Name: חיתוך רוחב חוט השדרה בדג הזברה הזחל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-21T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: למד שיטת חיתוך רוחב חוט השדרה בזחלי דג הזברה Danio rerio באמצעות מיקרופיפטה משופעת. השיטה מאפשרת שחזור תפקודי תוך שבועיים והדמיית תגובת קדם-תאים עצביים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו חייבים תודה למתקן דג הזברה אוניברסיטת יוטה לגידול בעלי חיים. RID נתמכה על ידי NIH R56NS053897, וLKB היה חניך predoctoral נתמך על ידי היוזמה HHMI Med-Into-הגראד.

דג הזברה גדלו וגדלה על פי נהלים קבועים; ניסויים אושרו על ידי האוניברסיטה של ​​ועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש מוסדי יוטה. 1. הכנת לוחות ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך צלחות ניתוח באמצעות 60 מ&quot;מ צלחות פטרי וSylgard 184 ערכת סיליקון אלסטומר, בעקבות הוראות יצרן. מלא מנות לא יותר מחצי מלא ולאפשר לפלמר. חנות מכוסות בטמפרטורת חדר. </li></ol> 2. הכנת Micropipettes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפברק micropipettes על ידי חימום ומשייכת צינור נימי ורוסיליקט קיר דק בחולץ micropipette עם אותן ההגדרות להכנת מחטי microinjection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתיחה, להצמיד את קצה micropipette כ 200 מיקרומטר בקוטר עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קצה שבור פוע עם microgrinder תחילה ל35 °, ואחריו beveling שני 25 מעלות. ודא קצה חד וSMOOTH. חנות סיימה micropipette המשופע בצלחת פטרי על כמות קטנה של חימר. </li></ol> 3. הכנת דג הזברה הזחלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 7 ימים לפני הניתוח, להגדיר טנקי הזדווגות של דג הזברה זכר ונקבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף עובר למחרת בבוקר, 3 שעות אחרי שהאורות באים על מנת להבטיח תשואה מקסימלי. אם אתם משתמשים בקו כתב מהונדס כגון Tg (elevl3: eGFP) knu3, עוברים מופרים סוג 100/100 צלחת מ&quot;מ ב25 מיליליטר של E3 על 28.5 ° C. אם באמצעות wildtype, מופרה סוג עוברים 25/100 צלחת מ&quot;מ ב25 מיליליטר של E3 על 28.5 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אתם משתמשים בקו עיתונאי, מסך עובר לביטוי ניאון ב48 hpf. אפשר לעוברים מזוהים להבשיל בצפיפות של 25/100 צלחת מ&quot;מ ב25 מיליליטר של E3 על 28.5 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר זחלים 5 DPF, להכין צלחת ניתוח על ידי כיסוי Sylgard עם E2 +10 מ&quot;ג / ליטר gentamycin סולפט (GS) + Tricaine. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את התאוששות מנה על ידי הוספת 25 מיליליטר E2 + GS ל100 מ&quot;מ דיס פטרישעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את האזמל על ידי מקליט יחד שלוש מטליות. זה יהווה כלי משולש עם שלושה חריצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר micropipette הוכן על מטליות ידי מקליט אותו לאחד מהחריצים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם שימוש חוזר micropipettes, סומק עד ברור עם E2 + GS באמצעות מזרק 1ml ומחט G 27 לפני ההרכבה במטליות. </li></ol> 4. ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי צלחת 1 של זחלים בכל פעם (25 דגים) עם Tricaine. דגים במידה מספקת בהרדמה כאשר הם כבר לא מציגים מגע תגובה. חשוב שהדגים מורדמים לחלוטין לפני הניתוח, אחרת הם עווית כאשר האזמל נוגע בם. ניתוח מתבצע תחת מיקרוסקופ לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הזחלים לצלחת ניתוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת הגדלה המרבית, לסובב זחל אחד בכל פעם, כך שהוא שוכב על הצד שלה עימה חזרה הקרוב ביותר למחזיקה אזמל היד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמדת מלקחיים כך שהן מונחות על Sylgard,זווית מעל הרוחב של הזחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרענן אזמל הזכוכית נגד אחת מהזרועות של המלקחיים, חתוך לרוחב הפנים הגב של הזחל ברמה של נקבובית האנאלי, להיות בטוח שלא לחתוך מעבר לקצה הגחון של notochord. לסובב את סכין המנתחים לנתק את חוט השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה עם זחלים הנותרים. הערה: אם זחל מדמם, הוא לא יתאושש מהניתוח. מייד להסיר את הזחל מצלחת הניתוח ולהרדים אותו באמצעות מנת יתר Tricaine. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהניתוח באצווה של זחלים הוא מוחלט, העברה נפצעה חיות לצלחת ההתאוששות. זאת על מנת לתמוך בסליקה של הרדמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות: בעת איסוף זחלים נפצעו להעברה, לוודא שהם ראשון נאספים ראש או זנב: אינו מדגיש את הפגיעה באתר על ידי כיפוף הזחלים. הערה: כל ההתקנים המשמשים לניתוח ניתן לעשות שימוש חוזר, כוללים micropipettes. </li></ol></li></ol> 5. שחזור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfer נפצע זחלים מצלחת ההחלמה ל100 צלחות מ&quot;מ מלאות 25 מיליליטר E2 + GS בצפיפות של 25/plate. לאפשר להתאושש בC חממה 28.5 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק צלחות יומיות, הסרת בעלי חיים חולים ומתים. לא לשנות את התקשורת עד Coleps (פרוטוזואה המים המתוקים) נראה בתקשורת. כאשר משנה את התקשורת, לא להעביר את הדגים לצלחת חדשה; במקום זאת, להסיר כמה שיותר אמצעי תקשורת אפשרי ולהציף את אותה צלחת עם מדיה חדשה. חזור על פעולה במידת צורך כדי להקטין את אוכלוסיית Coleps. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאכיל מדי יום עם כמות קטנה של מזון מטגנים אבקה. הערה: מזון חי (למשל, בסנדליות או rotifers) לא יכולה להיות מוזנת לזחלים פגועים עד אחרי שהם התאוששו תנועה. אחרת, המזון החי יהיה ליישב את הפגיעה באתר ולהרוג את הזחלים. </li></ol>

