חיתוך רוחב חוט השדרה בדג הזברה הזחל

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להבטיח חיתוך מלא של חוט השדרה בעוברים של דגי זברה באמצעות שיטה בעלת תפוקה גבוהה יחסית וניתנת לשחזור, תוך מקסום שיעור ההישרדות. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הזיווג של בוגרים בעלי הגנוטיפ המתאים וביצוע סריקה במידת הצורך. השלב השני הוא גידול העוברים עד חמישה ימים לאחר ההפריה.

בשלב הבא, בצעו את החיתוך באמצעות פייפט מיקרו-הזרקה בעל קצה מדורג. לבסוף, הדגים הפגועים יועברו להשקמה במצע מטופל באנטיביוטיקה עד לסיום הניסוי. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה של אימונופלורסנציה כדי להראות את תגובת תאי progenitor עצביים לפגיעה.

היתרונות המרכזיים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון אלו שפותחו במעבדות של Becker ו-fetcher, כוללים מספר גדול יותר של בעלי חיים למחקר, זמן החלמה קצר יותר ושימוש בכלים גנטיים שאינם זמינים בדרך אחרת בדג zebrafish בוגר. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הרגנרציה, כגון תגובתם של תאי אב עצביים לפגיעה. התחילו את ההכנות ביצירת פלטות ניתוח באמצעות צלחות פטרי בקוטר 60 millimeter וערכת אלסטומר סיליקון cell guard 180 4.

יש לפעול לפי הוראות היצרן. מלאו את הצלחות עד למחצית הנפח לכל היותר והמתינו לפולימריזציה. לאחר מכן, אחסנו את הצלחות כשהן מכוסות בטמפרטורת החדר.

בשלב הבא, ייצרו מיקרו-פיפטות על ידי חימום ומתיחה של צינורות קפילריים מבורוסיליקט בעלי דופן דקה בתוך מכשיר למשיכת מיקרו-פיפטות, תוך שימוש באותן הגדרות ששימשו להכנת מחטי מיקרו-הזרקה תחת מיקרוסקופ דיסקציה. השתמשו בפינצטה כדי לשבור את קצה המיקרו-פיפטה עד לקוטר של כ-200 מיקרון. לאחר מכן, השחיזו את הקצה השבור בעזרת מיקרו-שחייז (micro grinder) בזווית ראשונית של 35 מעלות, ולאחר מכן בצעו שחיזה שנייה בזווית של 25 מעלות כאשר רעש השחזקה פסק.

בדקו תחת מיקרוסקופ סטריאו כדי לוודא שהקצה חד וחלק. שימוש בקצה רחב מדי נוטה להוביל לשיעורי תמותה גבוהים יותר בשל הסיכוי המוגבר לפגיעה באורטה הגבית (dorsal aorta). בעוד שקצה צר מדי נוטה להחליק על העור במקום לחתוך את הרקמה, אחסנו את המיקרו-פיפטים בעלי השיפוע הנכון בצלחת פטרי על כמות קטנה של חימר שבעה ימים לפני הניתוח.

הכינו מיכלי הזדווגות של דגי spr זכרים ונקבות. אספו את העוברים המופרים למחרת בבוקר, שלוש שעות לאחר הדלקת האורות, כדי להבטיח תפוקה מקסימלית.

במידה ומשתמשים בקו דגמי דוחי (reporter line) טרנסגני בעל גנוטיפים מעורבים, יש להניח 100 עוברים לכל צלחת, ולהדגיר את הצלחות בטמפרטורה של 28.5 degrees Celsius. במידה ומשתמשים בקו דוחי, יש לסרוק את העוברים לאיתור ביטוי פלואורסצנטי 48 שעות לאחר ההפריה.

אפשרו לעוברים הפלואורסצנטיים להבשיל בטמפרטורה של 28.5 degrees Celsius עד שהזחלים יהיו בני חמישה ימים לאחר ההפריה. הכינו את פלטת הניתוח על ידי כיסוי מגן התאים ב-E2 ו-10 mg/L gentamicin sulfate ו-trica. בנוסף, הכינו כלי התאוששות על ידי הוספת 25 mL של E2 ו-Gentamycin sulfate לפטריית Petri בנפח 100 mm.

