Name: ScanLag: כימות תפוקה גבוהה של המושבה צמיחה ולג בזמן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: למדו את שיטת ScanLag לכימות זמן לג וקצב צמיחה במושבות חיידקים באמצעות סריקת תמונות בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת זיהוי וריאנטים איטיים בתרביות הטרוגניות ומסייעת באבחון זיהומים מתמשכים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לאליק אוסטר על התמונות של החיידק הסבטיליס. העבודה נתמכת על ידי המועצה האירופית למחקר (# 260871) והקרן הלאומית למדע (#592/10).

1. לבנות ההתקנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר סורק עם רזולוציה אופטית: 4,800 dpi; רזולוציה חומרה: 4,800 x 9,600 dpi; עומק צבע קצת: 48 ביט, שיכול לפעול ברמות טמפרטורה והלחות הרלוונטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש צלחות פטרי בהיקף משמעותי, בניגוד לנייר משמש בדרך כלל על סורקים מסחריים. המושבות לשכב על גבי השכבה אגר, כ 5 מ&quot;מ מעל פני השטח של הסורק. הערה: עבור רוב סורקי המושבות תהיה בפוקוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חברות סורק מסוימות אינן מאפשרות חיבור של יותר ממופע אחד של סורק מאותו הסוג לאותו מחשב. ודא שסורק יותר מאחד יכול להיות מחובר ומזוהה באופן ייחודי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את האביזרים כמפורט להלן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיסות שחורות סטרילי להכין הרגישו בד כדי לכסות את הצלחות (איור 1 שלב 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להחזיק את צלחות פטרי במקום, להכין מחזיקי לבנים צלחת (חומרים ושיטות) שמתאימים סורקים ושיש להם 6 חולes בגודל של המנות (איור 1 שלב 3). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת הצורך לצמיחה של מיקרואורגניזם, לשים את הסורקים בסביבה מבוקר טמפרטורה. חבר את הסורקים למחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: חיבור הממסר למחשב ולעקוף את מתג הפעלה / כיבוי של הסורק כדי להתגבר על שיפוע טמפרטורה. הערה: יחידת הממסר למיקרואורגניזמים מאוד רגישה לטמפרטורה. זה מכבה את הסורק כך שהאלקטרוניקה לא לחמם את פני השטח בצורה לא אחידה. שימוש רק בחלק ממשטח הסורק יכול להשיג תוצאות דומות. </li></ol> 2. התקן את מנהל הסריקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העתק את כל קבצי היישום &#39;סריקת מנהל&#39; לתוך ספרייה ייעודית מhttp://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications.html. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את תצורת קובץ ScanningManager.exe.config לפי שמות הסורקים כפי שהם מופיעים בניהול-&gt; מנהל-&gt; התקני הדמיה מכשיר למחשב ( <strong&gt; איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתרון בעיות של היישום &#39;מנהל סריקה&#39;, לראות את לקרוא לי קובץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתיעוד נוסף על היישום &#39;מנהל סריקה&#39;, ראה Documentation.html. </li></ol> 3. לבצע ניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את צלחות פטרי (איור 1): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את התרבות לכ -2,000 CFU / מיליליטר. פלייט 0.1 מיליליטר של התרבות אחידה על פני השטח הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבל קונטרסט טוב בין המושבות והצלחת ולספוג לחות, מכסה את הצלחת עם חתיכה השחורה סטרילי הרגיש בד. שים את המכסה על הצלחת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחות במחזיקים בסורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מנהל הסריקה (איור 3): בחר את הסורקים משתתפים מהרשימה של סורקים מצורפים. בחר את מספר התמונות שיש לנקוט (חזרות), מרווח הזמן בין התמונות הבאות (פער זמן), ועיכוב הזמן לפני שמתחיל tהוא להתנסות (התחל אחרי). </li></ol> 4. ניתוח של תמונות הערה: קווי המתאר של שיטות חישוביות מסופקים לניתוח התמונות בMATLAB באמצעות &quot;ScanLag&quot;, שהוא זמין באופן חופשי לשימוש לא מסחרי בhttp://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications. html. פונקציות נוספות זמינות מפורטות בתוכנה ידנית, וקוד דוגמא הוא בתוספת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין את התמונות מסורק בתיקיות נפרדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות החלון הפקודה של Matlab, הפעל את הנהלים הבאים. הפרמטרים הנדרשים כדי להפעיל נהלים אלה מוגדרים בתוכנה ידנית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל PreparePictures לבצע עיבוד מקדים: בעיבוד מקדים, תמונות מסורק מיושרות. בכל צלחת פטרי תיחתך מרצף של תמונות. הזמן שבו כל תמונה נאספה מאוחזר מחותמת הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TLAllPlates להפעיל כדי לבצע זיהוי ומעקב בדוארצלחת פטרי אח בנפרד, מושבות זוהו והוקצתה מספר זיהוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח של הנתונים שחולצו: הגדלים של כל מושבה זוהתה נמדד כפונקציה של זמן. כדי לחלץ את הפצת ההופעה של המושבות להשתמש בפונקציות הבאות בחלון הפקודה של Matlab (מידע נוסף זמין בתוכנה הידנית): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ScanLagApp כדי להציג את הניתוח של צלחת פטרי לצד מסוימת בגרף של מושבות גודל לעומת זמן (איור 4). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במחוון כדי לשנות את השעה הנוכחית של הצלחת. גם העיתוי יהיה מצויינים על ידי קו אנכי התאמה על גרף אזור מושבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על מושבה כדי לראות העקומה הקשורים אליו, ולהיפך, לחץ על עקומה למצוא המושבה הקשורים אליו. לאחר שזיהה את המושבה, הפנוטיפ יכול להאסף על ידי לקטוף את המושבה מצלחת פטרי שזוהתה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פגמים סינון בניתוח האוטומטי על ידי צ&#39;ולשיר מושבה ולחיצה על לחצן שלא לכלול. כאשר לחיצה להוציא את המספר של המושבה תהפוך צהובה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שעובר את התוצאות של הניתוח של כל צלחת, לסכם את התוצאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל AddHistograms ליצור היסטוגרמה של זמני מראה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל plotDeathCurve ליצור ייצוג עקומת הישרדות של ההפצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל GetAppearanceTimes כדי לקבל את זמן ההופעה של כל המושבות בניסוי. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Bochner, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+phenotypic+characterization+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Global phenotypic characterization of bacteria.</a> FEMS Microbiol Rev. 33, 191-205 (2009).</li>
<li>Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growth+of+bacterial+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The growth of bacterial cultures.</a> Annual Reviews in Microbiology. 3, 371-394 (1949).</li>
<li>Penfold, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Nature+of+Bacterial+Lag%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hyg+%28Lond%22%5BJournal%5D)">On the Nature of Bacterial Lag.</a> J Hyg (Lond. 14, 215-241 (1914).</li>
<li>Powell, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+rate+and+generation+time+of+bacteria%2C+with+special+reference+to+continuous+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growth rate and generation time of bacteria, with special reference to continuous culture.</a> J Gen Microbiol. 15, 492-511 (1956).</li>
<li>Elfwing, A., LeMarc, Y., Baranyi, J., Ballagi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+growth+and+division+of+large+numbers+of+individual+bacteria+by+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Observing growth and division of large numbers of individual bacteria by image analysis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70, 675-678 (2004).</li>
