Name: שיטות הדמיה אימונוהיסטוכימיים וסידן בWholemount עכברוש הרשתית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: למד שיטת סימון סלקטיבי של תאי גנגליון רשתית בעכברוש באמצעות צבע סידן דרך שארית עצב הראייה. טכניקה זו מאפשרת מדידת דינמיקת סידן בתאים ובאקסונים שלהם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד&quot;ר ס &#39;סטלה והלן Vuong על תרומתו לפרוטוקול ההדמיה סידן. אנו מודים לגיליונות ד&quot;ר ק לצילום סצנות הראיון. אנו מודים לד&quot;ר ארלין היראנו על הערותיה על כתב היד. פרויקט מחקר ופיתוח זה נערך על ידי החוקרים בבית ספר דייוויד גפן לרפואה באוניברסיטת קליפורניה ומתאפשר על ידי הסכם חוזה שהוענק ומנוהל על ידי פיקוד המחקר ואמצעי רפואה של צבא ארה&quot;ב (USAMRMC) וטכנולוגית טלרפואה והמתקדמת מרכז מחקר (TATRC), בפורט דטריק, MD תחת מספר חוזה: W81XWH-10-2-0077. תמיכה במחקרים אלה גם באו מEY04067 NIH וסקירת VA הצטיינות (NB). NCB הוא VA קריירה מדען מחקר.

