Name: שושלת תכנות מחדש של תאי שמקורם בpericyte של המוח האנושי למבוגרים לנוירונים מושרה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-12T21:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: למד שיטה להמרת תאי pericyte ממוח אנושי למבוגרים לנוירונים מושרים באמצעות וקטורים רטרו-ויראליים. גישה זו מאפשרת המרת שושלת ישירה ללא השתלה ומציעה פוטנציאל לתיקון מוחי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד&quot;ר מגדלנה גץ לקלט שלה במהלך הפיתוח של פרוטוקול זה. אנו מודים לד&quot;ר מריוס Wernig (אוניברסיטת סטנפורד) לנדיבות לתת לנו את רצף קידוד Sox2. אנחנו גם מאוד מודים לד&quot;ר אלכסנדרה Lepier לייצור וירוס. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של דויטשה Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) וBMBF (01GN1009A) ל-BB, והמשרד הבווארית הממלכתי למדעים, מחקר והאמנויות לח&quot;כ וBBCs קיבלו מימון מSYSTHER-דו לאומי מכון INREMOS וירטואלי (משרדי חינוך והמחקר הפדרליים גרמנים וסלובניים) וDFG (SFB 824).

1. בידוד וCulturing של תאים בוגרים מוח האנושי ניסויים מעורבים רקמה אנושית יש לבצע בהתאם לכל תקנות ממשלתיות ומוסדיות הרלוונטיות בנוגע לשימוש בחומר אנושי למטרות מחקר. הפרוטוקול הנוכחי פותח בהתאם לאישור על ידי ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה במינכן LMU וכתב הסכמה מדעת מכל החולים. פרוטוקול זה של תרבויות הכנה של האדם בוגר קליפת המוח כבר נקבע באמצעות דגימה של חולים משני המינים הסובלים מאפילפסיה של אונה הרקתית או נגעים אחרים עמוקים לא טראומטיים, שאינם ממאירים. הרקמה המתקבלת מחדר הניתוח המורכב אך ורק את ערוץ הגישה לפגיעה המוחית ולכן נחשבת בריאה. טווח הגילים של המטופלים היה 19-70 שנים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מדיום גידול על ידי הוספה עוברי עגל בסרום חום מומת(FCS) לגלוקוז גבוהה DMEM עם Glutamax להשיג ריכוז סופי של FCS 20%. הוסף 5 מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין לסך של 500 בינוני מיליליטר צמיחה. לבצע את זה וכל הצעדים הבאים דורשים תנאים סטריליים תרבות בזרימה למינרית מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על הביופסיה במוח האנושית הבוגרת שהתקבלה מחדר הניתוח בתמיסת מלח מאוזן &quot;הנקס עם CaCl 2 וMgCl 2 בינוני (HBSS) כוללים HEPES (ריכוז סופי 10 מ&quot;מ) על קרח עד לעיבוד. להתחיל בעיבוד בהקדם האפשרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל דיסוציאציה לתוך תאים בודדים, להעביר את הרקמה לתוך צלחת פטרי 65 מ&quot;מ וברר לחתיכות קטנות על ידי שימוש בשני סכינים לשימוש יחיד סטרילי. לעיכול אנזימטי להשתמש 3-6 מיליליטר TrypLE בצינור חרוטי 15 מיליליטר ו דגירה של 15-30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 נפח של מדיום גידול prewarmed כדי להקל על ניתוק ובעדינות triturate התמיסה המכילה חתיכות רקמה למעלה ולמטה על ידי השימוש הראשון5 מיליליטר פיפטה חד פעמית, ואחריו בעזרת פיפטה פסטר זכוכית עד הומוגניזציה של ההשעיה התא. בדרך כלל, כמה חתיכות רקמת שייר, בעיקר מורכבות מחומר לבן, יישארו בהשעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה ב157 XG במשך 5 דקות וresuspend את הכדור בכמות המתאימה של מדיום גידול (10 מיליליטר לבקבוק תרבות T75 ללא ציפוי). השתמש בבקבוק תרבות T75 אחד לביופסיה של 5-10 מ&quot;מ קוטר בגודל ובלהסיק מכך במקרה של דגימות גדולות יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח תאים לתוך חממת 37 ° C עם 5% CO 2 ו -5% O 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף מחצית בינונית בכל 3-4 ימים עד תאים הגיעו confluency. זה בדרך כלל לוקח עד שבועיים (המכונים [P0] מעבר 0). </li></ol> 2. במבחנה התרחבות ואפיון של תאים בוגרים מוח האנושי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהרחבת מבחנה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את מדיום התרבות ולשטוף עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS), המשיך בt החדרemperature, לפני הוספת 3 TrypLE מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות עד שרוב התאים מנותקים. לטפוח בעדינות את צלוחיות כדי להקל על הסרת התאים; בעקבות תוספת של 3 כרכים של מדיום גידול, העברת התאים לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר וספין למטה ב157 XG במשך 5 דקות ו resuspend התאים בכמות המתאימה של מדיום גידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר התאים ביחס של 1:3 לתשואה אופטימלית לתוך צלוחיות תרבית תאי T75 חדשות. הערה: יש לנו passaged תאים אלה עד P5 ללא כל סימנים של יעילות תכנות מחדש מופחתת. בעוד בP0 התרבות מכילה חלק ניכר של תאי האנדותל (כפי שהוערך על ידי ביטוי CD34), בקטעים שלאחר מכן מספרם הופך להיות זניח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפיון של תרבויות מוח אנושיות בוגרות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunocytochemistry: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפיון של תאים, זרעים ~ 60,000 תאים על פולי-D-ליזין מצופה כיסוי הזכוכית מחליקה ב500 μl mediu גידול הטרימ &#39;בצלחות תרבית רקמת 24 גם לדגור על 37 ° C עם 5% CO 2 ו -5% O 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח immunocytochemical של תאי המוח האנושיים בתרבית להסיר את המדיום ולשטוף 3x עם 1 מיליליטר של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים על ידי הוספת 500 μl של paraformaldehyde 4% ב-PBS במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את כיסוי הזכוכית מחליק לתוך תא מכתים humidified מתאים ולחסום עם 80 μl PBS המכיל 3% אלבומין בסרום שור (BSA) ו0.5% טריטון X-100 במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נוגדנים עיקריים מדוללים באותו הפתרון (לגורמי דילול ראו טבלה של חומרים כימיים וציוד ספציפיים) ודגירת הלילה בשעה 4 ° C או 1 שעות בטמפרטורת חדר. הערה: חלק ניכר אבל שונה של התאים בשלב זה של culturing הוא immunoreactive לβ רצפטור נגזר גורם גדילה של טסיות דם (PDGFRβ), מקבץ של בידול 146 (CD146), proteo כונדרואיטין סולפט NG2סוכרים, ויקטין שריר חלק (SMA), סמנים כלומר מאפיין של pericytes הקשורים דם קטן. רק מיעוט (&lt;1%) מבטא את חלבון סמני astroglial גליה fibrillary חומצי (GFAP) וS100β. יתר על כן, בשלב זה את התרבות צריכה להיות נטול כל תאים המבטאים את βIII-טובולין הסמן העצבי. השתמש בשילובי נוגדן ראשוני מרובים לשיתוף תיוג של סמנים שונים. ניתן לקבל אישור נוסף לביטוי של סמני גליה, עצביים, אנדותל וpericyte ידי שעתוק לאחור ותגובה הכמותית זמן אמת שרשרת פולימרז (לא תוארה בפרוטוקול זה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה עם הנוגדנים הראשוניים לשטוף שלוש פעמים עם 1 מיליליטר PBS ולהוסיף נוגדנים המתאימים משני (בדילולים המתאימים) לפתרון מכתים ודגירת 1 שעות בטמפרטורת חדר בחושך. לשטוף את התאים 3x עם PBS. במידת צורך, לפני ההרכבה כולל צביעה עם DAPI במשך 5 דקות בחדרטמפרטורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש antifading הרכבה בינונית ולנתח את התלושים לכסות באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence או מיקרוסקופ confocal. