קביעת הפעילות של תנועה הספונטנית ב
10 באפריל 2014
תסיסנית שימושית בלומדת מניפולציות גנטיות או סביבתיות המשפיעות על התנהגויות כמו פעילות של תנועה ספונטנית. כאן אנו מתארים פרוטוקול אשר מנצל צגים עם קרניים אינפרא אדומות ותוכנות לניתוח נתונים לכמת פעילות של תנועה ספונטנית.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לכמת פעילות מוטורית ספונטנית של זבובים פירות. מטרה זו מושגת תחילה על ידי איסוף והזקנה של זבובים ניסוייים. השלב השני הוא הגדרת מוני אוכלוסייה בתוך אינקובטור בבקרת טמפרטורה והורדת התוכנה המתאימה.
בשלב הבא, הזבובים מועברים לבקבוקוני זכוכית ולאחר מכן ממוקמים בתוך מסכי ניטור אוכלוסייה שבהם מופעלים מסכי ניטור הפעילות. השלב הסופי הוא ניתוח הנתונים. בסופו של דבר, מסכי ניטור אוכלוסייה משמשים להצגת הבדלים בפעילות פיזית ספונטנית של זבובים.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון negative geo axis, הוא שהיא מאפשרת תיעוד רציף, פשוט, אמין ואובייקטיבי של פעילות גופנית ספונטנית של אוכלוסיות זבובים מרובות. שיטה זו יכולה לסייע לנו לקבוע כיצד מניפולציות שונות משפיעות על הזבובים. את הפעילות הגופנית הספונטנית המדגימה את הפרוצדורה תבצע Suzanne Kowski, עוזרת מעבדה ממעבדה. כדי להתחיל, הכינו מזון בהתאם לשלבים המפורטים בפרוטוקול הטקסט המצורף והניחו לו להצטנן תוך ערבוב קבוע על פלטה חשמלית.
העבירו מנה של חמישה מיליליטרים של מזון לכל מבחנה זכוכית צרה, וודאו שכמות המזון נמוכה מהטבעת התחתונה של האוכלוסייה. המתינו עד שהמזון יתקרר לטמפרטורת החדר. סגרו את המבחנות עם פקקי ספוג ושמרו אותן בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים.
יש לחמם את המבחנות לטמפרטורת החדר לפני השימוש. לאחר מכן, גדלו זבובים מסוג Canton S במבחנות פלסטיק עם מזון מעבדה סטנדרטי. שמרו את המבחנות בתא בעל בקרת טמפרטורה ולחות ב-25 degrees Celsius במחזור של 12 שעות אור וחושך.
הסר את הזבובים הבוגרים מהמבחנות בבוקר. לאחר מכן, הפרד את הזבובים שזה עתה נסגרו לפי מין באמצעות פד פחמן דו-חמצני תוך שמונה שעות מהבקיעה כדי להבטיח שהזבובים הנקבות הן בתולות. הכן 10 מבחנות של זבובים הורים על ידי הנחת זכר ונקבה בתולים בני חמישה עד 10 ימים.
זבובים בבקבוקון מזון סטנדרטי עם מספר גרגירי שמרים. יש להחזיק את הזבובים באינקובטור בטמפרטורה של 25 °C עם מחזור אור-חושך של 12 שעות למשך יומיים. יש להעביר את הזבובים לבקבוקון פלסטיק חדש מדי יומיים ולהחזיק את הבקבוקונים עם הביצים שהופקו באינקובטור בטמפרטורה של 25 °C.
לאחר מכן, יש להסיר ולהשליך את הזבובים שבגרו במהלך היום הראשון ולהחזיר את המבחנות לאינקובטור כדי לאסוף אוכלוסיית זבובים מסונכרנת יותר ביום השני. לאחר מכן, על גבי משטח פחמן דו-חמצני, אסוף במהירות 25 זבובים זכרים ו-25 זבובים נקבות לכל מבחנה בעזרת כף מתכת בתוך 24 שעות. רשום את יום ה-ELO על המבחנה.
