Name: ההדמיה confocal של רגיעה מרותקת ותערובות קולואיד פולימר מזרימים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-20T19:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: חקור התנהגות פאזה ותכונות תחבורה של תלכידים קולואידיים מושכים באמצעות מיקרוסקופיית confocal. השיטה מאפשרת ניתוח מבני ודינמי ישיר של תערובות פולימר-קולואיד במערכות מוגבלות גאומטרית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר שפורסם בפרסום זה נתמכה על ידי ניו הפקולטה גרנט אוניברסיטת יוסטון, מענק זרע ממרכז טקסס למוליכות, והאגודה האמריקנית לכימיה נפט קרן המחקר (52537-DNI).

1. הכנת תערובות קולואיד פולימר הערה: פרוטוקול זה משתמש פולי (מתיל) (PMMA) חלקיקים, sterically התייצב באמצעות פולי (חומצת 12 hydroxystearic) וכותרתו עם צבע פלואורסצנטי (כגון הנילוס אדום, rhodamine B, או העמסה), שהיו מסונתזים הבאים סטנדרטי מתכון 52. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 3:01 w / w תערובת של רומיד cyclohexyl (CXB) וdecahydronaphthalene (DHN) כממס מניות. תערובת זו כמעט תואמת את הצפיפות ואינדקס שבירה של החלקיקים. להוסיף מלח אורגני, כלוריד tetrabutylammonium (TBAC) 46, לממס בריכוז של 1.5 מ&quot;מ למסך באופן חלקי את ההאשמות על החלקיקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדיוק על מנת לקבוע את הצפיפות של החלקיקים, להכין השעיה בכל חלק חלקיקים בנפח משוער Φ = 0.10 בCXB: ממס DHN. צנטריפוגה ההשעיה בXG 800 ל75 דקות ולהוסיף CXB או dropwise DHN כדי לשפר את כוח העילויהתאמה. בניסויים אלה, הצפיפות של חלקיקי PMMA נמדדה להיות ρ = 1.223 גר &#39;/ מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השעיה מרוכזת המניה של חלקיקי PMMA (כאן, Φ = 0.40) בCXB: תערובת ממס DHN. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מרוכז של קלקר ליניארי (PS) בCXB: תערובת ממס DHN. כאן, פתרון של PS של M משקל המולקולרי w ≈ 3,000,000 (רדיוס של ההסתובבות r g = 15 ננומטר) מוכן בעמ &#39;ריכוז ג ≈ 50 מ&quot;ג / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את המשקולות מתאימות של החלקיקים, פולימרים, ותערובות מניית ממס לגבש השעיות בריכוזים הרצויים של חלקיקים ופולימרים. הערה: כאן, השעיות של חלקיקי monodispersed מוכנים בשבריר קולואיד נפח קבוע Φ = 0.15 וריכוז פולימר משתנה בעמ 53 ג הנפח החופשי = 0-25 מ&quot;ג / מיליליטר, וbidispersed השעיות המכילות שני גדלים של חלקיקי colloidal, Wה-i כל גודל נושאת תווית ניאון שונה, ערוכים בסך הכל חלק קטן קולואיד נפח קבוע Φ = 0.15, יחס עוצמת שבר של חלקיקים קטנים r = 0.50, וריכוז פולימר בנפח החופשי של 5 או 25 מ&quot;ג / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כל השעיה מוכנה, להוסיף dropwise CXB או DHN צנטריפוגות הדגימות ב XG 800 לפחות 75 דקות כדי לוודא שהחלקיקים ואשכולות בתוך ההשעיה יישארו ציפה מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את כל הדגימות לפחות 24 שעות לפני ניסויי הדמיה. </li></ol> . 2 ניסויים מדגמים רגיעה: התנהגות שלב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע את השלב בתפזורת ההתנהגות, לפברק תאים מלבניים מהזכוכית coverslips (איור 1 א). לתערובות קולואיד הפולימר במחקר זה, תאים של שעות = מ&quot;מ עובי 1 (שנקבע על ידי העובי של שקופיות מיקרוסקופ) נותנים התנהגות בתפזורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לגשת ללידות מרובות בניסוי מיקרוסקופיה יחיד, לפברק דק טריזצורת תאים, באמצעות coverslip יחיד כשומר רווח על טריז אחד (איור 1b). זווית הפתיחה של החדר היא &lt;0.5 °, כך שבשדה בודד מבט הקירות כמעט במקביל. קאמרי יציג מאפשר גישה לעוביי כליאה של שעות = 6 ל&gt; 100 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות תאים על בסיס coverslip להדמיה על מיקרוסקופ הפוכה ולאטום עם אפוקסי UV-לריפוי, אשר אינו מתמוסס בתערובת ממס CXB-DHN. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות תמונה באמצעות מיקרוסקופ confocal. פרוטוקול זה מדגים הדמיה עם confocal קו סריקה מצורף למיקרוסקופ הפוכה מצוידות בעדשת טבילת שמן 100X של צמצם מספרי NA = 1.40. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להלהיב את הצבעים באמצעות מקור לייזר. הנה אורכי הגל λ = 491 או 561 ננומטר משמשים כדי לעורר את ההעמסה וצבעי rhodamine / הנילוס אדום, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשיטת הניקוד לסריקת, ליצור תמונה על ידי הסריקה במהירות לנקודה שעל פני מדגם המוקד (בx-מטוס y) באמצעות תוכנת confocal. תמונה דו ממדית של 512 פיקסלים x 512 פיקסלים, המכסים כ 50 מיקרומטר x 50 מיקרומטר, ניתן לרכוש ב1/32 שניות. לשפר את איכות תמונה על ידי חישוב ממוצע של מספר תמונות או להגדיל את זמן הרכישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את החלק התחתון של החדר (z = 0), למשל על ידי התמקדות בחלקיקים דבקו בתחתית שלה. בהגדרה זו, הגובה (z) עם הגדלת מיקוד לתוך התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדוגמא, לאפיין את ההשפעה של כליאה בדינמיקה של החלקיקים על ידי רכישת סדרת 2-D זמן של תמונות (במישור XY) בmidplane של החדר. בניסוי טיפוסי, 500 תמונות של ממד 512 פיקסלים x 512 פיקסלים נרכשות במסגרת שיעור של 1 מסגרת / שניות (זמן מרווח שניות Δt = 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדוגמא שנייה, לאפיין את מבנה 3-D של חלקיקים על ידי רכישת סדרה תלת ממדית של תמונות (x, y, z). בניסוי טיפוסי, תמונות דו ממדיות (512 פיקסלים x 512 פיקסלים) הןרכש בתפקידי z מרובים בתוך התא, עם מרווח קבוע של Δz = 0.2 מיקרומטר בין תמונות רצופות שנקבעו על ידי piezo. מחסנית בנפח כיסוי בעובי של שעות = 30 מיקרומטר וכך מכיל 151 תמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר וחלקיקים במסלול לאורך זמן ב2-D או 3-D באמצעות תוכנת מעקב חלקיקים נכתבה ב23,54-56 IDL, MATLAB 57,58, LabView 59, או Python 60. אלגוריתמים אלה בדרך כלל מאפשרים למרכזים של החלקיקים להיפתר בתוך 40-50 ננומטר. מעקב אחר חלקיקים מוצלחים דורש כי החלקיקים לנוע פחות ממרווח interparticle בין מסגרות ברציפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעמדות החלקיקים, לחשב מדדים מבניים ודינמיים. שלושה מדדים נוחים המוצגים כאן הם גרם 3-D פונקציית מתאם זוג (r) 61, עקירת 2-D הממוצע בריבוע (MSD) 58,62, וחלק עצמי 2-D של פונקציית המתאם ואן הוב G s ( x, t) 58. שני המדדים האחרונים ניתן מחושבים גם ב 3-D. </li></ol> . 3 ניסויים זורמים: מאפייני תזרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפברק תא זרימה פשוט באמצעות microcapillary זכוכית עם חתך מרובע (100 מיקרומטר x 100 מיקרומטר) שמודבק צינורות טפלון. השתמש coverslips זכוכית לתמוך בנימים ולספק קשיחות מכאנית, כפי שמוצג בסכמטי באיור 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את תערובת קולואיד הפולימר לתוך מזרק זכוכית. צרף את המזרק למערכת מחלק נוזל פנאומטי משאבה או מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר התקנת תא זרימה על מיקרוסקופ ההפוכה. שמור את המזרק, תא זרימה, ולשקע באותו הגובה כדי למזער את ההשפעה של כוח הכבידה על תזרים הפרופיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלוט על קצב הזרימה של ההשעיה דרך תא הזרימה בקצב זרימת הנפחית (למשאבת המזרק) או לחץ מופעל (לתיבת הלחץ). המהירות הממוצעת של ההשעיה בmicrochannel תלויה גם suניסוח spension. ערכים אופייניים של המהירות המרבית בmicrochannel רבוע שנמדד כאן הם 200-2,000 מיקרומטר / sec. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך זרימה, לרכוש סדרת זמן confocal 2-D במסגרת שיעורים מהירים. הנה, 500 תמונות של ממד 512 פיקסלים x 512 פיקסלים נרכשים ב32 מסגרות / שניות (t Δ זמן מרווח = 1/32 שניות) בגבהים שונים מעל תחתית microchannel (z = 0 מיקרומטר) החל z = 5 - 50 מיקרומטר. כל תמונה מכסה כמחצית מרוחב הממד (y) של microchannel, כפי שמוצג בהבלעה באיור 7. אם החלקיקים מופיעים אליפטי, להגביר את קצב המסגרת של רכישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו בניסויים שקטים, לאתר את החלקיקים ב2-D באמצעות אלגוריתמים סטנדרטיים לאיתור ומעקב אחר החלקיקים בIDL או MATLAB. לתזרימי איטיים, שבו חלקיקים לנוע פחות מהמרחק interparticle הממוצע בין מסגרות, משתמשים באלגוריתמי מעקב להשיג מסלולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במתאם תמונה לCalculate מהירות הפרופילים לתזרים מהיר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלק את התמונה לתמונות אופקית בגובה קבוע (y) לאורך כיוון הזרימה (x). לשתי תמונות רציפים אני 1 (x, y) ולי 2 (x, y) להעביר את התמונה האחרונה בפקטור Δx ולאחר מכן לחשב את השונות המשותפת הצולבות ביני 1 (x, y) ולי 2 (x + Δx, y). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את מיקום השיא של היסטוגרמה של ערכי Δx כי למקסם את השונות המשותפת הצולבות בין כל זוג תמונות כדי להשיג את מהירות advection הממוצעת בכל y עמדה לרוחב. אם חלוקה זו אינה בתוקף הגיעה לשיא, לרכוש תמונות במסגרת שיעור מהיר יותר. </li></ol></li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