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cytometry זרימה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח של ביטוי סמן פני השטח באמצעות cytometry זרימה, לגדל תאים לconfluency בT25 ללא ציפוי או צלוחיות תרבית תאי T75. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק תאים באמצעות TrypLE כפי שתואר קודם ו resuspend בפתרון מכתים בהיקף של BSA + 0.5% PBS. לכל תגובה מכתים, resuspend תאים ב100,000-200,000 של פתרון מכתים 100 μl. הכן את התגובות מכתים אחד לכל נוגדן משמשות (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, נוגדני שליטת אלוטיפ בהתאמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נוגדני fluorochrome מצומדות לכל פתרון מכתים (לדילולים ראו טבלה של חומרים כימיים וציוד ספציפיים) ישירות לתוך ההשעיה תא דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 500 μl PBS וספין למטה בין כלשלב כביסה ב157 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב 0.5-1 מיליליטר פתרון מכתים ותאי העברה דרך מסננת תא (70 מיקרומטר) לצינורות FACS. הגנה על המדגם מחשיפה לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות ורטקס לפני הצבתם במכשיר FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את תאי חיים ואינם כולל אגרגטים פסולת וסלולריים, שער לFSC-SSC ו-. duplets התא מגודרת החוצה במיוחד על ידי FSC-וFSC-W. כדי לקבוע את תנאי gating הנכונים עבור הסמנים פני התא להגדיר את השערים עם שליטת נוגדנים מתאים אלוטיפ מצומדת לfluorochrome בהתאמה. לאחר מכן לקבוע את חלקם של תאים הנכנס נוגדנים. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. העשרה לתאים שמקורם בpericyte ידי תא הקרינה מיון פעיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את אוכלוסיית תא pericyte (resuspended במדיום גידול) לפני התמרה באמצעות FACS מיון באמצעות זרבובית 70 מיקרומטר. השתמש CD34-APC בשילוב עם CD140b-PE ו-CD146 FITC כדי לבחור עבור pericytes. מיון ל, תאי CD140b, וCD146-CD34 חיוביים שלילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף התאים ממוינים במדיום גידול וצלחת על פולי-D-ליזין מצופה כיסוי הזכוכית מחליק בצלחות תרבית רקמת 24 גם לדגור על 37 ° C עם 5% CO 2 ו -5% O 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 48 שעות לאחר המיון להחליף את המדיום עם מדיום גידול טרי ולבצע התמרה כפי שתוארו בפרוטוקול 4. </li></ol> 4. Retroviral התמרה של תאים שמקורם בpericyte ותכנות מחדש לנוירונים מושרה הערה: עיין בהנחיות בטיחות ביולוגיות מקומיות בעת טיפול בחלקיקי רטרווירלי. בגרמניה השימוש ברטרווירוסים מועסקים כאן דורשים בטיחות ביולוגית ברמה 2. לייצור של חלקיקי רטרווירלי מתייחס לפרוטוקול 6. לבונת רטרווירלי משמשת לתכנות מחדש, עיין Karow et al. (2012). רטרווירוסים היו pseudotyped עם VSV-G (-glyco וירוס stomatitis שלפוחיחלבון) 5. לייצור עיין אל Gavrilescu et 6. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לפני זרע התמרה retroviral ~ 60,000 תאים על פולי-D-ליזין מצופה כיסוי הזכוכית מחליקה ב500 μl מדיום גידול טרי ב24 גם צלחות תרבית רקמה ולדגור על 37 ° C עם 5% CO 2 ו -5% O 2 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להחליף את מצע הגידול עם 500 μl מדיום גידול טרי, prewarmed ולהוסיף 1 μl של supernatants בהתאמה מרוכזת המכיל חלקיקי רטרווירלי (pCAG-IRES-DsRed לשליטה, במיוחד בתקופת הקמת הפרוטוקול במעבדה), pCAG-ascl1 -DsRed IRES, pCAG-Sox2-IRES-GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לאחר מכן, להסיר את המדיום כולל חלקיקים נגיפיים מהתאים ולהוסיף 1 מיליליטר טרי, prewarmed בינוני B27-בידול, מורכב מ49 מיליליטר גלוקוז גבוהה DMEM עם Glutamax ותוספת סרום ללא 1 מיליליטר B27. לשמור על התאים בתרבית על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 ו -5% O 2 במשך 4-8 שבועות מבלי לשנות את המדיום כמדיום שינויים חוזרים ונשנים להיות מזיקים כמו INS להתבגר. </li></ol> 5. אפיון מושרה נוירונים ידי Immunocytochemistry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע את הזהות הסלולרית של תאי transduced, בפרט כדי להדגים את רכישת הפנוטיפ עצבי, לבצע immunocytochemistry נגד אנטיגנים עצביים כגון bIII-טובולין, MAP2, וNeuN (לנוגדנים והדילולים שלהם, ראה טבלה של חומרים כימיים מסוימים ו ציוד; בצע את אותו התהליך כפי שצוין ב2.2.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשיפור ההבשלה של PdiNs, שיתוף תרבות תאים אלה עם תאי עצב שמקורם בקורטקס מוח עכבר E14. לשם כך, לנתח את קליפת המוח ולנתק את הרקמה באופן מכאני עם הזכוכית פיפטה פסטר אש מלוטשת. הוספת 10,000-50,000 נוירונים עכבריים לתרביות של תאים שמקורם בpericyte 2-3 שבועות הבאים התמרה עם Sox2 וascl1 קידוד מחדשtroviruses ולהמשיך culturing. ניתן להבחין בין תאי transduced מתא העצב עכברי על ידי ביטוים כתב (GFP וdsRed), או על ידי epifluorescence החי או הבא immunocytochemistry עבור ה-GFP וdsRed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך את היווצרות של סינפסות על PdiNs ידי נוירונים עכבריים, לבצע immunocytochemistry נגד קולטני הנוירוטרנסמיטר ועי כגון טרנספורטר לפוחי גלוטמט 1 (vGluT1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדיקה תאי transduced לתכונותיהם חשמליות (כלומר יכולת לייצר פוטנציאל פעולה) ואת הקמתה של סינפסות הפונקציונלית על ידי אלקטרופיזיולוגיה תיקון מהדק. לפרטים בדבר ההליך לראות היינריך et al. (2011). </li></ol>

