מדידת השדרה Presynaptic עיכוב בעכברים על ידי הקלטה פוטנציאלית הגבי רוט
29 במרץ 2014
עיכוב presynaptic GABAergic הוא מנגנון מעכב חזק בחוט השדרה החשוב עבור מנוע ושילוב אות תחושתי ברשתות חוט השדרה. שלילת קוטביות מביא ראשוני בסיסית ניתן למדוד על ידי הקלטה של פוטנציאל שורש הגבי (DRP). כאן אנו מדגימים שיטת רישום vivo של DRP בעכברים.
עיכוב פרה-סינפטי הוא אחד ממנגנוני העיכוב החזקים ביותר בחוט השדרה. שינויים פתולוגיים בעיכוב פרה-סינפטי הם בעלי חשיבות במספר מנגנונים של דפוסי מחלה. לדוגמה, כאב נוירופתי ודלקתי, כמו גם עיבוד שגוי של כאב במערכת העצבים המרכזית.
דבר זה חשוב בפגיעות בחוט השדרה ובהפרעות של מערכת העצבים המרכזית המלוות בעירור יתר מוטורי. לכן, כאשר נחקרים מודלים של בעלי חיים להפרעות אלה, ידיעת עוצמת העכבה הפרה-סינפטית תספק מידע משמעותי. אנו מציגים כאן שיטה להערכת העכבה הפרה-סינפטית במודל של עכבר.
עיכוב פרה-סינפטי in vivo מתווך על ידי דפולריזציה של סיבים תחושתיים ראשוניים, המושרה על ידי סינפסות אקסו-אקסונליות GABAergic על סיבים פרה-סינפטיים תחושתיים. פעילות של קולטן GABA_A מובילה לעלייה במוליכות הכלוריד, שמעוררת לאחר מכן דפולריזציה של הסיבים התחושתיים הראשוניים בשל התפלגות היונים המקומית. דפולריזציה זו חוסמת את התפשטות פוטנציאלי הפעולה אל סופי האקסונים ומפחיתה את עוצמתם, מה שמוביל לירידה בכניסת סידן ולהפחתה בשחרור המוליכים העצביים.
לפיכך, ניתן לדכא פוטנציאלים פוסט-סינפטיים מעוררים בבודדים, נוירונים מעוררים סינפטית, מבלי לשנות את פוטנציאל ממברנת הפוסט-סינפסה ואת העירור של הנוירונים. פוטנציאל המוליכות הנפחית של דפולריזציית ENT ראשונית זו מספק מדד ישיר לעכבה פרה-סינפטית בחוט השדרה, וניתן למדוד פוטנציאלים אלו משורשים הגביים (dorsal roots) של חוט השדרה לאחר גרייה; אלו נקראים פוטנציאלי שורש גבי. מדידה של פוטנציאלי שורש גבי היא שיטה מבוססת ששימשה באופן נרחב בחתולים, חולדות וצפרדעים, אך בעכברים, ההקלטות בוצעו כמעט אך ורק בהכנות של חוט שדרה מבודד ex vivo. כאן אנו מתארים שיטה להקלטת פוטנציאלי שורש אלו בעכברים הרדומים in vivo, המאפשרת מדידה ישירה של עכבה פרה-סינפטית באורגניזם שלם.
להקלטת DRP בעכברים in vivo, נדרש הציוד הבא. מכשירים סטנדרטיים לניתוח גולגולת, מיקרוסקופ סטריאו ושלוש ידיים ידניות למיקום אלקטרודת הגירוי, אלקטרודת ההקלטה ואלקטרודת הייחוס בהתאמה. בנוסף, מסגרת לעכבר ומערכת חימום לבקרת טמפרטורת הגוף של העכבר לצורך גירוי והקלטה, לבד או באמצעות סטימולטור.
דרושים מגבר סטנדרטי ומערכת לאיסוף נתונים כדי לשפר את יחס אות לרעש. במהלך הקלטת ה-DRP, נדרשות אלקטרודות מותאמות אישית עבור ייצורן. משוך צינוריות זכוכית קונבנציונליות באמצעות מכשיר למשיכת פיפטות סטנדרטי.
