טכניקת Microfluidic לחקור deformability הסלולרי
3 בספטמבר 2014
אנו מדגימים מבוססי assay מיקרופלואידיקה כדי למדוד את הזמנים לתאים למעבר דרך רצף של אילוצי מיקרון בקנה מידה.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לחקור את יכולת העיוות של סוגי תאים שונים באמצעות בדיקה פשוטה המבוססת על מיקרופלואידיקה. זה מושג על ידי ייצור מכשיר מיקרופלואידית פולי דימתיל סובוקסן או PDMS כדי לחקור את ציר הזמן של מעבר התא דרך רצף של היצרויות היצרות לאחר מכן משמשת זרימה מונעת לחץ כדי להניע תאים דרך התעלות המיקרופלואידיות שלהם, מה שמאפשר לבדוק את העיוות וההרפיה התלויה בזמן של תאים בודדים. לאחר מכן, תוכנית ניתוח התמונות האוטומטית מופעלת על מנת לעבד את הסרטונים ולקבל היסטוגרמה של נתוני זמן המעבר.
התוצאות מראות כי סוגי תאים שונים מציגים הבדלים ביכולת עיוות התאים בהתבסס על זמן המעבר שלהם דרך סדרה של התכווצויות. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות כגון מיקרוסקופ כוח אטומי או שאיבת מיקרו פיפט הוא שמכשירים מיקרופלואידיים יכולים לפעול בהצלחה עם יכולות תפוקה גבוהות. בעוד שמכשירים מיקרופלואידיים אחרים יכולים לשמש גם לבדיקת יכולת הצורה של התאים.
אנו מתכננים את המכשיר שלנו כך שתאים יעברו דרך התכווצויות עוקבות, גיאומטריה נפוצה בהקשרים פיזיולוגיים כמו מיטת נימי הריאה. כדי להתחיל, תכנן את המכשיר המיקרופלואידי על ידי בחירת רוחב תעלות מערך ההיצרות כך שיהיה כ-30 עד 50% מקוטר התא הממוצע וגובה התעלה יהיה לפחות 50% מקוטר התא. כלול מסנן ביציאות הכניסה כדי להסיר פסולת ולהפריד אשכולות תאים.
לפני תחילת הניסוי, יצר את מאסטר המכשיר באמצעות טכניקות סטנדרטיות לעיבוד מיקרו ליטוגרפי. ודא את גובה תכונות התבנית באמצעות פרופילומטר. לאחר מכן, תקן את מקור האוויר לזרימה מונעת לחץ באמצעות מיכל אוויר דחוס ורצף של ווסתי אוויר ואביזרים.
ראשית הגדר מיכל אספקת אוויר ווסת ידני. לאחר מכן הגדר ווסת לחץ בשליטה אלקטרונית בהתאם לווסת הידני. השתמש בקוד הפשוט שנכתב ב-LabVIEW כדי להזין את הלחץ הרצוי.
הממיר האלקטרו-פנאומטי משתמש בלולאת משוב פנימית כדי להתאים את לחץ יציאת השסתום כך שיתאים ללחץ שצוין על פני המכשיר המיקרופלואידי. הגדר תא בלחץ כדי להניע את זרימת מתלה התא על ידי הרכבת תא מתלה תאים מתוך צינור ציטומטר זרימה סטנדרטי ומכסה מעובד היוצר אטימה אטומה בלחץ על הצינור. מכסה תא הלחץ מכיל שני פתחים, כניסה המתחברת למיכל האוויר הדחוס ויציאה שדרכה זורמים תאים מתא הלחץ למכשיר.
לאחר מכן, הגדר מיקרוסקופ הפוך המצויד במצלמה בעלת קצב רכישה של לפחות 100 פריימים לשנייה. כדי ללכוד תמונות של התאים הזורמים דרך מערך ההיצרות, הכינו תמיסת פעילי שטח מלאי בתמיסת מלח חוצצת פוספט או PBS שכן הוספת כמות קטנה של חומר פעילי שטח לתמיסת המדיה התאית תעזור למזער את הידבקות התאים לדפנות ה-PDMS. כדי לייצר את בלוק ה-PDMS עם תעלות מיקרופלואידיות, הוסף גרם אחד של חומר ריפוי ל-10 גרם של בסיס PDMS וערבב היטב.
יוצקים את התערובת על המכשיר. מאסטר דגה בצנצנת פעמון עם ואקום מופעל עד שהבועות הכלואות נעלמות, או למשך כ-10 עד 20 דקות. לאחר זמן זה, עדיין עשויות להיות בועות בממשק AIR PDMS, וזה נורמלי.
