Name: טכניקת Microfluidic לחקור deformability הסלולרי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: חקור את הדפורמביליות התאית באמצעות מכשיר מיקרו-זרימה מבוסס PDMS. שיטה זו מודדת זמני מעבר תאים דרך מצרים בקנה מידה מיקרוני תחת זרימה מונעת לחץ, ומספקת ניתוח יעיל לביומכניקה תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לויד Ung עבור קלט קונסטרוקטיבי בגרסאות המוקדמות של טכניקה זו, ד&quot;ר ג&#39;רמי Agresti לטיפים לעיצוב כובע לחץ, וד&quot;ר Dongping צ&#39;י על עזרתו בבודת כובע הלחץ. אנו מודים למעבדות של מ &#39;Teitell ופ Gunaratne למתן מגוון רחב של דגימות תאים לבדיקה. אנו מודים לקרן הלאומית למדע (קריירת פרס DBI-1,254,185), המרכז לסרטן באוניברסיטת UCLA Jonsson, וUCLA הקליני וTranslational Science Institute לתמיכה בעבודה זו.

<ol><li>Doerschuk, C. M., Beyers, N., Coxson, H. O., Wiggs, B., Hogg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+neutrophil+and+capillary+diameters+and+their+relation+to+neutrophil+sequestration+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of neutrophil and capillary diameters and their relation to neutrophil sequestration in the lung.</a> Journal of applied physiology. 74 (6), 3040-3045 (1993).</li>
<li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+cancer+metastasis%3A+the+%60seed+and+soil%E2%80%99+hypothesis+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of cancer metastasis: the `seed and soil’ hypothesis revisited.</a> Nature Reviews Cancer. 3, 453-458 (2003).</li>
<li>Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+access+microfluidic+device+for+the+study+of+cell+migration+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology%3A+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis.</a> Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 2 (11-12), 648-658 (2010).</li>
<li>Hou, H. W., Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Kumar, A. P., Ong, C. N., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deformability+study+of+breast+cancer+cells+using+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+microdevices%22%5BJournal%5D)">Deformability study of breast cancer cells using microfluidics.</a> Biomedical microdevices. 11 (3), 557-564 (2009).</li>
<li>Byun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+deformability+and+surface+friction+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Characterizing deformability and surface friction of cancer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).</li>
<li>Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+cell+mechanics+in+hematologic+diseases+with+microfluidic+biophysical+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry.</a> Lab on a chip. 8 (7), 1062-1070 (2008).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+cell+types+using+a+microfluidic+device+for+mechanical+and+electrical+measurement+on+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Classification of cell types using a microfluidic device for mechanical and electrical measurement on single cells.</a> Lab on a Chip. 11 (18), 3174(2011).</li>
<li>Zheng, Y., Shojaei-Baghini, E., Azad, A., Wang, C., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+biophysical+measurement+of+human+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">High-throughput biophysical measurement of human red blood cells.</a> Lab on a Chip. 12 (14), 2560(2012).</li>
<li>Zheng, Y., Nguyen, J., Wang, C., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+measurement+of+red+blood+cell+deformability+on+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Electrical measurement of red blood cell deformability on a microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 13 (16), 3275(2013).</li>
<li>Hogg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+kinetics+and+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil kinetics and lung injury.</a> Journal of applied physiology. 67 (4), 1249-1295 (1987).</li>
<li>Hochmuth, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropipette+aspiration+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomechanics%22%5BJournal%5D)">Micropipette aspiration of living cells.</a> Journal of biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).</li>
<li>Yap, B., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+remodeling+and+cellular+activation+during+deformation+of+neutrophils+into+narrow+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal remodeling and cellular activation during deformation of neutrophils into narrow channels.</a> Journal of applied physiology. 99 (6), 2323-2330 (2005).</li>
<li>Bow, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfabricated+deformability-based+flow+cytometer+with+application+to+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfabricated deformability-based flow cytometer with application to malaria.</a> Lab on a Chip. 11 (6), 1065-1073 (2011).</li>
<li>Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+single+cells+using+flow+in+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Physical+Journal+Special+Topics%22%5BJournal%5D)">Probing single cells using flow in microfluidic devices.</a> The European Physical Journal Special Topics. 204 (1), 85-101 (2012).</li>