הכינו לפחות חמישה מבחנות שכפול לכל קבוצה. עבור הקבוצות הניסיוניות וקבוצות הביקורת. שמרו את המבחנות בתאים סביבתיים בבקרת טמפרטורה של 25 °C עם מחזור אור-חושך של 12 שעות.
העבירו את הזבובים לבקרי פלסטיק חדשים מדי יומיים למשך 10 ימים. באמצעות משפך, מקמו את מדדי האוכלוסייה באינקובטור בעל בקרת טמפרטורה. לאחר מכן, חברו כל מדד באמצעות כבל טלפון בעל ארבעה גידים ליחידת ממשק אספקת הכוח (PSIU) באמצעות מפצל חמישי.
לאחר מכן, חברו את כבל הטלפון ל-PSIU. חברו את ה-PSIU לשקע חשמל של 100 עד 240 וולט, וחברו את מחבר המוצא של ספק הכוח לאחד מחיבורי ה-PSIU התואמים. לאחר מכן, הורידו את תוכנת ה-USB המשמשת את ה-PSIU ליצירת קישור נתונים בין תוכנית המחשב לבין ה-PSIU ומגשרי הפעילות.
הפעל את התוכנה. לאחר מכן, תחת הגדרות (preferences), בחר בפורט הטורי PSIU עבור Macintosh.
לאחר מכן, בחרו את מרווח הקריאה. בשלב הבא, בחרו את המדדים לפי מספר היצרן הייחודי שלהם. בחרו את טווח המדדים התואם למספרים שהוקצו למדדים.
ודאו שכל המסכים מחוברים כראוי על ידי בדיקת הנורה הירוקה. נורה אדומה מעידה על כך שהחיבור אבד. תיבה שחורה מעידה על כך שהמערכת כבויה או שחיבור ה-USB לא בוצע כראוי.
הפרידו זבובים זכרים ונקבות בני אותו גיל. על פד עם פחמן דו-חמצמני, העבירו 10 זבובים זכרים ו-10 זבובים נקבות לבקבוקוני זכוכית נפרדים בטמפרטורת החדר.
השתמשו בלפחות שלושה מבחנות עבור כל קו ניסויי וביקורת, ועבור כל מין של זבובים, השאירו את המבחנות על צדן עד שהזבובים יתאוששו מהפחמן הדו-חמצני כדי להבטיח שהם לא ייתקעו במזון. השאירו אותם למשך שעתיים בטמפרטורת החדר כדי להתאושש מהפחמן הדו-חמצני. לאחר מכן, הניחו את המבחנות בתוך האוכלוסייה.
שמרו את המדגריות בתוך האינקובטורים. העבירו את הזבובים למבחנות חדשות לאחר שלושה או ארבעה ימים כדי למנוע את התייבשות המצע. בסיום הניסוי, סרקו את הנתונים כדי להסיר קריאות כפולות ולהבטיח שהרישומים מלאים.
בעזרת סריקת קובץ של 110 x, בחרו את הרווח לאיסוף נתונים והשליכו את הנתונים שנאספו במהלך 24 השעות הראשונות בפרק הזמן שנבחר. התוכנה תשלח למחשב את הספירה הכוללת הנוכחית עבור כל מדד ותתחיל לספור שוב מאפס. לאחר מכן, בחרו שם לניסוי והעתיקו את הקבצים מתיקיית הנתונים במחשב כדי לשמור את הנתונים.
התחילו את ניתוח הנתונים על ידי העתקה מדויקת של הנתונים שנאספו מקבצי הטקסט לעמודות בגיליונות אלקטרוניים של Excel. לאחר מכן, חשבו את הפעילות הכוללת בפרק זמן רצוי עבור כל מדד, המייצגת את סכום הפעילות שנאספה משלושה גבהים שונים של קרני אינפרה-אדום. לבסוף, קבעו את ממוצע הפעילות המוטורית ואת סטיית התקן בין שלושת המדדים המייצגים שלושה חזרות ביולוגיות באמצעות מבחן t של Student דו-זנבי.