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות לרווחתם של חיות ניסוי שהונפקו על ידי מדיניות שירות בריאות הציבור בארה&quot;ב על טיפול באדם ושימוש בחי מעבדה ואוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג&#39;לס (UCLA) ועדת מחקר בבעלי חיים. חולדות ספראג-Dawley בוגרת זכר ונקבה (נהר המעבדה צ&#39;ארלס, Wilmington, MA) בין גיל 3-5 שבועות היו בשימוש. .1 בעלי חיים ורקמות הכנה לWholemount רשתית ואימונוהיסטוכימיה פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החומרים הבאים וכלים: מיקרוסקופ לנתח, 2 מלקחיים עם טיפים יפים מאוד, מספריים, נייר סינון תאית, פיפטה פלסטיק ושקופיות מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברוש בחדר סגור על ידי עמוק הרדמת בעלי החיים עם isoflurane 1-3% אחריו עריפת ראש עם גיליוטינה. הסר את העיניים עם זוג מספריים איריס ומניחים בצלחת פטרי המכילה פתרון תאי. מצב שינה, איימסdium או פתרונות פיסיולוגיים מומלצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [צעד אופציונאלי אם למלא את המשבצות של RGCs עם Fluo-4 היא רצויה]. לבצע את תיוג Fluo-4, כמתואר ב2.3-2.4 צעדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתח (עוצמת אור: 1.6 x 10 8 פוטונים / 2 מ&quot;מ ⋅sec), להסיר את הקרנית על ידי חיתוך החלק הקדמי של העין הכדור. הסר את העדשה וזגוגית מפני שטח הרשתית הפנימי עם מלקחיים. כדי להסיר את הזגוגית, לייצב את גלגל העין על ידי לחיצה על לובן העין בחוזקה עם מלקחיים אחד. לקלף בעדינות את בסיס הזגוגית לכיוון מרכז הרשתית עם המלקחיים האחרים. ההכנה בשלב זה נקראת עיינית, המשמשת לcryosections. ניתן למצוא פרטים נוספים על cryosections באזכור 14,15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרשתית מעיינית. ואז, להפוך את ארבעה חתכים, כדי לאפשר את הרשתית לשכבה. בעדינות לעלות הרשתית בשקופית מיקרוסקופ עם השכבה עד קולטי האור. הוסף טיפה אחת של פתרון לרשתית ולשים ceנייר סינון llulose על הרשתית. ברגע שהרשתית מתחברת לנייר הסינון, למקם את הרשתית חזרה בפתרון. במידת הצורך, לשטח את הרשתית עם מברשת או מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את רשתיות wholemounted לPFA 4% עבור 10-15 דק &#39;לקיבעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את רשתיות wholemounted שלוש פעמים ל30 דקות ב0.1 M חיץ פוספט (PB), pH 7.4. לחסום את הרשתיות עם 5% עזים בסרום נורמלי או חמור בדם ב0.1 PB מכיל 0.3% Triton-X 100 ו0.1% NaN 3 על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. אנו ממליצים נפח סופי של μl 500 לכל הצעדים כדי להציל את הפתרונות ונוגדנים חסימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, דגירה wholemounts רשתיות עם 5-7 ימי הנוגדן הראשוניים ב 4 ° C.. דילולים אופטימליים צריכים להיקבע על ידי המשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את רשתיות 3 x 30 דקות בPB 0.1 M ודגירת הלילה בשעה 4 ° C בנוגדן fluorophore מצומדות- המקביל המשני שמופנה נגד המינים של הנוגדן הראשוני (ריכוז 1: 1,000). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שלוש שטיפות סופיות של 30 דקות כל אחד עם PB, הר הרשתיות בהרכבה בינונית. חותם את coverslips עם לק לאחסון ממושך. דגימות חנות ב 4 ° C ולהגן מפני אור. </li></ol> .2 תיוג של תאים הגנגליון והאקסונים בעכברוש Wholemount רשתיות עם סידן המחוון דיי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1,000 מ&quot;ל של Ringer של יונקים המכילים (במ&quot;מ) 125 NaCl, KCl 3, 2 CaCl 2, 1.25 לאא 2 PO 4, 1 MgCl 2, 25 NaHCO 3, ו10 גלוקוז מבעבע עם 95% O CO 2/5% &#173; 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את הנתיחה, כמתואר ב1.2-1.4 הצעדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לטעון תאי הגנגליון ברשתית (RGCs) והאקסונים שלהם עם צבע מחוון סידן, להזריק 0.5 μl של מלח Fluo-4 pentapotassium (40 מניית מ&quot;מ בH 2 O) לגדם עצב הראייה כ מ&quot;מ אחורי 1 לגלגל העין באמצעות מזרק . כדי למדוד עליות דינמיות בתא גנגליון [Ca 2 + </sup&gt;] אני מחוון בזיקה גבוהה, כגון Fluo-4 עם ד K של 345 ננומטר, הוא אופטימלי. Fluo-4 מציע יתרון נוסף שיש לו יעילות קוונטית גבוהה מאוד וכתוצאה מכך גידול פליטה של&gt; 100 לקפל כאשר חייב סידן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את עיינית בCO 2/5% מבעבע עם 95% O רינגר יונקים &#173; 2 לשעה 1 בטמפרטורת חדר בחושך. </li></ol> פרוטוקול הדמיה 3 סידן לתאי הגנגליון ברשתית והאקסונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העין, העדשה וזגוגית כמתואר בשלבי 1.1-1.4. לבודד את הרשתית מעיינית ומתחלקים לרביעים. צד הר תא גנגליון רבע אחד על שקופית זכוכית ולהשתמש ברשת פרוסת נבל כדי לייצב אותו. שמור את החלקים האחרים כהים מותאמים בCO 2/5% מבעבע עם 95% O רינגר יונקים &#173; 2 על קרח לשימוש מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Superfuse חדר ההקלטה עם הפתרון של רינגר יונקים ולשמור על הפתרון המבעבע ברציפות עם 95% O 2/5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת הרקמה תחת המיקרוסקופ. ניסויי התנהגות בטמפרטורת חדר (~ 23 מעלות צלזיוס) או להשיג טמפרטורות פיסיולוגיות על ידי התחממות השלב, חימום אמבט המים מתחת לדגימה או החלת אוויר חם אל פני השטח של הדגימה. הערה: חשוב לציין כי רבים תפקודים תאיים מוסדרים על ידי טמפרטורה, אשר ממלאת תפקיד מפתח בשמירה על הומאוסטזיס תאיים 16. עם זאת, כניסתה של אמצעי ההתחממות עשויה להגדיל את שיעור photobleaching, אידוי של הסחיפה בינונית ומיקוד הנגרמת על ידי התפשטות תרמית 17. שימוש בטמפרטורת חדר יורד מידור תאיים של Fluo-4 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע שליטה של שתי K + פולסים גבוהים לזווג בהעדר תרופות. Depolarize האקסונים RGCs וRGC ידי העלאה [K +] o מ3 מ&quot;מ ל60 מ&quot;מ ל33 שניות במהלך כל דופק כדי להפעילVGCCs עם מערכת superfusion מונעת שמונה הכבידה ערוץ. להפחית Na + על ידי 57 מ&quot;מ לשמור isosmolarity בפתרון K + הגבוה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את התרומה של VGCCs שונה לאות סידן עם השימוש בחוסמי תעלות Ca כלליות או ספציפיים. לדוגמא, הירידה באות סידן הבא הממשל של קובלט חוסם תעלות הסיד שאינו ספציפי, ובלבד מידה חצי כמותית של התרומה של VGCCs לגבוה K אות סידן -evoked +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש ערכי עוצמת הקרינה על ידי הצבת אזור של עניין (ROI) ברחבי RGCs של עניין (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את השינוי בעוצמת הקרינה המיוצרת על ידי הגבוה K השני + שיא לשינוי המיוצר על ידי הגבוהה K + השיא הראשון. ואז, לבדיקה של חוסמי תעלות סידן ספציפיים, תחול תרופות רק בדופק K + הגבוה השני של זוג ולנרמל את השיא הזה נגדערך השיא הראשון. כדי למדוד את ההשפעה של התרופה על הגבוהה K + השיא, לחלק את המשרעת של K + השיא השני על ידי זה של הראשונה. ניתוח צריכה להתבצע על ערכים אלה בביחס לבקרות ההתאמה שלהם נגזרות מגבוה K לזווג + פסגות נמדדו בהעדר התרופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות ב5 מרווחי שניות. כדי להימנע מצילום הלבנה, לשמור על עירור הלייזר נמוך ככל האפשר. לספק עירור על ידי קו 488 ננומטר של לייזר הארגון, תוך הצינור מכפיל אוסף את פליטת הניאון דרך מסנן LP 505 ננומטר. </li></ol>