אלה בדרך כלל יתפוגגו במהלך האפייה. לאחר מכן אופים את מכשיר הדגה בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לאחר שהמכשיר התקרר. הסר את המכשירים המיקרופלואידיים מתבנית המאסטר.
התחל בהרמה עדינה של פינה אחת של המכשיר. קילוף איטי ועדין בניגוד להרמה בלוק PD DMS ישר כלפי מעלה מפחית את הלחץ הן על ה-PDMS והן על המאסטר חתוך מכשירים מיקרופלואידיים בודדים מבלוק ה-PDMS בעזרת סכין גילוח והסר את המכשיר מחורי האגרוף הראשיים במכשיר ה-PDMS כדי ליצור יציאות חיבור לגישה בין צינורות לערוצי מיקרו. צור חורים מצד התעלה ועד לצד החיצוני של המכשיר באמצעות ניקוב ביופסיה.
שטפו את מכשיר ה-PDMS עם איזופרופנול כדי להסיר אבק ולתקוע נתחי PDMS. ודא שהחורים המנוקבים נקיים מפסולת על ידי הפניית זרם קבוע של איזופרופנול טהור מבקבוק סחיטה דרך החורים. יש לייבש באוויר מסונן.
נקו את מצע הזכוכית על ידי שטיפה במתנול. לאחר מכן יש לייבש בפן עם אוויר מסונן ולהניח על פלטה חמה של 200 מעלות צלזיוס למשך חמש עד 10 דקות כדי להבטיח שהכוס נקייה ויבשה לחלוטין לפני טיפול בפלזמה. כמפורט בפרוטוקול הטקסט, בדוק את המכשיר המיקרופלואידי תחת מיקרוסקופ.
ודא שהתעלות אינן מכווצות או שבורות, וכי גם חורי הכניסה וגם היציאה מתחברים ישירות לתעלות המכשיר באמצעות יעד הספק נמוך. הנח את מתלה התאים בצינור ציטומטר זרימה וחבר למכסה הלחץ לפני חיבור הצינור למכשיר המיקרופלואידי, כוונן את הלחץ לכ-14 עד 21 קילופסקל ושטוף עד שמתלה התא יוצא מקצה הצינור. לאחר מכן, הנח את המכשיר על משטח ישר כדי להכניס את הצינור לכניסת המכשיר.
מכיוון שהחלקת כיסוי הזכוכית המודבקת לחלק התחתון של מכשיר ה-PDMS היא שברירית. הכנס את קצה הצינור המכיל את מתלה התא לכניסת המכשיר. לאחר מכן הכנס חתיכת צינור לפתח היציאה ונתב אותה לתוך צינור ריק לאיסוף פסולת, כגון צינור פלקון ריק המודבק לצד שלב המיקרוסקופ.
הגבירו בעדינות את הלחץ לכ-28 קילופסקל או עד שהתאים זורמים דרך התעלות. מקם את ההתקן כך שמספר ערוצים יהיו בשדה הראייה ויהיו בניצב לתחתית המסך. כדי להתחיל בניתוח נתונים, פתח את קובץ ה- Script הראשי m והפעל את התוכנית.
בחר את הסרטון הראשון לניתוח מחלון סייר Windows שמופיע. ציין את קצב המסגרות של הווידאו שנבחר והקש Enter. יופיע איור המבקש מהמשתמש לבחור חלון חיתוך מלבני.
עבור הסרטון הראשון, בחר חלון המקיף את כל הערוצים משמאל לימין ומצטלב עם הערוצים ממש מעל הנורה הראשונה של מערך הערוצים. בחלק העליון והתחתון, בחרו באזורי הצמצום מהתמונה שנחתכה. האלגוריתם מציג את פילוח התאים עבור 50 הפריימים הראשונים של כל סרטון.
עקוב מקרוב אחר התמונה השמאלית העליונה כדי לקבוע אם האלגוריתם מאתר תאים במדויק. תמונה ממוזגת מונחת על גבי סרטון המקור. כדי להדגים את המיקום של תאים שזוהו, בחר את סרטון הווידאו הבא לעיבוד מחלון סייר Windows.
