Name: הקרנה מהירה של HIV ההפוך טרנסקריפטאז וintegrase המעכבים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-09T21:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: חקור שיטת הקרנה מהירה של תרכובות נגד HIV-1 בעזרת מבחני לוציפראז. גלה תרכובות אפקטיביות נגד זנים עמידים לתרופות ופתח אפשרויות טיפול חדשות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי תכנית המחקר העירונית של NCI.

1. הכנת מניות מאסטר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך מניות ראשיים של התרכובות להיבדק בDMSO. הכן את המניות בריכוז סטנדרטי של 20 מ&quot;מ. הערה: כל ריכוז מעל 10 מ&quot;מ יכול לשמש. תרכובות שיכולים לשמש כביקורת חיובית כדי לאמת assay זה כוללים RAL, EVG, וDTG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודאו התרכובות מומסים DMSO ידי vortexing מספר הפעמים פתרונות ל15 שניות ודוגרים על RT במשך שעה 1. אחסן 20 פתרונות מניות מ&quot;מ בחושך ב-20 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li></ol> 2. הכנת צלחות 96 היטב להקרנת מתחם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הקו הסלולרי להיבדק (למשל HOS או TZM-BL), וזרעים של תאים אלה 100 μl בצפיפות של 4 x 10 4 תאים / מיליליטר (4,000 תאים / טוב) בתקשורת (למשל בינוני שונה Dulbecco הנשר של או DMEM בתוספת 5% (v / v) בסרום שור עוברי, 5% נסיוב עגל בן יומו, ופניצילין (50 יחידות / מיליליטר) בתוספת streptomycin). </li></ol> 3. דור של מניות וירוס לייצר VSV-G-pseudotyped-HIV על ידי transfecting 293 תאים (כפי שמוצג באיור 1, שלב 1) 32-34. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום לפני transfection, צלחת 293 תאים ב100 מנות בקוטר מ&quot;מ בצפיפות של 1.5 x 10 6 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של transfection, transfect 293 תאים עם 16 מיקרוגרם של סוג בר או איידס מוטציה (pNLNgoMIVR - ΔLUC) ו4 מיקרוגרם של VSV (pHCMV-g) בשיטת סידן זרחה 35. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 6 שעות לאחר משקע סידן זרחה הוא הוסיף, לשטוף 293 תאים פעמיים עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS) ודגירה עם תקשורת טריות ל48 שעות. [DMEM בתוספת 5% (v / v) בסרום שור עוברי, 5% נסיוב עגל בן יומו, ופניצילין (50 יחידות / מיליליטר) בתוספת סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מיליליטר)]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר הווירוס המכיל supernatants ידי הסרת התקשורת מקוטר 100 מ&quot;ממנות, להבהיר את supernatants ידי צנטריפוגה במהירות הנמוכה ב3,000 סל&quot;ד 10 דקות, לסנן את supernatants דרך מסנן 45 מזרק הגודל הנקבובית מיקרומטר, לטפל supernatants עם טורבו DNase ל30 דקות ב RT ולדלל את supernatants בתקשורת להכנה במבחני זיהום . אחסן את supernatants הנגיפי קפוא, בaliquots, ב -80 ° C. הערה: כמות p24 בsupernatant נקבעת באמצעות ערכת HIV-1 p24 צמוד אנזים immunosorbent assay. ריכוז p24 משמש לשליטה את כמות הנגיף במדגם. כ 500 ננוגרם של וירוס נוסף תאי HOS מצופים על צלחות בקוטר 60 מ&quot;מ בצפיפות של 1.5 x 10 5 תאים / תבשיל ביום לפני ההדבקה. לאחר שעה 48 של דגירה, התאים נקצרים, שנאספו על ידי צנטריפוגה, שטף, וresuspended בשל PBS 100 μl. מוסיף כמות שווה של מגיב assay גן כתב הארה ולמדוד את פעילות לוציפראז כמפורט בסעיפים 5.4.1 ו5.4.2. מכאן, דילול מתאים של הנגיף יכול להתבצע כאמור בשלב 4.6. </li></ol> 4. מתחם הקרנה בצלחות 96 היטב מסך בכל מתחם בשלושה עותקים ומחשבים את ממוצע התוצאות. הערה: ההשפעה של כל מתחם בשכפול נגיפי היא תיקנה על ידי נרמול לרמה של שכפול המתקבל בהעדר כל מתחם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את טווח הריכוז האמפירי שיוקרנו. הערה: בדרך כלל, מסכי עם 11 דילולים סדרתי מבוצעים על ידי הוספת המתחם לעמודת הצלחת לפי עמודה ומסכים עם 7 דילולים סדרתי מבוצעות על ידי הוספת המתחם אחר שורה. שלושה עותקים סט אחד של בארות חייבים להיות שמורות לשליטה אין מתחם. בנוסף, עמודה או שורה אחת אחד חייבת להישאר ריקה לפעול כביקורת השלילית / רקע. לבסוף, בין אם מדובר בcytotoxicity סלולארי או assay infectivity יכתיב אם הוא הוסיף וירוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכיןדילולים סדרתי מפתרון מניות 20 מ&quot;מ. הריכוזים נבחרים בהתאם לטווח אמפירי הנחוש של ריכוזים להיבדק (כפי שמוצגים בטבלה 1). הכן את דילולים בתקשורת ב10x הריכוז הסופי הרצוי, כלומר אם הריכוז הסופי הולך להיות 100 מיקרומטר, להפוך את המניה עובדת 1 מ&quot;מ. הערה: תרכובות עם IC 50 של מעל 5-10 מיקרומטר אינן מועמדים טובים בדרך כלל לפיתוח תרופה. במבחנים הראשוניים אנו בוחנים את התרכובות רק נגד וקטור WT. תרכובות מבטיחות שיעילות לעכב את וקטור WT מכן נבדקו מול פנל של מוטציות עמידות לתרופות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחות 96 היטב מן האינקובטור ולהוסיף דילולים סדרתי של התרכובות להיבדק לבארות בשלושה עותקים (כפי שמוצג באיור 1, שלב 2). הערה: הנפח הוסיף לגם צריך להיות בריכוז הסופי 1/10 נפח. לפיכך, להוסיף 22 μl / טוב (עמ &#39;הנפח הסופיבנוסף וירוס OST הוא 220 μl) עבור מבחני infectivity. עבור מבחני cytotoxicity, להוסיף μl 11 / טוב (נפח סופי הוא 110 μl / טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את צלחות 96 היטב לחממה. למסך cytotoxicity הסלולרי, דגירה צלחות 96 היטב 48 שעות על 37 מעלות צלזיוס ולא מניפולציות נוספות יש צורך בפרוטוקול 4: להמשיך לפרוטוקול 5 למבחני infectivity, תמשיך ביצוע ההנחיות בפרוטוקול 4.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחני Infectivity בלבד. הסר את הצלחות מן החממה לאחר מינימום של 3 שעות דגירה על 37 מעלות צלזיוס עם התרכובות כדי להיות מנותחים. שים לב: זה מאפשר את המתחם שנלקח על ידי התאים לפני ההדבקה עם וקטור ה-HIV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את דילול מניות של הנגיף 33, 34 (בדרך כלל כ 1:3) שיפיק אות לוציפראז בין .2-1.5 יחידות יחסי לוציפראז (RLUs) בתאים שלא טופלו. כל צלחת תיקח כ 10 מיליליטר של diluוירוס טד. הוספה של וירוס 100 μl לכל אחת מהבארות, או באמצעות pipettor רבת ערוצים 8 או 12. אל תוסיף וירוס לבארות ביקורת שלילי / רקע. החזר את הצלחות ל37 מעלות צלזיוס החממה ל48 שעות. הערה: דילול מניות 1:03 של הנגיף הוא דילול טיפוסי שיפיק אות לוציפראז בין 0.2 -1.5 RLUs מבוססת על assay p24 מראה כי הריכוז הנגיפי בsupernatant הוא כ 500 ng ב1.0 מיליליטר. </li></ol> 5. הכנה ומדידה של Cytotoxicity וInfectivity צלחות 96 היטב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את התקשורת מהבארות (פנול האדום בתקשורת יכולה להפריע לאות לוציפראז). השתמש פיפטה זכוכית עם קצה פיפטה 200 μl מצורף בסוף. התחל בחלק העליון של התקשורת ועובד לאט לכיוון הפינה התחתונה של הבאר. אל תבזבזו יותר מדי זמן בתחתית הבאר, או תאים ניתן להסיר מהבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> של PBS הוספה 100 μl בתוספת 0.5 מ &#39;M MgCl 2 היטב כל אחד. זה צריך להיעשות באופן מיידי לאחר שהתקשורת מוסרת, כך שהתאים לא יתייבשו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק עבור מבחני cytotoxicity, מוסיף 5 מיליליטר של חיץ מצע מassay גילוי הארה ATP לכל בקבוקון של מגיב lyophilized שסופק. בקבוקון אחד מספיק לצלחת 96 היטב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של חיץ תמוגה התא מassay גילוי הארה ATP היטב כל אחד. לנער את צלחת 96 היטב ב700 סל&quot;ד ב RT במשך 5 דקות באמצעות thermomixer קומפקטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של מגיב assay הגילוי מחדש הארה ATP לכל הבארות מלבד בארות שליטה / רקע השליליות. לנער ב700 סל&quot;ד בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות באמצעות thermomixer קומפקטי. דגירה הצלחות ב RT עבור 20 דקות כדי לאפשר זמן לפיתוח אות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את צלחת 96 היטב באמצעות luminometer microplate. הערה: פתח את תכנית luminometer microplate Pro SoftMax. ודא luminometer מוגדר למדוד לומיםnescence ברגישות של 5 קריאות / כן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק עבור מבחני infectivity, להוסיף 10 מיליליטר של חיץ מצע מassay גן כתב הארה לכל בקבוקון של מגיב lyophilized שסופק. בקבוקון אחד מספיק לכל צלחת 96 היטב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של מגיב כתב הארה מחדש assay גן 100 μl היטב כל אחד. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות כדי לאפשר זמן לפיתוח אות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את צלחת 96 היטב באמצעות luminometer microplate כפי שבוצע בסעיף 5.3.3. </li></ol></li></ol> 6. קביעת CC 50 וIC 50 ערכים לתרכובות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את נתוני לוציפראז מluminometer microplate לתוך גיליון אלקטרוני Excel. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע שני נתונים לוציפראז בשלושה עותקים ונתונים אות רקע / שליטה. להחסיר אות רקע / שליטה הממוצעת של האות בשלושה עותקים בממוצע לטווח הריכוז כולו. </li> &lt;li&gt; נרמל הרקע תיקן אות ממוצעת לטווחי הריכוז נגד הפעילות, בין אם מדובר cytotoxicity או infectivity, בהעדר כל מתחם על מנת לקבוע את עיכוב אחוזים. הערה: עיכוב אחוזים מוגדר כפעילות לוציפראז בנוכחות הסמים מחולקת בפעילות לוציפראז בהעדר התרופה כפולה 100. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת Kaleidagraph להשיג CC 50 וIC 50 ערכים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את שני טווח הריכוז באופן אמפירי נחוש ועיכוב אחוזים מפעילות לוציפראז לKaleidagraph. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתוות את הנתונים בטווח הריכוז על ציר x ועיכוב אחוזים מפעילות לוציפראז על ציר y. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Mouton, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+protease+inhibitors+on+AIDS-defining+events+and+hospitalizations+in+10+French+AIDS+reference+centres.+Federation+National+des+Centres+de+Lutte+contre+le+SIDA%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Impact of protease inhibitors on AIDS-defining events and hospitalizations in 10 French AIDS reference centres. Federation National des Centres de Lutte contre le SIDA.</a> AIDS. , 101-105 (1997).</li>
<li>Hammer, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+controlled+trial+of+two+nucleoside+analogues+plus+indinavir+in+persons+with+human+immunodeficiency+virus+infection+and+CD4+cell+counts+of+200+per+cubic+millimeter+or+less+AIDS+Clinical+Trials+Group+320+Study+Team%5BTitle%5D)+AND+%22New+Eng.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">A controlled trial of two nucleoside analogues plus indinavir in persons with human immunodeficiency virus infection and CD4 cell counts of 200 per cubic millimeter or less AIDS Clinical Trials Group 320 Study Team.</a> New Eng. J. Med. 337, 725-733 (1997).</li>
<li>Hogg, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival+among+HIV-infected+patients+after+initiation+of+triple-drug+antiretroviral+regimens%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+Med.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Improved survival among HIV-infected patients after initiation of triple-drug antiretroviral regimens.</a> Can. Med. Assoc. 160, 659-665 (1999).</li>
<li>Egger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+new+antiretroviral+combination+therapies+in+HIV+infected+patients+in+Switzerland%3A+prospective+multicentre+study.+Swiss+HIV+Cohort+Study%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Impact of new antiretroviral combination therapies in HIV infected patients in Switzerland: prospective multicentre study. Swiss HIV Cohort Study.</a> BMJ. 315, 1194-1199 (1997).</li>
<li>Gulick, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+indinavir%2C+zidovudine%2C+and+lamivudine+in+adults+with+human+immunodeficiency+virus+infection+and+prior+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22New+Eng.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment with indinavir, zidovudine, and lamivudine in adults with human immunodeficiency virus infection and prior antiretroviral therapy.</a> New Eng. J. Med. 337, 734-739 (1997).</li>
<li>Perelson, A. S., Neumann, A. U., Markowitz, M., Leonard, J. M., Ho, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+dynamics+in+vivo%3A+virion+clearance+rate%2C+infected+cell+life-span%2C+and+viral+generation+time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HIV-1 dynamics in vivo: virion clearance rate, infected cell life-span, and viral generation time.</a> Science. 271, 1582-1586 (1996).</li>
<li>Simoni, J. M., Amico, K. R., Pearson, C. R., Malow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+promoting+adherence+to+antiretroviral+therapy%3A+a+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Infect.+Dis.+Rep%22%5BJournal%5D)">Strategies for promoting adherence to antiretroviral therapy: a review of the literature.</a> Curr. Infect. Dis. Rep. 10, 515-521 (2008).</li>
<li>Simoni, J. M., Amico, K. R., Smith, L., Nelson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiretroviral+adherence+interventions%3A+translating+research+findings+to+the+real+world+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+HIV%2FAIDS+Rep%22%5BJournal%5D)">Antiretroviral adherence interventions: translating research findings to the real world clinic.</a> Curr. HIV/AIDS Rep. 7, 44-51 (2010).</li>