שברו את קצה האלקטרודה באמצעות פצירה של יהלום כדי להרחיב את פתח הקצה. פולישו את הקצה בעזרת מבער מעבדה סטנדרטי כדי להחליקו. לפני תחילת ההכנה, הרדימו את החיה באמצעות הזרקה IP של ketamine וקבעו את ראשו של העכבר בתוך המסגרת הסטריאוטקטית.
לאחר מכן, בדקו את עומק ההרדמה על ידי צביטה של ה-PO האחורי של העכבר. התחילו את ההכנה רק כאשר לא נראה נסיגה של ה-PO; יש לבדוק את עומק ההרדמה שוב ושוב במהלך הפרוצדורה. יש לבצע הזרקות חוזרות של ketamine sine לשריר ה-quadriceps האחורי.
האריכו את ההרדמה, ונטרו את טמפרטורת הגוף של בעל החיים באמצעות הגשושית הרקטלית. להכנת העמוד האחורי (dorsal column), פתחו את העור לאורך קו האמצע הגבי.
שחררו את העור מהרקמה שמתחתיו כדי להפריד את החוליה מרקמת החיבור הסובבת אותה. בצעו שני חתכים משני צידי עמוד השדרה והרחיבו את החתכים על ידי דחיפת הרקמה הצידה באמצעות המסקלפל. לאחר מכן, הסירו את ה-S spinous processes בעזרת קובע עצם קטן.
התחילו מגובה החליאות. התקדמו לרמות מרכז החזה כדי למנוע התייבשות של פצע ניתוחי זה. הניחו פיסות קטנות של גזה מסביב לפצע והרטיבו אותן ב-0.9% sodium chloride.
לאחר מכן, התחל בהכנת חוט השדרה החל מאזור המותניים. דחף בזהירות את קצה הפיפטה העגולה (bone nipple) אל החלל שבין שתי חוליות סמוכות. הקפד במיוחד להפחית ככל האפשר את הלחץ המופעל על חוט השדרה.
המשיכו לרמות החזיים והרטיבו את חוט השדרה בנוזל מוחי שרירי מלאכותי. בצעו זאת באופן חוזר במהלך כל השלבים הבאים. פתחו את הדורומטר בזהירות באמצעות מחט במידה 30 gauge.
לאחר מכן, שחרר והפר שני שורשים סמוכים מאותו צד (ipsilateral) מהעמוד השדרה. לאחר מכן, חתוך את השורשים במיקום הדיסטלי ביותר האפשרי. במהלך הפרוצדורה.
יש למנוע מתירה מסיבית של השורשים, שכן הדבר יפגע בסופו של דבר בהקלטה מוצלחת של DRP. לאחר מיקום אלקטרודת הרפרנס בקרבת השריר השדרה, הזז את קצה אחת מאלקטרודות המקטע לסמיכות לקצה הפרוקסימלי של שורש גבי (dorsal root) אחד. לאחר מכן, מקם את השורש הגבי מעל פתח הקצה של אלקטרודת השאיבה.
לאחר מכן, שאיבו את השורש הגבי (dorsal root) אל תוך האלקטרודה על ידי הפעלת לחץ שלילי קצר באמצעות מזרק המחובר לאלקטרודה. לאחר מכן, מלאו את האלקטרודה ב-A CSF תוך הפעלת לחץ שלילי רציף ונמוך, עד שהתמיסה מקיפה הן את השורש הגבי והן את תיל הכסף-כלוריד בתוך האלקטרודה. לאחר מכן, הרימו את קצה האלקטרודה מהחוט השדרתי כך ששום גשר נוזלי לא יגרום לקצר באלקטרודה.
חזור על השלבים עבור השורש הסמוך השני באותו צד. לאחר ששתי האלקטרודות ממוקמות, התחל את ההקלטה של ה-DRP על ידי גירוי של נתיב אחד בזמן הקלטה מהנתיב השני, והעלה את מתח הגירוי לרמות על-מקסימליות. הקלטות טיפוסיות של פוטנציאלים של השורש הדורסלי נראות כמו זו המוצגת בפאנל השמאלי.