<ol><li>Houweling, D. A., Bär, P. R., Gispen, W. H., Joosten, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+injury%3A+bridging+the+lesion+and+the+role+of+neurotrophic+factors+in+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+brain+research%22%5BJournal%5D)">Spinal cord injury: bridging the lesion and the role of neurotrophic factors in repair.</a> Progress in brain research. 117, 455-471 (1998).</li>
<li>Mikami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+dendritic+cells+in+injured+adult+spinal+cord+results+in+activation+of+endogenous+neural+stem%2Fprogenitor+cells+leading+to+de+novo+neurogenesis+and+functional+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">Implantation of dendritic cells in injured adult spinal cord results in activation of endogenous neural stem/progenitor cells leading to de novo neurogenesis and functional recovery.</a> Journal of neuroscience research. 76 (4), 453-465 (2004).</li>
<li>Chernoff, E. A. G., Sato, K., Corn, A., Karcavich, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+regeneration%3A+intrinsic+properties+and+emerging+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Spinal cord regeneration: intrinsic properties and emerging mechanisms.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 13 (5), 361-368 (2002).</li>
<li>Kuscha, V., Barreiro-Iglesias, A., Becker, C. G., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+tyrosine+hydroxylase+and+serotonergic+systems+in+the+regenerating+spinal+cord+of+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of tyrosine hydroxylase and serotonergic systems in the regenerating spinal cord of adult zebrafish.</a> The Journal of comparative neurology. 520 (5), 933-951 (2012).</li>
<li>Becker, C. G., Lieberoth, B. C., Morellini, F., Feldner, J., Becker, T., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1.1+is+involved+in+spinal+cord+regeneration+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">L1.1 is involved in spinal cord regeneration in adult zebrafish.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24 (36), 7837-7842 (2004).</li>
<li>Hui, S. P., Dutta, A., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+response+after+crush+injury+in+adult+zebrafish+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+An+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Cellular response after crush injury in adult zebrafish spinal cord.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 239 (11), 2962-2979 (2010).</li>
<li>Goldshmit, Y., Sztal, T. E., Jusuf, P. R., Hall, T. E., Nguyen-Chi, M., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf-dependent+glial+cell+bridges+facilitate+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fgf-dependent glial cell bridges facilitate spinal cord regeneration in zebrafish.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7477-7492 (2012).</li>
<li>Reimer, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+regeneration+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Motor neuron regeneration in adult zebrafish.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 28 (34), 8510-8516 (2008).</li>
<li>Hale, M. E., Ritter, D. A., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+confocal+study+of+spinal+interneurons+in+living+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">A confocal study of spinal interneurons in living larval zebrafish.</a> The Journal of comparative neurology. 437 (1), 1-16 (2001).</li>
<li>Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP-induced+repair+of+zebrafish+spinal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits.</a> Science. 305 (5681), 254-258 (2004).</li>
<li>McClenahan, P., Troup, M., Scott, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fin-tail+coordination+during+escape+and+predatory+behavior+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Fin-tail coordination during escape and predatory behavior in larval zebrafish.</a> PloS one. 7 (2), (2012).</li>
<li>Kim, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repressor+activity+of+Headless%2FTcf3+is+essential+for+vertebrate+head+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Repressor activity of Headless/Tcf3 is essential for vertebrate head formation.</a> Nature. 407 (6806), 913-916 (2000).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

