Name: שיטה ליצירת ריאות neutrophilia שימוש התרסיס lipopolysaccharide (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: למדו שיטה לאינדוקציה של דלקת ריאות נויטרופילית באמצעות LPS מרוסס באוויר בעכברים. הטכניקה כוללת נבוליזציה, בידוד ריאות ושטיפת ברונכואלוולרית לאיסוף תאים דלקתיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לקרסטין Thim (AstraZeneca, לונד, שוודיה), בניטה Dahlberg וד&quot;ר אנדרס אקלונד (קרולינסקה, שטוקהולם, שוודיה), כמו גם ד&quot;ר מרטין סטאמפפלי (אוניברסיטת מקמאסטר, המילטון, ON, קנדה) לקבלת סיוע מיומן ועצה מומחה.

המחקרים בבעלי החיים אושרו על ידי ועדת אתיקה לרווחת בעלי החיים בצפון שטוקהולם. הפרוצדורות בוצעו בציות לחוק שוודי. 1. יצירת תרסיס LPS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר 0.5 גרם מטוהר P. aeruginosa LPS בתמיסת מלח סטרילית 50 מיליליטר עם תסיסה עדינה ולאמת פירוק. לדלל 1 מיליליטר מומס LPS ב9 מיליליטר תמיסת מלח סטרילית, לריכוז סופי של 1 מ&quot;ג / מיליליטר. להגן מפני אור עם רדיד האלומיניום ולאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר LPS solubilized בחושך בטמפרטורת חדר ומערבבים היטב מייד לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף הביולוגי מסוכן ברמה השנייה מאוורר, הכנס כניסה אדומה לnebulizer, ולחבר את nebulizer לאוויר חדר דחוס באמצעות צינורות הניתנים על ידי (ערכת סקירה המציגה את המכשירים הניסיוניים באיור 1) יצרן. זהירות: ציוד מגן אישי מתאים, ובכלל זה שימוש חוזר respirat מחצית חתיכת פניםאו עם מסנני חלקיקים, משקפי מגן, כפפות ובגדי מגן יש להשתמש במהלך החשיפה. </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/51470/51470fig1highres.jpg" /> איור 1:. מצגת סכמטי של המכשירים הניסיוניים המשמשים לייצור תרסיסי הכניסה של nebulizer מחוברת לאספקת אוויר. היציאה של nebulizer מחוברת ראשון מד זרימה דרך צינור 15.9 מ&quot;מ ומסנן אוויר, ואספקת אוויר מותאם ל5.0 L / מ &#39;בלחץ kbar 2. השקע הוא הבא מחובר למצוידת עם מכסים נשלפים ו -5 חורים מ&quot;מ כדי למנוע הצטברות לחץ תיבת פרספקס. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את היציאה של nebulizer לflowmeter המוני באמצעות מסנן אוויר. חבר את מד הזרימה ההמונית לאספקת חשמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את אספקת האוויר ל5 L / min, עם לחץ שנותר ב1.0-2.0 בר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מד הזרימה ההמונית ונתק את אספקת האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את היציאה של nebulizer לצינור 15.9 מ&quot;מ, שמתפצל ומתחבר לשתי תיבות פרספקס עם הממדים: 150 x 163 x 205 מ&quot;מ, מצוידים עם מכסים נשלפים. כל תיבה צריכה להיות חור 5 מ&quot;מ בצד מנוגדים הכניסה, כדי למנוע הצטברות לחץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח עד 5 עכברים בכל תיבת פרספקס ולסגור את העפעפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את nebulizer ולמלא את הכנס עם לפחות 4 LPS מיליליטר מומס בתמיסת מלח או רכב סטרילי לבד (תמיסת מלח סטרילית; הנפח לא יעלה על 8 מיליליטר). Re-לחבר את הכניסה לאספקת האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר התרסיס לזרום לתוך תיבות פרספקס הסגור במשך 10 דקות. לפקח על בעלי החיים ברציפות. ודא שאספקת האוויר נשארה בחוזקה מאובטחת לכניסה של nebulizer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתק את אספקת האוויר. עם המכסים סגורים, תן לחיות להישאר בתיבות פרספקס 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את המכסים ולאפשר לתרסיס לפיזור, ולהחזיר את בעלי החיים לtהוא כלובים. אם בעלי החיים מופיעים רטובים, למקם את הכלובים על כרית חימום מוגדרת חום נמוך, כדי למנוע היפותרמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על בעלי החיים ברציפות במשך 30 דקות הראשונות, ולאחר מכן כל שעה 2 ל6 שעות הראשונות. בעלי החיים צריכים להפגין דפוס נשימה נורמלי ופעילות במהלך ואחרי הליך עִרפּוּל. </li></ol> 2. שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודת סיום