<li>Volberding, P. A., Deeks, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiretroviral+therapy+and+management+of+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Antiretroviral therapy and management of HIV infection.</a> Lancet. 376, 49-62 (2010).</li>
<li>Acosta, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+to+assess+antiretroviral+target+trough+concentrations+using+in+vitro+susceptibility+data%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicr%22%5BJournal%5D)">Novel method to assess antiretroviral target trough concentrations using in vitro susceptibility data.</a> Antimicr. 56, 5938-5945 (2012).</li>
<li>Rockstroh, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+treatment+with+raltegravir+or+efavirenz+combined+with+tenofovir%2Femtricitabine+for+treatment-naive+human+immunodeficiency+virus-1-infected+patients%3A+156-week+results+from+STARTMRK%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Long-term treatment with raltegravir or efavirenz combined with tenofovir/emtricitabine for treatment-naive human immunodeficiency virus-1-infected patients: 156-week results from STARTMRK.</a> Clin. Infect. Dis. 53, 807-816 (2011).</li>
<li>Fernandez-Montero, J. V., Eugenia, E., Barreiro, P., Labarga, P., Soriano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiretroviral+drug-related+toxicities+-+clinical+spectrum%2C+prevention%2C+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Opin.+Drug+Safety%22%5BJournal%5D)">Antiretroviral drug-related toxicities - clinical spectrum, prevention, and management.</a> Exp. Opin. Drug Safety. , (2013).</li>
<li>Lunzen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Once+daily+dolutegravir+%28S%2FGSK1349572%29+in+combination+therapy+in+antiretroviral-naive+adults+with+HIV%3A+planned+interim+48+week+results+from+SPRING-1%2C+a+dose-ranging%2C+randomised%2C+phase+2b+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Once daily dolutegravir (S/GSK1349572) in combination therapy in antiretroviral-naive adults with HIV: planned interim 48 week results from SPRING-1, a dose-ranging, randomised, phase 2b trial.</a> Lancet Infect Dis. 12, 111-118 (2012).</li>
<li>Sax, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-formulated+elvitegravir%2C+cobicistat%2C+emtricitabine%2C+and+tenofovir+versus+co-formulated+efavirenz%2C+emtricitabine%2C+and+tenofovir+for+initial+treatment+of+HIV-1+infection%3A+a+randomised%2C+double-blind%2C+phase+3+trial%2C+analysis+of+results+after+48+weeks%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Co-formulated elvitegravir, cobicistat, emtricitabine, and tenofovir versus co-formulated efavirenz, emtricitabine, and tenofovir for initial treatment of HIV-1 infection: a randomised, double-blind, phase 3 trial, analysis of results after 48 weeks.</a> Lancet. 379, 2439-2448 (2012).</li>
<li>Sax, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abacavir%2Flamivudine+versus+tenofovir+DF%2Femtricitabine+as+part+of+combination+regimens+for+initial+treatment+of+HIV%3A+final+results%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Abacavir/lamivudine versus tenofovir DF/emtricitabine as part of combination regimens for initial treatment of HIV: final results.</a> Infect. Dis. 204, 1191-1201 (2011).</li>
<li>Kellam, P., Larder, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+virus+assay%3A+a+rapid%2C+phenotypic+assay+for+assessment+of+drug+susceptibility+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicr.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Recombinant virus assay: a rapid, phenotypic assay for assessment of drug susceptibility of human immunodeficiency virus type 1 isolates.</a> Antimicr. Agents Chemother. 38, 23-30 (1994).</li>
<li>Hertogs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+simultaneous+detection+of+phenotypic+resistance+to+inhibitors+of+protease+and+reverse+transcriptase+in+recombinant+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates+from+patients+treated+with+antiretroviral+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicr.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">A rapid method for simultaneous detection of phenotypic resistance to inhibitors of protease and reverse transcriptase in recombinant human immunodeficiency virus type 1 isolates from patients treated with antiretroviral drugs.</a> Antimicr. Agents Chemother. 42, 269-276 (1998).</li>
<li>Petropoulos, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+phenotypic+drug+susceptibility+assay+for+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicr.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">A novel phenotypic drug susceptibility assay for human immunodeficiency virus type 1.</a> Antimicr. Agents Chemother. 44, 920-928 (2000).</li>
<li>Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+DNA+integration%3A+mechanism+of+viral+DNA+cleavage+and+DNA+strand+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer.</a> Cell. 67, 1211-1221 (1991).</li>
<li>Hazuda, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+strand+transfer+that+prevent+integration+and+inhibit+HIV-1+replication+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of strand transfer that prevent integration and inhibit HIV-1 replication in cells.</a> Science. 287, 646-650 (2000).</li>
<li>Nguyen, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raltegravir%3A+the+first+HIV-1+integrase+strand+transfer+inhibitor+in+the+HIV+armamentarium%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Raltegravir: the first HIV-1 integrase strand transfer inhibitor in the HIV armamentarium.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1222, 83-89 (2011).</li>
<li>Wills, T., Vega, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elvitegravir%3A+a+once-daily+inhibitor+of+HIV-1+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Opin.+Invest.+Drugs%22%5BJournal%5D)">Elvitegravir: a once-daily inhibitor of HIV-1 integrase.</a> Exp. Opin. Invest. Drugs. 21, 395-401 (2012).</li>
<li>Kobayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+antiretroviral+properties+of+S%2FGSK1349572%2C+a+next-generation+HIV+integrase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicr.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In Vitro antiretroviral properties of S/GSK1349572, a next-generation HIV integrase inhibitor.</a> Antimicr. Agents Chemother. 55, 813-821 (2011).</li>
<li>Cooper, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subgroup+and+resistance+analyses+of+raltegravir+for+resistant+HIV-1+infection.+Eng%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med%22%5BJournal%5D)">Subgroup and resistance analyses of raltegravir for resistant HIV-1 infection. Eng.</a> J. Med. 359, 355-365 (2008).</li>
<li>Briz, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raltegravir+and+etravirine+are+active+against+HIV+type+1+group+O%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res.Human+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Raltegravir and etravirine are active against HIV type 1 group O.</a> AIDS Res.Human Retroviruses. 25, 225-227 (2009).</li>
<li>Fransen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+raltegravir+susceptibility+by+human+immunodeficiency+virus+type+1+is+conferred+via+multiple+nonoverlapping+genetic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Loss of raltegravir susceptibility by human immunodeficiency virus type 1 is conferred via multiple nonoverlapping genetic pathways.</a> J. Virol. 83, 11440-11446 (2009).</li>
<li>Goethals, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+mutations+selected+in+vitro+with+raltegravir+confer+large+fold+changes+in+susceptibility+to+first-generation+integrase+inhibitors%2C+but+minor+fold+changes+to+inhibitors+with+second-generation+resistance+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Primary mutations selected in vitro with raltegravir confer large fold changes in susceptibility to first-generation integrase inhibitors, but minor fold changes to inhibitors with second-generation resistance profiles.</a> Virology. 402, 338-346 (2010).</li>
<li>Goethals, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+mutations+in+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+selected+with+elvitegravir+confer+reduced+susceptibility+to+a+wide+range+of+integrase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 integrase selected with elvitegravir confer reduced susceptibility to a wide range of integrase inhibitors.</a> J. Virol. 82, 10366-10374 (2008).</li>
<li>Canducci, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+patterns+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+gene+evolution+in+patients+failing+raltegravir-based+salvage+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Dynamic patterns of human immunodeficiency virus type 1 integrase gene evolution in patients failing raltegravir-based salvage therapies.</a> AIDS. 23, 455-460 (2009).</li>
<li>Ceccherini-Silberstein, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+structural+analysis+of+HIV-1+integrase+conservation%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Rev%22%5BJournal%5D)">Characterization and structural analysis of HIV-1 integrase conservation.</a> AIDS Rev. 11, 17-29 (2009).</li>
<li>Charpentier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+resistance+profiles+for+the+HIV+integrase+gene+in+patients+failing+raltegravir+salvage+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22HIV+Med%22%5BJournal%5D)">Drug resistance profiles for the HIV integrase gene in patients failing raltegravir salvage therapy.</a> HIV Med. 9, 765-770 (2008).</li>
<li>Julias, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mutations+in+the+G+tract+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+polypurine+tract+on+virus+replication+and+RNase+H+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Effects of mutations in the G tract of the human immunodeficiency virus type 1 polypurine tract on virus replication and RNase H cleavage.</a> J. Virol. 78, 13315-13324 (2004).</li>
<li>Hare, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+analyses+of+the+second-generation+integrase+strand+transfer+inhibitor+dolutegravir+%28S%2FGSK1349572%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional analyses of the second-generation integrase strand transfer inhibitor dolutegravir (S/GSK1349572).</a> Mol. Pharmacol. 80, 565-572 (2011).</li>
<li>Adachi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+acquired+immunodeficiency+syndrome-associated+retrovirus+in+human+and+nonhuman+cells+transfected+with+an+infectious+molecular+clone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone.</a> J. Virol. 59, 284-291 (1986).</li>
<li>Kemp, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+polymorphism+at+codon+333+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+reverse+transcriptase+can+facilitate+dual+resistance+to+zidovudine+and+L-2%27%2C3%27-dideoxy-3%27-thiacytidine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A novel polymorphism at codon 333 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase can facilitate dual resistance to zidovudine and L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.</a> J. Virol. 72, 5093-5098 (1998).</li>
<li>Butler, S. L., Hansen, M. S., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+assay+for+HIV+DNA+integration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo.</a> Nat. Med. 7, 631-634 (2001).</li>
<li>Brussel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+monitoring+of+2-long+terminal+repeat+circles+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+patients+with+chronic+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Longitudinal monitoring of 2-long terminal repeat circles in peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic HIV-1 infection.</a> AIDS. 17, 645-652 (2003).</li>
<li>Daelemans, D., Pauwels, R., De Clercq, E., Pannecouque, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-of-drug+addition+approach+to+target+identification+of+antiviral+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A time-of-drug addition approach to target identification of antiviral compounds.</a> Nat. Protoc. 6, 925-933 (2011).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