<ol><li>Guenther, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+calcium+currents+in+retinal+ganglion+cells+from+postnatal+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Separation of calcium currents in retinal ganglion cells from postnatal rat.</a> Brain Res. 633, 223-235 (1994).</li>
<li>Farrell, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+voltage-gated+ion+channels+in+rat+retinal+ganglion+cells+mediated+by+somatostatin+receptor+subtype+4%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Modulation of voltage-gated ion channels in rat retinal ganglion cells mediated by somatostatin receptor subtype 4.</a> J Neurophysiol. 104, 1347-1354 (2010).</li>
<li>Caterall, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+regulation+of+voltage-gated+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 521-555 (2000).</li>
<li>Berridge, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium--a+life+and+death+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium--a life and death signal.</a> Nature. 395, 645-648 (1998).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+microdomains+Organization+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium microdomains Organization and function.</a> Cell Calcium. 40, 405-412 (2006).</li>
<li>Dolphin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+channel+diversity+multiple+roles+of+calcium+channel+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Calcium channel diversity multiple roles of calcium channel subunits.</a> Curr Opin Neurobiol. 19, 237-244 (2009).</li>
<li>Rottman, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribonuclease+protection+assay+a+powerful+tool+for+the+veterinary+pathologist%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">The ribonuclease protection assay a powerful tool for the veterinary pathologist.</a> Vet Pathol. 39, 2-9 (2002).</li>
<li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> J Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).</li>
<li>Segev, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+spikes+from+a+large+fraction+of+the+ganglion+cells+in+a+retinal+patch%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Recording spikes from a large fraction of the ganglion cells in a retinal patch.</a> Nat Neurosci. 7, 1154-1161 (2004).</li>
<li>Jeon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The major cell populations of the mouse retina.</a> J Neurosci. 18, 8936-8946 (1998).</li>
<li>Blankenship, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+and+extrasynaptic+factors+governing+glutamatergic+retinal+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic and extrasynaptic factors governing glutamatergic retinal waves.</a> Neuron. 62, 230-241 (2009).</li>
<li>Daniels, B. A., Baldridge, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((d-Serine+enhancement+of+NMDA+receptor-mediated+calcium+increases+in+rat+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">d-Serine enhancement of NMDA receptor-mediated calcium increases in rat retinal ganglion cells.</a> J Neurochem. 112, 1180-1189 (2010).</li>
<li>Weitz, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+response+of+the+retina+to+electrical+stimulation+with+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators.</a> J Neurophysiol. 109, 1979-1988 (2013).</li>
<li>Pérez de Sevilla Müller, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+voltage-gated+calcium+channel+%CE%B1%282%29%CE%B4%284%29+subunits+in+the+mouse+and+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Expression of voltage-gated calcium channel α(2)δ(4) subunits in the mouse and rat retina.</a> J Comp Neurol. 521 (2), 2486-2501 (2013).</li>
<li>Hirano, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAP25+expression+in+mammalian+retinal+horizontal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">SNAP25 expression in mammalian retinal horizontal cells.</a> J Comp Neurol. 519, 972-988 (2011).</li>
<li>Berridge, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+dynamics%2C+homeostasis+and+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling dynamics, homeostasis and remodeling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 517-529 (2003).</li>
<li>Dailey, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+live+cells+and+tissue+slices+in+the+imaging+setup%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+ProtocI%22%5BJournal%5D)">Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup.</a> Cold Spring Harb ProtocI. , 373-379 (2011).</li>
<li>Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+intracellular+calcium+ion+dynamics+in+hair+cell+populations+with+Fluo-4%5BTitle%5D)+AND+%22AM.+PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Monitoring intracellular calcium ion dynamics in hair cell populations with Fluo-4.</a> AM. PLoS One. 7, e51874(2012).</li>
<li>Kwong, J. M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+binding+protein+with+multiple+splicing+A+new+marker+for+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">RNA binding protein with multiple splicing A new marker for retinal ganglion cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1052-1058 (2010).</li>
<li>Pérez deSevilla Müller, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Displaced+amacrine+cells+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Displaced amacrine cells of the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 505, 177-189 (2007).</li>
<li>Pérez de Sevilla Müller, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracer+coupling+of+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells+to+amacrine+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Tracer coupling of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells to amacrine cells in the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 518, 4813-4824 (2010).</li>
<li>Raymond, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyan+fluorescent+protein+expression+in+ganglion+and+amacrine+cells+in+a+thy1-CFP+transgenic+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Cyan fluorescent protein expression in ganglion and amacrine cells in a thy1-CFP transgenic mouse retina.</a> Mol Vis. 14, 1559-1574 (2008).</li>
<li>Raymond, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Thy1-CFP+DBA%2F2J+mouse+line+with+cyan+fluorescent+protein+expression+in+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Thy1-CFP DBA/2J mouse line with cyan fluorescent protein expression in retinal ganglion cells.</a> Vis Neurosci. 26, 453-465 (2009).</li>
<li>Mayer, M. L., Westbrook, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeation+and+block+of+N-methyl-D-aspartic+acid+receptor+channels+by+divalent+cations+in+mouse+cultured+central+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Permeation and block of N-methyl-D-aspartic acid receptor channels by divalent cations in mouse cultured central neurones.</a> J Physiol. 394, 501-527 (1987).</li>
<li>Ascher, P., Nowak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+divalent+cations+in+the+N-methyl-D-aspartate+responses+of+mouse+central+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The role of divalent cations in the N-methyl-D-aspartate responses of mouse central neurons in culture.</a> J Physiol. 399, 247-266 (1988).</li>
<li>Aizenman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+mediated+by+excitatory+amino+acid+receptors+in+solitary+retinal+ganglion+cells+from+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Responses mediated by excitatory amino acid receptors in solitary retinal ganglion cells from rat.</a> J Physiol. 396, 75-91 (1988).</li>
<li>Taschenberger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+current+kinetics+in+a+solely+AMPA-receptor-operated+glutamatergic+synapse+formed+by+rat+retinal+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic current kinetics in a solely AMPA-receptor-operated glutamatergic synapse formed by rat retinal ganglion neurons.</a> J Neurophysiol. 74, 1123-1136 (1995).</li>
<li>Chen, S., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+released+glutamate+activates+extrasynaptic+NMDA+receptors+on+cells+in+the+ganglion+cell+layer+of+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina.</a> J Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).</li>
<li>Jakobs, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+mRNA+for+glutamate+receptor+subunits+distinguishes+the+major+classes+of+retinal+neurons%2C+but+is+less+specific+for+individual+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Expression of mRNA for glutamate receptor subunits distinguishes the major classes of retinal neurons, but is less specific for individual cell types.</a> Mol Vis. 13, 933-948 (2007).</li>
<li>Margolis, D. J., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+mechanisms+generate+maintained+activity+in+ON+and+OFF+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+NeurosciI%22%5BJournal%5D)">Different mechanisms generate maintained activity in ON and OFF retinal ganglion cells.</a> J NeurosciI. 27, 5994-6005 (2007).</li>
<li>Margolis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+calcium+signaling+in+ON+and+OFF+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic calcium signaling in ON and OFF mouse retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 30, 7127-7138 (2010).</li>
<li>Baldridge, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recordings+of+the+effects+of+cholinergic+ligands+on+neurons+in+the+ganglion+cell+layer+of+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optical recordings of the effects of cholinergic ligands on neurons in the ganglion cell layer of mammalian retina.</a> J Neurosci. 16, 5060-5072 (1996).</li>
<li>Hartwick, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assessment+of+glutamate+clearance+mechanisms+in+a+chronic+rat+glaucoma+model+using+retinal+ganglion+cell+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Functional assessment of glutamate clearance mechanisms in a chronic rat glaucoma model using retinal ganglion cell calcium imaging.</a> J Neurochem. 94, 794-807 (2005).</li>
<li>Badea, T. C., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+neuronal+morphologies+in+the+mouse+retina+visualized+by+using+a+genetically+directed+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of neuronal morphologies in the mouse retina visualized by using a genetically directed reporter.</a> J Comp Neurol. 480, 331-351 (2004).</li>
<li>Huberman, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+and+activity-mediated+refinement+of+axonal+projections+from+a+mosaic+of+genetically+identified+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Architecture and activity-mediated refinement of axonal projections from a mosaic of genetically identified retinal ganglion cells.</a> Neuron. 59, 425-438 (2008).</li>
<li>Kim, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+a+retinal+cell+type+that+responds+to+upward+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion.</a> Nature. 452, 478-482 (2008).</li>
<li>Munch, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approach+sensitivity+in+the+retina+processed+by+a+multifunctional+neural+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Approach sensitivity in the retina processed by a multifunctional neural circuit.</a> Nat Neurosci. 12, 1308-1316 (2009).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
</ol>