כאשר בתחילה ללמוד את הטכניקה הזו, אנו ממליצים שתנסו לא יותר מ 50-100 transections בפגישה אחת. כאשר תשלטו בטכניקה זו, אנו מסוגלים transect עד 300 עובר לכל שעה; עם זאת, רמה זו של תפוקה דורשת כמה חודשים של תרגול שבועי. בנוסף, אנו ממליצים לתרגל עם קו כתב ואימות חיתוך רוחב מלא עד לשכיחות של חיתוך רוחב חוט השדרה שלם מצטמצמת פחות מ -1%. חיתוך רוחב חוט השדרה בדג הזברה המבוגר הוא טכניקה מבוססת וחזקה ללימוד לצמיחה מחודשת ו...

טראומה גדולה לחוט השדרה האנושי לעתים קרובות תוצאות שיתוק ואיבוד התחושה מתחת לרמה של פגיעה קבוע, בשל חוסר היכולת לגדל מחדש אקסונים או reinitiate נוירוגנזה 1,2. בניגוד ליונקים, לעומת זאת, anamniotes כוללים סלמנדרות ודג זברה (Danio rerio) מראה התאוששות חזקה גם לאחר חיתוך רוחב חוט השדרה 3,4. דג הזברה המבוגר הוא מודל מבוסס היטב ללימוד תהליך ההתאוששות לאחר פגיעה בחוט השדרה 5-7. בעקבות חיתוך רוחב חוט השדרה שלם, הקמתה מחדש של תפקוד חושי וקטר הוא ציין בדג הזברה המבוגר ב -6 שבועות שלאחר פציעה 8. על מנת לבחון את תהליך התחדשות in vivo, פנינו לדג זברת הזחל השקוף 9. כאן אנו מציגים שיטה ותחצה את חוט השדרה של 5 ימים לאחר ההפריה USI דג הזברה (DPF) זחלng פיפטה משופעת microinjection כאזמל, שונה מהאט, et al. 10 שיטה זו תומכת בקצב העברת נתונים גבוה, תמותה נמוכה, ושחזור. בעזרת תרגול, ניתן transected 300 זחלים / שעה, ובמשך 6 חודשים של transections, כוללים מעל 3,600 בעלי חיים, 98.75% ± 0.72% שרדו עד 7 ימים לאחר פציעה (dpi). הנתונים שלנו מראה התאוששות מהירה של תנועה חושית וגם: בdpi 1, כל התנועה על ידי הדגים הפצועים היא מונעת על ידי תנועת סנפיר חזה בלבד. עם זאת, זחלים מתחילים להגיב למגע טונגסטן הזנב מחט לחיתוך רוחב של 2 dpi, להקים מחדש את תנועת C-עיקול על ידי 3 dpi, ולהציג את חיה טורפת בשיעור של 5 dpi 11. באמצעות מכתים נוגדן כנגד טובולין acetylated, יש לנו אישרו כי האקסונים נעדרים מאתר הפציעה בdpi 1, אבל חצינו את הפגיעה באתר על ידי 5 dpi. אנו מאמינים פרוטוקול זה יספק טכניקת ערך לחקר צמיחה מחודשת אקסון ונוירוגנזה בחוט השדרה בעקבות פציעה. </p&gt;