אנו מתארים assay מהיר, יעיל, ושחזור שניתן להשתמש בם לתרכובות מסך לcytotoxicity ויכולתם כדי לעכב את השכפול של שני WT וסמים עמידים HIV-1. היכולת לזהות במהירות תרכובות ובדיקת היעילות ורעילה לתאים שלהם היא קריטית בפיתוח של תרופות חדשות ומשופרות נגד HIV-1. ברגע שתרכובות עופרת מזוהות, אנלוגים של המתחם להוביל יכולים להיות מיוצרים ונבדקו תוך שימוש באותה assay. Assay הוא יחסית פשוט. ישנן שני בקרות חיוביות ושליליות המאפשרות למשתמש כדי לאבחן את הבעיות הנפוצות ביותר (תרכובות רעילות, בעיות עם מניית הווקטור). השימוש בסט שלושה עותקים של בארות ללא מתחם הוסיף מראה כי זיהום ויראלי התרחש. העובדה שcytotoxicity נמדד בassay עצמאי נמנעה פרשנות שגויה לירידה בלוציפראז נגרמת על ידי cytotoxicity כהשפעה ספציפית על שכפול נגיפי. השלבים הקריטייםבפרוטוקול מכינים את הצלחות, כך שהתאים מפוזרים באופן אחיד בבארות, שיש להם הבארות ריכוזים תקינים של התרכובות להיבדק, ומוסיף את אותה הכמות של וירוס לכל אחת מהבארות, ומדידת פעילות לוציפראז כדי לקבוע את CC 50 וIC 50 ערכים. Assay הוא בטוח, כמוני, ושחזור. Assay הוא בטוח כי הווקטור הוא שכפול פגום. Assay הוא כמוני ולשעתק משום שהיא מבוססת על וקטור אחד עגול שמבטא לוציפראז, אשר ניתן assayed במדויק ובנוחות. בassay שכפול נגיף עגול רב, IC נמדד 50 תלוי במספר מחזורי חיים נגיפיים; מדובר בבעיה מסוימת כאשר מבחני כרוכים בשני WT ווירוסים עמידים לתרופות שעשויות להיות יכולות שכפול שונות באופן משמעותי. יש כמה מבחני האנזימטית כבר דיווחו כי יכולים בעברלשמש מסך למעכבי IN. מבחני שכוללים טכנולוגיית ה-PCR בזמן אמת כדי למדוד DNA המשולב דורשים חלבונים מטוהרים רקומביננטי (ים), והם, באופן כללי, הן יותר עבודה אינטנסיבית ויקר 36, 37. למרות שניתן להשתמש במבחנים האנזימטית כדי למדוד את ההשפעה של תרכובות על אנזימים האחרים נגיפיים (RT ופרוטאז), כל אנזים דורש מערכת assay משלו. Assay וקטור הסיבוב אחד, כפי שתואר, ניתן להשתמש בם, ללא שינוי, מסך עבור מעכבי RT. Assay דומה יכול לשמש מסך למעכבי פרוטאז; עם זאת, בassay מעכבי פרוטאז, התרכובות יש להוסיף לתאים המשמשים לייצור הווקטורים. Assay בנושא, תוך שימוש בתאים ווקטורים שונים, יכול גם לשמש מסך למעטפה (env) ומעכבי איחוי כניסת ה-HIV. לבסוף, ניתן להשתמש assay, בקנה מידה גדול יותר, עם מכשירי רובוטית אוטומטיים. לפיכך, assay יכול לשמש מסך ספריות גדולות של תרכובות נגד WT ומטרutant-HIV. עם זאת, העובדה assay יכול לזהות מעכבי של שכפול נגיף איידס שפועל בשלבים שונים של מחזור החיים נגיפיות נקודות להגבלה בפרשנות הנתונים. על ידי עצמו assay אינו מגדיר ששלב במחזור החיים חסום על ידי מתחם. אם שאלה זו מתעוררת, ניתן לפתור אותו על ידי שימוש בזמן של מבחני בנוסף 38, ועל ידי בדיקת המתחם נגד חלבונים נגיפיים רקומביננטי מטוהרים. למרבה הצער, למרות ההצלחה של תרופות נגד HIV, יש עדיין בעיות עם שניהם התנגדות ורעילות. בהיעדר חיסון ל-HIV אנטי יעיל, יש צורך לא רק לפיתוח תרופות טיפוליות חדשות שתהיינה יעיל נגד מוטציות עמידות לתרופות הקיימות, אלא גם לפתח תרופות מונעות שיכול לצמצם את התפשטות הנגיף. אם שימוש מניעתי בתרופות נגד HIV incudes הטיפול של אנשים נגוע, גישה זו תציב את נטל מיוחד על פיתוח תרופות שיש little או ללא רעילות לטווח ארוך.

