בשכבה דקה כרומטוגרפי (TLC) הפרדות וbioassays של תמציות צמחים כדי לזהות תרכובות Antimicrobial

המטרה הכללית של הליך זה היא לזהות מטבוליטים של צמחים בעלי פעילות אנטי-מיקרוביאלית נגד חיידקים אנארוביים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הפרדת תמצית צמחית באמצעות כרומטוגרפיה על שכבה דקה (TLC). לאחר מכן, הכרומטוגרמה נחתכת לאזורים המכילים תרכובת אחת או יותר.

לאחר מכן, מניחים את האזורים על גהגא שזוהם בחיידקים אנאירוביים ומדגירים אותם. לאחר הדגירה, מסירים את האזורים וצובעים את הפתחים כדי לזהות תרכובים המעכבים צמיחה חיידקית. הנתונים המתקבלים חושפים את נוכחותם או היעדרם של מטבוליטים צמחיים אנטימיקרוביאליים.

שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום התזונה של רuminants, כגון מהן ההשפעות של מטבוליטים משניים של צמחים על ניצול חומרים מזינים על ידי מיקרואורגניזמים ספציפיים. למרות ששיטה זו חושפת תרכובות צמחיות המעכבות חיידקי קידקא (rumen), ניתן להשתמש בה גם לחשיפת תרכובות המעכבות חיידקים או פטריות אחרים.

בפרוטוקול זה, תרכובות פנוליות מנפש אדום ישמשו להדגמת זיהוי של תרכובות אנטימיקרוביאליות באמצעות ביוגרפיה במגע. התחילו בניקוי של לוחות כרומטוגרפיה בשכבה דקה או TLC בעבודה בתוך מ 빠르게

כאשר המערך מוצב בתוך התא כאן, מכינים תמיסה של אתיל אצטט ומנול ביחס של שניים לאחד. לאחר מכן, בעודכם לובשים כפפות ועובדים תחת מ 빠르게, השתמשו במספריים כדי לגזור פלטות סיליקה גמישות בעלות גב אלומיניום או פלסטיק כך שיתאימו לתא הפיתוח.

הכניסו את הפלטות לתא כאשר החלקים העליונים נשענים על דפנות התא. הפלטות לא צריכות לגעת זו בזו. כסו את התא והניחו לממס לעלות במעלה הפלטות באמצעות פעולת נימיות.

כאשר הממס מגיע לקצה העליון של הלוחיות, הוציאו אותן מתא הריצה והניחו אותן במצב אנכי במכסה המנדף עד שמיסם הממס יתאדה. לאחר שהלוחיות התייבשו, בדקו אם זיהומים נדדו לכיוון החלק העליון של לוחיות ה-TLC. אלו יופיעו כפס צהוב תחת תאורה נראית או כפס פלואורסצנטי תחת תאורת ultraviolet.

אם רוב הפלטה עדיין בעלת גוון צהבהב, חזור על תהליך הניקוי באותה תא TLC תוך שימוש באותו ממס. לאחר הוצאת פלטות ה-TLC מהתא, השלך את הממס. המתן להתאיידות מלאה של שאריות הממס לפני שימוש בתא עבור החלק הבא של הפרוטוקול.

כדי להסיר לחות שיורית שעלולה להשפיע על נדירת התרכובות על הסיליקה, העמידו את הלוחיות במצב אנכי בתנור ייבוש בטמפרטורה של 100 °C למשך 10 עד 15 דקות עבור לוחית של 20 על 20 סנטימטרים, וחמש דקות עבור לחיות של 7 על 10 סנטימטרים. לאחר שהלוחיות יתייבשו, הניחו להן להגיע לטמפרטורת החדר לפני טעינתן בתמציות. להכנת התאים להפרדת התמציות, השתמשו במספריים כדי לגזור פיסת נייר סינון שגובהה נמוך מעט מגובה התא ורוחבה הוא כחצי מהיקף התא.