<ol><li>Caiazzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+mouse+and+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts.</a> Nature. 476, 224-227 (2011).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+integration+of+dopaminergic+neurons+directly+converted+from+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts.</a> Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).</li>
<li>Duan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+water+deficit%2C+ABA%2C+and+provenances+in+Picea+asperata%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+experimental+botany%22%5BJournal%5D)">Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata.</a> Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).</li>
<li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+astroglia+from+the+cerebral+cortex+into+subtype+specific+functional+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons.</a> PLoS Biol. 8, (2010).</li>
<li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).</li>
<li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Karow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+pericyte-derived+cells+of+the+adult+human+brain+into+induced+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells.</a> Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).</li>
<li>Ortega, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+an+adherent+cell+culture+of+the+mouse+subependymal+zone+to+study+the+behavior+of+adult+neural+stem+cells+on+a+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level.</a> Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).</li>
<li>Ladewig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+enable+highly+efficient+neuronal+conversion+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts.</a> Nat Methods. 9, 575-578 (2012).</li>
<li>Espuny-Camacho, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+integrate+efficiently+into+mouse+brain+circuits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo.</a> Neuron. 77, 440-456 (2013).</li>
<li>Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+reduction+in+oxygen+tension+enhances+the+induction+of+neurons+from+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts.</a> J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).</li>
<li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463, 1035-1041 (2010).</li>
<li>Pfisterer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Integration-free+and+Region-Specific+Neural+Progenitors+from+Primate+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts.</a> Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).</li>
<li>Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+neuronal+cells%3A+how+to+make+and+define+a+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced neuronal cells: how to make and define a neuron.</a> Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).</li>
<li>Pang, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+human+neuronal+cells+by+defined+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of human neuronal cells by defined transcription factors.</a> Nature. 476, 220-223 (2011).</li>
<li>Yoo, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-mediated+conversion+of+human+fibroblasts+to+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons.</a> Nature. 476, 228-231 (2011).</li>
<li>Son, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+mouse+and+human+fibroblasts+into+functional+spinal+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons.</a> Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).</li>
<li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing%2C+tripotent+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).</li>
<li>Thier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+into+stably+expandable+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).</li>
<li>Yang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+oligodendroglial+cells+by+direct+lineage+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion.</a> Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).</li>
<li>Najm, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor-mediated+reprogramming+of+fibroblasts+to+expandable%2C+myelinogenic+oligodendrocyte+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells.</a> Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).</li>
</ol>