אי לנו גילויים.

במאמר זה, שתארנו שתי טכניקות שונות: 1) אימונוהיסטוכימיה להראות Fluo-4 לוקליזציה לתאי הגנגליון ברשתית wholemounts, ו2) סידן הדמיה כדי לנתח דינמיקת סידן בתאי הגנגליון ברשתית והאקסונים שלהם. אימונוהיסטוכימיה באמצעות wholemounts נעשתה שימוש כדי לחשוף את הלוקליזציה של חלבונים במכרסמי רשתית 20-23. עם זאת, יש כמה מגבלות. איכות הצביעה מסתמכת במידה רבה על יכולתו של הנוגדן לאנטיגן להכיר בהתאמתה ויכולתה לחדור לרק...

תאי הגנגליון ברשתית (RGCs) להביע VGCC L-, N-, P / Q- וT-הסוג, כפי שנקבע באמצעות מצור תרופתי של רכיבים של כל התא אלה Ca לתעל 1,2 הנוכחי. VGCC הם חלבוני Multimeric הטרנסממברני כי הם מעורבים בשחרור משדר, שעתוק הגנים, תקנת התא ו3,4,5 פלסטיות הסינפטית. VGCCs פונקציונלי מורכב של לפחות שלוש כיתות שונות של יחידות משנה: גדולות, הטרנסממברני α נקבובית 1 להרכיב יחידות משנה, אשר קובעת את מאפייני biophysical והתרופתיים של הערוץ, α בעיקר תאי עזר 2 δ יחידות משנה ותת יחידות β תאיות. שני מתחמי heteromeric הטופס האחרונים עם תת יחידות 1 α שונים ולשנות את קינטיקה gating וסחר של הערוצים לקרום הפלזמה 6. בעשורים האחרונים, בטכניקות רבות כבר מועסקות ללמוד expre חלבוןssion, כגון אימונוהיסטוכימיה, assay immunosorbent צמוד אנזים, ניתוח מערבי וcytometry זרימה. טכניקות אלו דורשות השימוש בנוגדנים ספציפיים לזיהוי של חלבון מסוים של ריבית ומספקות כלים רבי עוצמה ללוקליזציה וההפצה של חלבונים ספציפיים ברקמות שונות. טכניקות המשמשות לאיתור וללכמת רמות ביטוי mRNA של חלבון מסוים, כגון ניתוח כתם צפוני, RT-PCR, בזמן אמת RT-PCR, הכלאה באתר, microarrays cDNA וassay הגנת ribonuclease לספק גישה חלופית כאשר נוגדנים אינם בקלות רמות ביטוי זמינות או אם של חלבון מסוים הן נמוכות 7. עם זאת, מגבלה אחת לשימוש בטכניקות מולקולריות כזה הוא זיהוי הנדרש של רצף הגן. בתרגום חלבונים ברשתית, אימונוהיסטוכימיה יכולה להתבצע על רשתית wholemount. בשל הנגישות של RGCs, wholemountהכנה מספקת פלטפורמה מצוינת ללמוד הלוקליזציה של חלבונים ספציפיים לsomata RGC והאקסונים שלהם. בנוסף ללוקליזציה שלהם, ניתן להדגים כמה תכונות פונקציונליות של VGCCs בRGCs באמצעות השימוש בטכניקות הדמיה סידן. אנו מתארים פרוטוקול הדמיה סידן לתייג RGCs סלקטיבי עם צבע מחוון סידן למדידת דינמיקת סידן תוך תאי. התרומה של VGCCs שונה לאות סידן בתאים סלולריים שונים יכולה להיות מבודדת עם השימוש בחוסמי תעלות תת ספציפי Ca. אולי אחד ההיבטים מועילים ביותר של טכניקת ההדמיה סידן שתוארה כאן היא היכולת להקליט בו זמנית ובאופן עצמאי מRGCs מרובה והאקסונים שלהם. למרות שרבי טכניקות פיסיולוגיות, כגון הקלטת מהדק תא כל תיקון, לספק הקלטות גבוהות זמניות רזולוציה של זרמי קרום, סומטי או מקור axonal של thesזרמי דואר נרשמו לא יכולים להיות מופלים ולהקלטות יכולות להתבצע רק מתא עצב בודד בכל פעם. מערכי Multielectrode (MEAs) מסוגלים בו זמנית הקלטת קוצים מהתאים רבים, אבל אינו יכולים לזהות ולא להפלות את ההפעלה של, למשל, תת שונה של תעלות סידן. MEAs מעדיף להקליט מהתאים הנמצאים בסמיכות לאלקטרודה נתנה 8 ושיא מהתאים שיוצרים קוצים גדולים 9. שיטות הדמיה אופטיות לספק אסטרטגיה חלופית כדי לאפשר הקלטות בו זמנית ובלתי תלויות של אוכלוסיות שלמות של תאים שיכולים להיות משולבת עם המידע שהתקבל מmicroelectrode התא ותא והקלטת מהדק תיקון והקלטת MEA. למרות שטכניקות ההדמיה סידן המתוארות כאן הועסקו כדי ללמוד את דינמיקת סידן של RGCs, מהדק התיקון וMEAs יכולים גם לשמש במקביל על מנת להבהיר עוד יותר את הזרמים היוניים ומאפייני spiking של RGCs. