שיטות הדמיה אימונוהיסטוכימיים וסידן בWholemount עכברוש הרשתית
13 באוקטובר 2014
פרוטוקולי אימונוהיסטוכימיה משמשים ללמוד את הלוקליזציה של חלבון מסוים ברשתית. טכניקות הדמיה סידן מועסקות ללמוד דינמיקת סידן בתאי הגנגליון ברשתית והאקסונים שלהם.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לתייג באופן סלקטיבי תאי גנגליון רשתית בכל הכנת ההר באמצעות הזרקת גדם עצב ראייה של צבע אינדיקטור סידן. זה מושג על ידי הזרקת צבע אינדיקטור סידן בעל זיקה גבוהה מאוד, כגון זרימה ארבע לתוך גדם עצב הראייה. לאחר מכן, הרשתית מבודדת מכוס העין ומחולקת לרבעים להרכבה על מגלשת זכוכית בתא הקלטה שהוקם כדי לחקות תנאים פיזיולוגיים, התרומות של תעלות סידן מגודרות מתח לאות הסידן.
בגנגליון ברשתית ניתן למדוד תאי גנגליון בתאים דה-פולריים באמצעות חוסמי תעלות. בסופו של דבר, התוצאות יכולות לספק מדידות כמותיות למחצה של תרומת תעלות הסידן המשכילות במתח לאות כגון אות סידן מעורר אשלגן גבוה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון אלקטרופורציה וטעינה בתפזורת, הוא היכולת לתייג באופן סלקטיבי תאי גנגליון ברשתית והאקסונים שלהם בתכשיר שלם לאחסן, לנתח עיני ראד ולתרדמת מדיום מטרות או פתרון דומה.
כעת, אם אתה מתכוון לבצע ניסויי הדמיית סידן, מלא מחדש את תאי הגנגליון ברשתית בזרימה ארבע. להזריק 0.5 מיקרוליטר של 40 מילי-מולרית זרימה של 40 מלח אשלגן פנטה, שנוצר מחדש במים לעצב הראייה, גדם כמילימטר אחד אחורי לגלגל העין. העבירו את גלגל העין לצלצולי יונקים.
מבעבע עם 95% חמצן, 5% פחמן דו חמצני, או שעה בטמפרטורת החדר. שמור את ההכנה בחושך. נתח את העיניים תחת מיקרוסקופ בעוצמת אור מבוקרת.
בעזרת סכין גילוח, בצעו בעדינות חתך קטן בקדמת גלגל העין והסירו את הקרנית. לאחר מכן הסר את העדשה ממשטח הרשתית הפנימי באמצעות מלקחיים. החזק את הסקלרה בחוזקה.
בעת הסרת הזגוגית עם המלקחיים האחרים, יש לקלף בעדינות את בסיס הזגוגית לכיוון מרכז הרשתית. ניתן לעבד את התכשיר המתקבל הנקרא I cup להכנת הרכבה שלמה אימונוהיסטוכימית, הכנת הדמיית סידן, או להכין לחלקי רשתית רוחביים להכנת תכשיר אימונוהיסטוכימי שלם. ראשית, בצע ארבעה חתכים ברשתית כך שהיא תשכב שטוחה.
הנח את הרשתית על מגלשת כיסוי הזכוכית כששכבת תאי הגנגליון פונה כלפי מטה. שנית, הוסיפו טיפת תמיסה לרשתית וכסו אותה בנייר סינון תאית במידת הצורך, שטחו את הרשתית בעזרת מברשת או מלקחיים. שלישית, כאשר הרשתית שטוחה לחלוטין ומתנתקת מנייר המסנן, הנח אותה בחזרה לתמיסה.
כדי לעבד את התכשיר תחילה, העבירו אותו ל -4% אלדהיד פרפורם למשך 10 עד 15 דקות. לאחר מכן שטפו את הרשתית שלוש פעמים במאגר פוספט מולארי של 0.1 ב-pH 7.4 למשך 30 דקות לכל שטיפה למשך 90 דקות בסך הכל. לאחר מכן, דגרו את הרשתית ב-500 מיקרוליטר של תמיסת חסימה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.
תמיסה זו היא סרום עיזים רגיל או סרום חמור במאגר פוספט עם 0.3% טריטון ו-0.1% נתרן אזיד במהלך חמשת עד שבעה הימים הבאים, לדגור את הרשתית בתמיסת הנוגדנים העיקרית בארבע מעלות צלזיוס. יש להגיע להרכב של פתרון זה באופן אמפירי. שטפו את תמיסת הנוגדנים העיקרית בדיוק כפי שהקיבוע נשטף.
לאחר מכן דגרו את הרשתית בנוגדנים משניים בריכוז של 1 עד 1000 למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. הסר את הנוגדן המשני עם שלוש שטיפות נוספות ומאגר פוספט. לאחר מכן הרכיבו את הרשתית להדמיה ואטמו עם לק.
