ביצוע מיצוי של החומר באמצעות הממיסים המתאימים בהתאם לניתוח שלאחר מכן.

לאחר מכן, מטבוליטים ופחמימנים נמדדים באמצעות כרומטוגרפיה של גז, ספקטרומטריית מסה או GCMS והתמלילים מנותחים באמצעות רכישת נתוני ריצוף RNA. בסופו של דבר, השילוב של פרופיל מטבוליט ופרופיל שעתוק באמצעות ריצוף RNA משמש כדי להראות כיצד עלי עץ טבק מפתחים פחמימנים ארוכי שרשרת ותרכובות חשובות אחרות. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לזהות ולכמת מטבוליטים שימושיים חשובים המיוצרים בעלים של עץ הטבק.

אם כי שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מטבולום עץ הטבק. זה יכול לשמש גם למערכות אחרות כגון טבק או מינים קשורים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שקשה להפיק מהם עלי עץ טבק RNA טוב.

בסרטון מרובה Bioo PRO זה, תוכלו לראות חברים מקבוצת FERNA מחלצים ומבצעים חילוף חומרים בפרופיל. באמצעות GCMS, תראה גם חבר מקבוצת פרייזר מחלץ פחמימנים וגם חבר אחד מהקבוצה שלי שיחלץ RNA לריצוף RNA התחל על ידי גידול צמחי neko Oceana Glauca בעציצים בקוטר 30 סנטימטר המכילים M שני מצעי גידול מקצועיים כמפורט בפרוטוקול הטקסט להכנת המטבוליטים העיקריים, קצרו את העלים והגבעולים של הצמח והקפיאו את החומר מיד ליופיליזציה של החומרים הצמחיים הקפואים על ידי ייבוש בהקפאה למשך שלושה ימים, ואז טוחנים את הדגימות הליופיליות על ידי טחנת מערבל עם כדורי מתכת, מביאים את החומרים היבשים הטחונים העדינים המתקבלים לתוך צינור צנטריפוגה של שני מיליליטר או בקבוקון זכוכית. לאחר מכן, 10 מיליגרם של עלה או 20 מיליגרם של חומר צמחי יבש טחון גבעול לתוך שני מיליליטר עם מכסה בורג צינורות תחתונים עגולים.

הוסף 1.4 מיליליטר של 100% מתנול ומערבולת למשך 10 שניות. לאחר מכן הוסף 60 מיקרוליטר אטול צלעות כתקן כמותי פנימי לפני המערבולת. למשך 10 שניות נוספות, הוסף כדור נירוסטה אחד והומוגניזציה של החומר עם טחנת מיקסר למשך שתי דקות ב-25 הרץ לאחר צנטריפוגה למשך 10 דקות.

בכוח הכבידה פי 11,000, העבירו את הסופרנטנט לבקבוקון זכוכית. הוסף 750 מיקרוליטר כלורופורם ו -1.5 מיליליטר מים לפני מערבולת התערובת למשך 10 שניות. לאחר מכן העבירו 150 מיקרוליטר מהשלב העליון לצינור צנטריפוגה טרי של 1.5 מיליליטר.

לאחר מכן, יבש את הדגימות באמצעות שואב מהירות. הכרחי שהדגימות יופחתו ליובש בין שלוש ל-24 שעות עד שלא יימצא נוזל שנותר. לאחר הייבוש, מוסיפים 40 מיקרוליטר של מתין הידרוכלוריד.

לאחר מכן מנערים את התערובת בשייקר בלוק חום אופקי למשך שעתיים בחום של 37 מעלות צלזיוס. מוסיפים 70 מיקרוליטר תערובת M-S-T-F-A לפני שניערו שוב במשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס. סובב את הטיפות על המכסה על ידי צנטריפוגה קצרה לפני, לפני העברת הנוזל לבקבוקוני זכוכית המתאימים לניתוח GC MS.

בעקבות GCMS ניתוח נתונים על ידי הגדרת תוכנה לניתוח נתוני ספקטרומטריית מסה ובחירת ניתוח הנתונים לעיבוד. הכן טבלה של שיאי עניין שזוהו בהתאם לסוג התרכובות. זהה את הפסגות על ידי קואליציה של תרכובות סטנדרטיות, ולאחר מכן ביאורים על פסגות שזוהו באמצעות ניתוח ספקטרומטריית מסה, אלגוריתמים לאפיון מבני, סקר ספרות וחיפוש מסד נתונים של מטבוליט להפקת פחמימנים.