<li>Hertog, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+automated+image+analysis+for+detection+and+phenotyping+of+Mycobacterium+tuberculosis+on+porous+supports+by+monitoring+growing+microcolonies%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Simplified automated image analysis for detection and phenotyping of Mycobacterium tuberculosis on porous supports by monitoring growing microcolonies.</a> PloS one. 5, (2010).</li>
<li>Levin-Reisman, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+imaging+with+ScanLag+reveals+previously+undetectable+bacterial+growth+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated imaging with ScanLag reveals previously undetectable bacterial growth phenotypes.</a> Nature Methods. 7, (2010).</li>
<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persister+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+microbiology%22%5BJournal%5D)">Persister cells.</a> Annual review of microbiology. 64, 357-372 (2010).</li>
<li>Metris, A., George, S. M., Baranyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+optical+density+detection+times+to+assess+the+effect+of+acetic+acid+on+single-cell+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Use of optical density detection times to assess the effect of acetic acid on single-cell kinetics.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72, 6674-6679 (2006).</li>
<li>Niven, G. W., Fuks, T., Morton, J. S., Rua, S. A. C. G., Mackey, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+measuring+lag+times+in+division+of+individual+bacterial+cells+using+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for measuring lag times in division of individual bacterial cells using image analysis.</a> Journal of Microbiological Methods. 65, 311-317 (2006).</li>
<li>Niven, G. W., Morton, J. S., Fuks, T., Mackey, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+environmental+stress+on+distributions+of+times+to+first+division+in+Escherichia+coli+populations%2C+as+determined+by+digital-image+analysis+of+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Influence of environmental stress on distributions of times to first division in Escherichia coli populations, as determined by digital-image analysis of individual cells.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74, 3757-3763 (2008).</li>
<li>Pin, C., Baranyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+and+population+lag+times+as+a+function+of+cell+age%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Single-cell and population lag times as a function of cell age.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74, 2534-2536 (2008).</li>
<li>Guillier, L., Pardon, P., Augustin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+stress+on+individual+lag+time+distributions+of+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Influence of stress on individual lag time distributions of Listeria monocytogenes.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 2940-2948 (2005).</li>
<li>Metris, A., George, S. M., Peck, M. W., Baranyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+turbidity+detection+times+produced+by+single+cell-generated+bacterial+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Distribution of turbidity detection times produced by single cell-generated bacterial populations.</a> Journal of Microbiological Methods. 55, 821-827 (2003).</li>
<li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305, 1622-1625 (2004).</li>
<li>Glaser, D. A., Wattenburg, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+system+for+the+growth+and+analysis+of+large+numbers+of+bacterial+colonies+using+an+environmental+chamber+and+a+computer-controlled+flying-spot+scanner%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">An automated system for the growth and analysis of large numbers of bacterial colonies using an environmental chamber and a computer-controlled flying-spot scanner.</a> Ann N Y Acad Sci. 139, 243-257 (1966).</li>
<li>Guillier, L., Pardon, P., Augustin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image+analysis+of+bacterial+colony+growth+as+a+tool+to+study+individual+lag+time+distributions+of+immobilized+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated image analysis of bacterial colony growth as a tool to study individual lag time distributions of immobilized cells.</a> Journal of Microbiological Methods. 65, 324-334 (2006).</li>
<li>Michel, J. B., Yeh, P. J., Chait, R., Moellering, R. C., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+interactions+modulate+the+potential+for+evolution+of+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Drug interactions modulate the potential for evolution of resistance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14918-14923 (2008).</li>
<li>Ernebjerg, M., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Growth+Strategies+of+Soil+Bacteria+as+Revealed+by+Large-Scale+Colony+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Distinct Growth Strategies of Soil Bacteria as Revealed by Large-Scale Colony Tracking.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78, 1345-1352 (2012).</li>
<li>Rotem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+phenotypic+variability+by+a+threshold-based+mechanism+underlies+bacterial+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Regulation of phenotypic variability by a threshold-based mechanism underlies bacterial persistence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 12541-12546 (2010).</li>
<li>Bigger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bactericidal+action+of+penicillin+on+staphylococcus+pyogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Irish+Journal+of+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">The bactericidal action of penicillin on staphylococcus pyogenes.</a> Irish Journal of Medical Science. 19, 585-595 (1944).</li>
<li>Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+persister+fractions+suggests+different+mechanisms+of+formation+among+environmental+isolates+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli.</a> BMC Microbiol. 13, 25 (2013).</li>
<li>Moyed, H. S., Bertrand, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hipa+a+Newly+Recognized+Gene+of+Escherichia-Coli+K-12+That+Affects+Frequency+of+Persistence+after+Inhibition+of+Murein+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Hipa a Newly Recognized Gene of Escherichia-Coli K-12 That Affects Frequency of Persistence after Inhibition of Murein Synthesis.</a> Journal of Bacteriology. 155, 768-775 (1983).</li>
<li>Balaban, N. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence%3A+mechanisms+for+triggering+and+enhancing+phenotypic+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Persistence: mechanisms for triggering and enhancing phenotypic variability.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 21, 768-775 (2011).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