הניסוי, עמוק להרדים את החיות עם isoflurane להשפעה כפי שהומלץ על ידי צוות הוטרינרים של המוסד שלך. לצבוט את כף הרגל האחורית כדי לבדוק רפלקס נסיגה כדי להבטיח עומק מספק של הרדמה לנהל ניתוח גדול. תרסיס למטה הפרווה של בעלי החיים עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הבטן באמצעות מספריים, ולנתק את אב העורקים לexsanguinate בעלי החיים. מניחים פיסת הרקמה על הבטן כדי לספוג את הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Follwing המתת חסד, להשתמש לחתוך קדמי, אחורי יחיד של המספריים ללחשוף את החזה. להרים את כלוב צלעות על ידי הקצה הקדמי של עצם החזה ולהשתמש במספריים לנקב את הסרעפת בנקודת הגחון ביותר, בלי לחתוך את כל אונת ריאה. לפתוח את בית החזה על ידי ביצוע שני חתכים בכיוון הקדמי, אחורי (מפגש מתחת ללסת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך בעדינות לגזרים את כלוב הצלעות באמצעות מלקחיים, וחתך את קנה הנשימה מתחת לגרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את קנה הנשימה עם המלקחיים ולהסיר את הריאות על ידי חיתוך הרצועות המחברות את האונות לחלל בית החזה, ומשייכתו בעדינות על ידי השומן ורקמת לב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס צינור פוליאתילן (קוטר פנימי: 0.58 מ&quot;מ; קוטר חיצוני: .965 מ&quot;מ) לתוך קנה הנשימה ולאבטח את הצינור עם מחרוזת של חוט משי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשור את multilobe (ארבע אונות של הריאה ימין) עם חוט משי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מחט 23 מד לתוך צינור פוליאתילן ולהזריק לאט 250 μl של PBS סטרילי קר כקרח לאונה אחת עם מזרק 1 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברז בזהירות את הריאות30 פעמים ולאסוף את הנוזל באמצעות המזרק. חזור על התהליך עם 200 μl PBS (כ -300 μl PBS צריך להיות התאושש מהאונה אחת מהנפח הכולל של 450 הזריק μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את נוזל שטיפת רונכואלוואולרית (בלף) על קרח, או למנות את תאי BAL באופן מיידי. ספירת התאים עם heamocytometer, באמצעות פתרון טורק להכתים את התאים 11. חישוב המספר הכולל של התאים על ידי הכפלת מספר התאים עם הגורם לדילול של הפתרון מכתים והנפח בתחום נספר של heamocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ספירת תאי ההפרש מתאי cytocentrifuged כפי שתואר במקום אחר 11. </li></ol> 3. פורמלין קיבוע של רקמת ריאות להערכה היסטולוגית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את multilobe וsnap-הקפאת קרח יבש. חנות ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר מזרק 60 מיליליטר עם הבוכנה הוסרה על דוכן תמיכת מתכת. מלא את המזרק עם פורמלין 10% להגובה של 20 סנטימטרים מעל ספסל המעבדה, המייצגים את 20 סנטימטרים של לחץ מתמיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את מחט 23 מד מאובטח לקנה הנשימה למזרק 60 מיליליטר באמצעות צינור פלסטיק עם שסתום כדי לשלוט בזרימה של פורמלין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Insufflate אונת הריאה עם פורמלין למשך 5 דקות. נתק את המחט ולהסיר אותו יחד עם צינור פוליאתילן מקנה הנשימה תוך משיכת חוט המשי כדי לסגור את קנה הנשימה ולשמר את הלחץ בריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את אונת הריאה בפורמלין ולתקן למשך 24 שעות על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הרקמה קבועה שלוש פעמים לפחות 20 דקות עם 70% אתנול, ומייבש לקסילן באמצעות המשטר הבא (1 שעה כל אחד): <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3x אתנול 70% </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3x אתנול 95% </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3x אתנול 100% </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קסילן 3x </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1x פרפין (נוזל) </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמה להטביע מיובשת בפרפין, לחתוך ב4-5 מיקרומטר סעיפים, ואת כתם עם hematoxylin ו eosin, כדי לאפשר הערכה היסטולוגית.</li>
</ol>