<li>Doll, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SU-8+force+sensing+pillar+arrays+for+biological+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">SU-8 force sensing pillar arrays for biological measurements.</a> Lab on a Chip. 9, 1449-1454 (2009).</li>
<li>Huntington, M. D., Odom, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Portable%2C+Benchtop+Photolithography+System+Based+on+a+Solid-State+Light+Source%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">A Portable, Benchtop Photolithography System Based on a Solid-State Light Source.</a> Small. 7 (22), 3144-3147 (2011).</li>
<li>Grimes, A., Breslauer, D. N., Long, M., Pegan, J., Lee, L. P., Khine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shrinky-Dink+microfluidics%3A+rapid+generation+of+deep+and+rounded+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Shrinky-Dink microfluidics: rapid generation of deep and rounded patterns.</a> Lab on a chip. 8 (1), 170-172 (2008).</li>
<li>Rowat, A. C., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chips+%26+Tips%3A+see+where+to+punch+holes+easily+in+a+PDMS+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Chips & Tips: see where to punch holes easily in a PDMS microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 8, 1888-1895 (2008).</li>
<li>Meyer, P., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+Acid+Induced+Differentiation+and+Commitment+in+HL-60+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Retinoic Acid Induced Differentiation and Commitment in HL-60 cells.</a> Environmental Health Perspectives. 88, 179-182 (1990).</li>
<li>Olins, A., Herrmann, H., Lichter, P., Olins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+Acid+Differentiation+of+HL-60+Cells+Promotes+Cytoskeletal+Polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Retinoic Acid Differentiation of HL-60 Cells Promotes Cytoskeletal Polarization.</a> Experimental Cell Research. 254 (1), 130-142 (2000).</li>
<li>Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+Microscopy+of+Nonadherent+Cells%3A+A+Comparison+of+Leukemia+Cell+Deformability+%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Force Microscopy of Nonadherent Cells: A Comparison of Leukemia Cell Deformability .</a> Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).</li>
<li>Tsai, M., Waugh, R., Keng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+HL-60+cell+deformability+during+differentiation+induced+by+DMSO%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Changes in HL-60 cell deformability during differentiation induced by DMSO.</a> Biorheology. 33 (1), 1-15 (1996).</li>
<li>Rowat, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Envelope+Composition+Determines+the+Ability+of+Neutrophil-type+Cells+to+Passage+through+Micron-scale+Constrictions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nuclear Envelope Composition Determines the Ability of Neutrophil-type Cells to Passage through Micron-scale Constrictions.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (12), 8610-8618 (2013).</li>
<li>Lam, W. A., Rosenbluth, M. J., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+exposure+increases+leukemia+cell+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy exposure increases leukemia cell stiffness.</a> Blood. 109 (8), 3505-3508 (2007).</li>
<li>Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+surface+wettability+of+poly%28dimethyl%29+siloxane+%28PDMS%29+and+glass+under+oxgen-plasma+treatment+and+correlation+with+bond+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microelectromechanical+Systems%22%5BJournal%5D)">Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxgen-plasma treatment and correlation with bond strength.</a> Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).</li>
<li>Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+poly%28dimethylsiloxane%29+surface+modification+to+control+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Surface+and+Interface+Analysis%22%5BJournal%5D)">Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion.</a> Surface and Interface Analysis. 41 (1), 11-16 (2009).</li>
<li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithic+Microfabricated+Valves+and+Pumps+by+Multilayer+Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography.</a> Science. 288 (5463), 113-116 (2000).</li>
</ol>

אי לנו ניגודי עניינים לחשוף.

<html> כאן אנו מספקים הליך ניסיוני מקיף לניתוח העיוות של תאים העוברים דרך ערוצי microfluidic מכווצים באמצעות זרימה המונע על ידי לחץ. תסריט MATLAB מאפשר עיבוד נתונים אוטומטי (משלימה חומר); גרסה מעודכנת של הקוד נשמר <a href="www.ibp.ucla.edu/research/rowat" target="_blank">(www.ibp.ucla.edu/research/rowat).</a> באופן רחב יותר, ניתן להתאים את הטכניקות שהוצגו כאן במבחני microfluidic מבוססי תאים רבים, כוללים השפעת cytoskeletal וסוכני התקשות גרעיני 24,23 כמו גם מנסה לאמוד defo...