פעילות מוטורית ספונטנית ב-drosophila תלויה במין הזבב ובמחזור האור-חושך. כפי שמוצג בגרף זה של הפעילות הממוצעת של זבובים זכרים ונקבות, החץ מסמן את המעבר מאור לחושך. במקום שבו נצפית ירידה בפעילות, הפעילות הכוללת של זבובים זכרים בני 20 יום עולה כאשר הזבובים מקבלים מחצית מכמות המזון הסטנדרטית בתזונה דלה בקלוריות, בהשוואה לפעילות המופחתת של זבובים בתזונה עשירה בקלוריות.
לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו ניתן לקבוע את הפעילות הפיזית הספונטנית של drosophila. שיטה זו מסייעת לקבוע כיצד מניפולציות גנטיות או סביבתיות שונות משפיעות על פעילות הזבובים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה לכימות פעילות מוטורית ספונטנית ב-Drosophila melanogaster. באמצעות שימוש במסכי קרן אינפרה-אדום ותוכנה לניתוח נתונים, חוקרים יכולים למדוד ביעילות את הפעילות הפיזית של זבובים פירות תחת תנאים מבוקרים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי מוח
- ביולוגיה התנהגותית
- גנטיקה
רקע
- Drosophila melanogaster משמשת כאורגניזם מודל לחקר התנהגות.
- הבנת הפעילות המוטורית יכולה לספק תובנות לגבי השפעות גנטיות וסביבתיות.
- טכנולוגיית ניטור באינפרא-אדום מאפשרת מעקב מדויק אחר הפעילות.
- ניתוח נתונים הוא חיוני לפירוש דפוסי תנועה מוטורית.
מטרת המחקר
- לכימות פעילות מוטורית ספונטנית בזבובים.
- להערכת ההשפעה של גורמים גנטיים וסביבתיים על ההתנהגות.
- לספק פרוטוקול סטנדרטי עבור חוקרים בתחום.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף והזקנה של זבובים ניסיוניים מסוג Drosophila melanogaster.
- הקמת מסכי מעקב אחר אוכלוסיות בתוך דגרה בבקרה תרמית.
- העברה של זבובים לבקבוקוני זכוכית לצורך ניטור.
- הפעלת מסכי פעילות וניתוח הנתונים שנאספו.
תוצאות עיקריות
- ניטור אוכלוסיות מאפשר כימות יעיל של הבדלים בפעילות מוטורית.
- ניתוח נתונים חושף תובנות לגבי רמות של פעילות גופנית ספונטנית.
- התוצאות יכולות להנחות מחקרים עתידיים על התנהגות וגנטיקה.
- הפרוטוקול ניתן לשחזור וניתן להחלה על הגדרות ניסיוניות שונות.
מסקנות
- שיטה זו מספקת גישה מהימנה לחקר פעילות מוטורית בזבובי פירות.
- הבנת התנהגויות אלו יכולה להעמיק את הידע על אינטראקציות גנטיות וסביבתיות.
- ניתן להתאים את הפרוטוקול לצרכי מחקר שונים בתחומי מדעי המוח והביולוגיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות פעילות מוטורית ספונטנית ב-Drosophila melanogaster מספק מדד אובייקטיבי וניתן להרחבה להערכת השפעות גנטיות וסביבתיות על התנהגות, ובכך תומך בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים במחקרים של מדעי המוח ומחלות מטבוליות. שיטה זו מאפשרת הפחתת סיכונים מכנית על ידי קישור פלטיים פנוטיפיים לוויסות מסלולים, ובכך מעניקה ביטחון חזוי בתהליכי זיהוי מובילים. יכולת השחזור שלה ויכולת הניטור הרציף ממצבים אותה כפלטפורמת סמן ביולוגי תרגומית לתיקוף מודלים פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות מדידת פעילות גופנית ספונטנית כמדד תפקודי לשלמותם של מסלולים עצביים ומטבוליים.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות כימות אובייקטיבי ורציף של התנהגות מוטורית תחת תנאים גנטיים וסביבתיים שונים.