השעיות Colloidal הם נחקרו באופן נרחב כמודלים למרותקים שלב התנהגות, משום שחלקיקי colloidal בגודל של מיקרון מפגינים דינמיקה איטית יותר באופן משמעותי מאטומים ומולקולות, ולכן יכולים להיות צילמו בקלות ולעקוב אחריו לאורך זמן 10. ללימודי יסוד אלה, להבין את ההשפעה של אטרקציות interparticle על מרותקת שלב התנהגות מציע את ההזדמנות כדי לחקור תופעות כגון עיבוי נימים ו21,22,67 אידוי. בנוסף, השעיות אטרקטיביות מוגבלות מופיעות בכל מקום ביישומים תעשייתיים וטכנולוגיים. למחקרים ...

מסמך זה מדגים (א) confocal הדמיה של תערובות שקטים וזורמים מרותקים קולואיד פולימר בשתיים ושלושה ממדים ו( ב) חלקיקי מעקב ומתאם הניתוחים של תמונות שנוצרה כדי לקבל מידע כמוני על התנהגות השלב ותכונות זרימה. השעיות קולואיד עם אינטראקציות interparticle אטרקטיביות להופיע בכל מקום ביישומים טכנולוגיים כחומרים להרכבה בבימויו 1-3, משלוח סמים 4, 5-7 הפחמימנים משופר, ואחסון אנרגיית 8. תכונה משותפת של יישומים אלה היא שצריכים זרמו החלקיקים באמצעות גיאומטריות עדינות, כגון חרירים, ראשי הדפסה, microchannels, או תווך נקבובי, ו / או להיות מעוצבים לתוך סרטים או מוטות דקים. טכניקות בשימוש כדי לחקור את המבנה של קולואידים בגודל של מיקרון בגיאומטריות מוגבלות, כוללים מיקרוסקופ אלקטרונים 17,18, מיקרוסקופיה רנטגן 19, ומטר לייזר עקיפהicroscopy 20, ניתן להשתמש בם כדי למדוד את המבנה ודינמיקה של חלקיקים על microscale. טכניקות אלה, עם זאת, אינן מאפשרות גישה למסלולים של חלקיקים בודדים, שממנו ניתן לחשב מדדים מבניים ודינמיים להשוואה ישירה לסימולציות מספריות 21,22. מיקרוסקופיה confocal הינה נגזרת של מיקרוסקופ פלואורסצנטי המאפשר הדמיה של חלקים דקים של מדגם ניאון. למדע colloidal 10, טכניקה זו שימושית במיוחד עבור הדמיה עמוקה בתוך השעיות צפופות או בשלושה ממדים. אלגוריתמי חלקיקים מעקב 23 להחיל שתיים או סדרת זמן תלת ממדי של micrographs confocal יניבו את המסלולים של כל החלקיקים הנראים לעין. כתוצאה מכך, השילוב של מיקרוסקופיה confocal וחלקיקי מעקב יושם ללמוד את התנהגות השלב, מבנה ודינמיקה של תרחיפי colloidal, כולל גבישי הורה 24-27 והפרעהed משקפי 28-31 וג&#39;לים 32-35. ניתן ליישם אלגוריתמי ניתוח תמונה אחרים למדידת חלקיקי דינמיקת סדרת זמן של micrographs confocal מ. לדוגמא, ניתן ללמוד את הדינמיקה של חלקיקי diffusive ידי ניתוח התנודות בעוצמה לאורך זמן באמצעות מיקרוסקופ דינמי ההפרש confocal 36. כאשר התקות החלקיקים גדולות יותר מאשר מרווח interparticle, מתאם תמונה 37 מבוסס על velocimetry תמונת חלקיקי 38-40 ניתן ליישם כדי למדוד מהירות פרופילים של החלקיקים. השילוב של אלגוריתמי מעקב ומתאם אפשר דינמיקת colloidal להימדד מערכות עוברות זרימה איטית ומהירה 11-16,41-45. אנו משתמשים בתערובות קולואיד פולימר כמודלים להשעיות colloidal אטרקטיביות 9. בתערובות אלה, מגוון ועוצמתו של פוטנציאל interparticle אטרקטיבי נשלטים באמצעות היחסשל רדיוס הפולימר של הסתובבות לרדיוס החלקיקים והריכוז של הפולימר והדחייה אלקטרוסטטית נשלט באמצעות התוספת של חד ערכי אורגני מלח 46. מכיוון שיכולים להיות מכוון אינטראקציות interparticle זהירות, המיצוק של תערובות אלה נחקר בהרחבה עם מיקרוסקופיה confocal 34,47-51. כאן אנו מדגימים confocal הדמיה וניתוח תמונה 37 תערובות קולואיד פולימר שקטים וזורמים, שבו חלק קולואיד הנפח מוחזק קבוע בΦ = 0.15, בדיקה כי ההשפעה של כליאה בהתנהגות השלב ותכונות זרימה של תערובות אלה. טכניקות אלה הן נרחב החלים על מערכות חלקיקים כי הם שבירה ובי יכולים להיות מתויגים החלקיקים ו / או ממס עם פלורסנט לצבוע בהתאמה מדד.