ארטיפקט גירוי קצר מוביל להסטה חיובית קצרה ולאחר מכן להסטה שלילית ממושכת. ההסטה האחרונה היא פוטנציאל השורש הדורסלי בפועל. ניתן לחשב את האמפליטודה שלו ביחס לקו הבסיס שנרשם ישירות לפני רישום הגירוי.
מספר עקבות מזוג שורשים אחד, כארטיפקטים של תנועות נשימה ו/או ארטיפקטים של EKG, עלולים להפריע ל-DRP המוקלט. לאחר הקלטה מוצלחת, ניתן להחליף בין אתר הגירוי לאתר ההקלטה ולבצע הקלטה שנייה. שיטת ההקלטה המוצגת.
בדיקת פוטנציאלים של שורשים בבעלי חיים חיים (in vivo) מאפשרת להעריך פנימה של סיבים ראשוניים, אנטי-קיטב (anti-polarization) ואת בעל החיים השלם, במיוחד בשילוב עם עכברים שעברו הנדסה גנטית. זה יכול להיות כלי רב עוצמה לחקירת המנגנונים העומדים בבסיס העכבה הספנלית. אינטגרציה ספנלית היא קריטית לתפקוד מוטורי ולתפיסה חושית רב-מודלית.
שיטה זו שימושית במחקר העוסק בכאב, פגיעה בחוט השדרה, פגיעה בעצבים היקפיים ודלקת. הקלטה של DRP in vivo מאפשרת ניתוח של אינטראקציות בין פעילות סופראספינלית לבין הכרית. דבר זה אינו אפשרי בהכנות של חוט שדרה מבודד המשמשות בדרך כלל למדידת DRP בעכברים.
באופן עקרוני, ניתן להחיל תרופות עלהחוט השדרה במהלך ההקלטה. יישום מקומי באמצעות פיפטות נוספות עשוי לשפר ולהאיץ את השליטה בריכוז התרופה המקומי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן עיכוב פרה-סינפטי GABAergic בחוט השדרה, מנגנון חיוני לאינטגרציה של אותים מוטוריים ותחושתיים. השיטה המוצגת כוללת הקלטה in vivo של פוטנציאלים של שורש הגב (DRP) בעכברים, המספקת תובנות לגבי עיכוב פרה-סינפטי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- חקר חוט השדרה
רקע
- עיכוב פרה-סינפטי הוא מנגנון עיכוב משמעותי בחוט השדרה.
- שינויים פתולוגיים בעיכוב זה קשורים למחלות שונות.
- הבנת העיכוב הפרה-סינפטי חיונית לחקר פגיעות בחוט השדרה והפרעות במערכת העצבים המרכזית.
- מודלים של בעלי חיים מסייעים בהערכת עוצמתו של העיכוב הפרה-סינפטי.
מטרת המחקר
- להציג שיטה להערכת עיכוב פרה-סינפטי בעכברים.
- לספק תובנות לגבי תפקידו של העיכוב הפרה-סינפטי במנגנוני כאב.
- להגביר את ההבנה של האינטגרציה ברשתות של חוט השדרה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הקלטה in vivo של פוטנציאלי שורש גבי (DRP).
- שימוש במודלים של עכברים לחקר עיכוב פרה-סינפטי.
- טכניקות אלקטרופיזיולוגיות למדידת עוצמת העיכוב.
- ניתוח של אינטגרציה בין אותות מוטוריים ותחושתיים.
תוצאות עיקריות
- הודגמה שיטה אמינה למדידת DRP in vivo.
- סופקה ראיה לתפקידה של עיכוב פרה-סינפטי בתפקוד חוט השדרה.
- הודגשה חשיבותו של מנגנון זה במצבי כאב שונים.
- הסבסב לתרומה להבנת השילוב של אותות תחושתיים ומוטוריים.
מסקנות
- עיכוב פרה-סינפטי הוא קריטי לתפקוד רשתות של חוט השדרה.