יש מחברים אין לחשוף.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את ההתרחבות במבחנה והעשרה של תאי שמקורם pericyte הבאות בידוד מהמבוגרים האנושי קליפת המוח ואת ההמרה שלאחר מכן לאח&quot;י על ידי ביטוי בתיווך רטרווירוס של השעתוק העצבי גורמי Sox2 וAscl1. פרוטוקול כזה מספק ניסיוני במערכת מבחנה כדי לחקור את שושלת ההמרה של תאי מוח תושב לנוירונים ובאופן פוטנציאלי גם גליה, עם המטרה בראש לתרגם סופו של דבר גישת המרה הישירה הזה להגדרת vivo במוח הבוגר. <p class="jove_step" style=";text-align:right;directio...

בניגוד לתכנות מחדש של תאים הסומטיים לתאי גזע pluripotent מושרה (iPSCs), אשר בתורו ניחן בשפע של פוטנציאל התמיינות, תכנות מחדש ישיר נועד להמרה ישרה של סוג תא ספציפי אחד למשנו. עם כל כבוד ליישום שלהם בהקשר של דוגמנות מחלה וטיפולים מבוססי תאים פוטנציאליים, יש שתי גישות תכנות מחדש יתרונות וחסרונות מסוימים. תכנות מחדש לiPSCs (i) מספק מקור כמעט אינסופי של תאים; (Ii) מאפשר להנדסה גנטית; (Iii) מעניק לך את פוטנציאל התמיינות בלתי מוגבל כמעט. עם זאת, חסרונות עיקריים של iPSCs כרוך הסיכון של tumorigenicity של תאים שלא עברו התמיינות (היווצרות תפלצת in vivo) ואת הצורך בטיפוח vivo לשעבר והשתלה שלאחר מכן, אם תאים אלה הם לשמש לטיפולים מבוססי תאים. לעומת זאת, שושלת תכנות מחדש ישיר מוגבל על ידי התשואה נמוכה יותר של התאים הרצוייםאשר עולה בקנה ישירות עם מספר התאים הממוקדים של האוכלוסייה מתחילה, אבל יש לה את היתרון שתאים לתכנות מחדש שושלת מופיעים לתערוכה לא tumorigenic סיכון על ההשתלה 1,2; יתר על כן, תכנות מחדש ישיר יכול גם להיות מושגת באתרו, כלומר בתוך האיבר שבו תאים אלה יהיו צורך, וכך למנוע את הצורך בהשתלה. עם זאת בחשבון, במעבדה שלנו רדפה את האפשרות של תאי מוח תושב תכנות מחדש שושלת לאח&quot;י כגישה חדשנית כלפי טיפולים מבוססי תאים במחלות ניווניות. תאי מוח תושב שעשוי להיות באופן פוטנציאלי נחשבים כמטרות הסלולר לשושלת תכנות מחדש מהווים סוגים שונים של macroglia (האסטרוציטים, תאי NG2 וoligodendrocytes), מיקרוגליה, ותאים הקשורים דם קטן (תאים וpericytes אנדותל). בהרחבה יש לנו למדנו את פוטנציאל תכנות מחדש במבחנה של astroglia של cor המוחיטקס של עכברים לאחר לידה המוקדם 3-5. בחיפוש אחר מקורות תא דומה המתאימים לשושלת תכנות מחדש ישיר במוח האנושי הבוגר, נתקלנו באוכלוסיית תא שניתן לתכנות מחדש בהצלחה לכל הפרטים סימני ההיכר תערוכה של pericytes. כאן אנו מתארים פרוטוקול של איך לקצור את התאים האלה מביופסיות מוח אנושיות בוגרות, כדי להרחיב ולהעשיר את התאים האלה במבחנה, ובסופו לתכנת מחדש בהצלחה חלק ניכר במבחנת תאים מורחבים אלה (בטווח של 25-30%) לתוך תוספות. תכנות מחדש יכול להיות מושגת על ידי שיתוף ביטוי בתיווך רטרווירוס בו זמנית של שני גורמי שעתוק, Sox2 וascl1. PdiNs אלה נמצאו לרכוש את היכולת של ירי פוטנציאל פעולה חוזר על עצמו ועל מנת לשרת מטרות הסינפטי כלנוירונים אחרים המצביעים על היכולת שלהם להשתלב ברשתות עצביות. הפרוטוקול שלנו מספק הליך פשוט להמרת הבידוד ושושלת של pericytes המוח האנושי הבוגר לתוספות. </p&gt;