שינויים בצורת תא הם קריטיים בהקשרים ביולוגיים רבים. לדוגמא, אריתרוציטים ולויקוציטים לעוות דרך נימים שהם קטנים יותר מאשר הקוטר שלהם 1. בגרורות, תאים סרטניים חייבים לעוות דרך פערים צרים ביניים, כמו גם כלי דם מפותלים ורשתות הלימפה זרע באתרים משניים 2. כדי לחקור את ההתנהגות הפיסית של תאים בודדים, מכשירי microfluidic להציג פלטפורמה אידיאלית שיכול להיות מותאם אישית כדי ללמוד מגוון רחב של התנהגויות תאים הכוללים את היכולת שלהם להעביר דרך צרים פערים 3 ולעוות באופן פסיבי באמצעות אילוצי מיקרון בקנה מידה 3 9. Polydimethylsiloxane (PDMS) מכשירי microfluidic הם שקופים אופטי, המאפשרים לעיוותי תא להיות דמיינו באמצעות מיקרוסקופ אור ונותחו באמצעות כלים לעיבוד תמונה בסיסיים. יתר על כן, מערכים של אילוצים יכולים להיות מוגדרים במדויק, המאפשרים ניתוח של תאים מרובים בו זמנית עםתפוקה שעולה על טכניקות קיימות רבות 10,11. כאן אנו מציגים פרוטוקול ניסוי מפורט לבדיקת deformability תא באמצעות מכשיר microfluidic PDMS &#39;תא deformer&#39;. המכשיר תוכנן כך שמעבר תאים דרך אילוצים רציפים; גיאומטריה זו היא נפוצה בהקשרים פיסיולוגיים, כגון נימי ריאתי למיטה 12. כדי לאמוד את deformability תא, זמן מעבר מספק מטרי נוחה שנמדד בקלות את הזמן הנדרש לתא יחיד למעבר דרך 4,6 התכווצות אחת. כדי לשמור על ירידה בלחץ קבועה על פני הערוצים המכווצים בזמן מעבר תא, אנו משתמשים בזרימה מונע לחץ. הפרוטוקול שלנו כולל הוראות מפורטות על עיצוב מכשיר וייצור, תפעול מכשיר על ידי-לחץ מונע זרימה, הכנה והדמיה של תאים, כמו גם עיבוד תמונה כדי למדוד את הזמן לתאים כדי לעוות באמצעות סדרה של התכווצויות. אנו כולליםשני עיצובי מכשיר וקוד עיבוד נתונים חזון כקבצים משלימים. כמדגם מייצג של נתונים, אנו מראים את הזמן מעבר תא דרך סדרה של התכווצויות כפונקציה של מספר האילוצים passaged. ניתוח של לוח הזמנים לתאים למעבר למרות אילוצים צרים של מכשיר microfluidic יכול לחשוף הבדלים בdeformability של מגוון רחב של סוגי תאים 4,5,13. המכשיר הפגין כאן באופן ייחודי סוקר מעבר תא דרך סדרה של התכווצויות מיקרון בקנה מידה; עיצוב זה מחקה את הדרך המפותלת שתאים חווים במחזור וגם מאפשרים חיטוט מאפיינים פיזיים נוספים של התאים כגון זמן הרפיה.

