טכניקת Microfluidic לחקור deformability הסלולרי
September 3rd, 2014
אנו מדגימים מבוססי assay מיקרופלואידיקה כדי למדוד את הזמנים לתאים למעבר דרך רצף של אילוצי מיקרון בקנה מידה.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לחקור את יכולת העיוות של סוגי תאים שונים באמצעות בדיקה פשוטה המבוססת על מיקרופלואידיקה. זה מושג על ידי ייצור מכשיר מיקרופלואידית פולי דימתיל סובוקסן או PDMS כדי לחקור את ציר הזמן של מעבר התא דרך רצף של היצרויות היצרות לאחר מכן משמשת זרימה מונעת לחץ כדי להניע תאים דרך התעלות המיקרופלואידיות שלהם, מה שמאפשר לבדוק את העיוות וההרפיה התלויה בזמן של תאים בודדים. לאחר מכן, תוכנית ניתוח התמונות האוטומטית מופעלת על מנת לעבד את הסרטונים ולקבל היסטוגרמה של נתוני זמן המעבר.
התוצאות מראות כי סוגי תאים שונים מציגים הבדלים ביכולת עיוות התאים בהתבסס על זמן המעבר שלהם דרך סדרה של התכווצויות. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות כגון מיקרוסקופ כוח אטומי או שאיבת מיקרו פיפט הוא שמכשירים מיקרופלואידיים יכולים לפעול בהצלחה עם יכולות תפוקה גבוהות. בעוד שמכשירים מיקרופלואידיים אחרים יכולים לשמש גם לבדיקת יכולת הצורה של התאים.
אנו מתכננים את המכשיר שלנו כך שתאים יעברו דרך התכווצויות עוקבות, גיאומטריה נפוצה בהקשרים פיזיולוגיים כמו מיטת נימי הריאה. כדי להתחיל, תכנן את המכשיר המיקרופלואידי על ידי בחירת רוחב תעלות מערך ההיצרות כך שיהיה כ-30 עד 50% מקוטר התא הממוצע וגובה התעלה יהיה לפחות 50% מקוטר התא. כלול מסנן ביציאות הכניסה כדי להסיר פסולת ולהפריד אשכולות תאים.
לפני תחילת הניסוי, יצר את מאסטר המכשיר באמצעות טכניקות סטנדרטיות לעיבוד מיקרו ליטוגרפי. ודא את גובה תכונות התבנית באמצעות פרופילומטר. לאחר מכן, תקן את מקור האוויר לזרימה מונעת לחץ באמצעות מיכל אוויר דחוס ורצף של ווסתי אוויר ואביזרים.
ראשית הגדר מיכל אספקת אוויר ווסת ידני. לאחר מכן הגדר ווסת לחץ בשליטה אלקטרונית בהתאם לווסת הידני. השתמש בקוד הפשוט שנכתב ב-LabVIEW כדי להזין את הלחץ הרצוי.
הממיר האלקטרו-פנאומטי משתמש בלולאת משוב פנימית כדי להתאים את לחץ יציאת השסתום כך שיתאים ללחץ שצוין על פני המכשיר המיקרופלואידי. הגדר תא בלחץ כדי להניע את זרימת מתלה התא על ידי הרכבת תא מתלה תאים מתוך צינור ציטומטר זרימה סטנדרטי ומכסה מעובד היוצר אטימה אטומה בלחץ על הצינור. מכסה תא הלחץ מכיל שני פתחים, כניסה המתחברת למיכל האוויר הדחוס ויציאה שדרכה זורמים תאים מתא הלחץ למכשיר.
לאחר מכן, הגדר מיקרוסקופ הפוך המצויד במצלמה בעלת קצב רכישה של לפחות 100 פריימים לשנייה. כדי ללכוד תמונות של התאים הזורמים דרך מערך ההיצרות, הכינו תמיסת פעילי שטח מלאי בתמיסת מלח חוצצת פוספט או PBS שכן הוספת כמות קטנה של חומר פעילי שטח לתמיסת המדיה התאית תעזור למזער את הידבקות התאים לדפנות ה-PDMS. כדי לייצר את בלוק ה-PDMS עם תעלות מיקרופלואידיות, הוסף גרם אחד של חומר ריפוי ל-10 גרם של בסיס PDMS וערבב היטב.
יוצקים את התערובת על המכשיר. מאסטר דגה בצנצנת פעמון עם ואקום מופעל עד שהבועות הכלואות נעלמות, או למשך כ-10 עד 20 דקות. לאחר זמן זה, עדיין עשויות להיות בועות בממשק AIR PDMS, וזה נורמלי.
אלה בדרך כלל יתפוגגו במהלך האפייה. לאחר מכן אופים את מכשיר הדגה בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לאחר שהמכשיר התקרר. הסר את המכשירים המיקרופלואידיים מתבנית המאסטר.