<ol><li>King, J. D., Kocincova, D., Westman, E. L., Lam, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Lipopolysaccharide+biosynthesis+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Review: Lipopolysaccharide biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa.</a> Innate Immun. 15, 261-312 (2009).</li>
<li>Grommes, J., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+neutrophils+to+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Contribution of neutrophils to acute lung injury.</a> Mol Med. 17, 293-307 (2011).</li>
<li>Pesci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cells+and+mediators+in+bronchial+lavage+of+patients+with+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cells and mediators in bronchial lavage of patients with chronic obstructive pulmonary disease.</a> Eur Respir J. 12, 380-386 (1998).</li>
<li>Hoogerwerf, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+Inflammation+Induced+by+Lipoteichoic+Acid+or+Lipopolysaccharide+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Lung Inflammation Induced by Lipoteichoic Acid or Lipopolysaccharide in Humans.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 178, 34-41 (2008).</li>
<li>Scheuchenzuber, W. J., Eskew, M. L., Zarkower, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+humoral+responses+to+Escherichia+coli+and+sheep+red+blood+cell+antigens+introduced+via+the+respiratory+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Lung+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative humoral responses to Escherichia coli and sheep red blood cell antigens introduced via the respiratory tract.</a> Exp Lung Res. 13, 97-112 (1987).</li>
<li>Asti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+lung+injury+in+mice.+I.+Concomitant+evaluation+of+inflammatory+cells+and+haemorrhagic+lung+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Pulm+Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. I. Concomitant evaluation of inflammatory cells and haemorrhagic lung damage.</a> Pulm Pharmacol Ther. 13, 61-69 (2000).</li>
<li>Brand, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+deposition+of+therapeutic+particles+during+spontaneous+and+controlled+inhalations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+pharmaceutical+sciences%22%5BJournal%5D)">Total deposition of therapeutic particles during spontaneous and controlled inhalations.</a> Journal of pharmaceutical sciences. 89, 724-731 (2000).</li>
<li>Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trubel, H., Wang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+acute+lung+injury+in+rats%3A+comparative+assessment+of+intratracheal+instillation+and+aerosol+inhalation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation.</a> Toxicology. 304, 158-166 (2013).</li>
<li>Skerrett, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+type+1+TNF+receptor+in+lung+inflammation+after+inhalation+of+endotoxin+or+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of the type 1 TNF receptor in lung inflammation after inhalation of endotoxin or Pseudomonas aeruginosa.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 276, L715-L727 (1999).</li>
<li>Roos, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+epithelial-C%2FEBPbeta+contributes+to+LPS-induced+inflammation+and+its+suppression+by+formoterol%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Lung epithelial-C/EBPbeta contributes to LPS-induced inflammation and its suppression by formoterol.</a> Biochem Biophys Res Commun. 423, 134-139 (2012).</li>
<li>Didon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+epithelial+CCAAT%2Fenhancer-binding+protein-beta+is+necessary+for+the+integrity+of+inflammatory+responses+to+cigarette+smoke%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Lung epithelial CCAAT/enhancer-binding protein-beta is necessary for the integrity of inflammatory responses to cigarette smoke.</a> Am J Respir Crit Care Med. 184, 233-242 (2011).</li>
<li>Silverpil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+feedback+on+IL-23+exerted+by+IL-17A+during+pulmonary+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Negative feedback on IL-23 exerted by IL-17A during pulmonary inflammation.</a> Innate Immunity. 19, 479-492 (2013).</li>
<li>Mercer, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteinase-Activated+Receptor-1%2C+CCL2+and+CCL7+Regulate+Acute+Neutrophilic+Lung+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteinase-Activated Receptor-1, CCL2 and CCL7 Regulate Acute Neutrophilic Lung Inflammation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. , (2013).</li>
<li>Korkmaz, B., Horwitz, M. S., Jenne, D. E., Gauthier, F. Neutrophil Elastase, Proteinase 3, and Cathepsin G as Therapeutic Targets in Human Diseases. Pharmacological Reviews. 62, 726-759 (2010).</li>
<li>Bafadhel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Exacerbations+of+COPD%3A+Identification+of+Biological+Clusters+and+Their+Biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Acute Exacerbations of COPD: Identification of Biological Clusters and Their Biomarkers.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. , 201104-200597 (2011).</li>
<li>Hurst, J. R., Perera, W. R., Wilkinson, T. M. A., Donaldson, G. C., Donaldson, G. C., Wedzicha, G. C. Systemic and Upper and Lower Airway Inflammation at Exacerbation of Chronic Obstructive Pulmonary. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHurst%2C+JR+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22">Am. J. Respir. Crit. Care Med</a>. 173, 71-78 (2006).</li>
<li>Rabe, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Strategy+for+the+Diagnosis%2C+Management%2C+and+Prevention+of+Chronic+Obstructive+Pulmonary+Disease%3A+GOLD+Executive+Summary%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Pulmonary Disease: GOLD Executive Summary.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 176, 532-555 (2007).</li>
</ol>