<table><tbody><tr><td>פלורוניק F-127 בלוק קופולימר פעילי שטח&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>8409400</td><td>מיוצר על ידי BASF, זמין גם באמצעות בסיס Sigma</td></tr><tr><td>PDMS ו-crosslinker</td><td>Essex Brownell</td><td>DC-184-1.1</td><td>מוצר בשם נפוץ Sylgard 184 Elastomer</td></tr><tr><td>חמצן יחידת פריקת פלזמה</td><td>Enercon</td><td>Dyne-A-Mite 3D Treater</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 מ"מ)Ted</td> <td>Pella, Inc.</td><td>15072</td><td></td></tr><tr><td>Fingertight Ferrule, 1/32 אינץ'</td> <td>Upchurch Scientific</td><td>UP-F-113</td><td></td></tr><tr><td>Fingertight III Fitting, 10-32</td><td>Upchurch Scientific</td><td>UP-F-300X</td><td></td></tr><tr><td>Polyetheretherketone (PEEK), קוטר חיצוני = 1/32 אינץ' או 0.79 מ"מ</td><td>Valco</td><td>TPK.515-25M</td><td></td></tr><tr><td>צינורות פוליאתילן (PE-20), 0.043 אינץ' או 1.09 מ"מ</td><td>Becton Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>ווסת לחץ</td><td>צינורות Airgas או Praxair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פוליאוריתן, 15/32 אינץ' OD</td><td>McMaster Carr</td><td>5648K284</td><td></td></tr><tr><td>אביזרי דחיפה לחיבור</td><td>McMaster Carr</td><td>5111K91</td><td></td></tr><tr><td>ממיר מתח ללחץ (E/P) ממיר אלקטרו-פנאומטי</td><td>אומגה</td><td>IP413-020</td><td></td></tr><tr><td>16 סיביות, 250 kS/S, 80 כניסות אנלוגיות רב תכליתי DAQ</td><td>National Instruments</td><td>NI PCI 6225-779295-01</td><td></td></tr><tr><td>מחבר אנלוגי מסוף בלוק-בורג</td><td>National Instruments</td><td>SCB-68-776844-01</td><td></td></tr><tr><td>LabView תוכנת עיצוב מערכת</td><td>מכשירים לאומיים תוכנת</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks, Inc.</td>קוד <td>MATLAB R2012a</td><td>דורש את ארגז הכלים לעיבוד תמונה</td></tr><tr><td>כבל מוגן</td><td>National Instruments</td><td>SHC68-68</td><td></td></tr></tbody></table>

טכניקת microfluidic לחקור deformability הסלולרי

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

כאן אנו פירוט עיצוב, ייצור, ושימוש במכשיר microfluidic להעריך deformability של מספר רב של תאים בודדים באופן יעיל. בדרך כלל, נתונים ל~ 10 2 תאים ניתן לרכוש בתוך ניסוי שעה 1. תכנית ניתוח תמונה אוטומטית מאפשרת ניתוח שלאחר ניסוי יעיל של נתוני תמונה, המאפשר עיבוד להיות שלם בתוך כמה שעות. הגיאומטריה המכשיר שלנו היא ייחודית בכך שתאים חייבים לעוות באמצעות סדרה של התכווצויות מיקרון בקנה מידה, ובכך לאפשר את העיוות הראשונית והרפיה של תאים בודדים תלוי זמן להיות assayed. תחולתה של שיטה זו לוקמיה פרומיילוציטית (HL-60) התאים באה לידי ביטוי. נהיגה תאים לעוות דרך אילוצי מיקרון בקנה מידה באמצעות זרימה המונע על ידי לחץ, אנו צופים כי פרומיילוציטית האנושית (HL-60) תאים לרגע לחסום את ההתכווצות הראשונה לזמן החציוני של 9.3 אלפיות שניים לפני passaging במהירות רב יותר דרך להצר הבאיונים עם זמן מעבר החציוני של 4.0 אלפיות שניים להתכווצות. בניגוד לכך, (נויטרופילים סוג) שטופל בחומצה רטינואית כל טרנס HL-60 תאים לחסום את ההתכווצות הראשונה רק 4.3 אלפית שניים לפני passaging דרך האילוצים שלאחר מכן עם זמן מעבר החציוני של 3.3 אלפיות שניים. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי טבע viscoelastic של תאים, וסופו של דבר לחשוף את המקורות המולקולריים של התנהגות זו.

כדי לחקור את deformability סוגי תאים שונים, תאים אנושיים מיאלואידית לוקמיה (HL-60), תאי נויטרופילים מובחנים, תאי הלימפוציטים עכבר, ושורות תאי סרטן השחלות אנושיות (OVCAR8, HEYA8) שלהם הוערכו באמצעות טכניקת microfluidic &#39;תא deformer&#39;. תוצאות עבור נציג את זמן המעבר של HL-60 תאי HL-60 ונויטרופילים הסוג להראות הזמנים לתא בודד למעבר דרך סדרה של התכווצויות, כפי שמוצגים באיור 6. זמן מעבר נמדד לאוכלוסייה של תאים בודדים ב כל התכווצות 7 מיקרומטר בסדרה של 7 אילוצים בל...