<table><tbody><tr><td>anti-CD140b-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>558821</td><td>להשתמש ב-1:100</td></tr><tr><td>anti-CD146-FITC</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA2141FT</td><td>להשתמש ב-1:100</td></tr><tr><td>anti-CD13-FITC</td><td>AbD Serotec</td><td>MVA1270A488T</td><td>להשתמש ב-1:100</td></tr><tr><td>anti-CD34-APC</td><td>BD Biosciences</td><td>560940</td><td>להשתמש ב-1:100</td></tr><tr><td>anti-PDGFR&beta;</td><td>איתות סלולרי</td><td>3169S</td><td>השתמש ב-1:200</td></tr><tr><td>אנטי-CD146</td><td>Abcam</td><td>Ab75769</td><td>השתמש ב-1:400</td></tr><tr><td>אנטי-NG2</td><td>Millipore</td><td>AB5320</td><td>השתמש ב-1:400</td></tr><tr><td>אנטי-SMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2547</td><td>השתמש ב-1:400</td></tr><tr><td>אנטי-ובטא; III-tubulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8660</td><td>השתמש ב-1:400</td></tr><tr><td>אנטי-MAP2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4403</td><td>השתמש ב-1:200</td></tr><tr><td>אנטי-GFAP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3893</td><td>השתמש ב-1:600</td></tr><tr><td>אנטי-GFP</td><td>Aves Labs</td><td>GFP 10-20</td><td>השתמש ב-1:1,000</td></tr><tr><td>אנטי-RFP</td><td>Chromotek</td><td>5F8</td><td>השתמש ב-1:500</td></tr><tr><td>אנטי-S100&beta;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532</td><td>השתמש ב-1:300</td></tr><tr><td>anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td>השתמש ב-1:200</td></tr><tr><td>anti-GABA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2052</td><td>השתמש ב-1:500</td></tr><tr><td>אנטי-קלרטינין</td><td>Millipore</td><td>AB5054</td><td>השתמש ב-1:500</td></tr><tr><td>anti-vGluT1</td><td>SYnaptic SYstems</td><td>135511</td><td>השתמש ב-1:1,000</td></tr><tr><td>חולדה IgG1 בקרת איזוטיפ FITC</td><td>AbD Serotec</td><td>11-4301-81</td><td>השתמש 1:100</td></tr><tr><td>חולדה IgG1 איזוטיפ בקרת PE</td><td>AbD Serotec</td><td>12-4301-81</td><td>השתמש 1:100</td></tr><tr><td>חולדה IgG1 בקרת איזוטיפ APC</td><td>AbD Serotec</td><td>17-4301-81</td><td>השתמש 1:100</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה, GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>61965</td><td></td></tr><tr><td>B27 תוסף תזונה ללא סרום</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>17504044 סרום עגל עוברי</td><td>Invitrogen</td><td>10106-169</td><td>לבצע השבתת חום על ידי דגירה בטמפרטורה של 56 מעלות; C למשך 30 דקות</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (תמיסת מלח מאוזנת של הנקס)</td><td>Invitrogen</td><td>24020-091</td><td></td></tr><tr><td>PBS של Dulbecco ללא CaCl2 ו-MgCl2 (D-PBS, 1x)</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine הידרוברומיד (PDL)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>PFA (פרפורמלדהיד)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P1648</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&פריים;,6-דיאמידין-2-פנילינדול) דילקטט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>042M4005</td><td></td></tr><tr><td>אקווה-פולי/ Mount</td><td>Polysciences</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>צינורות פוליפרופילן תחתונים עגולים&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>צינורות פוליסטירן תחתונים עגולים עם מכסה מסנן&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 24 בארות</td><td>5530305</td><td></td><td>תפוז מדעי</td></tr><tr><td>75 ס"מ2 צלוחיות תרבית</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>25 ס"מ2 צלוחיות</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>690175</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות חד פעמיות 10 מ"ל</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>פסטר זכוכית פיפטות (150 מ"מ)</td><td>פישרברנד</td><td>FB50251</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית בקוטר 12 מ"מ</td><td>מנזל</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr><tr><td>אזמל חד פעמי כירורגי&nbsp;</td><td>ב. בראון</td><td>5518083</td><td></td></tr><tr><td>כלים לתרבית רקמות&nbsp;</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>633180</td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 15 מ"ל</td><td>BD Biosciences</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>קולט אדים</td><td></td><td></td><td></td>זרימה למינארי</tr><tr><td>צנטריפוגה ורוטור מתנדנד עם מתאמים לצינורות 15 מ"ל ו-50 מ"ל</td><td>Hettich Lab Technology</td><td>1406</td><td></td></tr><tr><td>ממיין תאים ציטומטרי זרימה: FACSAria l עם תוכנת FACSDiva&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חממת תרבית תאים משופרת</td><td>Eppendorf Galaxy 170R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אמבט וואטר ב-37 מעלות; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSנוזל נדן&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי BX61</td><td>מיקרוסקופ אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קונפוקלי LSM710</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

שושלת תכנות מחדש של תאי שמקורם בpericyte של המוח האנושי למבוגרים לנוירונים מושרה

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

שושלת תכנות מחדש ישיר של תאים שאינם עצביים לנוירונים מושרה (INS) עשוי לספק תובנות לתוך המנגנונים המולקולריים שבבסיס נוירוגנזה ולאפשר אסטרטגיות חדשות לדוגמנות במבחנה או תיקון המוח החולה. סוגי זיהוי מוח שאינו תושב עצבי תא ניתנים להמרה ישירה לאח&quot;י עשויים לאפשר לשיגור גישה כזו באתרו, כלומר בתוך רקמת המוח הפגועה. כאן אנו מתארים פרוטוקול שפותח בניסיון של זיהוי תאים שמקורם במוח האנושי הבוגר כי למלא את הנחת יסוד זו. פרוטוקול זה כולל: (1) culturing של תאי אדם מקליפת המוח המתקבל מביופסיות מוח אדם בוגרות; (2) ההרחבה במבחנה (כ דורשת 2-4 שבועות) ואפיון של התרבות על ידי immunocytochemistry וזרימת cytometry; (3) להעשרה על ידי תא הקרינה המופעל מיון (FACS) באמצעות קולט-β נגד PDGF ונוגדנים נגד CD146;(4) התמרה בתיווך רטרווירוס עם השעתוק העצבי גורמי Sox2 וascl1; (5) ולבסוף האפיון של תאי העצב כתוצאה נגזרת pericyte המושרית (PdiNs) על ידי immunocytochemistry (14 ימים עד 8 שבועות הבאים התמרה retroviral). בשלב זה, תוספות יכולות להיות נחקר לתכונות חשמליות שלהם על ידי הקלטת התיקון-clamp. פרוטוקול זה מספק הליך שחזור מאוד להמרת שושלת במבחנה של pericytes מוח תושב לאח&quot;י האנושי מתפקד.