<table><tbody><tr><td>צלחת פטרי 60 מ"מ</td><td>VWR</td><td>82050-544</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 100 מ"מ</td><td>VWR</td><td>89038-968</td><td></td></tr><tr><td>PDMS, ערכת אלסטומר סיליקון Sylgard 184</td> צינורות נימי בורוסיליקט <td>פישר סיינטיפיק</td><td>NC9644388</td><td></td></tr><tr><td>: OD 1.00 מ"מ, מזהה 0.78 מ"מ</td><td>וורנר אינסטרומנטס בע"מ.</td><td>64-0778</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>פיין סיינטיפיק כלים בע"מ</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה</td><td>ניקון</td><td>SMZ6454</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוגריינדר</td><td>Narishige</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin Sulfate</td><td>Amresco Inc.</td><td>0304-5G</td><td>ממיסים במים 10 מ"ג/מ"ל, מאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Acros Organics</td><td>118000100</td><td></td></tr><tr><td>מוליך כותנה, עץ, 6 אינץ'</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>מזרק BD 1 מ"ל</td><td>BD</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>27 גרם מחט</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Fry מזון</td><td>Argent Labs</td><td>חנות F-ARGE-PTL-CN</td><td>ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>דגם P-97</td><td>נימה תיבה FB330B</td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>20x E2 (1 ליטר); </חזק> יש לאחסן ב-RT</td></tr><tr><td>17.5 גרם NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-500</td><td></td></tr><tr><td>0.75 גרם KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>2.90 גרם CaCl2&middot; 2 שעות<תת>2</תת>O</td><td>סיגמא</td><td>C7902-500G</td><td></td></tr><tr><td>4.90 גרם MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Merck</td><td>MX0070-1</td><td></td></tr><tr><td>0.41 גרם KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>0.12 גרם Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S0876-500G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">500x NaCO3 (10 מ"ל); </חזק> להכין טרי, להשליך</td></tr><tr><td>0.35 גרם נוסף NaCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>1x E2 (1 ליטר); </חזק> יש לאחסן ב-RT</td></tr><tr><td>50 מ"ל 20x E2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 מ"ל טרי 500x NaCO3</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

חיתוך רוחב חוט השדרה בדג הזברה הזחל

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

יונקים להיכשל בהתאוששות חושית ומוטורית בעקבות פציעה בעמוד השדרה בשל חוסר צמיחה מחודשת אקסון מתחת לרמה של פציעה, כמו גם חוסר יכולת reinitiate נוירוגנזה השדרה. עם זאת, כמה anamniotes כולל תערוכת rerio Danio דג הזברה הן חושית והתאוששות תפקודית גם לאחר חיתוך רוחב של חוט השדרה. דג הזברה המבוגר הוא אורגניזם מודל שהוקם לחקר התחדשות בעקבות פציעה בחוט השדרה, עם התאוששות חושית ומוטורית על ידי 6 שבועות לאחר פציעה. כדי לנצל את היתרונות של ניתוח vivo של תהליך ההתחדשות זמינים בדג זברת הזחל השקוף, כמו גם כלים גנטיים אינם נגישים במבוגרים, אנו משתמשים בדג זברת הזחל ללמוד התחדשות לאחר חיתוך רוחב של חוט השדרה. כאן אנו מדגימים שיטה לreproducibly וverifiably transecting חוט השדרה הזחל. לאחר חיתוך רוחב, הנתונים שלנו מראה התאוששות חושית תחילת ב2 ימים לאחר פציעה (dpi), שנינותשעות תנועת C-עיקול לזיהוי על ידי 3 dpi וחידוש של שחייה חופשית בשיעור של 5 dpi. לכן אנו מציעים דג הזברה הזחל ככלי לוויה לדג הזברה המבוגר לחקר ההתאוששות לאחר פגיעה בחוט השדרה.