אנו מדגימים מבוססי assay מיקרופלואידיקה כדי למדוד את הזמנים לתאים למעבר דרך רצף של אילוצי מיקרון בקנה מידה.

טכניקת Microfluidic לחקור deformability הסלולרי

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לחקור את יכולת העיוות של סוגים שונים של תאים באמצעות בדיקת מיקרופלואידיקה פשוטה. מטרה זו מושגת על ידי ייצור התקן מיקרופלואידי מפולידימეთילסילוקסאן (PDMS) כדי לבחון את זמן המעבר של תאים דרך סדרה של היצרויות בקנה מידה של מיקרונים. זרימה מונעת לחץ משמשת להעברת התאים דרך הערוצים המיקרופלואידיים, מה שמאפשר לבחון את העיוות ואת ההרפיה התלויה בזמן של תאים בודדים. לאחר מכן, מופעלת תוכנה אוטומטית לניתוח תמונות כדי לעבד את הסרטונים ולהפיק היסטוגרמה של נתוני זמן המעבר.התוצאות מראות שסוגי תאים שונים מציגים הבדלים ביכולת העיוות של התא בהסתמך על זמן המעבר שלהם דרך סדרת מוצריים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות, כגון מיקרוסקופיית כוח אטומי או שאיבת מיקרו-פיפט, הוא שניתן להפעיל התקנים מיקרופלואידיים בהצלחה עם קיבולות תפוקה גבוהה. בעוד שניתן להשתמש גם בהתקנים מיקרופלואידיים אחרים כדי לבחון את יכולת העיוות של תאים.אנו מתכננים את המכשיר שלנו כך שתאים יעברו דרך היצריות עוקבות, גיאומטריה הנפוצה בהקשרים פיזיולוגיים כגון מיטת הנימיים הריאתית. ראשית, תכננו את המכשיר המיקרופלואידי על ידי בחירת רוחב של תעלות מערך ההיצריות להיות בערך 30% עד 50% מקוטר התא הממוצע, וגובה התעלה להיות לפחות 50% מקוטר התא. שלבו מסנן בפתחי הכניסה כדי להסיר שאריות ולפרק מקבצי תאים.לפני תחילת הניסוי, ייצרו את תבנית המכשיר (device master) באמצעות טכניקות סטנדרטיות לעיבוד מיקרו-ליתוגרפי. ודאו את גובה מאפייני התבנית באמצעות פרופילומטר. לאחר מכן, הכינו את מקור האוויר לזרימה מונעת לחץ באמצעות מיכל אוויר דחוס וסדרה של ווסתי אוויר ומחברים.ראשית, הגדירו מיכל אספקת אוויר ורגולטור ידני. לאחר מכן, הגדירו רגולטור לחץ מנוהל באופן אלקטרוני בטור עם הרגולטור הידני. השתמשו בקוד הפשוט שנכתב ב-LabVIEW כדי להזין את הלחץ הרצוי.הממיר האלקטרו-פנאומטי משתמש בלולאת משוב פנימית כדי לכוון את לחץ יציאת השסתום כך שיתאים ללחץ המוגדר לאורך המכשיר המיקרופלואידי. הגדירו תא תחת לחץ להנעת זרימת סספנסיית התאים על ידי הרכבת תא לסספנסיית תאים העשוי משפופרת סטנדרטית של ציטומטר זרימה ומכיריקה מעובדת היוצרת איטום אטום ללחץ על השפופרת. מכסה תא הלחץ מכיל שני פתחים: כניסה המתחברת למכל האוויר הדחוס ויציאה שדרכה זורמים התאים מתא הלחץ אל תוך המכשיר.בשלב הבא, הגדירו מיקרוסקופ הפוך המצויד במצלמה בעלת קצב רכישה של לפחות 100 פריימים לשנייה. כדי ללכוד תמונות של התאים הזורמים דרך מערך ההצריכים, הכינו תמיסת חומר פעיל שטח (surfactant) במגזר (stock solution) בתוך תמיסת סליין בבופר פוספט או PBS, שכן הוספה של כמות קטנה של חומר פעיל שטח לתמיסת המצע של התאים תסייע במיזעור הידבקות התאים לדפנות ה-PDMS. כדי לייצר את גוש ה-PDMS עם הערוצים המיקרופלואידיים, הוסיפו גרם אחד של חומר מעבשה (curing agent) ל-10 גרם של בסיס PDMS וערבבו היטב.שפוך את התערובת על המכשיר. בצעו Degas במבליל (פעמון ואקום) תחת ואקום עד להיעלמות הבועות הכלואות, או למשך כ-10 עד 20 דקות. לאחר זמן זה, ייתכן שעדיין יופיעו בועות בממשק ה-AIR PDMS, דבר הנחשב לתקין.אלה בדרך כלל יתפוגגו במהלך האפייה. לאחר מכן, אפו את התקן ה-Degas בטמפרטורה של 65 °C למשך ארבע שעות לאחר שהתקן התקרר. הוציאו את התקני המיקרופלואידיקה מהתבנית הראשית (master mold).התחילו בהרמה עדינה של אחת מפינות ההתקן. קילוף איטי ועדין, בניגוד להרמה ישירה של בלוק ה-PDMS כלפי מעלה, מפחית את המאמץ המופעל הן על ה-PDMS והן על התבנית (master). חתכו התקני מיקרופלואידיקה בודדים מתוך בלוק ה-PDMS באמצעות להב תער והספירה את ההתקן מהתבנית. נקבו חורים בהתקן ה-PDMS כדי ליצור פתחי חיבור למעבר בין הפחיתות לערוצי המיקרו. צרו חורים מצד הערוץ דרך הצד החיצוני של ההתקן באמצעות מחורר ביופסיה.