הזמינות של תרופות המכוונות כמה צעדים חיוניים במחזור החיים הנגיפי HIV-1 הובילה לטיפול משולב תרופתי (נקרא טיפול אנטי retroviral פעיל מאוד, או HAART) ששפר את הטיפול ב-HIV-1 זיהומים, והישרדות לטווח הארוך מאוד של חולים. HAART, אשר בדרך כלל משתמש בשילובים של שני טרנסקריפטאז ההפוך נוקלאוזידים מעכבים (RT) וגם מעכבי פרוטאז או מעכבי RT נוקלאוזידים לא, יש עכשיו הוסב מחלה קטלנית למצב חיים ארוכים 1-5. עם זאת, למרות הצלחות רבות של HAART בדיכוי מתמשך של שכפול נגיפי, יש לו מגבלות. HAART לא למגר את האיידס, ולכן החולים אינם נרפא וטיפול הוא חיים ארוכים. יש בעיות עם רעילות תרופה ועם הופעתה של סמים זנים עמידים. התנגדות יכולה להתעורר לכל תרופות שאושרו נגד האיידס, כוללים תרופות שאושרו לאחרונה כי יעד אינטגראז HIV (IN). עמידות לתרופות סבירה מתעוררת becaשימוש במוטציות ספונטניות המתרחשות בעת שכפול נגיפי (שיעור שגיאה של 3 x 10 מחזור -5 מוטציות / בסיס / שכפול) 6. כאשר מוטציות להתעורר בקידוד גנים למטרות של תרופות אנטי רטרווירלי, קבוצה קטנה של מוטציות אלה תוביל לירידה ברגישות של הזן הנגיפי לסמים. כדי למנוע ההתפתחות של עמידות לתרופה, ריכוז תרופה חייב להישמר ברמות שלדכא את שכפול נגיף האיידס באופן מלא. דבקות עניים למשטר הטיפולי מחריפה את הבעיה, ויכולה להוביל להתפתחות המהירה של התנגדות 7-9. למרות שריכוזי תרופה יכולים להשתנות בחולים עקב ספיגה שונה, חילוף חומרים, הפצה, ורמות הפרשה, ריכוזי תרופה גבוהים יכולים להוביל לרעילות 10. מאז הטיפול ממשיך לחייו של המטופל, יש חששות בטיחות חמורים על הרעילות ארוכת הטווח של retrovirals אנטי. Retrovirals נגד שימוש נפוץ בHAART יכול להיות תופעות לוואיnd יש כבר מקרים שבהם תופעות הלוואי הייתה סכנת החיים 11-15. בעיות חולים נתקלים עם ההתפתחות של עמידות ורעיל בבסיס הצורך בפיתוח תרופות חדשות שיעילות לחסום את השכפול של הזנים הנפוצים התרופה עמידות של הנגיף עם רעילות ארוך טווח קטן או לא. לפיכך, יש צורך בassay שיכול להקרין לתרכובות לחסום צעדים חיוניים במחזור החיים הנגיפי במהירות. כאן אנו מתארים assay יעיל שניתן להשתמש בם כדי להעריך את cytotoxicity של תרכובות והיכולת שלהם לחסום את השכפול של שני WT וזני HIV עמיד לתרופות במהירות וביעילות. Assay אנו משתמשים דומה לassay שפותח למסך בעמידות לתרופה בוירוס מבודד מהחולים 16-18. למרות assay ניתן להשתמש בם ללא שינוי למסך עבור תרכובות שיכולים לחסום שעתוק לאחור איידס, אנו descrIBE באמצעות assay להעריך במעכבים. IN הוא אנזים נגיפי חיוני שמוסיף את ה-DNA הנגיפי לתוך הגנום התאי 19. למרות מספר מבטיח במעכבים מפותחים, שחלקם כעת בתהליך של ניסויים קליניים, רק 20 Isentress, 21 (הידוע גם בRaltegravir או RAL) ולאחרונה, Elvitegravir (EVG) 22 וDolutegravir (DTG) 23 היו שאושר על ידי ה-FDA. תרכובות אלו הן פעילים נגד שני HIV B ו-B תת הלא בתרבית תאים ובחולים 24, 25. עם זאת, טיפול בRAL בוחר לעמידים לתרופות HIV-1 במוטציות, כולל Y143R, N155H, וG140S/Q148H 24, 26-31. N155H וG140S/Q148H גם להפחית את היעילות של EVG, המדגישה את הצורך לעצב ולפתח את הדור שני במעכבי העברת גדיל (INSTIs) כי הם יעילים נגד מוטציות עמידות אלה.