אברהם רוס קיבל תשלום ממרצה Boehringer Ingelheim, מלגות נסיעה מאסטרה-זנקתי R &amp; D ומענק מחקר מאסטרה-זנקתי R &amp; D. מגנוס Nord הנו עובד במשרה מלאה של אסטרה-זנקה R &amp; D וקיבל מענקי מחקר מאסטרה-זנקתי R &amp; D. יוהאן גרינוולד וTove ברג הוא שיתוף חוקרים בפרויקט מחקר שאינו קשור במימון החברה AstraZeneca R &amp; D.

LPS תרסיס יוצר תגובה דלקתית בדרכי הנשימה, המתאפיינת בנויטרופילים בsubmucosa אפיתל, חללים המקיפים את דרכי הנשימה ניהול, כמו גם רווחים מכתשי. זה, יחד עם התוכן המוגבר כולל החלבון בבלף, מעיד על דליפת פלזמה, נציג של הפתולוגיה של פגיעת ריאות חריפה. כLPS גורם דלקת סטרילית, התגובה היא עצמאית של התגובה החיסונית אדפטיבית, ויש מגבלות לרלוונטיות לזיהומים חיידקיים. הטכניקה עשויה, עם זאת, ניתן להשתמש כדי לנתח מנגנונים דלקתיים על ידי לא כולל תגובות חיסוני אדפטיבית. <p class="jove_content" st...

Lipopolysaccharide (LPS) הוא קיר תא מרכיב של חיידקים שליליים 1 גרם. אתגר לLPS הוא מודל מתועד היטב של פציעת ריאות חריפה, תסמונת המתאפיינת בדלקת חריפה neutrophilic ובצקת 2. בנוסף, neutrophilia ריאתי הוא גם סימן היכר של מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) 3, ואתגר LPS בבני אדם כבר בשימוש לדגמן החמרות COPD 4. לפיכך, מודלים ניסויים של חשיפת LPS קליניים כלים רלוונטיים ובעל ערך להבנת הפתולוגיה אנושית. המטרה של מסירת הריאות של LPS התרסיס שתואר כאן היא ליצור תגובה דלקתית neutrophilic בניצוח ודרכי הנשימה, ללא מעורבות מערכתית. כמה טכניקות של אתגר LPS תוארו בעבר. הזרקה תוך-ורידית של LPS היא הדרך הנפוצה ביותר של ממשל. למרות שטכניקה זו היא נגישה בקלות, tנזק עיקרי הוא לאנדותל, עם הרס המשני של האפיתל הריאה הבא הגירת נויטרופילים לריאות. ממשל Intra-ורידים גם גורם לדלקת מערכתית 2, שעלולה לסבך את התמונה הקלינית במודלים של בעלי חיים. דלקת מערכתית בניגוד לא נצפה עם ממשל תוך קנה הנשימה. טכניקה זו, עם זאת, היא עבודה אינטנסיבית ודורשת הרדמה כמו גם הכשרה 5 ניכרת, 6. יתר על כן, בתצהיר ריאתי במסלול הזה של ממשל תלוי בנשימה 7. כך, בתצהיר ריאות מושפע מעומק ההרדמה הנחוצה לממשל תוך קנה הנשימה והתצהיר משתנה בדרכי הנשימה יכולים להיות שנצפו. בניגוד לכך, מסירת ריאה עם LPS התרסיס דורשת הכשרה מינימאלית, ובקלות יכולה להיות מושלמת במספר גדול של בעלי חיים עם מעט או ללא וריאציה בין יחידים 5, 8.מחקר שנערך לאחרונה מאשר כי משלוח התרסיס עדיף על המסלול תוך-קנה הנשימה ביחס לתצהיר, וכי מינונים רלוונטיים יותר של LPS לגרום דלקת neutrophilic עם מודל זה 8. מחקרים קודמים הראו כי אתגר לPsuedomonas aeruginosa LPS תרסיס יוצר תגובה דלקתית משמעותית בלומן בדרכי הנשימה והריאות parenchyma, כוללים הרווחים מכתשי 9, 10. הדלקת מאופיינת בדומיננטיות של נויטרופילים ונוכחות של בצקת ריאות, ולכן יכולה לשמש כדי לטפל בפתוגנזה של פציעת ריאות חריפה ולצבור ידע נוסף של המנגנונים תורמים לפתולוגיה מחלה.