השלב הבא הוא להכין ידית סכין מנתחים על ידי הדבקת שלושה מקלוני צמר גפן יחד בעזרת סרט דבק. פעולה זו יוצרת כלי משולש עם שלושה חריצים. לאחר מכן, רכיבו את המיקרופיפטה שהוכנה על מקלוני צמר הגפן על ידי הדבקתה לאחד החריצים להשלמת הסכין; הניחו את המיקרופיפטה בצד עד למועד השימוש בה.

התחילו את הניתוח על ידי הרדמה של פלטה אחת של 25 זחלים בכל פעם. באמצעות trica, הדגים מורדמים מספיק כאשר הם אינם מראים יותר תגובה למגע. העבירו את הזחלים לפלטת ניתוח והניחו את הפלטה תחת מיקרוסקופ דיסקציה.

תחת הגדלה מקסימלית, סובב זחל אחד כך שישכב על צדו, כאשר גבו קרוב ככל הניתן ליד האוחזת בסקלפל. מקם את הפינצטה כך שתתמך על גבי מגן התא. החזק את הסקלפל מזכוכית בזווית על פני רוחב הזחל, כשהוא נשען על אחת מזרועות הפינצטה.

בצעו חתך בפנים הצדדי-גבי של הזחלים בגובה הנקב האנאלי. ודאו שאינכם חותכים מעבר לקצה הבטני של השכוך. לאחר מכן, סובבו את המבצע כדי לנתק את חוט השדרה.

הסיבוב הנדרש הוא בדרך כלל הרבה פחות מ-90 מעלות. חזרו על קטיעת הש republics חוט השדרה עם שאר הזחלים. עם השלמת הניתוח בקבוצת הזחלים, השתמשו בפ pipette אחורית ובמשאבת pipette כדי להעביר את בעלי החיים הפצועים לצלחת ההחלמה.

כדי להבטיח התאוששות מההרדמה, הקפידו לתפוס תחילה את ראש או זנב הזחלים במהלך ההעברה. אין להפעיל לחץ על אתר הפגיעה על ידי כיפוף הזחלים לאחר שהשפעת ההרדמה פגה. העבירו את הזחלים הפגועים מלוח ההתאוששות לצלחות בנפח 100 millimeter הממולאות ב-25 milliliters של E two ו-gentamycin sulfate, בצפיפות של 25 זחלים לצלחת.

לאחר מכן, מקם אותם באינקובטור בטמפרטורה של 28.5 °C בזמן שהפצע מחלים. בדוק את הצלחות מדי יום והסר בעלי חיים חולים או מתים.

אין להחליף את המצע עד להופעתם של קופי פרוטוזואים של מים מתוקים במצע. בעת החלפת המצע, אין להעביר את הדגים לפיתח חדש. במקום זאת, יש להסיר כמה שיותר מהמצע ולהמלא את אותה פיתח במצע חדש.

חזור על החלפת המצע לפי הצורך כדי להפחית את אוכלוסיית ה-coops. האכל את הזחלים מדי יום בכמות קטנה של מזון אבקה לדגיגים. כאן מוצג דג זברה עם חיתוך מלא של חוט השדרה לאחר יום אחד.

לאחר הפגיעה, GFP מובע בכל הנוירונים, והחץ הצהוב מצביע על אתר הפגיעה. דג זברה עם חתך מלא של חוט השדרה מוצג כאן שלושה ימים לאחר הפגיעה. דג זברה מקובע ומסומן ב-UCD זה מראה חתך מלא של חוט השדרה.

החץ הצהוב מזהה שוב את אתר הפגיעה. בניגוד לכך, האזור הרציף של סימון נוירונים לאורך הקצה הוונטרלי של חוט השדרה בדג זהברה מקובע שלושה ימים לאחר הפגיעה, מעיד על כריתה חלקית.

לאחר רכישת המיומנות, ניתן לעבד עד 300 זחלים לשעה באמצעות טכניקה זו.