- ערך ניבוי: מסייע במיון תיקי תרופות על ידי זיהוי תרכובות או מניפולציות גנטיות המשנות באופן משמעותי את דפוסי הפעילות, דבר המעיד על מעורבות המטרה (target engagement).
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לסריקות המשך, על ידי קביעת פרופילי פעילות מוטורית בסיסיים תחת תנאים מבוקרים.
- שחזוריות: מספק פלטים כמותיים וסטנדרטיים באמצעות ניטור קרני אינפרא-אדום, מה שמאפשר הערכה מהימנה של תרכובות לאורך חזרות.
- סקביליות: תומך בניטור מקבילי של מספר מבחנות להערכה בתפוקה גבוהה של התערבויות פרמקולוגיות או גנטיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה מצבים של מחלות אנוש על ידי הערכת שינויים במוטוריקה במניפולציות גנטיות המדמות הפרעות נוירולוגיות או מטבוליות.
- המשכיות תרגומית: מקשרת בין פנוטיפים התנהגותיים בשלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני באמצעות מדדי פעילות עקביים וכמותיים.
- החלטות מותאמות סיכון: מספקת מידע עבור קריטריונים של קידום על ידי הקשר בין שינויים בפעילות לבין מודולציה של המטרה, ובכך מפחיתה תוצאות חיוביות כוזבות באופטימיזציה של המולקולות המובילות.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline) וזרימה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות לגבי מטרות, דרך זיהוי מובילים ועד לתיקוף פרה-קליני, ומספקת נקודת סיום התנהגותית המגשרת בין תובנה מכניסטית לתוצאה פנוטיפית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בהבהרת מסלולים ובתיקוף מטרות על ידי כימות השפעת שינויים גנטיים או תרופתיים על תפוקת תנועה ספונטנית.
- סריקה: מאפשרת סטנדרטיזציה ושחזור של בדיקות באמצעות מעקב רציף ורב-פרמטרי אחר פעילות ב популяציות של זבובים.
- אנליזה: מייצרת מדידות כמותיות של משתנים תלויים (פעילות כוללת, סטיית תקנית) המאפשרות השוואה סטטיסטית של תנאי ניסוי באמצעות ניתוח t-test.
- מחקר תרגומי: תואמת לפיתוח סממנים ביולוגיים על ידי קישור שינויים בפעילות מוטורית להפרעות גנטיות או מטבוליות בבסיסן, הרלוונטיות למודלים של מחלות אנוש.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמה רב-פעמית לסריקה התנהגותית הניתנת ליישום בפרויקטים מרובים במחקרי מדעי העצב, מטבוליזם והזדקנות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באמצעות מדידה ישירה של פעילות פיזית ספונטנית כעגן פנוטיפי.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ושחזוריות באמצעות ניטור תכוף מכויל ותהליכי עבודה מוגדרים לניתוח נתונים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות המשך (go/no-go) על ידי אספקת נתונים התנהגותיים כמותיים מוקדמים, המפחיתים את שיעור הנשירה הביולוגית בשלבים מאוחרים.
- השפעה על תיק הפרויקטים: מאפשר תעדוף מותאם סיכון על ידי זיהוי התערבויות בעלות השפעות משמעותיות ושחזירות על תפוקת הלוקומוטוריקה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ב-Drosophila, בהקמת מערכי בדיקה התנהגותית ובמערכות ניטור באינפרא-אדום.
- תלוי במכשירי ניטור אוכלוסין, ממשק PSIU, אינקובטורים בעלי בקרת טמפרטורה ותוכנה לרכישת נתונים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הזדקנות הזבובים, הפרדה לפי מין והכנת מבחנות.
- כולל שיקולי התאמה לרקעים גנטיים שונים, תנאי תזונה וטיפולים פרמקולוגיים.
- כולל מגבלות מעשיות כגון התייבשות המזון עם הזמן והצורך בהעברות תקופתיות של הזבובים למבחנות חדשות כדי לשמור על שלמות הנתונים.