<table><tbody><tr><td>LPS מטוהר של &lt;em&gt;Pseudomonas aeruginosa&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>מסוכן. מומלץ להשתמש במוצר מטוהר. ניתן להשתמש ב-LPS מטוהר מחיידקים אחרים.</td></tr><tr><td>מערבל (נבולייזר) Pari LC sprint star</td><td>PARI Respiratory Equipment Inc.</td><td>023G1250</td><td></td></tr><tr><td>מד ספיקה מסתי TSI 4040</td><td>TSI</td><td>4040</td><td>ניתן להשתמש במוצר חלופי מהספק.</td></tr><tr><td>צינור Tygon ברוחב 15.9 mm של Saint-Gobain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z685704</td><td>מותג מומלץ.</td></tr><tr><td>קופסאות פלקסיגלאס עם מכסים נשלפים</td><td>בנייה מותאמת אישית</td><td>N/A</td><td>150 x 163 x 205 mm (חור של 2 mm בצד).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>מסכת נשימה רב-פעמית לחצי פנים של 3M</td><td>3M</td><td>7503</td><td>מותג מומלץ.</td></tr><tr><td>מסנני חלקיקים מתקדמים (P100) של 3M&amp;nbsp;</td><td>3M</td><td>2291</td><td>מותג מומלץ.</td></tr><tr><td>מספריים</td><td>VWR</td><td>233-1104</td><td>ניתן להשתמש במספריים מועדפים אחרים.</td></tr><tr><td>פינצטה</td><td>VWR</td><td>232-1313</td><td>ניתן להשתמש בפינצטה מועדפת אחרת.</td></tr><tr><td>צינור פוליאתילן Intramedic PE50</td><td>BD</td><td>427411</td><td>מותג מומלץ.</td></tr><tr><td>חוט משי Ethicon 2-0 Perma-hand</td><td>VWR</td><td>95056-992</td><td>מותג מומלץ.</td></tr><tr><td>מחט במידה 26 &amp;frac12; gage</td><td></td><td></td><td>קיימים ספקים חלופיים.</td></tr><tr><td>מזרק BD 1 ml עם קצה החלקה (slip-tip), לא סטרילי</td><td><a href="http://catalog.bd.com/bdCat/viewProduct.doCustomer?productNumber=301025" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> BD</a></td><td>301205</td><td>קיימים ספקים חלופיים.</td></tr><tr><td>מזרק BD Luer-Lok בנפח 60 ml, לא סטרילי, פוליפרופילן</td><td>BD</td><td>301035</td><td>קיימים ספקים חלופיים.</td></tr><tr><td>צבעי Hematoxylin-Eosin של Fluka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3972</td><td>קיימים ספקים חלופיים.</td></tr><tr><td>תמיסת T&amp;uuml;rk</td><td>Merck Millipore</td><td>109277</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה שולחנית</td><td></td><td></td><td>קיימים יצרנים חלופיים.</td></tr><tr><td>צנטריפוגת Cytospin 4</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>ניתן להשתמש בצנטריפוגה חלופית.</td></tr><tr><td>ערכת HEMA-3 stat pack</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-123-869</td><td>קיימות ערכות צביעה חלופיות.</td></tr><tr><td>תמיסת פורמלין, עם בופר ניטרלי, 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>קיימים ספקים חלופיים.</td></tr></tbody></table>

שיטה ליצירת ריאות neutrophilia שימוש התרסיס lipopolysaccharide

A Method for Generating Pulmonary Neutrophilia Using Aerosolized Lipopolysaccharide

פציעת ריאות חריפה (ALI) היא מחלה קשה המתאפיינת בneutrophilia alveolar, עם אפשרויות טיפול מוגבלות ותמותה גבוהה. מודלים ניסיוניים של ALI הם מפתח לשיפור ההבנה של היווצרות מחלה שלנו. Lipopolysaccharide (LPS) נגזר מחיידקים חיוביים גרם גורם לדלקת בדרכי נשימת neutrophilic וparenchyma ריאות של עכברים. משלוח ריאות יעיל של תרכובות כגון LPS הוא, עם זאת, קשה להשגה. בגישה שתוארה כאן, משלוח ריאות בעכברים מושגת על ידי אתגר לPseudomonas aeruginosa תרסיס LPS. LPS המומס היה תרסיס על ידי nebulizer מחובר לאוויר דחוס. עכברים נחשפו לזרימה רציפה של תרסיס LPS בקופסא פלסטיק במשך 10 דקות, ואחרי 2 דקות אוויר לאחר התרסיס הופסק. אינטובציה לקנה הנשימה ושטיפה ברונכואלוואולרית שלאחר מכן, ואחריו זלוף פורמלין בוצעו הבאה, המאפשר לאפיון של p סטרילידלקת ulmonary. LPS תרסיס יוצר דלקת ריאות מתאפיינת בneutrophilia alveolar, זוהתה בשטיפה ברונכואלוואולרית ועל ידי הערכה היסטולוגית. טכניקה זו ניתן להגדיר במחיר קטן עם כמה מכשירים, ודורשת הכשרה ומומחיות מינימליות. מערכת החשיפה ובכך ניתן לבצע באופן שיגרתי בכל מעבדה, עם הפוטנציאל לשפר את ההבנה של פתולוגיה ריאות שלנו.

אתגר לפ תרסיס aeruginosa LPS בדרך כלל מניב תגובה דלקתית מסומנת בלומן בדרכי הנשימה ומרחב alveolar, מתאפיין בדומיננטיות של נויטרופילים בשתי נקודות מוקדמות ומאוחרות זמן. התרסיס LPS גורם neutrophilia ריאתי עכברי C57BL / 6by וBALB / ג נחשפו לפ תרסיס aeruginosa LPS או רכב לבד ונויטרופילים נפקדו בבלף. מספר התאים הכולל ב...

אנו מתארים שיטה לגרימת דלקת ריאות neutrophilic על ידי אתגר לlipopolysaccharide תרסיס על ידי עִרפּוּל, מודל פציעת ריאות חריפה. בנוסף, טכניקות ניתוחיות בסיסיות לבידוד ריאה, אינטובציה לקנה הנשימה ושטיפה ברונכואלוואולרית הם גם תיארו.