התחל בהרמה עדינה של פינה אחת של המכשיר. קילוף איטי ועדין בניגוד להרמה בלוק PD DMS ישר כלפי מעלה מפחית את הלחץ הן על ה-PDMS והן על המאסטר חתוך מכשירים מיקרופלואידיים בודדים מבלוק ה-PDMS בעזרת סכין גילוח והסר את המכשיר מחורי האגרוף הראשיים במכשיר ה-PDMS כדי ליצור יציאות חיבור לגישה בין צינורות לערוצי מיקרו. צור חורים מצד התעלה ועד לצד החיצוני של המכשיר באמצעות ניקוב ביופסיה.
שטפו את מכשיר ה-PDMS עם איזופרופנול כדי להסיר אבק ולתקוע נתחי PDMS. ודא שהחורים המנוקבים נקיים מפסולת על ידי הפניית זרם קבוע של איזופרופנול טהור מבקבוק סחיטה דרך החורים. יש לייבש באוויר מסונן.
נקו את מצע הזכוכית על ידי שטיפה במתנול. לאחר מכן יש לייבש בפן עם אוויר מסונן ולהניח על פלטה חמה של 200 מעלות צלזיוס למשך חמש עד 10 דקות כדי להבטיח שהכוס נקייה ויבשה לחלוטין לפני טיפול בפלזמה. כמפורט בפרוטוקול הטקסט, בדוק את המכשיר המיקרופלואידי תחת מיקרוסקופ.
ודא שהתעלות אינן מכווצות או שבורות, וכי גם חורי הכניסה וגם היציאה מתחברים ישירות לתעלות המכשיר באמצעות יעד הספק נמוך. הנח את מתלה התאים בצינור ציטומטר זרימה וחבר למכסה הלחץ לפני חיבור הצינור למכשיר המיקרופלואידי, כוונן את הלחץ לכ-14 עד 21 קילופסקל ושטוף עד שמתלה התא יוצא מקצה הצינור. לאחר מכן, הנח את המכשיר על משטח ישר כדי להכניס את הצינור לכניסת המכשיר.
מכיוון שהחלקת כיסוי הזכוכית המודבקת לחלק התחתון של מכשיר ה-PDMS היא שברירית. הכנס את קצה הצינור המכיל את מתלה התא לכניסת המכשיר. לאחר מכן הכנס חתיכת צינור לפתח היציאה ונתב אותה לתוך צינור ריק לאיסוף פסולת, כגון צינור פלקון ריק המודבק לצד שלב המיקרוסקופ.
הגבירו בעדינות את הלחץ לכ-28 קילופסקל או עד שהתאים זורמים דרך התעלות. מקם את ההתקן כך שמספר ערוצים יהיו בשדה הראייה ויהיו בניצב לתחתית המסך. כדי להתחיל בניתוח נתונים, פתח את קובץ ה- Script הראשי m והפעל את התוכנית.
בחר את הסרטון הראשון לניתוח מחלון סייר Windows שמופיע. ציין את קצב המסגרות של הווידאו שנבחר והקש Enter. יופיע איור המבקש מהמשתמש לבחור חלון חיתוך מלבני.
עבור הסרטון הראשון, בחר חלון המקיף את כל הערוצים משמאל לימין ומצטלב עם הערוצים ממש מעל הנורה הראשונה של מערך הערוצים. בחלק העליון והתחתון, בחרו באזורי הצמצום מהתמונה שנחתכה. האלגוריתם מציג את פילוח התאים עבור 50 הפריימים הראשונים של כל סרטון.
עקוב מקרוב אחר התמונה השמאלית העליונה כדי לקבוע אם האלגוריתם מאתר תאים במדויק. תמונה ממוזגת מונחת על גבי סרטון המקור. כדי להדגים את המיקום של תאים שזוהו, בחר את סרטון הווידאו הבא לעיבוד מחלון סייר Windows.
האלגוריתם יחזור על עצמו. עבור כל סרטון שנבחר, בחר ביטול. לאחר שכל הסרטונים הרצויים נוספו דרך חלון סייר Windows כדי להורות לפונקציה שרשימת הסרטונים מלאה, תוצאות מייצגות עבור זמן המעבר של תאי HL 60 ותאי HL 60 מסוג נויטרופילים מציגים את ציר הזמן לתא בודד לעבור דרך סדרה של מעבר היצרויות.
הזמן נמדד עבור אוכלוסייה של תאים בודדים בכל התכווצות של שבעה מיקרומטר בסדרה של שבע התכווצויות. בלחץ נהיגה של 28 קילופסקל תאי HL 60 חוסמים זמנית את ההתכווצות הראשונה למשך זמן חציוני של 9.3 מילישניות לפני האריזה דרך ההתכווצויות הבאות. לעומת זאת, תאי נויטרופילים מסוג HL 60 חוסמים את ההתכווצות הראשונה למשך 4.3 מילישניות בלבד לפני האריזה.
לאחר שעברו את ההיצרות הראשונה, תאי ההיצרות עוברים מהר יותר דרך ההיצרויות הנותרות משניים לשבע, עם זמן מעבר חציוני של 4.0 מילישניות עבור תאי HL 60 ו-3.3 אלפיות שנייה עבור תאים מסוג נויטרופילים. על ידי השוואת זמן מעבר בין אוכלוסיות תאים, ניתן לחשוף הבדלים ביכולת הזיהוי של התאים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד את יכולת העיוות של סוגי תאים שונים באמצעות הבדיקה המיקרופלואידית הפשוטה.