<table><tbody><tr><td>ציקלוהקסיל ברומיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>135194</td><td>מספר CAS&nbsp; 108-85-0, משקל מולקולרי = 163.06, משמש במלאי ממס</td></tr><tr><td>Decahydronapthalene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D251</td><td>CAS מספר 91-17-8, משקל מולקולרי = 138.25, משמש במלאי ממס</td></tr><tr><td>נילוס אדום</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>72485</td><td>צבע פלואורסצנטי פלואורסצין</td></tr><tr><td>5(6)-איזותיוציאנט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>F3651</td><td>צבע פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>רודמין B</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>83689</td><td>צבע פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>פיזור אור דינמי&nbsp;</td>ציוד <td>BI-APD</td> DLS <td>מבית Brookhaven Instruments</td><td>המשמש למדידת גודל חלקיקים</td></tr><tr><td>פוליסטירן&nbsp;</td><td>Varian/Agilent</td><td>PL20138-23</td><td>פוליסטירן (פולימר) לגרימת משיכת דלדול</td></tr><tr><td>טטרה-בוטיל (אמוניום כלוריד) (TBAC)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>86870</td><td>מלח חד ערכי</td></tr><tr><td>דבק UV</td><td>דבק נורלנד</td><td>NOA 68T</td><td>מספר חלק 68T01 (דבק מרפא UV)</td></tr> <tr><td>VT Eye</td><td>Visitech</td><td>VT</td><td>סורק עיניים קונפוקלי</td></tr><tr><td>VT Infinity</td><td>Visitech</td><td>VT </td><td>סורק קונפוקלי</td>אינפיניטי</tr><tr><td>מיקרוסקופ&nbsp;</td><td>Leica</td><td>DMI3000B</td><td>צנטריפוגה מיקרוסקופ</td></tr><tr><td></td><td>הפוך תרמו מדעי</td><td>Sorvall ST 16</td><td>1-5,000 סל"ד</td></tr><tr><td>צינורות טפלון</td><td>חלקים קטנים</td><td>SLTT 26-72</td><td>Zeus PTFE Sublite צינורות קיר 26 AWG 0.016 אינץ' מזהה x 0.003 אינץ' קיר</td></tr><tr><td>אפוקסי</td><td>Devcon</td><td>DA051</td><td>5 דקות מזרק אפוקסי</td></tr><tr><td></td><td>Micromate / Cadence</td><td>5004</td><td>מזרק זכוכית עם מתכת לואר קצה נעילה</td></tr><tr><td>קצות מזרק&nbsp;</td><td>Nordson</td><td>7018462</td><td>32 טיפים לדיוק GA&nbsp;</td></tr><tr><td>משאבת מזרק&nbsp;</td><td>מערכת משאבות עידן חדשה בע"מ</td><td>NE1002X</td><td>משאבה מיקרופלואידית ניתנת לתכנות (syringepump.com)</td></tr> <tr><td>איזון שקילה</td><td>מטלר טולדו</td><td>AB204-S</td><td>0.0001-220 גרם</td></tr><tr><td>חלקיקי PMMA</td><td>מסונתזים</td><td></td><td>פולי (מתיל-מתקרילט) חלקיקים קולואידים</td></tr></tbody></table>