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; מאחר ותאי amacrine עקורים מרכיבים כ 60% מהאוכלוסייה העצבית בשכבת תא גנגליון בעכבר רשתית 10, המטרה שלנו הייתה להשתמש בטכניקת העמסה שאופן סלקטיבי תוויות RGCs עם צבע מחוון סידן סינטטי ב הכנת wholemount. למרות צבעי מחוון סידן סינטטיים לספק פלטפורמה מצוינת ללימוד דינמיקת סידן תוך תאי, השימוש הנרחב שלה התעכב בשל חוסר היכולת לטעון ביעילות אוכלוסיות ספציפיות של תאי עצב בתוך רשת נתון. רבים טכניקות כגון טעינה בתפזורת 11 ו8,12 electroporation בוצעו לטעון אוכלוסיות שלמות של תאים, לעומת זאת, טכניקות אלה אינן מפלות בין סוגי תאים מסוימים. מבחינה גנטית מקודד מדדי סידן לספק את היכולת לתייג באופן סלקטיבי אוכלוסיות ספציפיות של תאים, לעומת זאת, שיטות אלו דורשות הדור של בעלי חיים מהונדסים 13. הטכניקה שלנו מתארת ​​methoד לתייג RGCs סלקטיבי בהכנת wholemount באמצעות הזרקת גדם עצב ראייה של צבע מחוון סידן. יחדיו, הטכניקות המבניות ופיזיולוגיות שתוארו במאמר זה מספקות פלטפורמה לחקור את הלוקליזציה ותרומה של VGCCs לאות סידן בRGCs והאקסונים שלהם.

<table><tbody><tr><td>מספריים ישרים</td><td>WPI</td><td>14124-G</td><td>כלי ניתוח</td></tr><tr><td>מלקחיים ישרים</td><td>WPI</td><td>501985</td><td>כלי ניתוח</td></tr><tr><td>מספריים מעוקלים קשתית</td><td>WPI</td><td></td><td>504487 כלי ניתוח</td></tr><tr><td>נייר סינון תאית</td><td>Millipore</td><td>HABP04700</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate A</td><td>Invitrogen</td><td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp; productID=A1247501">A12475-01</a></td><td>Media</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>וקטור</td><td>H-1000</td><td><a href="https://www.google.com/url?sa=t&amp; rct=j& q=& esrc=s& מקור=web& cd=1& cad=rja& sqi=2& ved=0CC0QFjAA& url=http%3A%2F%2Fwww.vectorlabs.com%2Fcatalog.aspx%3FcatID%3D279& ei=VAHbUb_fBceeiQLK2IHIDw& usg=AFQjCNHijFTTB8p19FMPQ5hg_qTawXU9mA& sig2=FJCfB9fzKR_TmjxoGvhLcg& bvm=bv.48705608,d.cGE">מדיית הרכבה לפלואורסצנטיות</a></td></tr><tr><td>Fluo-4 pentapotassium</td><td>Invitrogen</td><td>F-14200</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott Laboratories</td><td>05260-05</td><td></td></tr><tr><td>שקופית מיקרוסקופ</td> הרדמה <td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-178-277</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 5 מיקרוסקופ פסקל</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axioplan 40X (NA 0.8) אובייקט עדשה</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 עז נגד ארנב IgG (H+L)</td><td>נוגדן מולקולרי בדיקות</td><td>A-11034</td><td>נוגדן משני</td></tr><tr><td>RBPMS</td><td>ProSci, Poway, CA</td><td></td><td>נוגדן רב-שבטי ארנב&nbsp; נוצר כנגד מסוף ה-N של RBPMS&nbsp; פוליפפטיד (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, על ידי ספק מסחרי (ProSci, Poway, CA).</td></tr></tbody></table>