שטפו את התקן ה-PDMS באיסופרופנול כדי להסיר אבק וחלקי PDMS תקועים. ודאו שהחורים שננקבו נקיים משאריות על ידי הפניית זרם קבוע של איסופרופנול טהור מבקבוק לחיצה דרך החורים. ייבשו באמצעות נשיפת אוויר מסונן.נקה את תַּשְׁבֵּת הזכוכית על ידי שטיפה במתנול. לאחר מכן, ייבש אותה באמצעות אוויר מסונן והנח אותה על פלטה חמה בטמפרטורה של 200 °C למשך חמש עד 10 דקות כדי להבטיח שהזכוכית נקייה ויבשה לחלוטין לפני הטיפול בפלסמה. כפי שפורט בפרוטוקול הטקסט, בצע בדיקה של ההתקן המיקרופלואידי תחת מיקרוסקופ.השתמשו בעדשה בעלת הגדלה נמוכה כדי לוודא שהתעלות אינן קרוסות או שבורות, וכי הן חורי הכניסה והיציאה מחוברים ישירות לתעלות המכשיר. העבירו את תרחיף התאים למבחנה לציטומטריה זרימתית וחברו אותה למכסה תחת לחץ לפני חיבור הצינור למכשיר המיקרופלואידי; כווןו את הלחץ לכ- 14 עד 21 kilopascals ושטפו עד שתרחיף התאים יופיע מקצה הצינור. לאחר מכן, הניחו את המכשיר על משטח שטוח כדי להחדיר את הצינור לפתח הכניסה של המכשיר.כיוון שכיסוי הזכוכית המודבק לחלק התחתון של מכשיר ה-PDMS הוא שביר, יש להחדיר את קצה הפיתול המכיל את תרחיף התאים אל פתח הכניסה של המכשיר. לאחר מכן, יש להחדיר קטע פיתול אל פתח היציאה ולהפנות אותו אל מבחנה ריקה לאיסוף פסולת, כגון מבחנת Falcon ריקה המודבקת לדופן שלב המיקרוסקופ.העלו בעדינות את הלחץ לכ-28 kilopascals או עד לתחילת זרימת התאים דרך הערוצים. מקמו את המכשיר כך שמספר ערוצים יהיו במישור הראייה ובזווית ניצבת לתחתית המסך. כדי להתחיל בניתוח הנתונים, פתחו את קובץ ה-m של הסקריפט הראשי והפעילו את התוכנה.בחלון Windows Explorer שמופיע, בחר את הסרטון הראשון לניתוח. הגדר את קצב הפריימים עבור הסרטון הנבחר ולחץ על Enter. תופיע תמונה המבקשת מהמשתמש לבחור חלון חיתוך מלבני.עבור הסרטון הראשון, בחרו חלון המקיף את כל התעלות משמאל לימין וחותך את התעלות ממש מעל הנורה הראשונה של מערך התעלות. בחלק העליון והתחתון, בחרו את אזורי ההיצרות מהתמונה החתוכה. האלגוריתם מציג את הסגמנטציה של התאים עבור 50 הפריים הראשונים של כל סרטון.עקוב מקרוב אחר התמונה השמאלית העליונה כדי לקבוע אם האלגוריתם מאתר את התאים באופן מדויק. תמונה מעובדת מונחת על גבי סרטון המקור. כדי להדגים את מיקומם של תאים שזוהו, בחר את הסרטון הבא לעיבוד מחלון ה-Windows Explorer.האלגוריתם יחזור על הפעולה. עבור כל סרטון שנבחר, בחרו בביטול. ברגע שכל הסרטונים הרצויים נוספו באמצעות חלון סייר קבצי Windows כדי להנחות את הפונקציה שרשימת הסרטונים הושלמה, תוצג תוצאות מייצגות עבור זמן המעבר של תאי HL 60 ותאי HL 60 מסוג נויטרופיל, המראות את סדר הזמן למעבר של תא בודד דרך סדרה של היצריות.הזמן נמדד עבור אוכלוסייה של תאים בודדים בכל אחת משבעה הלימות של 7 µm בסדרה של שבעה הלימות. בלחץ דחיפה של 28 kPa, תאי HL 60 חוסמים באופן זמני את ההלימה הראשונה למשך זמן חציוני של 9.3 ms לפני המעבר דרך ההלימות הבאות. לעומת זאת, תאי HL 60 מסוג נויטרופיל חוסמים את ההלימה הראשונה למשך 4.3 ms בלבד לפני המעבר.לאחר המעבר דרך ההגבלה הראשונה, התאים עוברים במהירות רבה יותר דרך שאר ההגבלות, משתיים עד שבע, כאשר זמן מעבר חציוני הוא 4.0 milliseconds עבור תאי HL 60 ו-3.3 milliseconds עבור תאים מסוג נויטרופיל. באמצעות השוואת זמן המעבר בין אוכלוסיות תאים, ניתן לחשוף הבדלים ביכולת הדפורמציה של התאים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה כיצד למדוד את יכולת הדפורמציה של סוגי תאים שונים באמצעות בדיקת המיקרופלואידיקה הפשוטה.כאן, נעשה שימוש בזרימה מונעת לחץ כדי להניע תאים דרך ערוצים מיקרופלואידיים, דבר המאפשר לבחון את הדפורמציה וההרפיה של תאים בודדים.