כאן, זרימה מונעת לחץ משמשת להנעת תאים דרך תעלות מיקרופלואידיות, מה שמאפשר לבחון עיוות והרפיה של תאים בודדים.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מחקר זה חוקר את הנטייה לעיוות של סוגי תאים שונים באמצעות מבחן מבוסס מיקרופלואידיקה. המבחן מודד את קנה המידה הזמני עבור תאים לעבור דרך סדרה של מצומצמות בגודל מיקרון, ומספק תובנות לגבי התנהגות התאים תחת זרימה מונעת בלחץ.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה של תאים
- מיקרופלואידיקה
- ביומכניקה
רקע
- נטייה לעיוות של התא חיונית לתהליכים פיזיולוגיים שונים.
- טכניקות קיימות למדידת נטייה לעיוות של התאים כוללות מגבלות בתפוקה.
- מכשירי מיקרופלואידיקה מציעים חלופה בעלת תפוקה גבוהה למבחנים כאלה.
- מחקר זה משתמש במכשירי מיקרופלואידיקה PDMS כדי לשפר את דיוק המדידה.
מטרת המחקר
- להעריך את נטיית התאים מסוגים שונים לעיוות.
- למדוד את זמני המעבר של תאים דרך מצומצמות.
- להשוות את הביצועים של מבחנים מיקרופלואידיים עם שיטות מסורתיות.
שיטות ששימשו
- ייצור מכשירי מיקרופלואידיקה PDMS.
- זרימה מונעת בלחץ כדי להניע תאים דרך ערוצים.
- ניתוח אוטומטי של תמונות לעיבוד נתוני וידאו.
- ניתוח היסטוגרמה של נתוני זמן מעבר.
תוצאות עיקריות
- סוגי תאים שונים מפגינים רמות שונות של נטייה לעיוות.
- זמני מעבר מתואמים עם סוג התא ונטיית העיוות שלו.
- המבחן המיקרופלואידי מפגין יכולות תפוקה גבוהה.
- שיטה זו עולה על טכניקות מסורתיות כמו מיקרוסקופיית כוח אטומי.
מסקנות
- המבחן המבוסס על מיקרופלואידיקה יעיל למדידת נטיית התאים לעיוות.
- התוצאות מצביעות על הבדלים משמעותיים בהתנהגות התאים על סמך הסוג שלהם.
- גישה זו יכולה לשפר את הבנתנו את מכניקת התאים בהקשרים שונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This microfluidic technique enables high-throughput assessment of cell deformability, a key biophysical property linked to cell function and disease state. By quantifying transit times through micron-scale constrictions, it provides mechanistic insights into cytoskeletal dynamics and membrane mechanics. The method supports early discovery workflows by offering a scalable, quantitative readout for phenotypic screening and target validation in hematologic and immuno-oncology research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking cytoskeletal or molecular targets to functional deformability phenotypes.
- Operational Value: Supports biological de-risking through rapid, label-free screening of compound effects on cell mechanics.
- Predictive Value: Generates quantitative, reproducible data that inform target confidence and portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, high-content datasets on single-cell mechanical responses under controlled flow conditions.
- Operational Value: Enables assay readiness with automated image analysis, reducing manual processing time and increasing throughput to ~100 cells per hour.
- Scalability: Facilitates platform reuse across cell lines and experimental conditions due to modular PDMS device design and pressure-driven flow control.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects molecular perturbations to functional biomechanical outputs, supporting translational biomarker discovery in leukemia and neutrophil differentiation models.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery to preclinical validation by providing a consistent, quantitative readout of cell state changes.
- Risk Mitigation: Aids in identifying mechanistically distinct cell subpopulations that may influence drug response or resistance.
Pipeline & Workflow Integration
The technique fits within the discovery continuum from target engagement to phenotypic screening, particularly in mechanobiology-focused programs. It complements genomic and proteomic approaches by adding a functional, biomechanical layer to cell characterization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring how genetic or pharmacological perturbations alter cell transit dynamics through constrictions.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative transit time data that enable comparison across conditions and compound libraries.
- Analytics: Generates histogram-based readouts of transit times that allow statistical comparison of cell populations and detection of subphenotypes.
- Translational Research: Aligns with biomarker development efforts by correlating deformability shifts with differentiation states, as seen in HL-60 to neutrophil-like transitions.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular, adaptable platform applicable to diverse cell types and research contexts without major reconfiguration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in mechanistic links between molecular targets and cellular phenotypes.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through automated analysis and controlled microfluidic environments.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by providing early, functional readouts that reduce reliance on surrogate endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their impact on biomechanical hallmarks of disease-relevant cell states.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, PDMS handling, and pressure-driven flow systems.
- Depends on access to high-speed imaging systems (≥100 fps) and automated image analysis pipelines.
- Necessitates standardization of cell preparation, surfactant use, and pressure calibration across users and labs.
- Involves optimization of constriction dimensions relative to target cell size for accurate deformation profiling.
- Limited by the need for single-cell suspensions and compatibility with adherent or fragile cell types without prior adaptation.
