הקרנה מהירה של HIV ההפוך טרנסקריפטאז וintegrase המעכבים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לסנן תרכובות מעניינות כדי לקבוע את הציטוטוקסיות התאית שלהן ואת יכולתן לעכב HIV מסוג בר או עמיד לתרופות אחת בבדיקת זיהום סבב יחיד. זה מושג על ידי חשיפת התאים תחילה לתרכובות לספיגה ולאחר מכן דגירה של התאים המטופלים בלוציפראז המבטא סוג בר או HIV עמיד לתרופות. לאחר מכן ניתן למדוד את פעילות הלוציפראז של הנגיף.

בסופו של דבר, ניתן להשתמש באות קריאת הלוציפראז כדי לכמת את העיכוב של שכפול וקטור ויראלי אחד של HIV V על ידי התרכובות. לטכניקה זו יש השלכות טיפוליות מכיוון שניתן להשתמש בה כדי לסנן תרכובות חדשות המציגות יעילות טובה יותר נגד HIV עמיד לתרופות. תרכובות כאלה יכולות לשמש בטיפולים אנטי-רטרו-ויראלים בחולי HIV 1 ביום שלפני הטרנספקציה צלחת 2 93 תאים על צלחות של 100 מילימטר בצפיפות של 1,500,000 תאים.

למחרת העבירו את התאים עם 16 מיקרוגרם של HIV מסוג בר או מוטנטי וארבעה מיקרוגרם של VSV באמצעות אפליקציית שיטת סידן פוספט. שש שעות לאחר מכן, שטפו את 2,93 התאים פעמיים עם PBS ולאחר מכן דגרו אותם עם חומר טרי למשך 48 שעות. יומיים לאחר מכן, קצרו את הווירוס המכיל סופרנטנטים S מהצלחות בקוטר 100 מילימטר והבהירו את הסופרנטנטים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה למשך 10 דקות ב-1,620 גרם בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, סנן את הסופרנטנטים דרך מסנן מזרק בגודל נקבוביות 45 מיקרומולרי וטפל במתלים הוויראליים עם DNA טורבו. לאחר 30 דקות בטמפרטורת החדר, יש לדלל את הנגיף במדיה טרייה ולאחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי לבצע את סינון התרכובות בבדיקת זיהום ביום שלפני הניסוי, זרעו 4,000 מהתאים המעניינים בכל באר של 96.

צלחת היטב ב-100 מיקרוליטר מדיה ודגירה אותם ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני. 24 שעות לאחר מכן, יש לדלל באופן סדרתי את התרכובת מתמיסת המלאי למדיה טרייה. הריכוזים הסופיים שנבחרו יהיו תלויים בטווח ריכוזים שנקבע אמפירית כמתואר בטבלה.

לאחר מכן, הוסף את הדילול הסדרתי של התרכובות לבארות בשלוש עותקים. בעשירית מהנפח של הריכוז הסופי, דגרו את הדילול המתאים של התרכובות עם התאים למשך שלוש שעות לפחות. לאחר הדגירה, השתמש בפיפטה רב ערוצית כדי להוסיף 100 מיקרוליטר של נגיף מדולל לכל אחת מהבארות.

קבל את בארות הבקרה השליליות. לאחר מכן דגרו את הצלחות למשך 48 שעות נוספות. לאחר הדגירה, השתמש בפיפטה מזכוכית המצוידת בקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר כדי לשאוב את המדיה מהבארות החל מהחלק העליון של המדיה ולאט לאט כלפי מטה לכיוון הפינה התחתונה של הבאר.

הוסף מיד 100 מיקרוליטר של PBS בתוספת 0.5 מילי-מולרי מגנזיום כלוריד לכל באר ואז כדי למדוד את פעילות הלוציפראז, הוסף 10 מיקרוליטר של מאגר המצע מבדיקת הגן המדווח על הזוהר לכל בקבוקון של מגיב ליופיליזציה שסופק. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של המגיב המחודש לכל באר ודגר את הצלחת למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לאות להתפתח. לבסוף, קרא את צלחת 96 הבאר באמצעות לומינומטר מיקרופלייט.

ערכי הלוציפראז מהליך סינון תרכובות מוצלח מוצגים בטבלה. שימו לב שתרכובות פוטנציאליות חזקות מציגות פעילות לוציפראז הולכת וגוברת כאשר הבקרה מציגה את האות הגבוה ביותר בשתל קליידו מייצג זה. ריכוז התרכובת לעומת אחוז העיכוב של פעילות לוציפר תוכנן כדי לקבוע אם התרכובת יעילה בעיכוב השכפול של הסוג הפראי או HIV עמיד לתרופות.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לפזר במדויק כמות אחידה של תאים ווירוסים לכל בארות הצלחות, ולהקפיד להכניס את הריכוז הנכון של תרכובות לכל באר.