ההדמיה confocal של רגיעה מרותקת ותערובות קולואיד פולימר מזרימים

Confocal Imaging of Confined Quiescent and Flowing Colloid-polymer Mixtures

ההתנהגות של מתלי colloidal מרותקים עם אינטראקציות interparticle אטרקטיביות היא קריטית לעיצוב רציונלים של חומרים להרכבה בבימויו 1-3, משלוח סמים 4, 5-7 הפחמימנים השתפר, ואלקטרודות flowable לאחסון אנרגיה 8. מתלים המכילים קולואידים ניאון ופולימרים אינן adsorbing פונים מערכות מודל, כיחס של רדיוס הפולימר של הסתובבות לרדיוס החלקיקים וריכוז שליטה פולימר את הטווח ועוצמת המשיכה interparticle, בהתאמה. על ידי כוונון מאפייני הפולימר ועוצמת השבר של קולואידים, נוזלי קולואיד, נוזלים של אשכולות, ניתן להשיג ג&#39;לים, גבישים, וכוסות 9. מיקרוסקופיה confocal, גרסה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי, מאפשרת דגימה שקופה אופטי וניאון להיות צילמה עם גבוה במרחב וברזולוציה של זמן בשלושה ממדים. בטכניקה זו, חריר קטן או חריץ בלוקים אור הניאון הנפלט מאזורים של המדגם, כי הם מחוץ לנפח המוקד של המערכת האופטית מיקרוסקופ. כתוצאה מכך, סעיף דק בלבד של המדגם במישור המוקד הוא הדמיה. טכניקה זו היא גם מתאימה במיוחד כדי לחקור את המבנה ודינמיקה בהשעיות colloidal צפופות בקנה מידת חלקיק היחיד: החלקיקים הם גדולים מספיק כדי להיפתר באמצעות אור נראה ולפזר לאט מספיק כדי לנפול בפח במהירויות סריקה טיפוסיות של מערכות confocal מסחריות 10 . גם שיפורים במהירויות סריקה וניתוח אלגוריתמים אפשרו confocal הדמיה כמותית של השעיות זורמים 11-16,37. במאמר זה, אנו מדגימים ניסויי מיקרוסקופיה confocal לחקור מרותקת התנהגות השלב ותכונות זרימה של תערובות קולואיד פולימר. אנחנו הראשונים להכין את קולתערובות OID-פולימר שהן צפיפות ושבירה מדד מתאים. בשלב הבא, אנו מדווחים פרוטוקול סטנדרטי להדמית תערובות קולואיד פולימר צפופות שקטה תחת כליאה שונה בתאים בצורת טריז דקים. לבסוף, אנחנו מדגימים פרוטוקול הדמיה תערובות קולואיד פולימר במהלך זרימת microchannel.

כדי להדגים הדמיה confocal וחלקיקי מעקב, החוקרים בחנו את ההשפעה של כליאה בשלב ההתנהגות של תערובות קולואיד פולימר 63-65. בניסויים אלה בקוטר קולואיד היה 2 = 0.865 מיקרומטר. שבריר קולואיד הנפח נקבע על Φ = 0.15 והריכוז של p הפולימר ג היה מגוון 0-23.6 מ&quot;ג / מיליליטר. תמונות confocal נציג מוצגות באיור 2 63, בעמודה שמאלית. מעמדות החלקיקים שהושגו באמצעות אלגוריתמי מעקב, חישבנו את המדדים מבניים ודינמיים נציג, כוללים פו...

מיקרוסקופיה confocal משמשת לתערובות תמונה שקטה וזורמים קולואיד פולימר, הנלמדים כמערכות מודל להשעיות אטרקטיביות. אלגוריתמי ניתוח תמונה משמשים לחישוב מדדים מבניים ודינמיים לחלקיקי colloidal המודדים שינויים עקב כליאה גיאומטרית.