נייר זה ישמש כפתיל לשאיבת הממסים במעלה דופן התא ולהרוויית התא בניירות ממס, ובכך ישפר את השחזוריות של ההפרדות. ערבב את הממסים כאן בתוך מנדף. הממסים שנעשה בהם שימוש הם ethyl acetate ו-methanol ביחס של ארבעה לאחד לנפח. שפוך את תערובת הממסים לתוך התא וכסה אותו.

השתמשו בעיפרון כדי לסמן קלות את נקודת המוצא בנקודה על פלטת ה-TLC שתהיה מעל פני הממס המפתח בתא. אם החומר הסופג של פלטת ה-TLC רך ונוטה להינזק בקלות, סמנו את השוליים כפי שמוצג כאן. לאחר מכן, המסו את התמציות בכמות מספקת של ממס אורגני כדי לקבל תמיסה רכזת במקום סספנסיה עכורה.

במקרה זה הממס שנעשה בו שימוש הוא מתנול. שימוש במיקרו-פיפטות קפילריות או במזרק מיקרוליטר מאפשר להעמיס סטנדרטים ודגימות כפסים צרים, תוך השארת שוליים של סנטימטר אחד בצדדי הלוח. כדי לייבש את הפסים במהירות רבה יותר, ניתן להנפנף בלוח או להניחו בתוך מופה. לאחר שהפסים התייבשו, העמיסו את הדגימות שוב באותו נקודת העמסה או בצעו העמסה חוזרת על אותן נקודות (over spot).

אם נדרש ריכוז גבוה יותר של הדגימה על הלוח, חזור על הפעולה לפי הצורך בתא ה-TLC. ודא כי כל הפתיל רווי בממס. לאחר מכן, בעזרת פינצטה או מלקחים, הנח את הלוחות בתוך תא ה-TLC.

הלוחיות לא צריכות לגעת בפתיל. כסו את התא והמתינו להתפתחות הלוחיות לפני שחזית הממס מגיעה לקצה העליון של הלוחית. הוציאו את הלוחיות ממיכל ה-TLC וסמנו את גובה חזית הממס בעזרת עיפרון.

הניחו לפלטה להתייבש. בתוך מ 빠르게, פתחו את שאר פלטות ה-TLC באותה תא TLC, שבדרך כלל ניתן להשתמש בו לאורך יום שלם אם הוא נשאר סגור. אם כמות הממס בתא פוחתת באופן ניכר, הכינו תערובת ממס נוספת לאחר שהפלטות התייבשו.

הדמיאו את הפסים תחת אור נראה או אור UV. תא צפייה עם מנורת UV ניידת הוא פתרון נוח, במיוחד אם המנורה מסוגלת לזהות תרכובים הן באורך גל קצר של 254 nanometer והן באורך גל ארוך של 365 nanometer של UV. השתמשו בעיפרון כדי לסמן את הפסים, והשתמשו במערכת לתיעוד תצלומי ג'ל המצוידת בתאורה עליונה, UV ו/או אור נראה כדי להשיג תמונות של הלוחות.

לבסוף, כדי לסייע באפיון הפסים, חשבו את מקדם השרידות או את ערכי ה-RF על ידי מדידת המרחק שעבר התרכובת, לאחר מכן מדידת המרחק שעבר הממס וחילוק הראשון באחרון. לאחר סימון מיקומי הפסים, ניתן לשמור את הפלטות להמשך. השתמשו בהן בבדיקה הביולוגית.

עטפו את הפלטות בניילון וכסו אותן בנייר אלומיניום. אחסנו את הפלטות בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. משך האחסון המקסימלי תלוי ביציבות התרכובת כיוון שסיליקה אינה ניטרלית.

ייתכן שחלק מהתרכובות יתפרקו בעודן על לוח ה-TLC. כהכנה לבדיקת הביוגרפיה במגע, הכין והזרק חיידקים מייצרי אמוניה גבוהה או מצע HAB בתנאים אנאירוביים. התרבית המשמשת במקרה זה היא Clostridium stickland eye strain sr.