יש לאחסן את המגלשות הללו בחושך בארבע מעלות צלזיוס. התחל בהכנת תכשיר הדמיית סידן שלם מכוס I בצלצולים. ראשית, חתכו את רקמת הרשתית לרבעים.
הנח רבע אחד שטוח על תא ההקלטה כששכבת הגנגליון פונה כלפי מעלה, וכך שכבת קולטני האור פונה כלפי מטה. יבשו בזהירות את האזור שמסביב עם מגבון קים והניחו בעדינות את הנבל המשומן על הטישו. כעת העמיסו את הכנת הרשתית על המתקן וסיימו את הקמת מערכת הסופר-פיוז'ן המונעת על ידי כוח הכבידה של שמונה הערוצים.
אם הרשתית המותקנת זזה לאחר הנחת הנבל, הסר בזהירות ונקה את הנבל. יבש את האזור המקיף את הרשתית והרכיב מחדש את סופר הנבל. מזגו את תא ההקלטה עם תמיסת צלצול יונקים ושמרו על התמיסה מבעבעת ברציפות עם 95% חמצן, 5% פחמן דו חמצני.
ראשית, כביקורת ללא תרופות, בצע שני פולסים זוגיים של אשלגן גבוה משלושה מילימולר ל-60 מילימולר למשך 33 שניות. דה-פולריזציה, ה-RGC צריך להפעיל את תעלות הסידן המגודרות במתח אם התכשיר פועל. כעת המשך בניסויים.
חוסם תעלות סידן מגודר מתח מסוג ניפדיפין ו-L משמש בדרך כלל להערכת התרומה של תעלות סידן מגודרות מתח מסוג L לקובלט אות סידן מעורר דפולריזציה. ניתן להשתמש בחוסם תעלות סידן לא ספציפי כדי לחסום באופן סלקטיבי תעלות סידן מגודרות מתח. סרוק את ההכנה כל חמש שניות כדי לדמיין ולרכוש תמונות של ה-rgc הפלואורסצנטי.
השתמש בעוצמת לייזר נמוכה ככל האפשר. יש להגדיר עירור ל-488 ננומטר ולאסוף פליטה עם מסנן LP של 505 ננומטר. באמצעות הפרוטוקולים המתוארים, בוצע תיוג חיסוני כנגד חלבון תאי הגנגליון R-B-P-M-S, שהוא חלבון קושר RNA עם זרימת שחבור מרובה. ארבע.
הצביעה אכן הוגבלה לתאי גנגליון על סמך מפרט הנוגדנים. לאחר מכן, התרומה של תעלות הסידן המגודרות במתח לאות הסידן ב-R GCs נחקרה באמצעות ערכי עוצמת הפלואורסצנט שנרכשו מה-rgc. ברמות הבסיס, ניתן לראות אקסונים RGC ו-RGC מסומנים בזרימה ארבע.
על מנת לרכוש ערכי עוצמה פלואורסצנטיים, הונחו ROIs על תא הגנגליון, הסומטה ו/או האקסונים. לאחר מריחת אשלגן גבוה על כל הכנת התושבת, האות הפלואורסצנטי של ה-RG C גדל. לאחר מכן חלה ירידה בערכי עוצמת הקרינה בנוכחות קובלט במהלך דופק האשלגן הגבוה השני.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעמיס באופן סלקטיבי תאי גנגליון רשתית עם אינדיקטור סידן סינטטי למות בתכשיר הר שלם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מפרט פרוצדורה לסימון סלקטיבי של תאי עצב גרניולריים ברשתית באמצעות צבע אינדיקטור לסידן, באמצעות הזרקה לשורש העצב האופטי. הטכניקה מאפשרת לחקור את דינמיקת הסידן בתאים אלו ובאקסונים שלהם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- אימונוהיסטוכימיה
רקע
- דימוי סידן חיוני להבנת דינמיקה תאית.
- תאי גנגליונים ברשתית ממלאים תפקיד מרכזי בעיבוד חזותי.
- לשיטות קיימות לסימון תאים יש מגבלות.
- טכניקה זו מציעה גישה סלקטיבית יותר.
מטרת המחקר
- לסימון תאי גנגליון ברשתית בדגימות שלמות (whole mount).
- למדידת דינמיקת הסידן בתאים אלו.
- להערכת התרומה של תעלות סידן תלויות-מתח.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הזרקה של צבע אינדיקטור לסידן בעל זיקה גבוהה לתוך השארית של העצב האופטי.
- בידוד וחלוקה לרבעים של הרשתית לצורך קיבוע.
- שימוש בחוסמי תעלים להערכת אותות סידן בתאים דפולריזים.
- הקלטה בתא המדמה תנאים פיזיולוגיים.
תוצאות עיקריות
- סימון מוצלח של תאי גנגליון ברשתית ואקסוניהם.
- מדידה של אותי סידן בתגובה לדפולריזציה.
- הערכה כמותית של תרומתם של תעלות סידן תלויות-מתח.