The behavior of confined colloidal suspensions with attractive interparticle interactions is critical to the rational design of materials for directed ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לכמת את השינויים בהתנהגות הפאזה המוגבלת ובמאפייני ההובלה של תמיחות קולואידיות מושכות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. דבר זה מושג על ידי ניסוח תערובות של קולואיד-פולימר כדי לדמות תמיחות קולואידיות מושכות. התערובות מצולמות ומוגבלות בתאי טריז דקים כדי להראות כיצד ההבלה משנה את דינמיקת המבנה ואת התנהגות הפאזה של תערובות אלו.בשלב הבא, התערובות מצולמות בעודן זורמות דרך מיקרו-תעלות כדי לקבוע את השפעת עוצמת המשיכה בין הקולואידים על תכונות ההובלה המוגבלות של התערובות. ניתוח תמונה אוטומטי ואלגוריתמים למעקב אחר חלקיקים יכולים להראות כיצד כליאה שקטה מובילה להתמצקות ולמתאם תמונתי. אלגוריתמים יכולים להראות כיצד עלייה בעוצמת המשיכה מובילה להתנהגות זרימה לא-ניוטונית גוברת.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים ופיזור אור דינמי, הוא שהיא מאפשרת גישה ישירה למסלולי חלקיקים בודדים, מהם ניתן לחשב מדדים דינמיים ומבניים לצורך השוואה ישירה לסימולציות. שיטה סטנדרטית זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הפיזיקה של חומר רך דחוס, כגון האופן שבו תרחיפים מתארגנים עצמית בנוכחות אינטראקציות בין-חלקיקיות, או כיצד תרחיפים קשיחים ודליליים נכנעים תחת כוח או מאמץ המופעלים עליהם. עבור פרוטוקול זה, הכינו חלקיקי PMMA המסומנים בצבע; עיינו בחומר הייחוס המקושר בטקסט של הפרוטוקול לצורך הוראות ההכנה הסטנדרטיות.הכינו תערובת ביחס של שלושה לאחד לפי משקל של broy heane ב-deco hydro nataline lean; לאחר מכן, הוסיפו tetra butyl ammonium ומלח אורגני לריכוז של 1.5 millimolar. הממס תואם למקדם השבירה של החלקיקים ומסנן חלקית את המטען שלהם כדי לקבוע במדויק את צפיפות החלקיקים. השעיו את החלקיקים בריכוז של 0.1 נפח לנפח בממס שהוכן, וסובבו את התוךי תחת צנטריפוגה ב-800 G למשך 75 דקות.יש לוודא שהחלקיקים אינם שוקעים לאחר הצנטריפוגה. לאחר מכן, כדי למנוע מהחלקיקים לשקוע, יש להוסיף את הממס הבסיס טיפה אחר טיפה עד להתאמת צפיפות הממס לצפיפות החלקיקים. בשלב הבא, הכין תרחיף של 40% של חלקיקי PMMA בתערובת הממסים שהוכנה.הכינו גם פוליסטירן לינארי בתערובת הממס בריכוז גבוה. לדוגמה, 50 milligrams per milliliter שחושב על בסיס המשקל המולקולרי ורדיוס הגירציה של הפוליסטירן. שימוש בתרחיף חלקיקי PMMA מרוכז ובתמיסת פוליסטירן מאפשר להכין תרחיפים של חלקיקים עם פולימרים בריכוז הרצוי.כאן התרחופת מכילה 15 אחוזי נפח של חלקיקי PMMA וריכוז הפולימר נע בין אפס ל-25 mg/mL באמצעות תרחופות מפוזרות של שני חלקיקי PMMA בגדלים שונים ובסימונים שונים בנפחים שווים. ניתן לערבב פרקציות גם עם תמיסת הפולימר. לאחר ערבוב כל תרחופת, יש לסבב אותן בצנטריפוגה ולאחר מכן להוסיף ממס בטיפות כדי להתאים במדויק את צפיפות הממס לצפיפות החלקיקים.לבסוף, יש להביא את כל הדגימות לשיווי משקל על ידי הנחת הדגימות האטומות בתוך Tumblr למשך 24 שעות לפחות לפני הדימות. התחילו בהרכבת תאי תגובה מלבניים מלוחיות זכוכית. עובי תג המיקרוסקופ כאן הוא מילימטר אחד, וכך גם עובי התא, המאפשר התנהגות של חומר במסה (bulk behavior) עבור תערובות הפולימר המעגליות.אם נדרשת תא בעל גבהים משתנים, צרו תאים בצורת טריז דק באמצעות כיסוי זכוכית בודד המונח במרווח על גבי טריז. זווית הפתיחה של התא היא פחות מ-0.5 מעלות ועובי התא עולה משש מיקרון עד למילימטר אחד. תצורה זו מאפשרת לשנות את עובי הכלילה באופן רציף; הכינו את התאים כך שיוכלו להיות מונחים על מיקרוסקופ הפוך ואטמו אותם באמצעות אפוקסי המתקשה תחת קרינת UV ועמיד לתערובת הממיסים שבה נעשה שימוש במיקרוסקופ.כאן מוצג ראש סריקה קונפוקאלי של סריקת שורה המחובר למיקרוסקופ הפוך עם עדשת טבילה בשמן 100x. עם מספר מפתח (numerical aperture) של 1.4, השתמשו באורכי הגל המתאימים כדי לעורר את הצבעים וצלמו תמונות של 50 micron רבוע ברזולוציה של 512 פיקסלים רבוע. התחילו עם זמן חשיפה של 1/32 שנייה ולאחר מכן התאימו את ההגדרות כדי לשפר את איכות התמונה.