ייצור מרוכז, חמצן שומנים מבוסס microbubble אמולסיות ידי הגזירה גבוהה Homogenization וריכוז סידורי

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לייצר נפח גדול של מיקרו-בועות חמצן מבוססות ליפידים המרכיבות את עצמן (self assembling), או OMS, לצורך אספקת חמצן תוך-ורידית. דבר זה מושג באמצעות הומוגנייזר בעל כסכסוך גבוה ומכל אטום לגז לייצור וריכוז סדרתי של OMS. השלב השני הוא שימוש במזרקים שונה כדי לדחוס אמולסיית LOM המכילה 70 אחוזי נפח של חמצן.

בשלב הבא, האמולסיה מרוכזת באמצעות סרטיפוגציה כדי להפיק קצף חמצן בריכוז של 90 אחוזי נפח. השלב הסופי הוא ביצוע בקרת איכות על ידי חישוב אחוז הנפח של החמצן והערכת התפלגות גודל החלקיקים באמצעות טכנולוגיית פיזור אור. בסופו של דבר, הומוגניזציה בעוצמה גבוהה (high shear homogenization) מייצרת שני ליטרים של OMS המכיל 90% חמצן בנפח.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על שיטות ייצור קיימות, כגון סוניקציה ואמלגמציה, הוא שהומוגניזציה מייצרת מיקרו-בועות המרכיבות את עצמן בסדרי גודל של ליטרים, נפח הנחוץ לבדיקות של אספקת חמצן טיפולית בבעלי חיים גדולים. אחד השימושים בטכניקה זו הוא טיפול בחולים עם היפוקסמיה גבוהה, מכיוון שמיקרו-בועות ממולאות בגז חמצן מעבירות חמצן לדאוקסיהמוגלובין תוך שניות ספורות ונושאות פי שלושה מתכולת החמצן של הדם Visual. הדגמה של שיטה זו חשובה בשל עומקו של ראש ההומוגניזטור.

שמירה על סביבה מחומצנת לחלוטין והבחנה בין LMS מרוכז לבין הפאזה המימית עשויות להיות קשות להערכה. המערכת לייצור מיקרו-בועות חמצן מבוסססות ליפידים או OMS מורכבת ממכל אחסון וריכוז (HCT) המצויד במערבל בעל שלב אחד, הומוגניזטור בעל גזירה גבוהה (high shear) המותקן בקו, משאבת גלילים להעברת נוזלים בין ה-HCT להומוגניזטור, ומחליף חום.

כדי להתחיל בהגדרת המערכת, הניחו כלי איסוף זכוכית סטרילי בעל פיה רחבה בנפח ארבעה ליטר, המצויד בשני פתחי בסיס ושלושה פתחי צד, מתחת למערבל החד-שלבי. חברו לאחד מפתחי הבסיס של ה-HCT, פתח מספר אחת, צינורית שקופה סטרילית בעלת קוטר פנימי של 3/8 אינץ', באורך של כ-10 אינץ', המצוידת בברז עצירה תלת-כיווני בקצה לצורך איסוף האמולסיה המרוכזת. לאחר מכן, חברו את פתח הבסיס השני, פתח מספר שתיים, לצינורית סטרילית בעלת קוטר פנימי של 3/8 אינץ', באורך של כ-36 אינץ'. העבירו את הצינורית זו דרך משאבת הגלגול.

כניסת ההומוגניזטור בעל השערה הגבוהה מצוידת במחבר T הכולל שני פתחים. חברו צינור מפתח מספר שתיים דרך משאבת הגלילים וחברו לפתח הצדדי של מחבר ה-T. חברו את הפתח השני למכל חמצן באמצעות מד זרימה של גז חמצן לספיקה נמוכה.