שיטות הדמיה אימונוהיסטוכימיים וסידן בwholemount עכברוש הרשתית

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

במאמר זה אנו מתארים את הכלים, חומרים כימיים, וצעדים המעשיים הדרושים ל: 1) הכנה מוצלחת של רשתית wholemount אימונוהיסטוכימיה ו, 2) הדמיה סידן לחקר תעלות סידן מתח מגודרת (VGCC) בתיווך איתות סידן ברשתית תאי הגנגליון. שיטת ההדמיה סידן אנו מתארים בעיות עוקפים לגבי הטעינה הלא ספציפית של תאי amacrine עקורים בשכבת תא גנגליון.

Immunolabeling עם נוגדנים ספציפיים מספק פלטפורמה ללמוד הלוקליזציה של חלבונים מסוימים של עניין ברשתית וטכניקת ההדמיה סידן מאפשר המחקר של התרומה של VGCCs לדינמיקה סידן בתאי הגנגליון ברשתית והאקסונים שלהם. על ידי שימוש בנוגדנים נגד RBPMS חלבון תא גנגליון (חלבון RNA מחייב עם שחבור מרובה) שבאופן בררני תוויות RGCs 19, הצלחנו להראות כי תיוג Fluo-4 מוגבל לתאי הגנגליון (איור 1). גדם הזרקה אינה ...

פרוטוקולי אימונוהיסטוכימיה משמשים ללמוד את הלוקליזציה של חלבון מסוים ברשתית. טכניקות הדמיה סידן מועסקות ללמוד דינמיקת סידן בתאי הגנגליון ברשתית והאקסונים שלהם.