כדי להפחית את חומרת נזק לרקמות המקיפות את אתר פציעה, beveling התקין של micropipette הוא קריטי. איור 1 א מציג קצה משופע בצורה נכונה. שימוש בטיפ זה הוא רחב מדי (איור 1 ב) נוטה לגרום להרוגים גבוהים יותר בשל הסבירות המוגברת של אב העורקים שסחבו על הגב, ואילו קצה שהוא צר מדי (איור 1 ג) נוטה לחלוף מעל העור ולא חיתוך רקמות. כדי לתרגל את הטכניקה הזו, זה יתרון להשתמש בקו כ...

לאחר חיתוך רוחב השדרה, יש דג הזברה מבוגר התאוששות תפקודית על ידי שישה שבועות לאחר פציעה. כדי לנצל את שקיפות זחל והתאוששות מהירה יותר, אנו מציגים שיטה לtransecting חוט השדרה הזחל. לאחר חיתוך רוחב, אנו צופים התאוששות חושית מתחילים ב 2 ימים שלאחר פציעה, ותנועת C-עיקול על ידי 3 ימים לאחר פציעה.

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להבטיח חיתוך מלא של חוט השדרה בעוברים של דגי זברה באמצעות שיטה בעלת תפוקה גבוהה יחסית וניתנת לשחזור, תוך מקסום שיעור ההישרדות. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הזיווג של בוגרים בעלי הגנוטיפ המתאים וביצוע סריקה במידת הצורך. השלב השני הוא גידול העוברים עד חמישה ימים לאחר ההפריה.בשלב הבא, בצעו את החיתוך באמצעות פייפט מיקרו-הזרקה בעל קצה מדורג. לבסוף, הדגים הפגועים יועברו להשקמה במצע מטופל באנטיביוטיקה עד לסיום הניסוי. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה של אימונופלורסנציה כדי להראות את תגובת תאי progenitor עצביים לפגיעה.היתרונות המרכזיים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון אלו שפותחו במעבדות של Becker ו-fetcher, כוללים מספר גדול יותר של בעלי חיים למחקר, זמן החלמה קצר יותר ושימוש בכלים גנטיים שאינם זמינים בדרך אחרת בדג zebrafish בוגר. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הרגנרציה, כגון תגובתם של תאי אב עצביים לפגיעה. התחילו את ההכנות ביצירת פלטות ניתוח באמצעות צלחות פטרי בקוטר 60 millimeter וערכת אלסטומר סיליקון cell guard 180 4.יש לפעול לפי הוראות היצרן. מלאו את הצלחות עד למחצית הנפח לכל היותר והמתינו לפולימריזציה. לאחר מכן, אחסנו את הצלחות כשהן מכוסות בטמפרטורת החדר.בשלב הבא, ייצרו מיקרו-פיפטות על ידי חימום ומתיחה של צינורות קפילריים מבורוסיליקט בעל

spinal-cord-transection-in-the-larval-zebrafish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

השיטה שהוצגה כאן מהווה פגיעה המדויקת של עוברי דג זברה לחיות עם פעימות ליזר באנרגיה גבוהה ועל ניתוח בדיעבד של פגיעות אלה וההתאוששות שלהם עם זמן. אנו גם מראים איך שכותרת גנטית בודדה או קבוצות של תאי שריר שלד יכולות להיות במעקב בזמן ואחרי ניזק מושרה אור ליזר.

פגיעת הליזר הביא על שריר שלד עוברי דג זברה

תהליכים התפתחותיים כגון התפשטות, דפוסים, בידול, והדרכה האקסון יכולים להיות מודל בקלות בחוט השדרה דג הזברה. במאמר זה, אנו מתארים הליך הרכבה לעוברי דג הזברה, אשר מייעל את ההדמיה של אירועים אלה.

נתיחה והרכבה לרוחב של עוברי דג הזברה: ניתוח התפתחות חוט השדרה

Lampreys לשחזר תנועה לאחר פגיעה בחוט השדרה מלאה. עם זאת, חלק מתאי העצב מקרין שדרה הם regenerators טוב ואחרים לא. מאמר זה ממחיש את הטכניקות לזחלי צמד ים ים דיור (ומבוגרים הפכו לאחרונה), הפקת transections חוט השדרה מלאה והכנת מוח wholemount וחוט שדרה לכלאה באתר.