שיטות מיקרוסקופיות המבוססות על התבוננות ישירה נחשבות לעתים קרובות &quot;סטנדרטי זהב&quot; לחקר תא בודד התנהגות. ScanLag, המאפשר מדידה של חלוקת פעמים בפיגור באוכלוסיות חיידקים, מספק נתונים בהסכם טוב עם החלוקה שהתקבלה מניתוח תא בודד ומשיג הנתונים הסטטיסטיים גבוהים בהרבה. כמה שלבים קריטיים צריכים להתבצע בשיטה זו כדי לעבוד היטב: ראשית, לא מתפשר על הרזולוציה של הסורק, שאמורה להיות 4,800 x 9,600 להשיג תמונות טובות. שנית, להיות מודע לכך שללא מודול ניהול צריכת החשמל (שלב 1.6), שיפוע הטמפרטורה עלול להתפתח על פני השטח השטוח ומשפיע על צמיחה. צעד חשוב נוסף הוא הסינון של ליקויים כגון אבק שייתכן שנספרו בטעות כמושבות על ידי התוכנה. חיסור הרקע המובנה של התוכנה בדרך כלל מתגבר על פגמים אלה, אבל יש לי מושבות לפעמים &quot;שקר&quot; ללהיות מסונן באופן ידני. השלבים לפתרון בעיות העיקריים עשויים לטפל וריאציה בין צלחת בהתקנה, בשל מספר סיבות: (א) שיעור הצמיחה של מיקרואורגניזמים מושפעים טמפרטורה. תנאי טמפרטורה ולחות שונים יכולים להתרחש עקב אוורור או מיקום לא אחידים של המנה בחממה. (ב) האלקטרוניקה של הסורק עלולה להתחמם ולגרום לשיפוע טמפרטורה על פני השטח של הסורק. איור 10 מראה את ההשפעה של שיפוע חום מרחבית כגון בחיידקי Bacillus, יחד עם המדידות של הטמפרטורה על פני השטח הסורק לפני ו לאחר יישום מודול ניהול צריכת החשמל (שלב 1.6). שים לב שמודול זה לא יכול להיות הכרחי לסורקים חדשים יותר, ואם רק חלק ממשטח הסורק משמש, ניהול צריכת חשמל עשוי להיות מיותר. (ג) צלחות עם אטימות של חומר מזין אגר שונות עלולות להוביל לרמות זיהוי שונות. איור 11 מופעים הסובלנות דואר לכרכים שונים של אגר מזין כי תוצאת אטימות שונות. בניסוי טכניקת ScanLag היא קלה לביצוע ודורשת רק לצלחת מיקרואורגניזמים על צלחות פטרי סטנדרטיות, ולמקם אותם על פני השטח של הסורק. התוכנה שפותחה שולטת על ההליך כולו. רכישת התמונה נעשית באופן אוטומטי, וניתוח התמונה למעקב מושבה הוא גם אוטומטי. יתר על כן, המערכת יכולה להיות מדורגת למעלה כדי למדוד תנאים רבים ושונים באותו הזמן. לבסוף, השיטה מסתמכת על סורקי משרדים ומסחר, ולכן היא בעלות נמוכה. טכניקה זו ניתן להרחיב את המחקר של מיקרואורגניזמים השונות מE. coli K-12, עם זאת כמה שיקולים צריכים להתבצע. ראשית, השפעתה של מושבות המופיעות בשלב מוקדם במאוחר אלה יש להעריך, כפי שתואר בפירוט בפרסום קודם 7. עבור א &#39; Coli K-12,צפיפות המרבית של CFU לכל צלחת היא 200. זנים אחרים עם גדלים שונים של מושבות, ולדבר לחצות אפשריים אחרים בין מושבות, עשוי לחייב צפיפות שונה. שנית, הניתוח של הצלחות הוא מכויל לסף מבוסס תוכנה ספציפית שעשויות צריך להיות שונה, בהתאם לניגוד בין המדיום המוצק והמושבות. התוכנה יכולה להתארך גם כדי לחלץ מאפייני מושבה אחרים, מעבר לפיגור וקצב צמיחה. קוד התוכנה פתוח והוא יכול להיות שונה כדי לחלץ צורת מושבה, בהירות, חלקות וצבע. כי מדידות מבוצעות על מושבות שמקורם תאים בודדים, הנתונים חושפים פנוטיפים חדשים שלא ניתן למדוד על ידי מדידות ברמת אוכלוסייה. החשיבות של חלוקת זמן ההשהיה מתגלה בנוכחות של אנטיביוטיקה. אנטיביוטיקה רבות ידועות להיות יעילים רק נגד תאים הולך וגדל; לכן, כל עוד תאים נשארים בשלב הפיגור ולא גדלים, הם פרוtected מהשפעות של אנטיביוטיקה אלה 21. כאשר המספרים של חיידקי ניצול מוערכים במרווחי זמן במהלך טיפול אנטיביוטי 15,22,23, subpopulation של חיידקים, הנקרא persisters, מתגלה לעתים קרובות. במקרים מסוימים, חסינות לטיפול אנטיביוטי נובעת מפיגור ממושך. שימוש בהגדרה זו, הפיגור הזה מתגלה ולעתים קרובות יש חלוקת הלא טריוויאלי 24 (איור 6). שיטה זו גם מאפשרת שליפה של מוטציות נדירות. לדוגמא, לאחר ציפוי אוכלוסיית mutagenized, ניתן לזהות מוטציות המבוססות על הפנוטיפ ומבודד באופן ישיר, ללא בחירה. ההתקנה יכולה גם לעקוב אחר תאי תאי אינטראקציות על ידי מדידת הצמיחה של מושבות כפונקציה של צפיפות מושבות סמוכות ולכמת תופעות כגון חישת מניין או ההתפשטות של חיידקים שורצים. מידע רב ממדי שנחשף על ידי ניסויים עתידיים בשיטה זו יוביל לאפיון טוב יותר של אוכלוסיית חיידקיםים ולהתקדמות במחקר רפואי וסביבתי.