שיטות הדמיה אימונוהיסטוכימיים וסידן בWholemount עכברוש הרשתית

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לסמן באופן סלקטיבי תאי גנגליון ברשתית בהכנה של mount שלם (whole mount), באמצעות הזרקה של צבע אינדיקטור לסידן לבסיס עצב הראייה. הדבר מושג תחילה על ידי הזרקה של צבע אינדיקטור לסידן בעל זיקה גבוהה מאוד, כגון flow four, לבסיס עצב הראייה. לאחר מכן, הרשתית מבודלת ממעטפת העין ומחולקת לרבעים כדי להניח אותם על תגית זכוכית. בתא הקלטה שהוגדר כדי לדמות תנאים פיזיולוגיים, נבחנות תרומותיהם של ערוצי סידן תלויי מתח לאות הסידן.ניתן למדוד בתאי גנגליונים של הרשתית בתאים דפולריזים באמצעות חוסמי תעלות. בסופו של דבר, התוצאות יכולות לספק מדידות חצי-כמותיות של תרומת תעלות סידן תלויות-מתח לאות, כגון אות סידן ש Examples על ידי אשלגן בריכוז גבוה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון אלקטרופורציה וטעינה כוללת (bulk loading), הוא היכולת לסמן באופן סלקטיבי תאי גנגליונים של הרשתית ואת אקסוניהם בהכנה של דגימה שלמה (whole mount), עיניים של חולדה מנותחות ומטופלות בתוכסית של medium hibernate או תמיסה דומה.כעת, אם בכוונתכם לבצע ניסויי דימוי סידן, בצעו מילוי חוזר (backfill) של תאי הגנגליון ברשתית באמצעות flow four. מזריקו 0.5 µL של 40 mM flow four penta potassium salt, המומס במים, לתוך השארית של העצב האופטי, כ-1 mm מאחורי גלגל העין. העבירו את גלגל העין לתמיסת mammalian ringers.העבירו בועות של 95% oxygen, 5% carbon dioxide, או השאירו למשך שעה בטמפרטורת החדר. שמרו את הדגימה בחושך. בצעו דיסקציה של העיניים תחת מיקרוסקופ בעוצמת תאורה מבוקרת.בעזרת להב תער, בצעו חתך קטן בעדינות בחלקו הקדמי של גלגל העין והסירו את הקרנית. לאחר מכן, הסירו את העדשה מהשכבה הפנימית של הרשתית באמצעות פינצטה. החזיקו את הלובנה (sclera) בחוזקה.בעת הסרת הוויטריאוס עם הפינצטה השנייה, קלפו בעדינות את בסיס הוויטריאוס לכיוון מרכז הרשתית. הדגימה המתקבלת, הנקראת "I cup", ניתנת לעיבוד עבור הכנה של whole mount אימונוהיסטוכימית, הכנה לדימיוג סידן, או הכנה לחתכים רוחביים של הרשתית לצורך הכנת whole mount אימונוהיסטוכימי. ראשית, בצעו ארבעה חתכים ברשתית כדי שהיא תישכב בצורה שטוחה.הניחו את הרשתית על זכוכית כיסוי כאשר שכבת תאי הגנגליונים פונה כלפי מטה. שנית, הוסיפו טיפה של תמיסה לרשתית וכסו אותה בנייר סינון תאית במידת הצורך, ושטחו את הרשתית בעזרת מברשת או פינצטה. שלישית, כאשר הרשתית שטוחה לחלוטין ומופרדת מנייר הסינון, החזירו אותה אל התמיסה.כדי לעבד את הדגימה תחילה, העבירו אותה ל-4% paraform aldehyde למשך 10 עד 15 דקות. לאחר מכן, שטפו את הרשתות של העין שלוש פעמים בבופר פוספט 0.1 מולרי ב-pH 7.4 למשך 30 דקות לכל שטיפה, לסך הכל 90 דקות. לאחר מכן, דגרו את הרשתות ב-500 microliters של תמיסת חסימה למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.תמיסה זו מורכבת מ-5% normal goat serum או donkey serum בבופר פוספאט עם 0.3% tritton ו-0.1% sodium azide. במהלך חמישה עד שבעת הימים הבאים, דגרו את הרשתיות בתמיסת הנוגדן הראשוני בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. יש לקבוע את הרכב התמיסה באופן אמפירי. שטפו את תמיסת הנוגדן הראשוני באותו אופן שבו שוטף את המקבע.לאחר מכן, הדגרינו את הרשתית בנוכחות נוגדן שני בריכוז של 1:1000 למשך לילה במעמקים של 4°C. הסירי את הנוגדן השני באמצעות שלושה שטיפות נוספות בבופר פוספאט. לאחר מכן, בצעי הרכבה של הרשתית לצורך ויזואליזציה ואיטום באמצעות לק ציפורניים.יש לשמור שקופיות אלו בחושך בטמפרטורה של 4 °C. התחילו בהכנת דגימת mount שלמה לדימות סידן מה-I cup בתוך תמיסת רינגר. ראשית, חלקו את רקמת הרשתית לרבעים.הניחו רבע אחד בצורה שטוחה על תא ההקלטה כאשר שכבת הגנגליונים פונה כלפי מעלה, ובכך שכבת הפוטורצפטורים פונה כלפי מטה. ייבשו בזהירות את האזור מסביב בעזרת נייר Kim wipe והניחו בעדינות את הנבל (harp) המשומן על הרקמה. כעת טענו את הרטינה המוכנה על המתקן והשלימו את הגדרת מערכת הסופרפוזיה (superfusion) בעלת שמונת הערוצים המופעלת על ידי כוח הכבידה.אם הרשתית המקובעת זזה לאחר הצבת ה-harp, הסירו ונקו את ה-harp בזהירות. ייבשו את האזור שסביב הרשתית והחזירו את ה-harp למקומו. מלאו את תא ההקלטה בתמיסת ringer עבור יונקים ושמרו על בועות תמיסות רציפות באמצעות 95% oxygen ו-5% carbon dioxide.ראשית, כביקורת ללא תרופות, בצע שני פולסים זוגיים של אשלגן בריכוז גבוה, מ-3 millimolar ל-60 millimolar למשך 33 שניות. עם הדפולריזציה, ה-RGC אמור להפעיל את תעלות הסידן תלוי-המתח אם הדגימה תקינה. כעת ניתן להמשיך בניסויים.ניפשדיפין (Nifedipine), חוסם תעלות סידן תלויות-מתח מסוג L, משמש בדרך כלל להערכת התרומה של תעלות סידן תלויות-מתח מסוג L לאות הסידן המעורר על ידי דפולריזציה. ניתן להשתמש בחוסם תעלות סידן לא ספציפי כדי לחסום באופן לא סלקטיבי תעלות סידן תלויות-מתח. סרוק את הדגימה בכל חמישה שניות כדי להדגים ולהשיג תמונות של תאי RGC פלואורסצנטיים.השתמשו בהספק לייזר נמוך ככל האפשר. את העירור יש להגדיר ל-488 nanometers ואת הפליטה יש לאסוף באמצעות מסנן LP של 505 nanometer. באמצעות הפרוטוקולים המתוארים, בוצע סימון אימונולוגי נגד חלבון תאי העצביים R-B-P-M-S, שהוא חלבון קושר RNA עם זרימת שחבור מרובה. ארבע.הצביעה אכן הייתה מוגבלת לתאי גנגליון, בהתאם למפרט הנוגדן. לאחר מכן, נבדקה תרומתם של תעלות סידן תלויות מתח לאות הסידן ב-R GCs באמצעות ערכי עוצמת הפלואורסצנציה שנרכשו מה-rgc. ברמות הבסיס, ניתן לראות את ה-RGC ואת האקסונים של ה-RGC מסומנים ב-flow four.על מנת לקבל ערכים של עוצמה פלואורסצנטית, הוגדרו ROI (אזורי עניין) על תאי הגנגליון, גופי התא (somata) או האקסונים. לאחר יישום ריכוז גבוה של אשלגן להכנה שלמה (whole mount), עלה האות הפלואורסצנטי של תאי ה-RGC. לאחר מכן, נצפתה ירידה בערכי עוצמת הפלואורסצנציה בנוכחות קובלט במהלך פולס שני של אשלגן בריכוז גבוה.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להעמיס באופן סלקטיבי תאי גנגליון של הרשתית עם צבע אינדיקטור סינתטי לסידן בהכנה של mount שלם.

immunohistochemical-calcium-imaging-methods-wholemount-rat

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הרשתית העכברית הילוד מספקת מודל מאופיין היטב פיסיולוגי של אנגיוגנזה, המאפשר חקירה של התפקידים של גנים או תרופות שונים המווסתים אנגיוגנזה...