התוצאה הראשונה של פרוטוקול זה לאחר הקמת הצלחת תרבות מדגימה של אדם מבוגר קליפת מוח מורכבת בזיהוי ההרכב התאי של התרבות. Immunocytochemistry לחלבונים ספציפיים סוג התא מגלה מידה רבה של הטרוגניות בין התרבויות נובעות מדגימה של חולים שונים (איור 1 א). כלכמת ידי cytometry זרימה תמיד יש אחוז ניכר של תאים המבטאים PDGFRβ (בממוצע ~ 75%, החל 30 לעד 99%); סמנים אחרים של pericytes כגון CD146, NG2 וCD13 באים לידי ביטוי בדרך כלל בטווח תחתון (איור 1). כמו כן SMA בא...

מיקוד תאי מוח תושב לשושלת תכנות מחדש ישיר מציע נקודות מבט חדשות לתיקון מוח. כאן אנו מתארים פרוטוקול של איך להכין את התרבויות מועשרים עבור pericytes מוח תושב מהמבוגר קליפת המוח האנושית ולהמיר אותם לתאי עצב הנגרמים על ידי ביטוי בתיווך רטרווירוס של שעתוק גורמי Sox2 וAscl1.

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להפוך תאים המופקים מטפילים במוח אנושי לנוירונים מושריים. הדבר מושג על ידי בידוד וגידול של תאים המופקים מטפילים מתוך דגימות מוח כירורגיות. לאחר מכן, בעקבות הרחבה, התאים in vitro מסומנים אימונולוגית לסמנים טפיליים, דבר המאפשר את אפיון התאים ובסופו של דבר את העשרתם.לאחר מכן, תאים המופקים מטפילים מעוברי טרנסדוקציה באמצעות וקטורים רטרו-ויראליים המקודדים גורמים קובעי גורל נוירונלי, וזאת כדי להמיר אותם ישירות לנוירונים מושריים. התוצאות המתקבלות מראות נוירונים מושריים שהופקו מתאים המופקים מטפילים שעברו תכנות מחדש של השושלת התאית, על בסיס צביעה אימונולוגית למסמן הנוירונלי beta three tubulin. היתרון המרכזי של גישה זו על פני שיטות קיימות, כגון תכנות מחדש של פיברובלסטים או גילוי של תאי גזע עובריים לנוירונים, הוא שאנו פונים לתאים אנדוגניים במוח, דבר שעשוי בסופו של דבר לסלול את הדרך להמרה ישירה של השושלת התאית בתוך המוח, ללא צורך בהשתלת תאים.פרוטוקול זה פותח בהתאם לאישור של הוועדה לאתיקה של הפקולטה לרפואה ב-LMU Munich ובסכמה מודעת בכתב מכל המטופלים, החל מביופסיה טרייה של מוח אנושי. שמרו על קרח ב-HBSS ולהמשך פירוק הרקמה לתאים בודדים, העבירו אותה לצלחית פטרי בקוטר 65 מילימטר ובאמצעות שני סקלפלים סטריליים לשימוש חד-פעמי, קצצו את הרקמה לחתיכות קטנות. העבירו את הרקמה למבחנה קונוית של 15 מיליליטר והוסיפו שלושה עד שישה מיליליטר של tryple; דגרו למשך 15 עד 30 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius במקלח מים.לאחר תגובת העיכול, הוסיפו נפח אחד של מצע גידול שחומם מראש כדי להקל על ההתחברות, והשתמשו בפיפט חד-פעמי של חמישה מיליליטר ואחריו בפיפט פסטור מזכוכית כדי לערבב בעדינות את תרחיף התאים. סבבו את התמיסה ב-157 Gs למשך חמש דקות. השביחו מחדש את המשקע במצע גידול והעבירו את התרבית לבקבוק T 75.דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide ו-5% oxygen. החליפו מחצית מהמדיום בכל שלושה עד ארבעה ימים, עד שהתאים יגיעו לקונפלואנס. כאשר התאים הגיעו לקונפלואנס, שאבו את מדיום התרבית ושטפו ב-PBS בטמפרטורת החדר לפני הוספת 3 mL של tryple.לאחר דגירה של 5 עד 10 דקות ב-37 °C, הקישו בעדינות על הבקבוק כדי לסייע בניתוק התאים. לאחר מכן, סובבו את התרחיף במערך צנטריפוגה, השתמשו בשלושה נפחים של מצע גידול כדי לשטוף ולתרחף מחדש את התאים, והעבירו אותם ביחס של 1:3 לבקבוקי תרבית T 75 חדשים לקבלת תפוקה אופטימלית.התאים הועברו עד חמישה מעברים ללא כל סימן להפחתה בתהליך התכנות מחדש, ומספר התאים האנדותליאליים יהיה זניח עם כל מעבר. לצורך ביצוע אימונו-ציטוכימיה, זרעו כ-60,000 תאים על כיסויי זכוכית מצופים ב-poly D lysine, ב-500 µL של מצע גידול טרי בלוחיות תרבית רקמה בעלות 24 בארות, והדריכו אותם.יש להדגיר את התאים למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide ו-5% oxygen. לצורך ניתוח אימונוכימי של תאי המוח האנושיים שהגדלו, יש להסיר את המצע ולשטוף שלוש פעמים עם 1 mL של PBS. יש להוסיף 500 µL של 4% paraldehyde ב-PBS ולהדגיר למשך 15 דקות.