Acute lung injury (ALI) is a severe disease characterized by alveolar neutrophilia, with limited treatment options and high mortality. Experimental models ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ליצור נויטרופיליה עקבית וניתנת לשחזור בדרכי הנשימה באמצעות חשיפה ל-LPS במצב של אירוסול. הדבר מושג תחילה על ידי טעינה של LPS התלוי בתמיסת סליין לתוך נבולייזר המחובר לתא חשיפה. לאחר מכן, עכברים נחשפים ל-LPS במצב אירוסול, ולאחר מכן נאסף שטיפת ברונכו-אלבולארית (bronchoalveolar lavage) והתאים הדלקתיים בשטיפה נספרים.לבסוף, רקמת הריאה מקובעת באופן פורמלי לצורך השגחה, חיתוך ואנליזה אימונוהיסטוכימית. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בספירות התאים הכוללת והדיפרנציאלית של שטיפת ברונכואלוולרית (bronchoalveolar lavage) כדי להעריך את גיוס הנויטרופילים לריאות. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מתן LPS תוך-קשייתי, הם הפיזור האחיד של ה-LPS המאורסול בכל רחבי הריאות, קלות הביצוע וההכשרה המינימלית הנדרשת ליישום מוצלח. כדי להפיק אירוסול של LPS, תוך שימוש בציוד מיגון אישי (PPE) מתאים ובתוך מ ইরানের ביולוגית דרגה 2 מאווררת, התחילו בהחדרת פתח אדום לתוך נבולייזר ולאחר מכן חברו את הנבולייזר לאוויר חדרת בלחץ באמצעות הצינורות המסופקים על ידי היצרן.לאחר מכן, השתמשו במסנן אוויר כדי לחבר את מוצא הנבולייזר למד זרימה מסית, ואז חברו את מד הזרימה המסית למקור מתח. כווןו את זרימת האוויר ל-5 liters per minute, תוך שמירה על לחץ של 1 to 2 bar, ולאחר מכן הסירו את מד הזרימה המסית וניתקו את זרימת האוויר. לאחר מכן, חברו את מוצא הנבולייזר לצינור התפצלות (bifurcating tube) בקוטר 15.9 millimeter המחובר לשתי קופסאות פלקסיגלס בממדים 50 by 63 by 205 millimeter המצוידות במכסים נשלפים.בכל קופסה יש להכין חור בקוטר של 5 מילימטר בצד הנגדי לכניסה, כדי למנוע הצטברות לחץ. כעת יש להניח עד חמישה עכברים בכל קופסה ולסגור את המכסים. לאחר מכן, פתחו את הנבולייזר.מלאו את המכל ב-4 עד 8 מיליליטר של LPS מומס במי מלח או במי מלח בלבד, וחברו מחדש את פתח הכניסה לאספקת האוויר. אפשרו לארוסול לזרום אל תוך קופסאות הפלקסיגלס הסגורות תוך ניטור רציף של בעלי החיים, וודאו שאספקת האוויר נשארת מהודקת לפתח הכניסה של הנבולייזר במהלך הארוסוליזציה. לאחר 10 דקות, נתקו את אספקת האוויר והשאירו את בעלי החיים בקופסאות הפלקסיגלס למשך שתי דקות נוספות.לאחר מכן פתחו את המכסים. המתינו עד שיתפזר הארסול והחזירו את העכברים לכלוביהם בסיום הניסוי. עבור כל חיה בתורה, השתמשו תחילה במספריים כדי לבצע חתך בודד מקדימה לאחור לחשיפת בית החזה. לאחר מכן, הרימו את כלוב הצלעות דרך הקצה הקדמי של עצם הסטרנום ונקבו את הסרעוף בנקודה הוונטרלית ביותר, ללא פגיעה ברקמת הריאה.לאחר מכן, פתחו את כלוב הצלעות באמצעות שתי חתכים הנפגשים מתחת ללסת בכיוון קדמי-אחורי. לאחר פתיחת כלוב הצלעות, השתמשו בפינצטה כדי להרחיב אותו בעדינות וחתכו את הקנה מתחת לגרון. כעת הרימו את הקנה וחתכו את הרצועות המחברות את אונוי הריאה לחלל בית החזה.