<table><tbody><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-017</td><td></td></tr><tr><td>ATPlite זוהר ATP זיהוי מערכת בדיקה</td><td>Perkin Elmer</td><td>6016941</td><td></td></tr><tr><td>Steady Lite Plus רגישות גבוהה זוהר מדווח מערכת בדיקת גנים</td><td>Perkin Elmer</td><td>6016751</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco PBS</td><td>Gibco-Life Technologies-Invitrogen</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax Gemini EM</td> מכשירים <td></td><td></td><td>מולקולריים</td></tr><tr><td>KaleidaGraph</td><td>Synergy Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nunc F96 Microwell צלחת פוליסטירן לבנה</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>12-566-26</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer קומפקטי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>T1442-1EA</td><td></td></tr><tr><td>טורבו DNase</td><td>Ambion-Life Technologies-Invitrogen</td>יחידת מסנן <td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Millex HA, 0.45 ומיקרו; M</td><td>Millipore</td><td>SLAHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEK050B001KT</td><td></td></tr><tr><td>תאי HOS</td><td>ATCC</td><td>CRL-1543</td><td></td></tr><tr><td>תאי TZM-bl</td><td>NIH AIDS Reagent Program</td><td>8129</td><td></td></tr><tr><td>pNL4.3&Delta; Env.LUC</td><td>NIH-NCI תוכנית עמידות לתרופות HIV- Hughes Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VSV-G</td><td>NIH-NCI HIV תוכנית עמידות לתרופות- Hughes Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SoftMax Pro</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>0200-310</td><td></td></tr></tbody></table>