חבר את יציאת ההומוגניזר בעירה הגבוהה (high shear homogenizer) לכניסה של מחליף חום מקוורי (inline heat exchanger) השומר על טמפרטורה של 4 °C. חבר את יציאת מחליף החום לפתח ההחזרה של ה-HCT כדי ליצור מערכת בעלת מעגל סגור. חבר את מיכל החמצן באמצעות מד זרימה ל-HCT דרך פתח מספר 4.

לבסוף, חברו מדComposition גז הפתוח לאטמוספירה לפתח העליון של ה-HCT. כדי להתחיל בהליך זה, הניחו 20 גרם של GMP one two DYS steer oil, SN glycerol three PHOSPHOCHOLINE או DSPC ו-10 גרם כולסטרול בתחתית ה-HCT. הוסיפו ליטר אחד של plasma light A ל-HCT וערבבו ידנית במשך דקה אחת, כדי לשלב כמה שיותר ליפידים פנימה לשלב המימי.

הורידו את המערבל החד-שלבי אל תוך הפאזה המימית, תוך הבטחה שכל ראש המערבל מכוסה על ידי הפאזה המימית. כדי למנוע זיהום של חלל הראש על ידי אוויר הסביבה, השתמשו באטמי גומי או בסרט דבק כדי להבטיח שחלקו העליון של ה-HCT אטום לגז ושאין פתחי צד פתוחים. הפעילו את מקור הגז המחובר לפתח מספר ארבע והמתינו עד ששבר החמצן בחלל הראש של ה-HCT יעלה על 95%. בעזרת המערבל החד-שלבי, ערבבו את תמיסות המקור (precursor emulsion) למשך חמש דקות. במהירות של 5,000 RPM, התערובת המתקבלת צריכה להיראות לבנה בהירה ולא להכיל גושי ליפידים נראים לעין.

לאחר הערבוב, ניתן לשמור תערובת מים-ליפידים שאינה בשימוש בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך עד 30 ימים לפני השימוש. יש להזרים את כל מערכת הלולאה הסגורה עם תמיסות המקור על ידי הפעלת משאבת הגלילים בשיעור של 1.3 ליטר לדקה או LPM. לאחר שהמערכת מוזנת, יש להשאיר את המשאבה פועלת ב-1.3 LPM כדי להתחיל בייצור ה-LO's.

הפעל את ההומוגנייזר בעל הגזירה הגבוהה בקו (inline high shear homogenizer) ל-7,500 RPM. מיד לאחר מכן, הפעל זרימת חמצן לחלק הכניסה של ההומוגנייזר בקצב של 0.5 LPM. השאר את המערבל החד-שלבי ב-HCT דולק ב-3,500 RPM.

Oms נוצרים בממשק שבין להבי הרוטור למסנני האמולסיה בתוך ההומוגניזטור המקוון. בתוך הדקות הראשונות, הנוזל אמור להפוך לסמיך יותר באופן נראה לעין. הפעילו את המערכת למשך 15 דקות ולאחר מכן כבו את ההומוגניזטור בעל השערים הגבוהים ואת כניסת החמצן אליו.

פעולה זו מפחיתה הפרדה פאזית ושומרת על המוצר אחיד יחסית בתוך ה-HCT. שימו לב כי נפח האמולסיה מלאת הגז אמור לעלות פי שניים עד שלו בקירוב במהלך שלב הריכוז הסדרתי. מזרקי ה-lure lock בנפח 140 milliliters לאיסוף ה-OMS המיוצר עברו התאמה מוקדמת על ידי שאיבת 100 milliliters של אוויר למזרק, ולאחר מכן ניסור של שארית הבוכנה וחומר המזרק שמעל סימון ה-140 milliliters.

חברו מזרק סטרילי שעבר התאמה לברז המחובר ליציאה מספר אחת של כלי האיסוף. השתמשו בפינצטה בעלת שיניים כדי להוריד את הבוכנה ולשאוב 100 milliliters של נוזל, ואטמו את המזרק בחוזקה. חזרו על הפעולה עד להוצאת כל הנוזל. סבבו את המזרקים בצנטריפוגה עם הקצה האטום הפונה כלפי מטה, בתוך דלי מקורר, ב-225 times G למשך 10 דקות. לאחר הסבב יופיעו שלוש שכבות של חומר; הוציאו והשליכו את השכבה התחתונה של הפאזה המימית העכורה העודפת.

