שיטה ליצירת ריאות neutrophilia שימוש התרסיס lipopolysaccharide

אנו מתארים שיטה לגרימת דלקת ריאות neutrophilic על ידי אתגר לlipopolysaccharide תרסיס על ידי עִרפּוּל, מודל פציעת ריאות חריפה. בנוסף, טכניקות ניתוחיות בסיסיות לבידוד ריאה, אינטובציה לקנה הנשימה ושטיפה ברונכואלוואולרית הם גם תיארו.

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור נויטרופיליה עקבית וניתנת לשחזור בדרכי הנשימה על ידי חשיפה ל-LPS אירוסול. זה מושג על ידי טעינה ראשונה של LPS תלוי במי מלח לתוך נבולייזר המחובר לתא חשיפה. לאחר מכן, העכברים נחשפים ל-LPS התרסיסי ולאחר מכן נאספת שטיפת הסימפונות ונספרים תאים דלקתיים בשטיפה.

לבסוף, רקמת הריאה מקובעת פנימה, באופן רשמי לצורך הטמעה וחתך וניתוח אימונוהיסטוכימי. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בספירת התאים הכוללת והדיפרנציאלית של שטיפת הסימפונות כדי להעריך את גיוס הנויטרופילים לריאות. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מתן LPS תוך-קנה הם פיזור אחיד של LPS בתרסיס בכל הריאות, קלות הביצועים וההכשרה המינימלית הנדרשת ליישום מוצלח כדי ליצור תרסיס LPS באמצעות PPE מתאים ובתוך מכסה מנוע מאוורר ברמה שתיים, התחל בהכנסת כניסה אדומה לתוך נבולייזר ולאחר מכן חיבור הנבולייזר לאוויר החדר בלחץ על ידי הצינור המסופק על ידי יצרן.

לאחר מכן, השתמש במסנן אוויר כדי לחבר את שקע הנבולייזר למד זרימת מסה, ואז חבר את מד זרימת המסה לאספקת חשמל. כוונן את זרימת האוויר לחמישה ליטר לדקה, תוך שמירה על הלחץ על בר אחד עד שניים, ולאחר מכן הסר את מד זרימת המסה ונתק את זרימת האוויר. לאחר מכן, חבר את שקע הנבולייזר לצינור התפצלות בגודל 15.9 מילימטר המחובר לקופסאות פרספקס בגודל 2 1 50 על 1 63 על 2 0 5 מילימטר המצוידות במכסים נשלפים.

לכל קופסה צריך להיות חור של חמישה מילימטר בצד הנגדי לכניסה כדי למנוע הצטברות לחץ. כעת הכניסו עד חמישה עכברים לכל קופסה וסגרו את המכסים. ואז פתח את הנבולייזר.

מלאו את התוספת בארבעה עד שמונה מיליליטר של LPS מומס במי מלח או ברכב מלוח בלבד, וחברו מחדש את הכניסה לאספקת האוויר. אפשר לתרסיס לזרום לתוך קופסאות הפרספקס הסגורות תוך ניטור רציף של בעלי החיים ולוודא שאספקת האוויר נשארת מאובטחת היטב לכניסה של הנבולייזר במהלך התרסיס. לאחר 10 דקות, נתק את אספקת האוויר והשאיר את בעלי החיים בקופסאות פרספקס למשך שתי דקות נוספות.

ואז פתח את המכסים. אפשר לתרסיס להתפזר ולהחזיר את העכברים לכלובים שלהם בנקודת הסיום של הניסוי עבור כל בעל חיים בתורו, השתמש תחילה במספריים כדי לבצע חתך אחורי קדמי יחיד כדי לחשוף את בית החזה. לאחר מכן, הרם את כלוב הצלעות בקצה הקדמי של עצם החזה ונקב את הסרעפת בנקודה הגחונית ביותר מבלי לחתוך רקמת ריאה כלשהי.

לאחר מכן פתח את כלוב הצלעות עם שני חתכים הנפגשים מתחת ללסת בכיוון האחורי הקדמי. לאחר פתיחת כלוב הצלעות, השתמש במלקחיים כדי לפרק אותו בעדינות ולחתוך את קנה הנשימה מתחת לגרון. כעת הרם את קנה הנשימה וחתוך את הרצועות המחברות את אונות הריאה לחלל בית החזה.