חיידקים התפתחו להגיב להרבה מצבים מלחיצים. תכונה כללית של הסתגלות ללחץ היא שינוי ב1,2 דינמיקת צמיחה. דינמיקת צמיחה מאופיינת בעיקר על ידי שני פרמטרים: קצב מעריכי צמיחה וזמן ההשהיה, כלומר את הזמן הדרוש כדי להסתגל לתנאים חדשים. בעוד מספר רב של שיטות תפוקה גבוהה להתמקד במדידות של קצב הצמיחה, זמן ההשהיה הוא לעתים קרובות פרמטר להתעלם, למרות שזה הפרמטר הקריטי לאפיון של ההסתגלות לתנאים חדשים. כימות של ההסתגלות לתנאים משתנים באופן מסורתי מתבצעת באמצעות שיטות ידניות מייגע 3,4. לאחרונה, טכניקות מתקדמות פותחו לצורך הניתוח של תאים בודדים 5,6. עם זאת, זה עדיין קשה להבחין צמיחה נורמלית לאחר עיכוב בצמיחה (כלומר זמן השהיה) 2,3 מצמיחה איטית. שיטה אוטומטית נבנתה, 7 ScanLag, כדילהפלות בין שני פנוטיפים דומים אלה. דוגמא בולטת לחשיבותו של המחקר של התפלגות זמן ההשהיה מתגלה תחת טיפול אנטיביוטי. רבים באנטיביוטיקה ולחצים אחרים להרוג תאים רק הולך וגדל באופן פעיל, ולכן תאים שהם &quot;מפגרים&quot; מוגנים 8. כדי לפקח על זמן השהיה, ניתן לראות תאים בודדים תחת מיקרוסקופ ולפקח על זמן הליגה ראשונה. חסרון עיקרי של שיטה זו הוא שטווח הזמן הדינמי הוא מוגבל; אותם תאים שגדלים מוקדם לכסות את פני השטח בקצב מעריכי, בצורה יעילה ומקטין את הצמיחה של תאים עם זמן שהייה ארוך יותר. שימוש בזרימת תאים מעט עוקפת 5 הזה, אבל מספר מוגבל של תאים יכול להיות במעקב ואת החלק היחסי של חיידקים שיציאה משלב הפיגור אחרי רוב האוכלוסייה החלה גובר לא ניתן לצפות. למרות מגבלות אלה, מספר מחקרים העריכו את ההשפעה של הרמה different מדגיש על חלוקת זמן השהיה באמצעות מיקרוסקופ תא בודד 9-12. דרך נוספת כדי לפקח על חלוקת זמן השהיה היא באמצעות מדידות עכירות 13,14. תרבויות רבות במקביל, כל אחד התחילה מתא בודד, הם גדלו בקורא צפיפות אופטי המודד את מספר החיידקים בתרבית לאורך זמן. שיטה זו מוגבלת על ידי הדיוק של הניפוח ולמספר הבארות בצלחת. שיטה אוטומטית שפתחה, בשם ScanLag, המאפשרת פעמים בפיגור והפצות זמן צמיחה להיות מוערכים, אפילו עבור אחוז הקטן של חיידקים באוכלוסייה שיש לי פעמים בפיגור רבות מאוד. השיטה מבוססת על זיהוי של מושבות על צלחות אגר מזין קונבנציונלי 15 (איור 1). כדי להפוך את זיהוי 16,17 מערך של סורקים מסחריים 18 שמופנים על ידי תוכנה בבית לרכוש מעת לעת תמונות של הצלחות, היה מהונדס. תוכנה הייתהנועד לנתח את התמונות באופן אוטומטי ולחלץ פרמטרים כמותיים 19,20, כגון זמן של ההופעה בכל פעם שמושבה והצמיחה של כל מושבה, אשר מוגדרת כאן כזמן לגדול מ20 פיקסלים 80 פיקסלים. כאן אנו מציגים את השיטה בפירוט, כולל ההתקנה של המערכת והשימוש בתוכנת ניתוח תמונה האוטומטית אשר שופרה עם ממשק משתמש טוב יותר. שיטה זו יכולה להיות מותאמת למדידת מאפיינים אחרים של מושבות, כגון מורפולוגיה וצבע. מדידה של סוגים אלה של פרמטרים תאפשר השימוש של המערכת בPhenomics הרב ממדי. כשיטת מזהה מושבות של תאים בודדים, המערכת יכולה לחשוף פנוטיפים חדשים שלא ניתן למדוד על ידי מדידות ברמת אוכלוסייה. הטכניקה מאפשרת איתור ואחזור של גרסאות נדירות, ומאפשרת הקרנה של תכונות הרצויות.

<table><tbody><tr><td>Bacto agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Difco LB מרק</td><td>BD</td><td>240230</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 90 מ"מ</td><td>Miniplast</td><td>20090-01</td><td></td></tr><tr><td>Epson Perfection v37</td><td>Epson</td><td>B11B207201</td><td>סורק שטוח ברזולוציה אופטית: 4,800 dpi, רזולוציית חומרה:&nbsp; 4,800 x 9,600 dpi, עומק סיביות צבע 48 סיביות.</td></tr><tr><td>Epson Perfection v200</td><td>Epson</td><td>B11B188011</td><td></td></tr><tr><td>Epson Perfection 3490</td><td>Epson</td><td>B11B177011</td><td></td></tr><tr><td>ADU200 ממסר USB</td><td>ONTRAK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חתיכות בד לבד שחור סטרילי</td><td>בהתאמה אישית בקירוב</td><td></td><td>100 x 100 מ"מ</td></tr><tr><td>מחזיקי לוחות לבנים</td><td>בהתאמה</td><td></td> אישית <td>גודל פני השטח, עם חור</td></tr> <tr><td>בקוטר 6 x 99 מ"מטבעות Delerin בגודל צלחת פטרי</td><td>בהתאמה</td><td></td> אישית <td>קוטר פנימי: 72 מ"מ קוטר חיצוני: 86 מ"מ קוטר חיצוני עליון: 90 מ"מ</td></tr></tbody></table>