a-microfluidic-technique-to-probe-cell-deformability

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מתארים פרוטוקול עבור ייצור של מכשירים microfluidic שיכולה לאפשר לכידת תא ותרבות. בגישה זו microstructures בדוגמת כגון חריצים בתוך ערוצי microfluidic המשמשים ליצירת מתח נמוך גזירה אזורים בתוך התא שבו ניתן לעגן.

מכשיר microfluidic עם דפוסי Groove לחקר התנהגות נייד

בפרוטוקול זה, אנו מדגימים את ייצור של מערך microactuator מכלל הודעות העקורים אנכית שבו הטכנולוגיה מבוססת, ואיך הטכנולוגיה הזו בסיס ניתן לשנות לנהל תפוקה גבוהה תרבית תאים דינמי מכנית בתרבות הן דו מימדי ותלת מימדי פרדיגמות.

פלטפורמות microfabricated לתרבות Cell דינמי מכאני

כאן אנו מתארים שיטה פשוטה ומהירה למדידת נוקשות תא. העיקרון הכללי של גישה זו הוא למדוד עיוות קרום בתגובה ללחץ שלילי מוגדר היטב ליישם באמצעות micropipette על פני התא. שיטה זו מספקת כלי רב עצמה כדי לחקור את התכונות של תאי מצע biomechanical-מצורפים.