השכבה השנייה היא לבנה ובהה ומכילה oms רכזים. העבירו את הקצף הרכז למזרק זכוכית חסין גז באמצעות ברז תלת-כיווני למניעת זיהום מגזים מהסביבה. השליכו את השכבה האחרונה, המכילה גז חמצן חופשי מ-oms שהתפוצצו.

ניתן להעריך את איכות הקצף על ידי חישוב ריכוז הגז באופן הבא. קצף באיכות גבוהה יגיע לריכוז גז של 90 אחוזי נפח או יותר; כבקרת איכות שנייה, נמדד גודל המיקרו-בועות באמצעות פיזור אור אופטי כדי לקבוע אם גודל החלקיקים נמצא בטווח הצפוי. יש לציין ששינוי בזמן ההומוגניזציה או בפורמולציה עשוי לשנות את גודל הבועות; סגרו היטב את מזרקי הזכוכית המכילים oms רכז.

באמצעות חיבור מסוג lure lock, ניתן לאחסן מזרקים בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס, 4 מעלות צלזיוס או מינוס 20 מעלות צלזיוס. טמפרטורות נמוכות יותר עשויות לספק יציבות מוגברת של חיי המדף. באמצעות פרוטוקול זה ניתן לייצר עד שני ליטרים של OMS רכז בתוך 90 דקות.

ויזואליזציה של דגימה של 10 µL של OMS באמצעות מיקרוסקופיה של אור חשפה OMS כדוריים וכן ריכוז יחסי של פס debris ליפיד. כאשר אותה דגימה של OMS נבחנה באמצעות פיזור אופטי, קוטר החלקיקים הממוצע היה 2.624 ± 0.332 µm. יותר מ-90% מה-OMS היו בעלי קוטר של פחות מ-10 µm והאוכלוסייה הייתה פולי-דיספרסיבית.

צמיגות האמולסיה הייתה תלויה במידה רבה בחלק הגז, ולפיכך בריכוז המיקרו-בועות. נבדקו מנות של 2 מיליליטר של אמולסיית LOM בריכוזי גז של 60, 70 ו-90 אחוזי נפח, באמצעות סריקת זרימה במצב יציב תוך שימוש בלוח מקבילי של 40 מילימטר.

כאשר המתח שונה בין 0.1 ל-1000, OMS המכיל 60 אחוזי נפח של גז הראה פרופיל רדיולוגי דומה לדם אנושי. תכולת החמצן של ה-OMS נבדקה על ידי הוספת נפחים משתנים של חמצן בתוך 60 אחוזי נפח של OMS למנות של דם אנושי שסורג ממנו חמצן עם גרעון חמצן ידוע. הקשר בין נפח החמצן שהתווסף בתוך ה-OMS לבין העלייה הנפחית בתכולת החמצן של הדם היה 1.053 פלוס או מינוס 0.03025.

ממצאי המחקר מעידים כי ה-OMS שנבדקו מכילים כמעט 100% חמצן, הראו מעט מאוד כיסי גז כלואים, והעבירו ביעילות את כל מטען החמצן שלהם לדם אנושי in vitro. ברגע ששיטה זו תהפוך לשולה, ניתן יהיה להשתמש בה לייצור שני ליטרים של LMS ב-90 דקות, בתנאי שהיא תבוצע באופן תקין ויעיל. במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על בדיקה חזותית של ה-OMS המצטברים ולבצע בקרת איכות על ריכוז קצף ה-LOM. בעקבות הליך ייצור זה, ניתן להשתמש ב-OMS להזרקה תוך-ורידית בקנה מידה רחב ולהעברת גזים טיפוליים.