scanlag: כימות תפוקה גבוהה של המושבה צמיחה ול&quot;ג בזמן

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

דינמיקת גדילה היא מאפיינים בסיסיים של מיקרואורגניזמים. כימות מדויק של צמיחה הוא מטרה חשובה במיקרוביולוגיה. דינמיקת הגדילה מושפעת הן מזמן ההכפלה של המיקרואורגניזם והן מכל עיכוב בצמיחה עם המעבר ממצב אחד למשנהו, הפיגור. שיטת ScanLag מאפשרת לאפיין את שתי התכונות הבלתי תלויות הללו ברמת המושבות שכל אחת מהן מקורה בתא בודד, ויוצרת התפלגות דו-ממדית של זמן ההשהיה ושל זמן הגידול. ב-ScanLag, מדידת הזמן שלוקח לזיהוי מושבות על לוחות אגר נוטריינטים קונבנציונליים היא אוטומטית במערך של סורקים מסחריים הנשלטים על ידי יישום פנימי. צלחות פטרי מונחות על הסורקים, והאפליקציה רוכשת תמונות מעת לעת. ניתוח אוטומטי של צמיחת המושבה נעשה לאחר מכן על ידי אפליקציה המחזירה את זמן ההופעה וקצב הצמיחה של כל מושבה. ניתן לחלץ פרמטרים אחרים, כגון הצורה, המרקם והצבע של המושבה, למיפוי רב-ממדי של תת-אוכלוסיות של תאים. לבסוף, השיטה מאפשרת אחזור של וריאנטים נדירים עם פנוטיפים ספציפיים של גדילה לצורך אפיון נוסף. ניתן ליישם את הטכניקה בבקטריולוגיה לזיהוי פיגור ארוך שעלול לגרום להתמדה באנטיביוטיקה, כמו גם טכניקה כללית בעלות נמוכה למסכים פנוטיפיים.

כדוגמא למיצוי חלוקת זמן השהיה, איור 5 מראה את היכולת של ScanLag לזהות ולעקוב אחר כל מושבה עם מאפיינים ספציפיים על לוח אחד לאורך זמן, כפי שניתן היה לעשות בassay הקרנה. כאשר התרבות של מיקרואורגניזם היא הטרוגנית, האוכלוסיות השונות עלולות לחשוף את עצמם במהלך assay. לדוגמא, איור 6 מציג את כימות מראה ובכך חושף את חלוקת זמן ההשהיה bimodal בזן מוטנטי של א &#39; coli. קצב הגידול של התאים משפיע על זמן הופעתה של המושבה. כאשר מושבות לגדול באותו קצב, את המראה מאוחר ניתן לייחס לזמן ההשהיה (איור 7). כדי לאמת שהשיטה אכן מודדת את זמן השהייה של תאים בודדים, השווינו תוצאות עם אלו המתקבלות ScanLag באמצעות מיקרוסקופ תא בודד; אימות זה היא יורדribed בפירוט בפרסום קודם 7. שיטה זו מאפשרת ניטור של רבים יותר תאים מאשר יכול להיות מוערך במיקרוסקופ. ההפצות שהושגו באמצעות מיקרוסקופיה והושג באמצעות ScanLag חופפות במידה רבה. הפצת ScanLag היא מעט רחבה יותר; ניתוח תיאורטי לחזות ההרחבה להיות מסדר גודל של סטיית התקן של זמן החלוקה. אם זמן צמיחה הוא שונה עבור כל זן, מקורו של העיכוב בהופעה חייב להיחקר יותר בשיטות אחרות. ההשפעה של מושבות המופיעים מוקדם במראה של מושבות מאוחר יותר נבדקה. ניסויי בקרה 7 אישרו כי הופעתו מאוחר יותר לא נפגע כל עוד את המספר הכולל של מושבות בכל צלחת לא יעלה על 200 (איור 8). ניסוי שליטה נוסף אישר כי מיקומה של המושבה על הצלחת לא היה משפיע על זמן ההופעה שלה 7. הניתוח של plates הוא מכויל לסף מסוים שאולי צריך שינוי בהתאם לחומרים מזינים הנמצאים במצע גידול או הסוג של בקטריה. עם זאת, הניתוח הוא די חזק למגוון גדול של ספים כפי שמוצגים באיור 9. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. תרשים סכמטי של השלבים הדרושים ליצירת הפצת מראה מושבה. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2. צילום מסך של מנהל ההתקנים מראים את השמות של הסורקים המצורפים, ושל קובץ התצורה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/5456/51456fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גדול</a>גרסה של נתון זה. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3. צילום מסך של מנהל הסריקה. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4. צילום מסך של ScanLagApp. תמונה של הצלחת היא בחלונית הימנית, ועקומות הגדילה של כל מושבה נמצאות בחלונית הימנית, כמפורט במדריך. הקוצים בחלק מעקומות אזור המושבות להתרחש כאשר שתיים או יותר מושבות למזג. כאשר ההתמזגות של מושבות קורה, השטח של מושבות אלה נחשב כמשותף באזור. <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig5highres.jpg" width="500" /> איור 5. תוצאת נציג הניתוח של צלחת אחת. () תמונה של הפלט של יישום זיהוי בסוף הניסוי. כל אזור מושבה מזוהה, צבעוני והוקצה עם מספר זיהוי ייחודי. החיצים מצביעים על מושבות נציג נמדדו בב &#39;המושבה מזוהה מבוססת על סף עוצמה (למושבות החיידק על אגר LB או אגר M9 סף זה הוא 0.03. לתקשורת או חיידקים אחרים, סף זה יכול להיות מותאם בProcessPictures הפונקציה ). רק אובייקטים מעל 10 פיקסלים נספרים (סף זה יכול להיות שונה בMatchColonies הפונקציה). זיהוי של מושבה מתחיל בכ 10 5 חיידקים. מגרשים (ב &#39;) באזור בפיקסלים