לאחר מכן משוך בעדינות את הריאות וקנה הנשימה כלפי מעלה והרחק מרקמת השומן והלב והנח אותם על פיסת נייר אריזת מזרק. לאחר מכן, הכנס צינור פוליאתילן 0.965 מילימטר לקנה הנשימה ואבטח אותו בחוט משי. קושרים גם את האונה הרב-אונה בחוט משי, ולאחר מכן מכניסים מחט בגודל 23 לתוך צינור הפוליאתילן.

לאחר מכן כדי לאסוף את שטיפת הסימפונות, השתמש במזרק מיליליטר אחד כדי להזריק לאט 250 מיקרוליטר קרח הנקרא PBS סטרילי לאונה היחידה, וכדי להקיש בזהירות על הריאות ועל פני שולחן העבודה 30 פעמים למשוך לאט את הנוזל בחזרה למזרק ולאסוף אותו בצינור לאחר חזרה על ההליך עם 200 מיקרוליטר PBS טרי, הנח את שטיפת הסימפונות על קרח לניתוח מאוחר יותר. כדי לתקן את רקמת הריאה לניתוח היסטולוגי, הסר את האונה הרב-אונית והצמד. הקפיאו אותו על קרח יבש.

אחסן את האונה במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי לתקן את הרקמה לניתוח היסטולוגי, הרכיבו מזרק של 60 מיליליטר ללא בוכנה על מעמד תמיכה מתכתי ונפחו את האונה הבודדת בפורמלין למשך חמש דקות. לאחר מכן נתק את המחט ומשוך את חוט המשי כדי להסיר אותו יחד עם צינור הפוליאתילן מקנה הנשימה.

בו זמנית סוגרים את קנה הנשימה ושומרים על הלחץ בריאה. לאחר מכן, טבלו את האונה בפורמין למשך 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את הטישו הקבוע שלוש פעמים למשך 20 דקות לפחות בכל פעם באתנול 70%.

לאחר הטמעת הרקמה המיובשת בסרט פרה, חותכים את האונה לארבעה עד חמישה חלקי מיקרון וצובעים את החלקים בהמטין ואואין להערכה היסטולוגית. מספר התאים הכולל בנוזל שטיפת הסימפונות של עכברים שנחשפו לתרסיס שנוצר עם רכב בלבד הוא בדרך כלל בסביבות או מתחת ל-200,000 תאים. התאים מורכבים מ-95 עד 100% תאים חד-גרעיניים עם מעט לימפוציטים וללא נויטרופילים.

עכברים אותגרו עם מיליגרם אחד למיליליטר של אירוסול. LPS. עם זאת, מציגים מספר תאים כולל מוגבר בנוזל שטיפת הסימפונות, בדרך כלל גדול מ-500,000 תאים לאחר שש שעות כאשר חדירות התאים נשארות גבוהות לאחר 24 שעות, ועם פרופיל תאים שהוסט לכיוון דומיננטיות של נויטרופילים. פרופיל תאים דלקתי דומה ונויטרופיליה ריאתית נצפה גם עם ערפול של חמישה מיליגרם למיליליטר LPS.

נויטרופילים נצפו בתת-רירית האפיתל כמו גם בחללים המקיפים את דרכי הנשימה וכלי הדם המוליכים לאחר שש ו-24 שעות של אתגר LPS, אך לא בשליטה. עכברים שטופלו במי מלח. תכולת החלבון הכוללת בנוזל שטיפת הסימפונות של עכברי אתגר LPS מוגברת בהשוואה לעכברים שנחשפו למי מלח והביטוי של כימוקינס הנויטרופילים המושכים כימותרפיה c, XCL one ו-C XCL 2 מוגבר גם בעכברים מאותגרים LPS.

אם כי שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי דלקת ריאות הנגרמת על ידי LPs. ניתן ליישם אותו גם על מודלים אחרים של מחלות כגון זיהומים חיידקיים או ויראליים, שכן ניתן להתאים את האדים המרוססים כדי לספק אתגרים רבים ושונים.