- הדגמת היתרונות לעומת שיטות מסורתיות.
מסקנות
- הטכניקה מספקת שיטה מהימנה לחקר תאי גנגליון ברשתית.
- היא משפרת את ההבנה של דינמיקת הסידן בנוירונים אלה.
- מחקרים עתידיים יכולים להסתמך על שיטה זו כדי להגיע לתובנות נוספות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת סימון סלקטיבי של תאי עצב גרנולריים ברשתית (retinal ganglion cells) בדגימות של mount שלם, ובכך נותנת מענה לאתגר מרכזי בתיקוף מטרות במדעי העצבים, שבו סימון לא ספציפי מסתיר את הפרשנות המכניסטית. על ידי בידוד תרומות של איתות סידן מערוצי סידן תלויי-מתח, הגישה תומכת בביטחון ניבוי בהפחתת סיכונים של מסלולים עבור גילוי טיפולים נוירותרפויטיים. הטכניקה מספקת מערכת רלוונטית למחלה להערכת מעורבות המטרה ומדדים תפקודיים במודלים של תאי עצב גרנולריים ברשתית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות סימון סלקטיבי של תאי גנגליון ברשתית כדי לבודד איתות סידן ספציפי למטרה.
- ערך תפעולי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי עקיפת טעינה לא ספציפית של תאי אמקרין מוסטים בשכבת תאי הגנגליון.
- ערך ניבוי: תומך בביטחון לגבי המטרה באמצעות מדידה חצי-כמותית של תרומתם של תעלות סידן תלויות-מתח לאותים שעוררו דפולריזציה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מכין מערכות ביולוגיות עוברות תיקוף עבור תהליכי עבודה המשכיים על ידי בידוד תאי גנגליון של הרשתית ואקסונים שלהם בהכנה של דגימה שלמה (whole mount).
- תוצרים כמותיים: מאפשר מדידות של עוצמת פלואורסצנציה מאזורי עניין בגוף התא (soma) ובאקסונים של תאי הגנגליון לצורך סריקת תרכובות.
- שחזוריות: סטנדרטיזציה של ההכנה באמצעות חלוקה לרבעים והרכבה על שקופיות זכוכית בתנאים המדמים תנאים פיזיולוגיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מספק מודל של תאי גנגליון ברשתית התואם למסלולי עיבוד חזותי לצורך חקר ביומרקרים תרגומיים.
- המשכיות פרה-קלינית: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי מדידת דינמיקה של סידן בתגובה לדפולריזציה של אשלגן גבוה ולהחלת חוסמי תעלות.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבהיר את תפקידם של תעלות סידן תלויות-מתח מסוג L ותעלות סידן לא ספציפיות באיתות סידן באמצעות nifedipine וקובלט.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד להערכה פרה-קלינית, באמצעות יצירת סימון תאי סלקטיבי ומדידות פונקציונליות של סידן.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים באמצעות הזרקה של צבע אינדיקטור לסידן בעל זיקה גבוהה לשורש עצב הראייה.
- סינון: מספק מוכנות למסע ובדיקות ופלטים פלואורסצנטיים כמותיים באמצעות דפולריזציה מבוקרת והדמיה בתא הקלטה.
- אנליטיקה: מאפשר השוואה בין תנאים באמצעות ערכי עצימות פלואורסצנציה שנרכשו לפני ואחרי יישום של חוסמי תעלות.
- מחקר תרגומי: מקשר להמשכיות פרה-קלינית באמצעות מידול של מערכת רלוונטית למחלה של תפקוד תאי גנגליונים ברשתית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס יכולת הניתנת לשימוש חוזר לחקר דינמיקת סידן בהכנות עצביות תחת תנאים ניסיוניים מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי, תיקוף מטרות (target validation) וצמצום עמימות מכניסטית במחקרי אותיות סידסיום.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת הרחבה (scalability) של תכשירי רשתית שלמים (whole mount retinal preparations).
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך התקדמות (go/no-go), יעילות הון וצמצום סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות למטרות נוירולוגיות.
- השפעה על הפורטפוליו: תעדוף וקבלת החלטות על קידום, מותאמים לסיכון, על בסיס הערכות כמותיות של אותיות סידסיום.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרו-כירורגיה להזרקה לשארית העצב האופטי ולדיסקציה של הרשתית.
- תלוי בתשתית של מיקרוסקופיית פלואורסצנציה עם עירור ב-488 nm וסינון פליטה LP ב-505 nm.
- דורש סטנדרטיזציה בין צוותים להכנת תמיסות, כולל Ringer's של יונקים וחומרי חסימה.
- כולל שיקולי התאמה בין מערכות מודלים עקב אנטומיה רשתיות ספציפית למין ויעילות טעינת הצבע.
- מגבלות מעשיות כוללות שונות בטעינת הצבע ואת הצורך באחסון בחושך ב-4°C לשמירה על שלמות האות.