בטמפרטורת החדר. העבירו את כיסויי הזכוכית לתא צביעה לח ומותאם והוסיפו 80 µL של P-B-S-B-S-A Triton X 100 block למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, לפני הוספת נוגדנים ראשוניים המדוללים באותו תמיסה ודגירה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר או למשך הלילה בטמפרטורה של 4 °C. השתמשו ב-PBS לשטיפת התאים שלוש פעמים לפני הוספת נוגדנים שניוניים ודגירה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.לאחר שלושה שטיפות, יש להוסיף תמיסת מניעת דהייה (anti fading medium) ולהניח זכוכית כיסוי. השתמשו במיקרוסקופיה פלואורסצנטית (epi fluorescence) או במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לנתח את הדגימות. הקפידו על הנחיות בטיחות ביולוגית מקומיות בעת טיפול בחלקיקי רטרו-וירוס. 24 שעות לפני התעתוק הרטרו-ויראלי, זרעו כ-60,000 תאים למעלה.הסבירו זכוכית מצופה poly-D-lysine ב-500 µL של מצע גידול טרי בתוך פלטות תרבית רקמה בעלות 24 בארות, והדגירו בטמפרטורה של 37 °C. למחרת.החליפו את מצע הגידול ב-500 µL של מצע גידול טרי שחומם מראש, והוסיפו 1 µL של העל-נוזל (supernatant) המרוכז המתאים המכיל חלקיקי רטרו-וירוס. נערו בעדינות את הפלטה כדי להבטיח פיזור אחיד של החלקיקים הוויראליים בכל באר. לאחר יום אחד, הסירו מהתאים את המצע עם החלקיקים הוויראליים והוסיפו 1 mL של מצע טרי שחומם מראש.מדיום דיפרנציאציה B 27 כפי שפורט בפרוטוקול הטקסט, שמרו את התאים בתרבית למשך ארבעה עד שמונה שבועות ללא החלפת המדיום, שכן פעולה זו עלולה להזיק לנוירונים המושרים בעודם מבשילים כדי להדגים את רכישת הפנוטיפ הנוירונלי. בצעו אימונו-ציטוכימיה כנגד אנטיגנים נוירונליים כגון beta three tubulin, map two ו-nen. כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה, אימונו-ציטוכימיה שבוצעה על תרביות שהוקמו בהצלחה מקליפה מוחית של מבוגרים בני אדם מגלה מידה ניכרת של הטרוגניות בין תרביות שנגזרו מדגימות של מטופלים שונים, כפי שקוונטה על ידי ציטומטריה של זרימה.קיים חלק ניכר של תאים המבטאים P DG FR beta, בעוד שסמנים אחרים של טפילים כגון CD 1 46, NG two ו-CD 13 מובעים ברמות נמוכות יותר. באופן דומה, SMA מובע בתת-אוכלוסייה קטנה של תאים בתרבית במעבר אפס; בדרך כלל ישנם פחות מ-10% של תאי אנדותל חיוביים ל-CD 34, והם יורדים מתחת לסף הגילוי עם מעברים נוספים. בדומה לכך, אסטרוציטים מהווים רק זיהום זניח במעברים מוקדמים יותר.נתונים אימונו-פיטוכימיים ונתוני ציטומטריית זרימה מאוששיםים באופן מלא על ידי R-T-P-C-R-A כמותי. ניתן להשיג העשרה נוספת של תאים שמקורם בטפיל באמצעות מיון בשלב זה. דבר זה רלוונטי במיוחד כאשר טוהר התרבית נמצא בקצה הנמוך של הספקטרום, כפי שמשתקף ברמת הביטוי של P-D-G-F-R beta.לפיכך, השתמשנו בנוגדן נגד P-D-G-F-R beta CD one 40 B לבדו או בשילוב עם נוגדן anti CD 1 46, תוך החראת זיהומים חיוביים ל-CD 34 באמצעות מיון תאים (FACS). באופן ספציפי, העברה של וירוסי בקרה לתרביות אלו לא שינתה את פרופיל הביטוי שלהן, מה שמעיד על כך שהן נשארות בשושלת הפרסית (parasite lineage). בדומה לכך, ביטוי של SOX two בלבד בתיווך רטרו-וירוס לא גרם לשינויים במורפולוגיה ולא השרא ביטוי של beta three tubulin.לעומת זאת, כ-10% מהתאים שהועברו להם רטרו-וירוס המקודד עבור A SCL one בלבד, מראים ביטוי של beta three tubulin, אך אינם מקבלים מורפולוגיה נוירונלית. באופן בולט, כמעט 50% מכל התאים שהועברו להם So two ו-A SCL one יחד, מראים ביטוי של beta three tubulin, ושליש מהם מציגים גם תהליכים נוירונליים, המעידים על המרת גורלם ל-PNS בעקבות הליך זה.ניתן להשתמש בטכניקות אחרות, כגון אלקטרופיזיולוגיה של patch clamp, כדי לבחון שאלות נוספות הנוגעות להבשלה ולתפקוד של נוירונים מושריים.

lineage-reprogramming-pericyte-derived-cells-adult-human-brain-into

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

ראשוני, תאים אנושיים עובריים מופקים ממוח, multipotential progenitor...