טבלו כ-200 מיליגרם של עלי גלאוקו טריים שנקטפו ללא חדלות פירעון למשך שתיים עד 20 דקות, הסירו את העלים וייבשו את הממיסים לחלוטין על ידי אידוי סיבובי. לאחר מכן השעו מחדש את הדגימות במיליליטר אחד של הקסאן בדרגת HPLC. המשך לבצע ניתוח GCM של הדגימות באמצעות הפרמטרים המפורטים בפרוטוקול הטקסט.

בתחילה עבד את רכיבי הכרומטוגרמה באמצעות MS אוטומטי. מערכת דה-קונבולוציה וזיהוי ו-NIST 98 MS. ספריה. אשר את הזיהוי של פחמימנים ארוכי שרשרת רוויים על ידי השוואת זמני שמירה ודפוסי פיצול קלאסיים לסטנדרטים אותנטיים ידועים. לאחר מכן, קבע פחמימנים כמותית על ידי השוואת אזורי שיא משולבים עם עקומות תגובת מינון.

בנוי מסטנדרטים אותנטיים, חישוב אמצעים ושגיאת תקן של האמצעים באמצעות תוכנת אקסל. פרוטוקול זה משלב מיצוי RNA של TRIOL עם ערכת RN קלה להשגת RNA באיכות גבוהה לטחינת 100 מיליגרם של חומר צמחי קפוא בשני צינורות צנטריפוגה של מיליליטר עם כדור מתכת על ידי טחנת מערבל. לאחר הומוגניזציה של הדגימה, הוסף מיליליטר אחד של טריול לאחר צנטריפוגה של החומר למשך 10 דקות בכוח הכבידה פי 12,000 וארבע מעלות צלזיוס.

העבירו את הסופרנטנט לתוך צינור תגובה חדש. הוסף 200 מיקרוליטר כלורופורם והפוך את הצינור מספר פעמים לפני הדגירה למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה התערובת למשך 15 דקות.

כמו קודם, העבירו את השלב המימי העליון לצינור תגובה חדש. הוסף כ -2.5 נפחי אתנול. הפוך את הצינור מספר פעמים ודגירה למשך 30 דקות במינוס 80 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, העבר את הדגימה כולל כל משקעים לעמודת ספין. צנטריפוגה של העמוד למשך 15 שניות בכוח הכבידה פי 8,000 והשליכו את הזרימה דרכם. הוסף 700 מיקרוליטר של מאגר כביסה RW אחד, המסופק בערכת החילוץ לעמוד הסיבוב ולצנטריפוגה.

שוב, לאחר השלכת הזרימה, הוסף 500 מיקרוליטר ממאגר הכביסה השני, RPE המסופק גם על ידי הערכה לעמודת הסיבוב. צנטריפוגה שוב את העמודה והשליכו את הזרימה לפני הוספת עוד RPE חיץ וצנטריפוגה. כמו קודם, הנח את עמוד הספין לתוך צינור תגובה חדש של 1.5 מיליליטר והוסף 50 מיקרוליטר של צנטריפוגת מים ללא RNA, העמודה למשך דקה אחת בכוח הכבידה פי 8,000 כדי להוציא, את ה-RNA.

הסר את שאריות ה-DNA באמצעות ערכה נטולת DNA בהתאם להוראות היצרן. כשלב אחרון, קבע את איכות ה- RNA. ל-RNA צריכים להיות מספרי שלמות RNA מעל שמונה לפני שליחת ה-RNA לריצוף הדור הבא.

פרופיל HPLC מציג תוצאה מייצגת של ניתוח איזופרנואיד של תמציות עלי ncoa glauca. האיזופרנואידים השונים של C 40 ומעלה זוהו באמצעות גלאי מערך דיודות צילום. הפסגות הוסברו על סמך כרומטוגרפיה של קוד והשוואה ספקטרלית בין תקנים אותנטיים.

שתי הכרומטוגרמות של MS הן תוצאה של ניתוח מטבוליט ראשוני מחומר ncoa, עלה גלאוקו וגבעול. ספקטרום MS של שיא המתאים לסרין ניתן גם הוא, כדוגמה, מוצג פלט מייצג של הביו-אנלייזר המשמש לקביעת איכות ה-RNA. שתי הפסגות העיקריות בכרומטוגרמה תואמות ל-18 שניות ו-25 שניות ריבוזומליות, RNA המצביע על RNA שלם בדגימה זו.

שיאים נוספים של RNA ריבוזומלי מקוטע יופיעו במקרה של RNA מפורק חלקית או כבדה לאחר שליטה. ניתן לבצע טכניקה זו במהירות והיא תואמת לניתוח מטבוליטים אחרים בעקבות הליך זה. ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו PCR בזמן אמת או דרכים אחרות לניתוח RNA על מנת לענות על שאלות נוספות כמו ייצור RNA קטן או ביטוי של גנים ספציפיים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לחלץ ולהעריך נתוני מטבוליט מעץ הטבק.