מכתים Immunofluorescent הר שלם של רשתית עכבר ילודים לחקר אנגיוגנזה<em&gt; בvivo</em

הפרוטוקול המתואר כאן מיועד להערכה מבנית של תכשיר רשתית שלם. זה כולל תיאורים של דיסקציה של רקמות, הרכבה על תוספת ממברנה פוליטטרפלואורואתילן הידרופילית (PTFE), העמסת בולוס עם סמנים פלואורסצנטיים, והשוואה של קיבוע עם קרבודימיד ופרפורמלדהיד לניתוח אימונוהיסטוכימי של רכיבים תאיים וסינפטיים.

פרוטוקול אופטימלי עבור רשתית Wholemount הכנה להדמיה ואימונוהיסטוכימיה

אנו מתארים פרוטוקול לעקוב אחר דינמיקת 2 + Ca במסופים האקסון של קולטני האור חרוט באמצעות הכנת פרוסה לשעבר vivo של רשתית העכבר. פרוטוקול זה מאפשר מחקרים מקיפים של איתות קונוס Ca 2 + במערכת מודל של יונקים חשוב, העכבר.

ההדמיה Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dynamics בסופי קון קולטי האור אקסון של רשתית העכבר

נדגים שלוש טכניקות להכנת רקמות שונות להמחשת immunohistochemical של pericytes microvascular ברשתית עכברוש, קרי, הקפאה-סעיפים, שלם-טעינות בידוד היפוטוניק של רשת כלי הדם.

הקפאה-מקטעי רשתית, שלם-טעינות, וההכנות להערכת מבודד היפוטוניק להמחשת Immunohistochemical של Microvascular Pericytes

הדמיית in vivo היא כלי רב עוצמה לחקר הביולוגיה בבריאות ובמחלות. פרוטוקול זה מתאר הדמיה טרנס-אימונית של רשתית העכבר באמצעות מיקרוסקופ סטנדרטי של שני פוטונים. הוא גם מדגים שיטות שונות של הדמיה חיה כדי לתייג פלואורסצנטיות קבוצות תאים מרובות של הרשתית.

הדמיה טרנס-אימונית של שני פוטונים In vivo של רשתית העכבר

אנו מציגים פרוטוקול לחשוף את גזע המוח של עכבר בוגר מהצד הגחוני. באמצעות עדשת מדד שבירה הדרגתית עם מיקרוסקופ מיניאטורי, ניתן להשתמש בהדמיית סידן כדי לבחון את הפעילות של סומטה עצבית זית נחותה ב- vivo.

אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות

הפרוטוקול הנוכחי מתאר יצירת חלון גולגולתי גדול (6 x 3 מ"מ2) באמצעות עטיפת מזון, סיליקון שקוף וזכוכית כיסוי. חלון גולגולתי זה מאפשר ניסויים בהדמיית סידן בשדה רחב ובשני פוטונים באותו עכבר.

אין ויוו הדמיית סידן בשדה רחב ושני פוטונים מעכבר באמצעות חלון גולגולתי גדול

פרוטוקול זה מפרט את ההליך לדימות תגובות סידן בקוליקולוס העליון (SC) של עכברים ערים, כולל הדמיה של פעילות נוירון יחיד במיקרוסקופ של שני פוטונים תוך השארת קליפת המוח שלמה בעכברי בר, והדמיית ה-SC כולו במיקרוסקופ רחב שדה בעכברים מוטנטיים בעלי קליפת מוח חלקית.

הדמיית סידן בעכבר קוליקולוס מעולה

תותבות רשתית יש את היכולת ליצור תפיסות חזותיות. כדי לקדם את הפיתוח של תותבות חדשות, יש צורך בשיטות ex vivo כדי לבדוק מכשירים לפני ההשתלה. מאמר זה מספק פרוטוקול מקיף לחקר פעילות הסידן בשכבת תאי גנגליון הרשתית כאשר הוא נתון לגירוי חשמלי.

הדמיית סידן ברשתית שטוחה עם גירוי חשמלי

מדדי סידן מקודדים גנטית (GECI) מאפשרים ניתוח חזק ברמת האוכלוסייה של איתות נוירונים חושי. כאן, פיתחנו גישה חדשנית המאפשרת הדמיית GECI in vivo של פעילות גרעיני גרעינים של חולדות.

In-Vivo הדמיית סידן של נוירונים חושיים בגנגליון טריגמינלי של חולדה

פרוטוקול זה מתאר את ההליך לבידוד רשתית העכבר בהרכבה שלמה וביצוע immunostaining כדי לתייג את כל תאי גנגליון הרשתית (RGCs). התהליך מלווה בהדמיה וספירה אוטומטית של RGCs באמצעות תוכנה מבוססת בינה מלאכותית, המספקת שיטה פשוטה, מהירה ומדויקת לכימות RGCs בכל רשתית העכבר.

Immunostaining בהר שלם וספירה אוטומטית של תאי גנגליון רשתית עכבר

למד שיטת סימון סלקטיבי של תאי גנגליון רשתית בעכברוש באמצעות צבע סידן דרך שארית עצב הראייה. טכניקה זו מאפשרת מדידת דינמיקת סידן בתאים ובאקסונים שלהם.

שיטות הדמיה אימונוהיסטוכימיים וסידן בWholemount עכברוש הרשתית

גלה סרטונים נוספים