לעומת הזמן של ארבע מושבות נציג בצלחת זו. &quot;זמן המראה&quot; של כל מושבה הוא כאשר המושבה מזוהה. &quot;זמן הצמיחה&quot; של כל מושבה מוגדר כאן כזמן לגדול לכאן ולכאןמ &#39;20 פיקסלים 80 פיקסלים (גבולות אלה הם מתכוונן באמצעות הפונקציה getAppearanceGrowthByVec). התוכנה אינה כוללת את המושבות שהתמזגו לפני שהגיע לגבול העליון. זיהוי של מושבה ספציפית לפי מאפייניו הוא הודות קל את מספר זיהוי ואת הצבע שהוקצה לכל מושבה. לדוגמא מושבות # 1, 56, 77 ו124 מודגשים בשני הגרפים. <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig6highres.jpg" width="500" /> איור 6. כימות מראה יכול לחשוף חלוקת זמן השהיה bimodal. השוואת היסטוגרמות ניתוח ScanLag פעמים מראה לשני זנים שונים. קו כחול: מתח סוג בר אקספוננציאלית גובר (סה&quot;כ: 1,320 מושבות); המוטציה קו אדומה גבוה התמדה מועשרת בחיידקים מפגרים (סה&quot;כ: 1,529 מושבות). () היסטוגרמות מראה מנורמלות. השיאהופעה של תאים גדל באופן אקספוננציאלי הוא הזמן האופייני לגדול למושבה לזיהוי. הבלעה: אותו היסטוגרמה של הזן מוטנטי לאחר הפחתת הזמן של השיא של תרבות מעריכי כדי לקבל את זמן השהיה בפועל על פחים ברווח יומן המציגים את התפלגות זמן ההשהיה bimodal. (ב) פונקצית הישרדות של אותם נתונים כמו ב() בקנה מידת לוגריתמים. ייצוג זה משפר את זנב ההופעה המאוחר של המתח שעבר מוטציה. <img alt="איור 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig7highres.jpg" width="500" /> איור 7. הפצת מראה וחלוקת זמן צמיחה. (א) ו (ב) מראים שתי היסטוגרמות ממדיות של זמן המראה וזמן הצמיחה של שני תנאים שונים (התוכנה אינה כוללת מושבות שהתמזגו לפני שהגיע לגבול העליון). (ג) השוואה בין היסטוגרמותשל שני הזנים להראות את ההבדל בזמן הופעה, ואילו הפעמים הצמיחה (ד &#39;) הן דומות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51456/51456fig7highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig8highres.jpg" width="500" /> איור 8. המראה של מושבות מוקדמות לא מפריע למראה של מושבות מאוחר יותר. () ל&quot;ג בהפצה של wild-type תאים מצופים לבד זמן. (ב) ל&quot;ג בהפצה של זן רגיש קר לבד זמן, לאחר העברה לטמפרטורה מתירנית. (ג) ל&quot;ג בהפצה של שני הזנים מצופים יחד תחת אותם תנאי זמן. הקו השחור מייצג את ההתפלגות הצפויה המבוססת על נתונים המתקבלים בעת מדידת כל זן בנפרד. טובgreement בין הפצות צפויות ונמדדו מתקבל כל זמן שהמספר הכולל של מושבות בכל צלחת הוא מתחת 200. <img alt="איור 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig9highres.jpg" width="500" /> .. איור 9 סף הגילוי אינו משפיע על צורת התפלגות מראה המושבה הפצת מראה המושבה נותחה עבור אותו סט נתונים באמצעות שני גדלי סף שונים; (א) גודל סף הוא 10 פיקסלים; גודל סף (ב &#39;) הוא 50 פיקסלים. מספר התאים להיסטוגרמה: כ. 1,500. סף הגילוי שונה תוצאות רק בשינוי של זמן זיהוי. <img alt="איור 10" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig10highres.jpg" width="500" /> איור ACR מדידות יציבות 10. טמפרטורהתמונת פני השטח של הסורק ה-OSS. (א) לצלחת עם מושבות של subtillis Bacillus גדל על הסורק ללא ניהול צריכת חשמל. פני השטח הוא חם יותר בתחתית ולכן המושבות לצמוח מהר יותר. הקו ההדרגתי לצד הצלחת הוא ייצוג סכמטי של שיפוע החום. (ב) יציבות הטמפרטורה נמדדה עם שני צמדים ממוקמים על פני השטח של הסורק. הסורק מתחמם במהלך כל סריקה ומעל הזמן. (ג) עם ניהול צריכת חשמל, הטמפרטורה אחידה והמושבות לגדול בשיעורים דומים. (ד) אותו כ( ב &#39;) עם מודול ניהול צריכת החשמל. יציבות טמפרטורה של ± 0.2 ° C. <img alt="איור 11" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig11highres.jpg" width="500" /> איור 11. הבדלים בהתפלגות המראה יכולים להיות בגלל differences בהיקפי בינוני מוצק. אותה תרבות החיידקים הייתה מצופה על צלחות עם כמויות שונות של אגר LB, וכתוצאה מכך לגובה של משטח אגר שונה. הגבהים השונים הובילו לאטימות שונות של הצלחות, ולכן זמן זיהוי שונה. ההבדל בין הצלחות נבדק ואת ההבדל בין תנאי גובה שונים. (א) הבדלים אופייניים בין הצלחות של כמויות שווה של 30 ± 0.5 מיליליטר של LB אגר. הבדל (ב &#39;) בין תנאי גובה שונים: הפצת המראה נמדד לצלחות עם כרכים של 20 ± 0.5 מיליליטר (אדום), של 30 ± 0.5 מיליליטר (ירוק) ושל 40 ± 0.5 מיליליטר (כחול). כל תנאי הוא הממוצע של 6 צלחות שונות. כל עוד את עוצמת הקול של הצלחות היא בתוך הטווח ± 5 מיליליטר, האטימות היא דומות ומובילה להפצה דומה בזמן הופעה.