בשלב הבא, אתרו את תחתית התא, שם יידבקו החלקיקים. לאחר מכן, העבירו את המיקוד למרכז התא. כעת, צלמו כ-500 תמונות בקצב של פריים אחד לשנייה במישור המרכזי לצורך ניתוח דו-ממדי (2D).לאחר מכן, לצורך ניתוח תלת-ממדי, צלם תמונות Z stack במרווחים של 0.2 micron לאורך 30 microns בכל ניסוי דימוי נלווה. אופטימיזציה של תנאי הדימוי להשגת תמונות בעלות ניגודיות גבוהה היא קריטית. נתח את התמונות באמצעות חבילת תוכנה למעקב אחר חלקיקים.יש להשתמש באלגוריתם המסוגל להבחין בין חלקיקים ברזולוציה של 40 או 50 nanometers. מעקב אחר חלקיקים אפשרי רק אם החלקיקים נעים מרחק קצר מהמרווח הבין-חלקיקי בין פריימים עוקבים. כדי להעריך את מבנה החלקיקים ואת הדינמיקה שלהם, השתמש במדדים הבאים.פונקציית מתאם זוגית בתלת-ממד, תזוזה ריבועית ממוצעת בדו-ממד או תלת-ממד, וחלק עצמי של פונקציית המתאם של Van Hove בדו-ממד או תלת-ממד. עבור ניסוי זה, הכינו תא זרימה פשוט מנימי זכוכית ריבועי ברוחב 100 microns. חברו צינורות Teflon והשתמשו בכיסויי זכוכית לתמיכה מבנית.בשלב הבא, טענו את תערובת הקולואיד-פולימר הרצויה למזרק זכוכית וחברו אותו למערכת הגשה כגון משאבה. כעת, התקינו את המערך על המיקרוסקופ ההפוך כפי שבוצע בסעיף הקודם. יש לשמור על תא הזרימה של המזרק ועל פתח היציאה מפולסים ככל האפשר.קבעו את קצב הזרימה בהתאם לתערובת הפולימר הקולואידי. במהלך הזרימה דרך קפילרות מרובעות נעשה שימוש בריכוזים של 200 עד 2000 מיקרון לשנייה. אספו תמונות דו-ממדיות כפי שתושאר בסעיף הקודם, במרחקים שונים מרצפת התעלה, שבין 5 ל-50 מיקרון.אם החלקיקים נראים אליפטיים, הגדילו את קצב דגימת הפריימים (frame rate). השתמשו בתוכנת מעקב וב-IDL או MATLAB כדי לנתח את הזרימה. השגת רזולוציה מתחת לרמת הפיקסל (sub pixel resolution) במעקב אחר חלקיקים דורשת כיוונון מדויק של פרמטרי המעקב כדי להפיק OID-ים שאינם מוטים לכיוון מסוים.במהלך זרימה איטית, כאשר החלקיקים נעים מרחק הקטן מהמרחק הבין-חלקיקי בין פריימים, ניתן להפיק מסלולים באמצעות שגרות מעקב בזרימה מהירה יותר. השתמשו במתאם תמונות (image correlation) כדי לחשב את המהירות.חלקו כל תמונה לתמונות אופקיות בכיוון הזרימה. בתמונות עוקבות, הסיטו את התמונה השנייה כך שתתאים לראשונה, והשתמשו במרחק ההסטה כדי לחשב את המהירות בין זוגות תמונות או עבור כל תת-חלקה של התמונות המקוריות. צרו היסטוגרמה של כל ערכי ההסטה שחושבו.אם הערכים אינם ממוקדים בחדות, חזור על הניסוי בקצב פריימים מהיר יותר. חלקיקי PMMA בעלי קוטר של 0.865 microns הושעו בריכוז של 15% לנפח ב-23.6 milligrams של פולימר למיליליטר של תערובת ממסים. מדדים מבניים ודינמיים משמשים להערכת התמונות, כולל מתאם זוגי (pair correlation) והעתקה ריבועית ממוצעת (mean square displacement).שינוי של תרחיף עשוי לשנות את המבנה והדינמיקה של תרחיפים כלואים. לדוגמה, נוסחה תרחיף מפוזר של חלקיקים בגודל 1.48 micron ו-0.73 micron שבה החלקיקים תפסו 15% מהנפח על ידי הפחתת עובי הכליאה. השרה פאזה של ג'ל קולואידי דמוית מוצק הכוללת את שני סוגי החלקיקים, כאשר ההעתקה המרובעת הממוצעת (mean square displacement) של החלקיקים הגדולים פחתה ככל שהמערכת הייתה כלואה יותר.בדומה לזרימת התמצקות, הושוו תכונות של חלקיקים בעלי משיכה חלשה וחלקיקים בעלי משיכה חזקה. ריכוז הפולימר השתנה בין 5 ל-25 mg/mL. בתליות, התליה בעלת המשיכה החלשה הראתה פרופיל צפיפות שהשתנה באופן משמעותי בהתאם למיקום לאורך התעלה.בזרימה של 10 µL לשעה, פרופיל הצפיפות של התוך-תליה בעלת המשיכה החזקה היה כמעט קבוע לרוחב התעלה תחת אותם תנאים. באופן דומה, נצפו הבדלים בפרופילי המהירות של תוך-תלייים אלו. חלקיקים בעלי משיכה חלשה היו קרובים לתחזית הניוטונית עבור המהירות שלהם, בעוד שחלקיקים בעלי משיכה חזקה סטו מעט מהתחזית הניוטונית עבור המהירות שלהם, במיוחד בקרבת הדופן הצדית של התעלה, שבה Y הוא אפס.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן השימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית לחקר התנהגות פאזות ותכונות זרימה של תרחיפים קולואידיים בהתאם לנוהל זה. ניתן לחשב מדדים נוספים, כגון גדלי אשכולות וממדים פרקטליים, מתוך מיקומי החלקיקים כדי לענות על שאלות נוספות, כגון השאלה כיצד הגבלה מרחבית משנה את צורתם של האשכולות המצטברים.