האלגוריתם יחזור על עצמו. עבור כל סרטון שנבחר, בחר ביטול. לאחר שכל הסרטונים הרצויים נוספו דרך חלון סייר Windows כדי להורות לפונקציה שרשימת הסרטונים מלאה, תוצאות מייצגות עבור זמן המעבר של תאי HL 60 ותאי HL 60 מסוג נויטרופילים מציגים את ציר הזמן לתא בודד לעבור דרך סדרה של מעבר היצרויות.
הזמן נמדד עבור אוכלוסייה של תאים בודדים בכל התכווצות של שבעה מיקרומטר בסדרה של שבע התכווצויות. בלחץ נהיגה של 28 קילופסקל תאי HL 60 חוסמים זמנית את ההתכווצות הראשונה למשך זמן חציוני של 9.3 מילישניות לפני האריזה דרך ההתכווצויות הבאות. לעומת זאת, תאי נויטרופילים מסוג HL 60 חוסמים את ההתכווצות הראשונה למשך 4.3 מילישניות בלבד לפני האריזה.
לאחר שעברו את ההיצרות הראשונה, תאי ההיצרות עוברים מהר יותר דרך ההיצרויות הנותרות משניים לשבע, עם זמן מעבר חציוני של 4.0 מילישניות עבור תאי HL 60 ו-3.3 אלפיות שנייה עבור תאים מסוג נויטרופילים. על ידי השוואת זמן מעבר בין אוכלוסיות תאים, ניתן לחשוף הבדלים ביכולת הזיהוי של התאים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד את יכולת העיוות של סוגי תאים שונים באמצעות הבדיקה המיקרופלואידית הפשוטה.
כאן, זרימה מונעת לחץ משמשת להנעת תאים דרך תעלות מיקרופלואידיות, מה שמאפשר לבחון עיוות והרפיה של תאים בודדים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את יכולת העיוות של סוגי תאים שונים באמצעות בדיקה המבוססת על מיקרופלואידיקה. הבדיקה מודדת את פרק הזמן הדרוש לתאים כדי לעבור דרך סדרה של היגבויות (constrictions) בקנה מידה של מיקרונים, ובכך מספקת תובנות לגבי התנהגות התאים תחת זרימה מונעת לחץ.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- מיקרופלואידיקה
- ביומכניקה
רקע
- גמישות תאים היא קריטית לתהליכים פיזיולוגיים שונים.
- לטכניקות קיימות למדידת גמישות תאים יש מגבלות מבחינת תפוקה.
- התקנים מיקרופלואידיים מציעים חלופה בעלת תפוקה גבוהה לבדיקות מסוג זה.
- מחקר זה עושה שימוש בהתקנים מיקרופלואידיים מ-PDMS כדי לשפר את דיוק המדידה.
מטרת המחקר
- להערכת יכולת העיוות של סוגי תאים שונים.
- למדידת זמני המעבר של תאים דרך מחיצות.
- להשוואת הביצועים של בדיקות מיקרופלואידיות מול שיטות מסורתיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ייצור התקני מיקרופלואידיקה מ-PDMS.
- זרימה מונעת לחץ להובלת תאים דרך התעלות.
- ניתוח תמונות אוטומטי לעיבוד נתוני וידאו.
- ניתוח היסטוגרמה של נתוני זמן מעבר.
תוצאות עיקריות
- סוגי תאים שונים מראים רמות משתנות של יכולת דהפורמציה.
- זמני המעבר נמצאים במתאם עם סוג התא ויכולת הדהפורמציה שלו.
- הבדיקה המיקרופלואידית מדגימה יכולות של תפוקה גבוהה.
- שיטה זו עולה בביצועיה על טכניקות מסורתיות כמו מיקרוסקופיה של כוח אטומי.
מסקנות
- הבדיקה המבוססת על מיקרופלואידיקה יעילה למדידת דהפורמביליות של תאים.
- התוצאות מעידות על הבדלים משמעותיים בהתנהגות התאים בהתאם לסוגם.
- גישה זו יכולה לשפר את הבנתנו את המכניקה התאית בהקשרים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טכניקה מיקרופלואידית זו מאפשרת הערכה בספיקת גבוהה של דפורמביליות תאים, תכונה ביופיזית מרכזית הקשורה לתפקוד התא ולמצב מחלה. באמצעות כימות זמני המעבר דרך מצריים בסדר גודל של מיקרונים, היא מספקת תובנות מכניסטיות לגבי דינמיקה של השלד התאי ומכניקה של הממברנה. השיטה תומכת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי אספקת קריאה כמותית וניתנת להרחבה לסריקה פנוטיפית ותיקוף מטרות במחקר של המטולוגיה ואימונו-אונקולוגיה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי קישור יעדים של השלד התאי או יעדים מולקולריים לפנוטיפים תפקודיים של יכולת עיוות (deformability).