הקרנה מהירה של hiv ההפוך טרנסקריפטאז וintegrase המעכבים

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

למרות מספר תרופות אנטי HIV אושרו, יש עדיין בעיות עם רעילות ועמידות לתרופה. זה מדגים את הצורך לזהות תרכובות חדשות שיכול לעכב זיהום על ידי זני HIV-1 הנפוץ בסמים עמידים עם רעילות מינימאלית. כאן אנו מתארים assay יעיל שניתן להשתמש בם כדי לקבוע את cytotoxicity ויעילות של מתחם כנגד זנים נגיפיים WT ומוטציה הסלולריים במהירות. שורת תאי המטרה הרצויה היא זורעים בצלחת 96 היטב, ולאחר דגירה 24 שעות, באופן סדרתי דילולים של התרכובות להיבדק מתווספים. אין מניפולציות נוספות נדרשות למבחני cytotoxicity הסלולרי; עבור אנטי HIV מבחני סכום קבוע מראש של או WT או וקטור HIV-1 עמיד בפני תרופה המבטא לוציפראז מתווסף לתאים. Cytotoxicity נמדד באמצעות assay ATP תלוי הארה ואת ההשפעה של התרכובות בinfectivity נמדד על ידי קביעת סכום lucifeRase בנוכחות או היעדר מעכבים המשוערים. assay הקרנה זה לוקח 4 ימים כדי להשלים ויכולים להיות מוקרן תרכובות מרובות במקביל. תרכובות מוקרנות בשלושה עותקים והנתונים מנורמלים לרמות infectivity / ATP בהעדר תרכובות יעד. טכניקה זו מספקת מדידה מהירה ומדויקת של היעילות ורעיל של תרכובות אנטי HIV פוטנציאליים.

אם assay (איור 1, על שלבים 1 ו -2) בוצע בהצלחה, ולאחר מכן את ערכי לוציפראז צריכים להיות דומים לנתונים המוצגים בטבלה 2 סריקה על פני טווח הריכוז.; מתחם פוטנציאל חזק יגלה הגברת פעילות לוציפראז משמאל לימין, והשליטה צריכה להיות פעילות לוציפראז הגבוהה ביותר. אם פעילות לוציפראז אינה עולה על 0.1 יחידות יחסית בלוציפראז (RLUs) על פני טווח הריכוז, זה בדרך כלל מצביע על כך שהמתחם הרג את התאים. אם נתוני לוציפראז הוא גדולים או שווה ל2.0 RLUs בכל דילולים סדרתי, ולאחר מכן את התרכובות לא היו מסוגלים לעכב HIV-1 זיהומים בריכוזים שנבדקו. זומם את הריכוז של התרכובות לעומת עיכוב אחוזים מפעילות לוציפראז בKaleidagraph (לוח 3, חלק א &#39;), לאחר ביצוע ניתוח רגרסיה ליניארית, יפיק תוצאות דומות לt<html> צינור שמוצג בטבלה 3, ב &#39;חלק <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51400/51400fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. הכנה של HIV-1 מניות ויראלי וההתקנה של סלולארי Cytotoxicity ויחיד בסיבוב Infectivity מבחני. בשלב 1, תאי 293T הם transfected עם pNL4.3ΔEnv.LUC וVSV-G וטופחו במשך 48 שעות כדי לייצר וירוס 34 . הווירוס שנקטפו ואוחסן (הוקפא ב -80 מעלות צלזיוס בaliquots) עד שהוא השתמש במבחני infectivity. עבור שלב 2, תאי HOS הם זורעים בצלחת 96 היטב וטופחו במשך 24 שעות. לאחר מכן תאי preincubated עם דילולים סדרתי של התרכובות להיבדק במשך 3 שעות ולאחר מכן נגוע בוירוס (או WT או סמים עמידים). לאחר דגירה 48 שעות, פעילות לוציפראז נמדדת. &quot;Width =&quot; le1.jpg 300 &quot;/&gt; טבלת 1. תרופות הקרנת Prototype דילול סדרתי. הקרנה מחמירה יותר כרוכה 11 דילולים סדרתי אשר בדרך כלל מתחילים ב 10 מיקרומטר ויסתיימו ב0.0005 מיקרומטר. דילולים סדרה מוכנים 10x; יש תאי 100 μl ושל וירוס 100 μl בכל טוב). בכרך זה ולאחר חישובים אלה, דילולים סדרתי יהיו מספיק בשביל 3 שורות של צלחת 96 היטב כולו. מבחני cytotoxicity ערוכים באופן דומה; עם זאת 11 דילולים סדרתי להתחיל ב250 מיקרומטר ויסתיימו ב0.05 מיקרומטר. רק 11 μl של דילולים נוספים לבארות בצלחת המכילות תאי 100 μl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table1.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="טבלה 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" width="600" /><br/&gt; טבלה 2. Readout וקביעת עיכוב אחוז מבלוציפראז פעילות נתונים בלוציפראז איתותים. טבלת הנתונים מציגה סדרה טיפוסית של נתונים לוציפראז למתחם מוצלח. הטבלה מציגה גם את החישובים הנוספים דרושים על מנת לקבוע את עיכוב אחוזים מפעילות לוציפראז וCC 50 וIC 50 ערכים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="טבלה 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" width="600" /> לוח 3. ינארית ניתוח רגרסיה טבלת נתונים. חלק א &#39;. גרפים טווח הריכוז בשימוש לעומת עיכוב אחוזים מפעילות לוציפראז בKaleidagraph יפיק את עקומות העיכוב המתאימות. חלק ב &#39;, עקומות העיכוב מוגדרות על ידי פרמטרית 3תפקוד ובכושר לנתונים על ידי רגרסיה ליניארית sigmoidal מנתח 18. טבלת נתונים זה משמש לאחר מכן בשיתוף עם Microsoft Excel כדי לחשב את ריכוזי התרופה הנדרשים כדי לעכב אינטגרציה וירוס וcytotoxicity הסלולרי ב -50%, למשל IC 50 וCC 50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