לאחר מכן, משכו בעדינות את הריאות והקנה למעלה והרחיקו אותם מרקמת השומן ומרקמת הלב, והניחו אותם על פיסת נייר מאריזת מזרק. בשלב הבא, הכניסו צינור פוליאתילן בקוטר 0.965 millimeter לתוך הקנה ואבטחו אותו באמצעות חוט משי. קשרו גם את האונה המרובה בחוט משי, ולאחר מכן הכניסו מחט gauge 23 לתוך צינור הפוליאתילן.כדי לאסוף את שטיפת הסימפונות והנאבקים (bronchoalveolar lavage), השתמש במזרק של מיליליטר אחד כדי להזריק לאט 250 µL של PBS סטרילי קר לתוך האונה הבודדת. לאחר הקשה זהירה על הריאות ונגד פני שולחן העבודה כ-30 פעמים, משוך לאט את הנוזל חזרה אל המזרק ואסוף אותו למבחנה. לאחר חזרה על הפרוצדורה עם 200 µL של PBS טרי, הנח את שטיפת הסימפונות והנאבקים על קרח לצורך אנליזה מאוחרת. כדי לקבע את רקמת הריאה לאנליזה היסטולוגית, הוצא את ריבוי האונות והקפא אותן במהירות (snap freeze) על קרח יבש.אחסן את האונה בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. כדי לקבע את הרקמה לצורך אנליזה היסטולוגית, הרכב מזרק בנפח 60 מיליליטר ללא בוכנה על מעמד תמיכה ממתכת והזרק פורמלין לתוך האונה הבודדת למשך חמש דקות. לאחר מכן, נתק את המחט ומשוך בחוט המשי כדי להוציא אותו יחד עם צינור הפוליאתילן מקשריאה.סגירה בו-זמנית של הקנה ושמירה על הלחץ בריאה. לאחר מכן, השקעה של האונה בפורמלין למשך 24 שעות בטמפרטורה של 4°C. למחרת, שטיפת הרקמה המקובעת שלוש פעמים למשך לפחות 20 דקות בכל פעם ב-70% ethanol.לאחר הטמעת הרקמה המיובשת ב-para film, חתכו את האונה לפרוסות בעובי של ארבעה עד חמישה מיקרון וצבעו את הפרוסות ב-hematin and eoin לצורך הערכה היסטולוגית. מספר התאים הכולל בנוזל שטיפה ברונכואלוולולרי (BALF) של עכברים שנחשפו לארוסול המכיל רק את חומר הנשא הוא בדרך כלל סביב או מתחת ל-200,000 תאים. התאים מורכבים מ-95 עד 100% תאים מונונוקליאריים, עם לימפוציטים בודדים בלבד וללא נויטרופילים.עכברים שחשפו ל-1 mg/mL של LPS באירוסול מראים עלייה במספר התאים הכולל בנוזל שטיפת ברונכואלוולרית, בדרך כלל יותר מ-500,000 תאים לאחר שש שעות, כאשר חדירת התאים נותרת גבוהה לאחר 24 שעות, ועם פרופיל תאים שמוטה לעבר דומיננטיות של נויטרופילים. פרופיל תאים דלקתי דומה ונויטרופיליה ריאתית נצפים גם בעקב נבוליזציה של 5 mg/mL LPS.נויטרופילים נצפו בסוב-מוקוזה האפיתלית וכן בחללים המקיפים את דרכי הנשימה המוליכות ואת כלי הדם לאחר שש ו-24 שעות של חשיפה ל-LPS, אך לא בעכברים של קבוצת הביקורת שטופלו בתמיסת מלח. תכולת החלבון הכוללת בנוזל שטיפת הסימפונות והנאולוואולרי (bronchoalveolar lavage fluid) של עכברים שנחשפו ל-LPS גבוהה יותר בהשוואה לעכברים שנחשפו לתמיסת מלח, וביטוי הכמוקינים המגייסים נויטרופילים CXCL1 ו-CXCL2 מוגבר אף הוא בעכברים שנחשפו ל-LPS.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי דלקת ריאות המושרה על ידי LPs, ניתן להחילה אותה גם על מודלים של מחלות אחרות, כגון זיהומים חיידקיים או ויראליים, מאחר שניתן להתאים את האדים המרסוסים להחדרה של מגוון רחב של גורמים גורמי מחלה.