confocal-imaging-confined-quiescent-flowing-colloid-polymer

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

כאן אנו מדגימים את הפרוטוקולים לביצוע מולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לחיות תאים חיידקיים לאפשר קומפלקסים מולקולריים תפקודית כדי להתגלות, מעקב לכמת.

הדמיה מולקולרית מכלולים יחיד In vivo באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקדם

בעבודה זו נסביר את ייצור ושימוש במיקסר microfluidic מסוגל ערבוב שני פתרונות ~~~HEAD=NNS 8 μs. כמו כן, אנו מדגימים את השימוש מערבלי אלה עם זיהוי ספקטרוסקופיות באמצעות הקרינה UV ותהודה הקרינה העברת אנרגיה (סריג).

מערבלים microfluidic ללימוד קיפול חלבונים

מוצג פרוטוקול לכימות והשוואה בו-זמנית של שלושה רכיבים תאיים וחוץ-תאיים בתוך ביופילמים. המתודולוגיה כוללת שימוש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי, תוכנת ניתוח והדמיה מבנית של ביופילם ותוכנת ניתוח סטטיסטי.

כימות בו-זמני של רכיבים תאיים וחוץ-תאיים של ביופילמים

לביופילמים יש אינטראקציות מורכבות עם הסביבה הסובבת אותם. כדי לחקור באופן מקיף אינטראקציות בין ביופילם לסביבה, אנו מציגים כאן סדרה של שיטות ליצירת סביבה כימית הטרוגנית להתפתחות ביופילם, לכימות מהירות זרימה מקומית ולניתוח הובלת מסה בתוך מושבות ביופילם ובסביבתן.

שיטות לאפיון Co-הפיתוח של Biofilm ובית גידול הטרוגניות

כדי לחקור מהירויות זרימה וכיווניות של אקטין חוטי בסינפסה האימונולוגית של תאי T, הדמיה ברזולוציה גבוהה של תאים חיים משולבת עם פלואורסצנציה של השתקפות פנימית כוללת ומכומתת עם ספקטרוסקופיה של מתאם תמונה מרחבית-זמנית.

קליפת המוח אקטין זרימה בתאי T לכמת ידי מתאם תמונת ספקטרוסקופיה מרחב ובזמן של תאורה מיקרוסקופית נתונים מובנים

פילמור ממטרים ללא עוררה מספק גישה אבי טיפוס ודגמים, לשחזור לסינתזה של פולי גירויים רגיש (-isopropylacrylamide N) microgels של התפלגות גודל הצרה. בסינתזה בפרוטוקול זה, אפיון פיזור אור ומעקב קרינת חלקיק בודד של microgels אלה או בהתקנה של מיקרוסקופיה רחב בתחום הם הפגינו.

סינתזה מבוקרת מעקב הקרינה של פולי אחיד מאוד (<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide) Microgels

פרוטוקול זה מתאר את הסינתזה והניסוח של ביו-חומרים הידרוג'ל הידרוג'ל להזרקה, סופראמולקולריים (PNP). יישומים של חומרים אלה לאספקת תרופות, ייצוב ביופארמה, אנקפסולציה של תאים ואספקה מודגמים.

הידרוג'ל פולימר-ננו-חלקיקי להזרקה עבור יישומי אספקת תאים ותרופות

הטכניקה המוצעת תספק גישה חדשנית, יעילה, חסכנית ולא פולשנית להדמיית זרימה נוזלית דרך מצע אבקה ארוז, המניב רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה.

טכניקת הדמיה חסכנית של זרימה נימית באמצעות אבקות הדפסה פולימריות תלת מימדיות

אנו מציגים פרוטוקול ליישום מיקרוסקופיה של השתקפות הפרעות ומיקרוסקופיה כוללת-פנימית-השתקפות-פלואורסצנטית להדמיה בו-זמנית של מיקרו-טובולים דינמיים וחלבונים הקשורים למיקרו-טובולים המסומנים באופן פלואורסצנטי.

השתקפות הפרעה סימולטנית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת להדמיה מיקרוטובולים דינמיים וחלבונים נלווים

כאן מוצג פרוטוקול לביצוע וניתוח הקשירה, הניידות וההרכבה של מולקולות בודדות על ממברנות שומנים מלאכותיות צפופות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת של מולקולה אחת (smTIRF).

דיפוזיה והרכבה של מולקולה בודדת על ממברנות שומנים עמוסות פולימרים

פרוטוקול זה מפרט את התכנון והייצור של מכשיר מיקרופלואידי, המתאים לחקירת מכניקת פולימרים מיקרו-צינוריים. הסינתזה של מיקרו-ייצור, בקרת זרימה אוטומטית וטכניקות מידול חישוביות מאפשרת מערכת גמישה המתאימה באופן אידיאלי לחקירת השלד התאי במבחנה.

פיתוח גישה מבוססת מיקרופלואידיקה לחקר מכניקת פולימרים מיקרו-צינוריים

חקור התנהגות פאזה ותכונות תחבורה של תלכידים קולואידיים מושכים באמצעות מיקרוסקופיית confocal. השיטה מאפשרת ניתוח מבני ודינמי ישיר של תערובות פולימר-קולואיד במערכות מוגבלות גאומטרית.

ההדמיה confocal של רגיעה מרותקת ותערובות קולואיד פולימר מזרימים

גלה סרטונים נוספים