כאן אנו מתארים cytotoxicity הסלולרי ומבחני infectivity סיבוב בודדים המאפשרים סינון המהיר ומדויק של תרכובות כדי לקבוע cytotoxicity הסלולרי (CC 50) וIC 50 ערכים נגד WT וסמים עמידים HIV-1.

הקרנה מהירה של HIV ההפוך טרנסקריפטאז וintegrase המעכבים

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לסנן תרכובות מעניינות כדי לקבוע את הרעילות התאית שלהן ואת יכולתן לעכב HIV-1 מסוג בר (wild type) או עמיד לתרופות, באמצעות מבחן זיהום של סבב אחד. הדבר מושג תחילה על ידי חשיפת התאים לתרכובות לצורך ספיגה, ולאחר מכן דגירה של התאים המטופלים עם HIV-1 מסוג בר או עמיד לתרופות המבטא לוסיפראז. לאחר מכן ניתן למדוד את פעילות הלוסיפראז של הנגיף.בסופו של דבר, ניתן להשתמש באות קריאת הלუციפראז כדי לכמת את עיכוב השכפול של הווקטור הוויראלי HIV V one על ידי התרכובות. לטכניקה זו יש השלכות טיפוליות שכן ניתן להשתמש בה לסריקת תרכובות חדשות המפגינות יעילות טובה יותר נגד HIV העמיד לתרופות. תרכובות כאלה עשויות לשמש באופן פוטנציאלי בטיפולים אנטי-רטרוויראליים בחולי HIV one. ביום שלפני הטרנספקציה, זרעו תאי 293 במנות של 1,500,000 תאים בצלחונות של 100 מילימטר.ביום למחרת, בצע טרנספקציה לתאים עם 16 micrograms של HIV מסוג פרא או מוטנטי ו-four micrograms של VSV באמצעות שיטת סידן פוספט. כשיע 6 שעות לאחר מכן, שטוף את תאי 2 93 פעמיים עם PBS ולאחר מכן דגור אותם במצע טרי למשך 48 שעות. לאחר יומיים, אסוף את העל-נוזלים (supernatants) המכילים את הנגיף מתוך הצלחות בקוטר 100 millimeter והצלל את העל-נוזלים באמצעות סנטריפוגציה במהירות נמוכה למשך 10 דקות ב-1, 620 Gs בטמפרטורת החדר.בשלב הבא, סננו את העל-נסיב דרך מסנן מזרק עם גודל נקבים של 45 micromolar והעבירו את תרחיפי הנגיפים טיפול באמצעות turbo DNAs. לאחר 30 דקות בטמפרטורת החדר, דללו את הנגיף במצע טרי ואחסנו אותו במינוס 80 degrees Celsius. כדי לבצע את סריקת התרכובות בבדיקת זיהומיות, ביום שלפני הניסוי, זרעו 4,000 מהתאים הרלוונטיים לכל באער של פלטת 96.מלאו את פלטת הבארות ב-100 µL של מצע גידול והדגירו אותן בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. לאחר 24 שעות, בצעו דילול סדרתי של התרכובת מתמיסת המלאי אל תוך מצע גידול טרי. הריכוזים הסופיים שנבחרו יתבססו על טווח ריכוזים שנקבע באופן אמפירי כפי שפורט בטבלה.בשלב הבא, הוסיפו את הדילול הסידורי של התרכובות לבארות בשלוש חזרות. בנפח של עשירית מהריכוז הסופי, דגרו את הדילול המתאים של התרכובות עם התאים למשך שלוש שעות לפחות. לאחר הדגירה, השתמשו בפיפט רב-ערוצי כדי להוסיף 100 µL של נגיף מדולל לכל אחת מהבארות.קבלו את בארות ביקורת השלילה. לאחר מכן, דגרו את הפלטות למשך 48 שעות נוספות. לאחר הדגירה, השתמשו בפיפט זכוכית המצויד בקצה פיפט של 200 µL כדי לשאוב את המצע מהבארות, החל מהחלק העליון של המצע וירידה איטית לכיוון הפינה התחתונה של הבאר.הוסיפו מיד 100 µL של PBS המועשר ב-0.5 mM מגנזיום כלוריד לכל באער; לאחר מכן, כדי למדוד את פעילות הלוסיפראז, הוסיפו 10 µL של באפר המצע (substrate buffer) מתוך ערכת הבדיקה של הגן המדווח ללומינסנציה לכל מבחנה של הריאגנט הליופיליזד שסופק. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של הריאגנט המשוחזר לכל באער והדגירו את הפלטה למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר את התפתחות האות. לבסוף, קראו את הפלטה בעלת 96 הבאערים באמצעות לומינומטר למיקרו-פלטות.ערכי הלוסיפראז מתוך הליך סינון תרכובות מוצלח מוצגים בטבלה. שימו לב שתרכובות בעלות פוטנציאל רב מראות פעילות לוסיפראז עולה, כאשר הביקורת מציגה את האות הגבוה ביותר בשתל Kaleido מייצג זה. ריכוז התרכובת אל מול אחוז העכבה של פעילות הלוסיפראזK סורטט כדי לקבוע האם התרכובת יעילה בעיכוב השכפול של HIV מסוג הבר (wild type) או HIV העמיד לתרופות.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לחלק באופן מדויק כמות אחידה של תאים ונגיף לכל בארות הפלטות, ולוודא כי מוכנס ריכוז נכון של תרכובות לכל בארה.