חוט השדרה מלא פגיעה ומוח Dissection פרוטוקול Wholemount לאחר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה בזחל ים צמד ים

כדי לשפוך אור על המנגנונים התאיים והמולקולריים של נוירוגנזה והתחדשות בוגרים של דג הזברה, פיתחנו פרוטוקול לניתוח פולשני הגורם לפציעות מכניות בטלנצפלון הבוגר של דג הזברה וניטור לאחר מכן של שינויים בחצי הכדור הדקירה על ידי אימונוהיסטוכימיה או הכלאה באתר.

פציעה דקירת פצע של דג הזברה telencephalon מבוגרים: שיטה לחקר המוח של בעלי החוליות Neurogenesis והתחדשות

כתב יד זה מתאר שיטות הקלטות אלקטרו מן הנוירונים השדרה של עוברי דג הזברה הזחלים. הכנת שומרת נוירונים באתרו ולעיתים קרובות כרוך דיסקציה מינימום. שיטות אלה מאפשרות לחקר אלקטרו מגוון של נוירונים שדרה, מרכישת רגישויות חשמל הראשונית דרך שלבי זחל מוקדם.

זברה<em&gt; באתרו</em&gt; הכנת בחוט השדרה עבור הקלטות אלקטרו מתוך השדרה חושית הנוירונים המוטוריים

אנו מתארים פרוטוקול לניטור שינויים בפעילות הנוירונים האדיבים במהלך פקודות מוטוריות במערכת תאי שיער של בעלי חוליות מודל.

פעילות של נוירונים אפרנט קו לרוחב אחורי במהלך שחייה בזברהפיש

דגי זברה בוגרים, המסוגלים להחלמה תפקודית לאחר פגיעה בחוט השדרה, הם מערכת מודלים מובילה להבהרת מנגנונים מולדים של התחדשות עצבית. כאן, אנו מתארים סיבולת שחייה והתנהגות שחייה בדיקות כמו קריאות פונקציונליות של התחדשות חוט השדרה.

הערכה של סיבולת שחייה והתנהגות שחייה בדגי זברה בוגרים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לגרימת פציעות ספציפיות לרקמות ולשחזור גבוה בזחלי דגי זברה באמצעות מערכת נגע בלייזר בשילוב עם פלטפורמה מיקרופלואידית אוטומטית לטיפול בזחלים.

פציעות חצי אוטומטיות מבוקרות הנגרמות בלייזר לחקר התחדשות חוט השדרה בזחלי דגי זברה

טרנספורמציה של חוט השדרה קסנופוס לאביס ראשן היא שיטת פגיעה רלוונטית לחקר פגיעה בחוט השדרה והתחדשות על ידי ביצוע חתך רוחבי שמנתק לחלוטין את חוט השדרה ברמת בית החזה.

העברת חוט השדרה בקסנופוס לאביס ראשנים

פרוטוקול זה מתאר מודל cryoinjury כדי לגרום נזק עמוק של כמה מיומרים caudal בדגי זברה בוגרים. שיטה זו מספקת גישה חדשה לחקר התחדשות שרירי השלד לאחר אובדן חמור של רקמה אצל בעלי חוליות שאינם יונקים.

מודל Cryoinjury לחקר התחדשות שרירי השלד של הפדונקל הקאודלי בדגי זברה בוגרים

כאן אנו מציגים פרוטוקול להשתלת תאים ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה בעוברים ובזחלים של דגי זברה בכל שלב בין יום אחד לשבעה ימים לפחות לאחר ההפריה.

השתלת תאים ברזולוציה גבוהה בדגי זברה עובריים וזחלים

למד שיטת חיתוך רוחב חוט השדרה בזחלי דג הזברה Danio rerio באמצעות מיקרופיפטה משופעת. השיטה מאפשרת שחזור תפקודי תוך שבועיים והדמיית תגובת קדם-תאים עצביים.

חיתוך רוחב חוט השדרה בדג הזברה הזחל

גלה סרטונים נוספים