- השיטה המוצגת יכולה לסייע במחקרים עתידיים על כאב והפרעות בחוט השדרה.
- הבנת מנגנון זה עשויה להוביל לאסטרטגיות טיפוליות טובות יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית ניהולית
מדידה ישירה in vivo של עיכוב פרה-סינפטי בעמוד השדרה באמצעות רישום פוטנציאל שורש אחורי (DRP) בעכברים, מאפשרת בחינה מדויקת של מודולציה GABAergic במעגלים עצביים שלמים. יכולת זו היא קריטית להפחתת סיכונים בהשערות מנגוניות במודלים של כאב והגבירות-עירור מוטורית (motor hyperexcitability), ובכך היא תומכת ברצף תרגומי משלב הגילוי ועד למחקר פרה-קליני. התאימות של השיטה למודלים של עכברים טרנסגניים מגבירה את ערכה למטרת תיקוף מטרות הרלוונטיות למחלה ולמחקרים מנגוניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר כימות ישיר של עיכוב Presynaptic GABAergic במסלולים עצביים הרלוונטיים למחלה.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטיים למטרות לטיפול בכאב ובהפרעות מוטוריות על ידי מדידת עיכוב תפקודי in vivo.
- מקל על תיקוף מונחה-השערה של מנגנוני עיכוב ספינליים במודלים מהונדסים גנטית.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק קריאה אלקטרופיזיולוגית מתוקפת לפיתוח בדיקות תפקודיות במעגלים עצביים.
- מאפשר מדידה הדירה של אמפליטודת DRP כפלט כמותי לסריקת תרכובות או סריקה גנטית.
- תומך בסטנדרטיזציה של בדיקות עצביות in vivo לצורך השוואה בין מחקרים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלות של כאב נוירופתי, דלקת והגירה מוטורית יתרה.
- מאפשר הערכה של אינטראקציות על-שכווריות (supraspinal) ופריפריאליות באורגניזמים שלמים, ובכך משפר את הערך החזוי של התרגום הקליני.
- תומך בקידום מטרות והתערבויות מותאם-סיכון, בהתבסס על נתונים פונקציונליים in vivo.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטה זו משולבת בממשק שבין שלב הגילוי המוקדם לתיקוף פרה-קליני, ומגשרת בין מחקרים מכניסטיים למחקר תרגומי בהפרעות כאב ותנועה.
- ביולוגיה של גילוי: מספקת מדדים תפקודיים ישירים לבדיקת היפותזות לגבי מנגנונים מעכבים בעמוד השדרה.
- סריקה: מספקת מדידות DRP כמותיות הניתנות לשחזור, המתאימות לפיתוח בדיקות ולהערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה סטטיסטית של אמפליטודות DRP בין תנאים ניסיוניים וגנוטיפים שונים.
- מחקר תרגומי: שומרת על רלוונטיות פיזיולוגית על ידי שימור קישוריות על-שדרתית ופריפרית in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתנת להתאמה למגוון מודלים טרנסגניים והקשרי מחלה עבור יישום רחב במחקר ופיתוח (R&D).
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בניבוי בתהליכי תיקוף מטרות ובמחקרים מכניסטיים של עיכוב שדרתי.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של בדיקות אלקטרופיזיולוגיות in vivo לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go באמצעות אספקת ראיות תפקודיות במערכות רלוונטיות למחלה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של מטרות והתערבויות בהתבסס על נתונים מכניסטיים in vivo.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות ב-electrophysiology in vivo ובניתוחי עמוד שדרה בעכברים.
- דורש מכשור ייעודי, כולל suction electrodes ומגברים להקלטת DRP.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדאית בין צוותים של פרוטוקולי הרדמה, ניתוח והקלטה.
- ניתן להתאמה למודלים שונים של מחלות ושל עכברים טרנסגניים באמצעות התאמות פרוצדורליות מתאימות.
- מגבלות פוטנציאליות כוללות מורכבות טכנית ורגישות לארטיפקטים פיזיולוגיים.