ScanLag היא שיטה בעלת תפוקה גבוהה למדידת העיכוב בצמיחה, כלומר זמן השהיה, כמו גם קצב הצמיחה של מושבות עבור אלפי תאים במקביל. סינון באמצעות ScanLag מאפשר הבחנה בין זמן פיגור ארוך לצמיחה איטית ברמה של וריאנט בודד.

ScanLag: כימות תפוקה גבוהה של המושבה צמיחה ול&quot;ג בזמן

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לכמת את התפלגות זמן השיהוי (lag distribution) של תרבית חיידקים, כדי לאפשר הבחנה בין זמן שיהוי ארוך לבין גדילה איטית ברמה של וריאנט בודד. דבר זה מושג תחילה על ידי בניית מערך של סורקים המזוהים על ידי מחשב אחד. השלב השני הוא פריסה של יחידה יוצרת מושבה (CFU) מוגדרת של תרבית חיידקים על צלחות פטרי המכילות אגר תזונה קונבנציונלי.בשלב הבא, מניחים את הצלחות בתוך מחזיקים ייעודיים על הסורקים, ומבצעים צילומי time-lapse של המושבות באמצעות הסורקים. השלב הסופי הוא הרצת ניתוח התמונות באמצעות תוכנת scan lag, המנתחת אוטומטית את התמונות ומחלצת פרמטרים כמותיים, כגון זמן ההופעה של כל מושבה וזמן הצמיחה של כל מושבה. לבסוף, נעשה שימוש בפונקציות MATLAB כדי להפיק את היסטוגרם השיהוי (lag histogram) באמצעות נתונים אלו.ההשלכות של טכניקה זו הן לכיוון אבחון של זיהומים עמידים מכיוון שהיא מאפשרת זיהוי של וריאנטים איטיים. לתחילתו של התהליך, בחרו סורק שטוח עם רזולוציה אופטית של 4,800 DPI, רזולוציית חומרה של 4,800 על 9,600 DPI ועומק צבע של 48 bit שניתן להפעילו ברמות הטמפרטורה והלחות הרלוונטיות. בחרו סורק המאפשר חיבור וזיהוי של יותר מסורק אחד למחשב.לצלחות פטרי יש נפח משמעותי באופן ייחודי. בניגוד לנייר, המשמש בדרך כלל בסורקים מסחריים, המושבות נמצאות מעל שכבת האגר, כחמישה מילימטרים מעל פני השטח של הסורק. ברוב הסורקים, המושבות יהיו במיקוד.הכינו חתיכות של בד לבד שחור סטרילי לכיסוי הפלטות כדי להחזיק את פטריות הפטרי במקומן. הכינו מחזיקי פלטות לבנים המתאימים לסורקים ובעלי שישה חורים התואמים לגודל הפטריות, במידה ויש צורך עבור גידול המיקרואורגניזם. הניחו את הסורקים בסביבה עם בקרת טמפרטורה.חברו את הסורקים למחשב כדי להתקין את מנהל הסריקה. העתיקו את כל קבצי אפליקציית מנהל הסריקה לספריה ייעודית מאתר scan lag. השתמשו במחשב עם מערכת הפעלה Windows XP וודאו ש-microsoft.גרסת net framework 2.0 מותקנת. התהליך נעצר. אתר את שמות הסורקים בניהול המחשב (computer management), במנהל ההתקנים (device manager), תחת התקני הדמיה (imaging devices). לאחר מכן, הגדר את קובץ התצורה של מנהל הסריקה בהתאם לשמות אלה.לביצוע הניסוי, ראשית, יש לדלל את התרבית לריכוז של כ-2000 CFU למילליטר. לאחר מכן, יש לפרוס 0.1 מילליטר של תרבית באופן אחיד על צלחות פטרי שהוכנו עם אגר תזונה סטנדרטי. לאחר מכן, יש לכסות את הצלחת בפיסת בד לבד שחור סטרילי כדי להשיג ניגודיות טובה בין המושבות לצלחת, וכדי לספוג לחות.סגרו את המכסה של הפלטה והניחו את הפלטות במחזיקים שעל הסורקים. הפעילו את מנהל הסריקה. בחרו את הסורקים המשתתפים מרשימת הסורקים המחוברים.לאחר מכן, בחרו את מספר התמונות שיתקבלו, את מרווח הזמן בין תמונות עוקבות ואת השהיית הזמן לפני תחילת הניסוי לצורך ניתוח התמונות. ראשית, מינו את התמונות מכל סורק לתיקיות נפרדות באמצעות חלון הפקודות של MATLAB. הרגישו ראשית את הפקודה prepare images לביצוע עיבוד מקדים.בשלב עיבוד המקדימה, התמונות מהסורק מיושרות. כל צלחת פטרי נגזרת מכל רצף תמונות. הזמן שבו נאספה כל תמונה נשף מנתוני חותמת הזמן של ההרצה.ביצוע צילום רציף (Time lapse) עבור כל הצלחות כדי לבצע זיהוי ומעקב; המושבות מזוהות בכל צלחת פטרי ומקבלות מספר מזהה. גודלן של כל אחת מהמושבות המזוהות נמדד כפונקציה של זמן. ניתן להוציא את התפלגות ההופעה של המושבות באמצעות חלון הפקודות של MATLAB.ראשית, הפעל את אפליקציית scan lag כדי להציג את הניתוח של צלחת פטרי מסוימת לצד הגרף של הגודל לעומת הזמן עבור המושבות. לאחר מכן, השתמש בסמן הגלישה כדי לשנות את הזמן הנוכחי של הצלחת. התזמון יסומן גם באמצעות קו אנכי תואם בגרף השטח של המושבות.לחצו על מושבה כדי לראות את העקומה המשויכת לה ולהפוכה. לאחר זיהוי המושבה, ניתן לשחזר את הפנוטיפ על ידי בליטת המושבה מתוך פטריית הפטרי שלה.בעת לחיצה על exclude, מספר המושבה יהפוך לצהוב. לאחר מעבר על תוצאות הניתוח של כל צלחת, סכמו את התוצאות. בהרצה הראשונה, הוסיפו היסטוגרמות כדי ליצור היסטוגרמה של הופעה.לאחר מכן, הרץ את פקודת plot death curve כדי ליצור ייצוג של עקומת הישרדות עבור ההתפלגות. דוגמה להפקה של התפלגות זמני השהייה מוצגת כאן. Scan lag יכול לזהות ולעקוב אחר כל מושבה בעלת מאפיינים ספציפיים בצלחת אחת לאורך זמן, כפי שנעשה במבחן סריקה.כאשר התרבית של המיקרואורגניזם היא הטרוגנית, תת-אוכלוסיות שונות עשויות להיחשף במהלך הבדיקה. איור זה מציג את כימות זמן ההופעה ובכך חושף התפלגות במיודאלית (דו-שיאית) של זמן השיהוי בזן מוטנטי של e coli. מוצגים כאן היסטוגרמות דו-ממדיות של זמן ההופעה וזמן הגדילה עבור שני תנאים שונים.השוואה בין ההיסטוגרמות של שני הזנים מראה הבדל בזמן ההופעה, בעוד שזמני הגדילה דומים. כאשר מושבות גדלות באותו קצב, ניתן לייחס את ההופעה המאוחרת לזמן ההשהיה (lag time). נבחנה השפעתן של מושבות המופיעות מוקדם על הופעתן של מושבות מאוחרות יותר.מוצגים כאן התפלגות זמני השיהוי של תאי פרא, שנזרעו לבדם, והתפלגות זמני השיהוי של זן רגיש לקור. ניסויי ביקורת, שבהם נזרעו התאים לבדם לאחר העברה לטמפרטורה מאפשרת, אישרו כי הופעה מאוחרת יותר לא הושפעה כל עוד המספר הכולל של המושבות לצלחת לא עלה על 200. בהתאם לנוהל זה.ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ריצוף גנום מלא או ניתוח ביטוי, על מושבות בעלות פנוטיפ גדילה מעניין, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון האם הפנוטיפ הוא גנטי או אפיגנטי.

scanlag-high-throughput-quantification-of-colony-growth-and-lag-time

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: קורוקאווה, מ. ואחרים. ניתוח מדויק ומהיר של צמיחת חיידקים. J. Vis. Exp. (2017)הסרטון הזה מדגים את הכימות בתפוקה גבוהה של צמיחת חיידקים באמצעות קורא מיקרופלט. הוא מפרט את השלבים המעורבים בהכנת תרבית, מדידת צפיפות אופטית וניתוח דינמיקת צמיחה.