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות סריקה מהירה וללא סימון של השפעות תרכובים על מכניקת התא.
- ערך ניבוי: מייצר נתונים כמותיים הניתנים לשחזור, המזינים את רמת הביטחון ביעד ומסייעים בקבלת החלטות לגבי סדר העדיפויות של תיק הפיתוח (portfolio triage).
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר מערכי נתונים סטנדרטיים ועתירי תוכן על תגובות מכניות של תאים בודדים תחת תנאי זרימה מבוקרים.
- ערך תפעולי: מאפשר מוכנות של הבדיקה באמצעות ניתוח תמונות אוטומטי, ובכך מקטין את זמן העיבוד הידני ומעלה את התפוקה לכ-100 תאים לשעה.
- סקביליות: מקלה על שימוש חוזר בפלטפורמה עבור קווי תאים ותנאים ניסיוניים שונים, הודות לעיצוב מודולרי של התקני ה-PDMS ובקרת זרימה מונעת לחץ.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר בין הפרעות מולקולריות לתפוקות ביומכניות פונקציונליות, ובכך תומך בגילוי ביומרקרים תרגומיים במודלים של לוקמיה ודיפרנציאציה של נויטרופילים.
- ערך תפעולי: מבטיח רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי אספקת קריאה כמותית ועקבית של שינויים במצב התא.
- הפחתת סיכונים: מסייע בזיהוי תתי-אוכלוסיות של תאים הנבדלות מבחינה מכניסטית, העשויות להשפיע על התגובה לתרופה או על עמידות אליה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
הטכניקה משתלבת ברצף הגילוי, החל ממעורבות המטרה (target engagement) ועד לסריקה פנוטיפית, במיוחד בתוכניות המתמקדות במכנוביולוגיה. היא משלימה גישות גנומיות ופרוטאומיות על ידי הוספת רובד פונקציונלי וביומכני לאפיון התאים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי מדידה של האופן שבו הפרעות גנטיות או פרמקולוגיות משנות את דינמיקת המעבר של תאים דרך מכווצים.
- סריקה: מספק נתוני זמן מעבר כמותיים, המוכנים לניתוח, המאפשרים השוואה בין תנאים שונים ומספריות של תרכובות.
- אנליטיקה: מייצר קריאות מבוססות היסטוגרמה של זמני מעבר, המאפשרות השוואה סטטיסטית של אוכלוסיות תאים וזיהוי של סוב-פנוטיפים.
- מחקר תרגומי: עולה בקנה אחד עם מאמצים לפיתוח ביומרקרים על ידי קורלציה בין שינויים ביכולת העיוות למצבי דיפרנציאציה, כפי שנראה במעברים של HL-60 לתאים דמויי נויטרופילים.
- שימוש חוזר ארגוני: מתפקד כפלטפורמה מודולרית וסתגלנית הישימה לסוגי תאים והקשרי מחקר מגוונים ללא צורך בהגדרה מחדש משמעותית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי צמצום העמימות בקשרים המכניסטיים בין מטרות מולקולריות לפנוטיפים תאיים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה באמצעות ניתוח אוטומטי וסביבות מיקרופלואידיות מבוקרות.
- ערך אסטרטגי: משפר את היעילות של קבלת החלטות go/no-go על ידי אספקת תוצאות פונקציונליות מוקדמות המפחיתות את ההסתמכות על נקודות קצה חלופיות (surrogate endpoints).
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם סיכון, בהתבסס על השפעתן על סימני ההיכר הביומכניים של מצבים תאיים הרלוונטיים למחלה.
שיקולים ביישום
- דורש מומחיות בייצור התקני מיקרופלואידיקה, טיפול ב-PDMS ומערכות זרימה מונעות בלחץ.
- תלוי בגישה למערכות דימוי במהירות גבוהה (≥100 fps) ולצינורות ניתוח תמונה אוטומטיים.
- מחייב סטנדרטיזציה של הכנת תאים, שימוש בחומרים פעילים שטחית וכיול לחץ בין משתמשים ומעבדות שונות.
- כולל אופטימיזציה של ממדי ההצרת ביחס לגודל התא המטרה לצורך אפיון מדויק של הדפורמציה.
- מוגבל על ידי הצורך בתרחיפי תאים בודדים ותאימות לסוגי תאים דבקים או שבירים ללא התאמה מוקדמת.