מערכת מוליד-נגזר Oligodendrocyte תרבות ממוח העוברי של אדם

סרטון זה מדגים תכנות מחדש ישיר של תאי אב המטופויטיים מהונדסים גנטית לתאי גזע עצביים. גורמי שעתוק המבוטאים על ידי תאי אב המטופויטיים מעוררים שרשרת של אירועים מולקולריים המאפשרים את טרנספורמציה. מדיה ספציפית נוספת משמשת לבחירה ולגידול של תאי גזע עצביים מושרים.

תכנות מחדש ישיר של תאי אב המטופויטיים לתאי גזע עצביים

סרטון זה מדגים את תהליך התמיינות תאי אב עצביים מושרים (iNPCs) לנוירונים ואסטרוציטים באמצעות מדיה מיוחדת.

התמיינות תאי אב עצביים מושרים לאסטרוציטים

הסרטון מדגים את יצירת תאי העצב מפיברובלסטים עוריים אנושיים בוגרים (aHDFs). ה-aHDFs מתוכנתים מחדש באמצעות וקטור לנטי-ויראלי הנושא גנים עבור גורמי שעתוק עצביים ו-RNA קצר סיכת שיער (shRNAs). ה-shRNAs מעכבים את הביטוי של מדכא שעתוק עצבי, וגורמי השעתוק העצבי מפעילים גנים כדי להתמיין aHDFs לנוירונים. aHDFs מתוכנתים מחדש אלה מתורבתים במדיום המרה עצבי מוקדם ומאוחר כדי ליצור נוירונים בוגרים.

יצירת תאי עצב על-ידי תכנות מחדש של תאי פיברובלסט עוריים אנושיים

דור של תאי גזע pluripotent מושרה מספק סיכויים מרתקים לגזירה של השתלות אוטולוגית. עם זאת, ההתקדמות במדינת pluripotent מחדש בידול מייגע עדיין מעכבת תרגום קליני. כאן אנו מתארים את הגזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה הישירה שלהם לתאים עצביים מושרה ובידול שלאחר מכן לשושלות עצביות.

גזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה ישירה שלהם לתאים להרחבה עצבי אב

הדמיה חיה הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור התנהגויות הסלולר בזמן אמת. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור זמן לשגות וידאו-מיקרוסקופיה של קליפת המוח ראשי תאים המאפשרת בדיקה מקיפה של השלבים שחוקקו במהלך ההתקדמות שושלת היוחסין מתאי גזע עצביים העיקרי נוירונים הבדיל, עכשיו, דונלד.

חיים הדמיה של קליפת המוח ראשי תאים באמצעות מערכת תרבות 2D

פרוטוקול חזקים כדי לפקח אוכלוסיות עצבית על ידי זמן לשגות וידאו-מיקרוסקופיה ואחריו-מבוססות תוכנה שלאחר עיבוד מתואר. שיטה זו מייצגת כלי רב עוצמה לזיהוי אירועים הביולוגי בקרב אוכלוסיה הנבחר במהלך הניסויים הדמיה בשידור חי.

חיים הדמיה ואחריו תא בודד מעקב צג Cell Biology, ההתקדמות שושלת היוחסין של אוכלוסיות עצבית מרובים

התכנות עצביים ישיר יוצרת הנוירונים זה לשמור על הגיל לתא ההתחלה סומטיים. כאן, אנו מתארים שיטה המבוססת על וקטורים יחיד לייצר נוירונים המושרה fibroblasts עורי שהושג מתורמים האנושי למבוגרים.

דור פשוטה של תרבות תשואה גבוהה של נוירונים המושרה מ Fibroblasts עור מבוגר

הפרוטוקול מציג את התיכנות מראש של תאים היקפיים דם מונפקוף כדי לגרום לתאי גזע עצביים על ידי זיהום וירוס סנדאי, הבידול של iNSCs לתוך הנוירונים הפראים, השתלת ה-DA מקדים לתוך מגירסה חד צדדית מחלת פרקינסון מודלים העכבר, והערכה של הבטיחות והיעילות של הקדם-הלאומית של התובע המחוזי עבור טיפול PD.

דור של תאי גזע עצביים מתוך היקפי תאים מונמונומנט ובידול לכיוון תא העצב הפראמינרגיים ללימודי השתלות

אנו מתארים פרוטוקול לתכנת מחדש פיברובלסטים אנושיים שמקורם בעור לתאי אב עצביים המושרים (iNPCs), ואת הבידול הבא שלהם לאסטרוציטים המושרים (iAs). שיטה זו מובילה לייצור מהיר וניתן לשחזור של iNPCs ו- iAs בכמויות גדולות.

אין ויטרו מידול למחלות נוירולוגיות באמצעות המרה ישירה מפיברובלסטים לתאי אב עצביים ובידול לאסטרוציטים

היכולת לסמן באופן קבוע תאי גזע וצאצאיהם באמצעות פלואורופור באמצעות קו עכברים מהונדס בלתי ניתן להשראה מאפשרת ניתוח מרחבי וזמני של הפעלה, התפשטות, נדידה ו/או התמיינות in vivo. מעקב אחר שושלת יכול לחשוף מידע חדש על מחויבות לשושלת, תגובה להתערבויות ורב-תחומיות.

מעקב אחר שושלת של תאי גזע בעלי תווית פלואורסצנטית אינדוקטיבית במוח העכבר הבוגר

למד שיטה להמרת תאי pericyte ממוח אנושי למבוגרים לנוירונים מושרים באמצעות וקטורים רטרו-ויראליים. גישה זו מאפשרת המרת שושלת ישירה ללא השתלה ומציעה פוטנציאל לתיקון מוחי.

שושלת תכנות מחדש של תאי שמקורם בpericyte של המוח האנושי למבוגרים לנוירונים מושרה

גלה סרטונים נוספים