rapid-screening-of-hiv-reverse-transcriptase-and-integrase-inhibitors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

במבחני חוץ גופית כדי למדוד שכפול נגיף כבר השתפר מאוד על ידי הפיתוח של וירוסי RNA רקומביננטי להביע לוציפראז או אנזימים אחרים מסוגלים פליטת אור. כאן אנו פירוט צינור הקרנת תפוקה גבוהה המשלב זני רקומביננטי כגון חצבת והווירוסים chikungunya לבודד antivirals ספקטרום רחב מספריות כימיות.

הקרנת תפוקה גבוהה לספקטרום רחב כימיים מעכבי RNA וירוסים

בדיקת עמידות לתרופות ל-HIV-1 אנשים נגועים נכשלו טיפול תרופתי (ART) יכולה להדריך את הטיפולים בעתיד ולשפר את תוצאות טיפול. תוצאות בריאותיות אופטימיזציה של פרט ואוכלוסייה בשכיחות איידס גבוהה, אך משאב מוגבל הגדרות סופו של דבר תדרוש גנוטיפ עמידות לתרופה במחיר סביר ונגיש ושיטות פרשנות.

שיטת ניטור משתלמת HIV-1 תרופות התנגדות להגדרות משאב מוגבלת

דוח זה מתאר מבחן חוץ גופי למדידת פעילות האינטגרציה הקשורה לנגיף הכשל החיסוני האנושי מסוג 1 (HIV-1) בתמציות הציטופלזמיות של תאים נגועים באופן חריף. השילוב של DNA HIV-1 הקשור ל-PIC ב-DNA מטרה הטרולוגי מכומת על ידי שימוש באסטרטגיית תגובת שרשרת פולימראז מקוננת בזמן אמת.

מדידה במבחנה פעילות האינטגרציה של HIV-1 Preintegration מכלולים

כתב יד זה מתאר את הליך הניסוי וניתוח תוכנה עבור assay דו כיווני האתר אינטגרציה שיכולה בו זמנית לנתח במעלה הזרם ו-במורד הזרם ווקטור צומת ה- DNA. ניתן להשתמש במוצרי PCR דו-כיווניים עבור כל פלטפורמה של רצף דונסטרים. הנתונים שהתקבלו שימושיים עבור השוואה גבוהה, השוואה כמותית של מטרות DNA משולב.

דו כיווני Retroviral אינטגרציה אתר PCR מתודולוגיה וניתוח נתונים כמותיים זרימת עבודה

Integrase retroviral רקומביננטי oligomers DNA מחקה מסתיים DNA נגיפי יכול יוצרים קומפלקס פעיל enzymatically המכונה של intasome. Intasomes עשוי לשמש ללימודי הביוכימי, מבניים קינטי. פרוטוקול זה מפרט כיצד להרכיב ולטהר intasomes וירוס קצפית אב-טיפוס.

הרכבה ולטיהור Intasomes וירוס קצפית אב-טיפוס

אנו מתארים וזמינותו מבוססת תא לדווח על HIV-1 היתוך באמצעות הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק לזיהוי על ידי מיקרוסקופ לזרום cytometry או קרינה פלואורסצנטית. זה יכול לשמש כדי לבדוק את מעכבי נגיפי כניסה (במיוחד בשלב fusion) במערכות זיהום תא ולתא.

Cre-עצלן תפוקה גבוהה מופעל ממברנה ויראלי Assay פיוז'ן לזהות מעכבי של היתוך ממברנה נגיפי HIV-1

כאן אנו מציגים בגישה רצף עמוק המספקת של קביעה לא משוחדת של nascent-3' טרמיני, כמו גם פרופילים mutational של מולקולות דנ א חד גדילי. היישום העיקרי הוא אפיון nascent retroviral משלימים DNAs (cDNAs), intermediates שנוצר במהלך התהליך של retroviral שעתוק במהופך.

3'-Termini הקובע ורצפים של מולקולות Nascent חד גדילי ה-DNA הנגיפי במהלך HIV-1 הפוך שעתוק בתאים נגועים

פרוטוקול תפוקה גבוהה עבור הערכה תפקודית של הפעלה מחדש יעיל HIV ואישור של הפרו-וירוס החבויים תיאר, המיושם על ידי בדיקת ההשפעה של התערבויות ב- HIV שעתוק, שחבור. התוצאות נציג השפעת השהיית היפוך סוכנים על שעתוק מונחה-LTR, החדרת הינם מסופקים.

תפוקה גבוהה בחוץ גופית הערכה של השהיה היפוך סוכנים על HIV שעתוק ו שחבור

בעבודה זו, אנו מתארים את הפרוטוקולים המשמשים בבדיקות מבוססות אנזים מבוססות replicon ויראלי כדי לסנן מעכבים של שכפול וירוס זיקה בפורמט הקרנה תפוקה גבוהה.

בדיקות אנטי-ויראליות בעלות תפוקה גבוהה למסך עבור מעכבי שכפול וירוס זיקה

מחקר זה השתמש באסטרטגיות in-silico כדי לזהות Etravirine שנספר כחומר טיפולי מבטיח ל-HIV. הממצאים שלנו על אינטראקציות ודינמיקה מולקולריות תומכים בתכנון הרציונלי של NNRTI חדשים כחלופות אפשריות לטיפול ב-HIV.

יחסי מבנה-פעילות כמותיים, חיזוי פעילות ודינמיקה מולקולרית של מעכבי טרנסקריפטאז הפוך שאינם נוקלאוטידים

חקור שיטת הקרנה מהירה של תרכובות נגד HIV-1 בעזרת מבחני לוציפראז. גלה תרכובות אפקטיביות נגד זנים עמידים לתרופות ופתח אפשרויות טיפול חדשות.

הקרנה מהירה של HIV ההפוך טרנסקריפטאז וintegrase המעכבים

גלה סרטונים נוספים