גדלו את התרבית לשלב האקספוננציאלי או לשלב הסטציונרי בטמפרטורה של 39 °C. השתמשו בטכניקות אנאירוביות סטריליות בעבודה עם מיקרואורגניזמים אנאירוביים. הכינו תמיסה בריכוז 0.75% משקל לנפח.

אגר באותו מצע ששימש להגדלת החיידקים, לאחר שטמפרטורת האגר ירדה לפחות מ-60 °C. יש להחדיר לאגר המומס 1% נפח לנפח מהתרבית ולערבב בעדינות; מיד לאחר מכן יש להניח אותו בתא אנאירובי ולשפוך למכלי פטרי פלסטיים בגודל 15 על 100 מילימטר באמצעות מספריים. יש לחתוך את לוח ה-TLC לאזורים המכילים את הפס או הפסים הרלוונטיים.

סמנו את הצד האחורי של הפלטות באמצעות טוש Sharpie. הניחו פס TLC שאינו בשימוש על פלטת האגר כביקורת. לאחר מכן, הניחו את הפסים כשהפנים פונה כלפי מטה על פלטות האגר.

דגרו את הצלחות כשהצד של האגר פונה כלפי מטה באינקובטור של תא האנאירובי למשך 24 שעות בטמפרטורה של 39 °C באמצעות פינצטה. הוציאו את פסי ה-TLC מצעי האגר בעודם בתוך התא האנאירובי.

הוסיפו tetra oleum red טיפה אחר טיפה על פני פלטות האגר. המתינו לפחות 20 דקות לפיתוח הצבע. כאשר פלטת הביקורת תהפוך לאדומה לחלוטין, הוציאו את הפלטות מתא האנאירובי.

Clostridium stick Landi הוא חיידק אנאירובי, ולכן הוא יתחיל לאבד את חיוניותו מיד לאחר הוצאתו מהתא האנאירובי, אך הצבע נותר יציב למשך למעלה מ-24 שעות. צלם את הפלטות באמצעות מצלמה דיגיטלית תחת אור נראה על רקע המספק ניגודיות מספקת. צבע אדום בהיר ייראה כאשר תאים חיים נצבעים.

תאים מתים אינם נצבעים. מוצגות כאן הפרדות TLC מייצגות של תמציות תיתורה אדומה המכילות תרכובים פנוליים על סיליקה. הפרדה בתוך ethyl acetate hexane ביחס של תשע לאחד על פני 8.5 סנטימטרים הניבה חמישה פסים, כאשר אחד מהם הופרד לחלוטין מנקודת המוצא.

הסטנדרטים שהוטענו היו Formin Bio Canon A ו-Genine. ארבע רצועות מלוח זה הועברו לתרביות עם Clostridium stick Landi, חיידק המייצר היפר-אמוניה בקיבקיב, למשך 24 שעות ונצבעו ב-tetra oleum red כפי שמתואר כאן. דגירה עם רצועה אחת של Bio Canon A וחלק מרצועה שתיים של four Monon nein על אגרר זריעה של חיידקים הביאה לאזור עיכוב מוגדר היטב.

עם זאת, דגירה של שאר פס שני, יחד עם פסי שלושה וארבעה, לא עיכבה את הצמיחה הבקטריאלית. תוצאות אלו הוכירו כי bio Canon A עיכב את צמיחת see stickland eye, אך form aone Nein לא עיכב אותה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי הטכניקה היא גמישה.

ניתן להשתמש במיקרואורגניזמים אחרים לבדיקה כל עוד נבחרים מצעים מתאימים, ונכללו בקרות כדי להבטיח שכימיה ההפרדה ושיטת הזיהוי תואמות לביצוע פרוצדורה זו. ניתן להשתמש בטכניקות אחרות, כגון כרומטוגרפיה נוזלית בעירה גבוהה (HPLC) וספקטרומטריה של מסות, כדי לסייע באפיון התרכובות האנטימיקרוביאליות שזוהו בבדיקה ביולוגית (bioassay).