שאיפת micropipette של תאי מצע מצורפים להערכת נוקשות סלולריות

עיוות מכאנית מהירה של תאים התפתחה שיטה למסירה תאית של מקרומולקולות וננו מבטיחה, ללא וקטור. פרוטוקול זה מספק שלבים מפורטים כיצד להשתמש במערכת עבור מגוון רחב של יישומים.

לוחץ תא כחזק, Microfluidic תאית פלטפורמה להצגה

פרוטוקול הדמיה חדשני פותח באמצעות מפעיל מכני מונע מנוע מותאם אישית כדי לאפשר מדידה של תגובות בזמן אמת למתח מכני בתאים חיים. רלוונטית למכניוביולוגיה, המערכת יכולה ליישם זנים של עד 20% תוך שהיא מאפשרת הדמיה כמעט בזמן אמת עם מיקרוסקופ כוח קונפוקלי או אטומי.

הדמיה של תא חי במהלך מכאני למתוח

מאמר זה מספק שיטות מפורטות לגבי בדיית ואפיון מכשיר מיקרופלואידיג בעלי דלקת ריאות לדחיסת כונדרוציט.

פלטפורמת מיקרופלואידיג לעירור כונדרוציטים עם דחיסה דינמית

כוחות מכניים חשובים לשליטה בהעברת תאים. פרוטוקול זה מדגים את השימוש של הידרוג'לים אלסטיים שיכולים להיות מעוותים באמצעות מיקרופיפטה זכוכית מיקרומניפולציה כדי לגרות תאים עם מעבר קשיות מקומי כדי לעורר שינויים במבנה התא והגירה.

מערכת בודדת של תא להערכת בקרה מכנית של התנועה הסלולרית ואירועי איתות קשורים

עבודה זו מציגה פרוטוקול גמיש לשימוש בטכנולוגיית משטחים אלסטומריים (FLECS) בעלי תווית פלואורסצנטית בפורמט מיקרווול לכימות פשוט יותר של כוחות התכווצות של תאים חד-תאיים המבוססים על תזוזות חזותיות של מיקרופטרנים של חלבון פלואורסצנטי.

ניתוח פשוט בעל תפוקה גבוהה של התכווצות של תאים חד-תאיים באמצעות אלסטומרים מיקרו-מרופדים

כאן מוצג פרוטוקול לבניית מערכת מהירה ולא הרסנית למדידת דחיסות התא או הגרעין על בסיס מיקרו-מכשיר אקוסטופלואידי. נחקרו שינויים בתכונות המכניות של תאי הגידול לאחר מעבר אפיתליאלי-מזנכימלי או קרינה מייננת, המדגימים את סיכויי היישום של שיטה זו במחקר מדעי ובפרקטיקה הקלינית.

מדידת הדחיסות של תאים וגרעין על בסיס מיקרו-מכשיר אקוסטופלואידי

מוצגת כאן שיטה לפנוטיפ מכני של תאים בודדים באמצעות פלטפורמה מיקרופלואידית מבוססת אלקטרוניקה הנקראת חישת נקבוביות מכאנו-צומת (mechano-NPS). פלטפורמה זו שומרת על תפוקה מתונה של 1-10 תאים לשנייה תוך מדידת התכונות הביופיזיות האלסטיות והצמיגיות של התאים.

חישת נקבוביות Mechano-node: פלטפורמה מהירה ונטולת תוויות למדידות ויסקואלסיות של תאים בודדים מרובי פרמטרים

מוצג כאן פרוטוקול לבדיקת עייפות מכנית במקרה של תאי דם אדומים אנושיים באמצעות גישת אלקטרודפורמציה מווסתת אמפליטודה. גישה כללית זו יכולה לשמש למדידת השינויים השיטתיים במאפיינים מורפולוגיים וביומכניים של תאים ביולוגיים בתרחיף מעיוות מחזורי.

אלקטרודפורמציה מווסתת משרעת להערכת עייפות מכנית של תאים ביולוגיים

חקור את הדפורמביליות התאית באמצעות מכשיר מיקרו-זרימה מבוסס PDMS. שיטה זו מודדת זמני מעבר תאים דרך מצרים בקנה מידה מיקרוני תחת זרימה מונעת לחץ, ומספקת ניתוח יעיל לביומכניקה תאית.

טכניקת Microfluidic לחקור deformability הסלולרי

גלה סרטונים נוספים