ניתוח מדויק ומהיר של צמיחת חיידקים באמצעות קורא מיקרופלט

סרטון זה מדגים טכניקת כימות חוץ גופית לקביעת זיהום ליסטריה מונוציטוגנים של מקרופאגים על ידי בדיקת היחידה יוצרת-המושבה. מושבות החיידקים על צלחת האגר מייצגות את אוכלוסיית החיידקים התוך-תאיים הנמלטת ממנגנון ההגנה של המאכסן ושורדת בתוך המקרופאגים.

כימות זיהום חיידקי בתאים מארחים על ידי בדיקת היחידה יוצרת-המושבה

סרטון זה מציג מיקרוסקופ כמותי בהילוך מהיר להערכת הפצת מונוציטוגנים תלויי קשיחות מטריצה חוץ-תאית באמצעות תאי אנדותל. הידרוג'ל רך יותר מאפשר הפצה מהירה יותר של חיידקים דרך תאי אנדותל בהשוואה לעמיתים נוקשים יותר, ומדגיש את ההשפעה של קשיחות מטריצה על הפצת חיידקים.

מיקרוסקופ כמותי בהילוך מהיר להערכת הפצת חיידקים חוץ-תאיים תלויי קשיחות

בדיקה בתפוקה גבוהה בזמן אמת פותחה כדי לזהות בו זמנית (1) אנטי-מיקרוביאלים חודרי תאים אוקריוטיים המכוונים לפתוגן חיידקי תוך תאי, ו-(2) להעריך ציטוטוקסיות של תאים אוקריוטיים. וריאציה על אותה טכנולוגיה שולבה לאחר מכן עם טכנולוגיית חלוקה דיגיטלית כדי לאפשר מחקרי סינרגיה קלים, ברזולוציה גבוהה, מינון-תגובה וסינרגיה דו-ממדית ותלת-ממדית.

תפוקה גבוהה, בזמן אמת, בדיקת Dual-readout של פעילות מיקרוביאלית תאיים Cytotoxicity Cell איקריוטיים

אנו מציגים שיטה לכימות פנוטיפים הצמיחה של תאים שמרים בודדים כפי שהם גדלים לתוך מושבות על מדיה מוצקה באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופ בשם, אחת הכפלה הערכה של מערכים חיים של שמרים (ODELAY). הטרוגניות האוכלוסייה של תאים זהים גנטית גדל לתוך מושבות ניתן לצפות ישירות לכמת.

ODLAY: שיטה בקנה מידה גדול עבור כימות רב פרמטר של גידול שמרים

הערכה כמותית של התפתחות חיידקים חיוני להבנת הפיזיולוגיה מיקרוביאלי כתופעה מערכות ברמת. פרוטוקול עבור גישה אנליטית מניפולציה ניסויית הם הציגו, המאפשר ניתוח מדויק, תפוקה גבוהה של התפתחות חיידקים, אשר הוא נושא מפתח עניין במערכות ביולוגיות.

ניתוח מדויק, תפוקה גבוהה של התפתחות חיידקים

התפתחותם של התרבויות החיידקי רדיויניום בצלחות microtiter מאפשר דגימת תפוקה גבוהה המאפשרת שכפול טכני וביולוגי מרובים מספר השפע של הבריכה נוקלאוטיד, כולל זה של (p) ppGpp. ההשפעות של מעברים צמיחה שעוררה מקורות של לחץ פיזיולוגי, כמו גם התאוששות מהלחץ ניתן לפקח.

באמצעות Microtiter צלחת Radiolabeling עבור מספר מדידות Vivo של es, coli (p) ppGpp ואחריו כרומטוגרפיה שכבה דקה

עבודה זו מציגה שיטת מיקרוסקופיה המאפשרת הדמיה חיה של תא יחיד של Escherichia coli לניתוח וכימות של ההתנהגות הסטוקסטית של מעגלי גנים סינתטיים.

מדידה רציפה של רעש ביולוגי ב Escherichia קולי באמצעות מיקרוסקופיה לשגות זמן

פנוטיפים של צמיחת שמרים נמדדים במדויק באמצעות הדמיה מקבילה מאוד של תאים משותקים הגדלים למיקרוקולוניות. במקביל, ניתן לעקוב אחר עמידות ללחץ, ביטוי חלבון ולוקליזציה של חלבונים, וליצור ערכות נתונים משולבות כדי לחקור כיצד הבדלים סביבתיים וגנטיים, כמו גם הטרוגניות של ביטוי גנים בקרב תאים איסוגניים, מווסתים את הצמיחה.

הדמיה חיה בעלת תפוקה גבוהה של מיקרוקולוניות למדידת הטרוגניות בצמיחה ובביטוי גנים

שיטה זו מכמתת את השפע המיקרוביאלי באמצעות תבנית צלחת של 96 בארות ליחידות יוצרות מושבות לוחות (CFUs) ומיושמת על המיקרוביום Drosophila בדגימות הומוגניות של זבובים שלמים. יחידות CFU נספרות באמצעות תוכנת ניתוח תמונות אוטומטית המסופקת כאן.

ספירת יחידות יוצרות מושבה מהירה בתבנית צלחת 96 בארות המיושמת על מיקרוביום הדרוזופילה

למדו את שיטת ScanLag לכימות זמן לג וקצב צמיחה במושבות חיידקים באמצעות סריקת תמונות בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת זיהוי וריאנטים איטיים בתרביות הטרוגניות ומסייעת באבחון זיהומים מתמשכים.

ScanLag: כימות תפוקה גבוהה של המושבה צמיחה ול"ג בזמן

גלה סרטונים נוספים