a-method-for-generating-pulmonary-neutrophilia-using-aerosolized

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מראים, כיצד להשתמש 2-פוטון מיקרוסקופית לצורך השגחה של הדינמיקה של גרנולוציטים נויטרופילים בריאות נגוע בזמן שהם phagocytose פתוגנים או לייצר מלכודות תאי נויטרופילים (סלים).

תצפית ישירה של phagocytosis ו-NET היווצרות ידי נויטרופילים בריאות נגועים באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

Source: Yuan, Z., et al. Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates an in vivo mouse model for inducing and analyzing acute lung injury (ALI) using intraperitoneal administration of bacterial lipopolysaccharide. The inflammatory cascade triggered by alveolar macrophages and neutrophils leads to epithelial and endothelial barrier disruption, allowing fluid and immune cells to accumulate in the alveoli. Alveolar...

Lipopolysaccharide-Induced Acute Lung Injury in Mice for Exosome and Immune Analysis

סרטון זה מתאר את ההליך ליצירת שקיק אוויר ברקמה התת עורית של עכברים ואיסוף הפרשות דלקתיות בתגובה למתן lipopolysaccharide in vivo. סרטון זה מכסה גם את ניתוח חדירת הנויטרופילים בכיס האוויר.

דגם עכבר פאוץ' אוויר לקולקציית הפרשה דלקתית הנגרמת על ידי ליפופוליסכריד

התגובה החיסונית המארחת לזיהום הפתוגן היא תהליך מוסדר היטב. ניצול מודל חשיפת ריאות lipopolysaccharide בעכברים, ניתן לבצע הערכות ברזולוציה גבוהה של המנגנונים המורכבים הקשורים להיווצרות מחלה.

הניצול של לוע התחתון Intratracheal PAMP מנהל ושטיפה ברונכואלוואולרית כדי להעריך את תגובת מארח חיסון של עכברים

העבודה הנוכחית ממחישה את הנוחות של שימוש באימונותרפיה תת-לשונית כדי להגביר את התגובה החיסונית המולדת בריאות ולהעניק הגנה מפני דלקת ריאות פנאומוקוקית חריפה בעכבר.

אימונותרפיה תת לשונית כחלופה ללהשרות הגנה מפני זיהומים בדרכי הנשימה חריפים

מספר שיטות תוארו בספרות למידול דלקת ריאות חיידקית בעכברים. בזאת, אנו מתארים לא פולשנית, לא יקר, שיטה מהירה גרימת דלקת ריאות באמצעות שאיפה (כלומר, שאיפה) של בידוד חיידקי pipetted לתוך הלוע התחתון. שיטות Downstream להערכה של התגובה החיסונית המולדת ריאתי הם גם מפורטות.

שיטה לא פולשנית הטכנית ללא עתירי עבור אינדוקצית phenotyping של דלקת ריאות חיידקית הניסויית עכברים

עכברים נחשפים LPS בקרום הבטן מפרישים exosomes בנוזל שטיפה (BAL) Broncho-מכתשי הארוזים עם miRNAs. באמצעות מערכת תרבות משותפת, אנו מראים כי exosomes שוחרר בנוזל BAL לשבש את הביטוי של צומת חזק חלבונים בתאי אפיתל הסמפונות ולהגדיל את הביטוי של ציטוקינים פרו-דלקתיים זה להדגיש פגיעת ריאות.

Exosomes Bronchoalveolar שטיפה בפציעה ליפופוליסכריד-induced ריאות זיהומית

הציג כאן הוא צעד אחר צעד הליך כדי לגרום לפציעה ריאה חריפה בעכברים על ידי ישירה intratracheal ליפוסכאלפסיד ולבצע ניתוח FACS של דגימות דם, ברונמכתשי נוזל ששטיפה, ורקמות ריאות. מיניציה מינימלית, טיפול פשוט, תוכנות טובה, ו טיטור של חומרת המחלה הם יתרונות של גישה זו.

גרימת פציעה חריפה של הריאה בעכברים על ידי הישירה ליפופוליסכראסטיליאלגרלציה

אוזון משולב ועכברים חשופים אנדוטוקסין חיידקי מראים מוות תאי נרחב, כולל זה של נויטרופילים. ראינו התאמות תאיות כגון שיבוש של lamellipodia ציטוסלטל, ביטוי תאי מוגבר של subunit סינתאז V ATP מורכב β ואנגיוסטין בשטיפת ברונכו-מכתשית, דיכוי התגובה החיסונית ריאות וגיוס נויטרופילים מעוכבים.

הדמיה של התאמות תאיות ריאות במהלך אוזון משולב ו- LPS המושרה פגיעה ריאות חריפה מורין

כאן, אנו מציעים פרוטוקול להעברת ליפופוליסכריד תוך טרכאלי (LPS) באמצעות אינטובציה אנדוטרכאלית אורופרכאלית לא פולשנית. שיטה זו ממזערת את הטראומה של ההליך הכירורגי עבור החיה ומעבירה LPS מדויק לקנה הנשימה ולאחר מכן לריאות.

החדרת ליפופוליסכריד תוך טרכאלי לא פולשני בעכברים

במחקר זה, טכניקת החדרה אנדוטרכיאלית לא פולשנית הוכחה כמפתחת ALI בעכברים באמצעות לרינגוסקופ בסיסי להבטחת העברת LPS מדויקת לריאות. ה-LPS מושתל דרך צינור אנדוטרכיאלי באמצעות לרינגוסקופ. גודל הפגיעה בריאתיות מוערך במספר נקודות זמן.

מתן לא פולשני של ליפופוליסכריד באנדוטרכיה כדי לגרום לפגיעה ריאתית חריפה אצל מכרסמים

למדו שיטה לאינדוקציה של דלקת ריאות נויטרופילית באמצעות LPS מרוסס באוויר בעכברים. הטכניקה כוללת נבוליזציה, בידוד ריאות ושטיפת ברונכואלוולרית לאיסוף תאים דלקתיים.

שיטה ליצירת ריאות neutrophilia שימוש התרסיס lipopolysaccharide

גלה סרטונים נוספים