חיתוך רוחב חוט השדרה בדג הזברה הזחל

המטרה הכוללת של הליך זה היא להבטיח חתך מלא של חוט השדרה בדגי הזברה הזחלים באמצעות תפוקה גבוהה יחסית ושיטה הניתנת לשחזור תוך מקסום ההישרדות. זה מושג על ידי הזדווגות ראשונה של בוגרים עם הגנוטיפ המתאים וסינון לפי הצורך. השלב השני הוא גידול עוברים עד חמישה ימים לאחר ההפריה.

לאחר מכן, בצע את החתך עם פיפטה מיקרו-הזרקה משופעת. לבסוף, הדגים הפצועים מורשים להתאושש במצע שטופל באנטיביוטיקה עד לסיום הניסוי. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית משמשת להצגת תגובת אב עצבי לפציעה.

היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כמו אלה שפותחו על ידי מעבדות בקר ו-Fetcher, כוללים מספר גדול יותר של בעלי חיים כדי לחקור, זמן התאוששות קצר יותר ושימוש בכלים גנטיים שאינם זמינים אחרת בדג הזברה הבוגר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההתחדשות כגון תגובת האב העצבי לפציעה. התחל את ההכנות על ידי הכנת צלחות ניתוח באמצעות צלחות פטרי 60 מילימטר וכדי להגן על התאים 180 4 ערכת אלסטומר סיליקון.

בהתאם להוראות היצרן. ממלאים את הכלים, לא יותר מחצי מלאים ומניחים להם להתפלמר. לאחר מכן אחסן את הכלים המכוסים בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, ייצרו מיקרו פיפטות על ידי חימום ומשיכה של צינורות נימי סיליקט דקים בדופן דקה בקוטב מיקרו פיפטה, תוך שימוש באותן הגדרות המשמשות לייצור מחטי מיקרו-הזרקה תחת מיקרוסקופ דיסקציה. השתמש במלקחיים כדי להצמיד את קצה המיקרו פיפטה לקוטר של כ-200 מיקרון. לאחר מכן שפעו את הקצה השבור בעזרת מטחנת מיקרו בתחילה ל -35 מעלות, ואחריו שיפוע שני ב -25 מעלות כאשר רעש הטחינה נפסק.

בדוק תחת טווח חיתוך כדי לוודא שהקצה חד וחלק. שימוש בקצה רחב מדי נוטה לגרום לתמותה גבוהה יותר בשל הסבירות המוגברת לחתוך את אבי העורקים הגבי. בעוד שקצה צר מדי נוטה להציץ מהעור במקום לחתוך רקמות, אחסן את המיקרו-פיפטות המשופעות כהלכה בצלחת פטרי על כמות קטנה של חימר שבעה ימים לפני הניתוח.

הקימו מיכלי הזדווגות של זכרים ונקבות. דגים אוספים את העוברים המופרים למחרת בבוקר, שלוש שעות לאחר שהאורות נדלקים. כדי להבטיח תשואה מקסימלית.

אם משתמשים בקו מדווח טרנסגני עם גנוטיפים מעורבים, הניחו 100 עוברים לצלחת, דגרו על הצלחות ב-28.5 מעלות צלזיוס. אם אתה משתמש בקו מדווח, סנן את העוברים לביטוי פלואורסצנטי לאחר 48 שעות. לאחר ההפריה.

אפשר לעוברים הפלואורסצנטיים להתבגר ב-28.5 מעלות צלזיוס כאשר הזחלים או חמישה ימים לאחר ההפריה. הכן את לוחית הניתוח על ידי כיסוי מגן התא ב-E שניים ו-10 מיליגרם לליטר, גנטמיצין סולפט וטריקה. בנוסף, הכינו צלחת התאוששות על ידי הוספת 25 מיליליטר של E two וג'נטמיצין סולפט לצלחת פטרי של 100 מילימטר.

השלב הבא הוא הכנת ידית אזמל על ידי הדבקת שלוש ספוגיות. זה יוצר כלי משולש עם שלושה חריצים. לאחר מכן, הרכיבו את המיקרו פיפטה המוכנה על הספוגיות על ידי הדבקתה באחד החריצים להשלמת האזמל, הניחו את המיקרו פיפטה בצד עד הצורך.

התחל את הניתוח על ידי הרדמה של צלחת אחת של 25 זחלים בכל פעם. עם טריקה, הדגים מורדמים מספיק כאשר הם כבר לא מפגינים תגובת מגע. העבירו את הזחלים לצלחת ניתוח והניחו את הצלחת מתחת למיקרוסקופ מנתח.

בהגדלה מקסימלית, סובב זחל אחד כך שהוא ישכב על צדו כשגבו קרוב יותר ליד המחזיקה את האזמל. מקם את המלקחיים כך שהם מונחים על מגן התא. בזווית על רוחב הזחלים, מצמיד את אזמל הזכוכית לאחת מזרועות המלקחיים.

חותכים לתוך הפנים הצדדיות הגביות של הזחלים בגובה הנקבוביות האנאליות. הקפד לא לחתוך מעבר לקצה הגחון של החוט. לאחר מכן סובב את האזמל כדי לנתק את חוט השדרה.

הטוויסט הנדרש הוא בדרך כלל הרבה פחות מ-90 מעלות. חזור על חתך חוט השדרה עם הזחלים הנותרים. לאחר השלמת הניתוח בקבוצת הזחלים, השתמש בפיפטה אחורית ובמשאבת פיפטה כדי להעביר את החיות הפצועות לצלחת ההתאוששות.

כדי לנקות את ההרדמה, הקפד לאסוף תחילה את ראש הזחל או הזנב במהלך ההעברה. אל תלחץ על מקום הפגיעה על ידי כיפוף הזחלים לאחר שההרדמה התפוגגה. העבירו את הזחלים הפגועים מלוח ההתאוששות לצלחות 100 מילימטר מלאות ב-25 מיליליטר של E two וגנטמיצין סולפט בצפיפות של 25 זחלים לצלחת.

לאחר מכן הניחו אותם באינקובטור של 28.5 מעלות צלזיוס בזמן שהפצע מחלים. בדוק את הצלחות מדי יום. פינוי בעלי חיים חולים או מתים.

אין להחליף את המדיה עד שלולי פרוטוזואה המים המתוקים נראים במדיה. בעת החלפת המדיה, אל תעביר את הדג לצלחת חדשה. במקום זאת, הסר כמה שיותר מדיה והצף את אותה צלחת במדיה חדשה.

חזור על שינוי המדיה לפי הצורך כדי להפחית את אוכלוסיית הלולים. האכילו את הזחלים מדי יום בכמות קטנה של אבקת מזון מטוגן. דג זברה עם חוט שדרה מועבר לחלוטין מוצג כאן ביום אחד.

לאחר הפציעה, GFP מתבטא בכל תאי העצב, והחץ הצהוב מזהה את אתר הפגיעה. דג זברה עם חוט שדרה מועבר לחלוטין מוצג כאן שלושה ימים לאחר הפציעה ושלושה ימים לאחר הפציעה. דג זברה קבוע זה המסומן ב-UCD מראה חוט שדרה מועבר לחלוטין.

החץ הצהוב מזהה שוב את מקום הפציעה. לעומת זאת, האזור הרציף של תיוג הנוירון לאורך הקצה הגחוני של חוט השדרה. בשלושת הימים שלאחר הפציעה, דג זברה קבוע מעיד על חתך לא שלם.

לאחר השליטה ניתן לעבד 300 זחלים לשעה בטכניקה זו.