Name: Assay היבלעות: פרוטוקול להעריך אינטראקציות בין מערכת העצבים המרכזית וPhagocytes נוירונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-08T23:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: למדו שיטה לכימות היבלעות של קלטים פרה-סינפטיים על ידי מיקרוגליה במערכת העצבים המרכזית באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקלית. הפרוטוקול משתמש בזיהוי פלואורסצנטי של תאי גנגליון רשתית בעכברים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה נתמכה על ידי מענקים מקרן סמית המשפחה (BS), קרן דנה (BS), תכנית ג&#39;ון מרק מלומדים (BS), NINDS (RO1-NS-07,100,801; BS), NRSA (F32-NS-066,698; DPS), קרן ננסי וריא מרקס (DPS), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC ההדמיה Core).

<ol><li>Ransohoff, R. M., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+physiology%3A+unique+stimuli%2C+specialized+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses.</a> Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).</li>
<li>Aguzzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+scapegoat%2C+saboteur%2C+or+something+else%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microglia: scapegoat, saboteur, or something else.</a> Science. 339 (6116), 156-161 (2013).</li>
<li>Tremblay, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microglia+in+the+healthy+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of microglia in the healthy brain.</a> J Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).</li>
<li>Hanisch, U. K., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+active+sensor+and+versatile+effector+cells+in+the+normal+and+pathologic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain.</a> Nat. Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).</li>
<li>Sierra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Janus-faced+microglia%3A+beneficial+and+detrimental+consequences+of+microglial+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis.</a> Front Cell Neurosci. 7, (2013).</li>
<li>Dheen, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+activation+and+its+implications+in+the+brain+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Microglial activation and its implications in the brain diseases.</a> Curr Med Chem. 14 (11), 1189-1197 (2007).</li>
<li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+sculpt+postnatal+neural+circuits+in+an+activity+and+complement-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner.</a> Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).</li>
<li>Katz, L., Shatz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+and+the+constuction+of+cortical+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity and the constuction of cortical circuits.</a> Science. 274 (5290), 1133-1138 (1996).</li>
<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).</li>
<li>Hua, J. Y., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+activity+and+the+dynamics+of+central+nervous+system+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural activity and the dynamics of central nervous system development.</a> Nat Neurosci. 7 (4), 327-332 (2004).</li>
<li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nat Rev Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).</li>
<li>Butz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+structural+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent structural plasticity.</a> Brain Res Rev. 60 (2), 287-305 (2009).</li>
<li>Bruel-Jungerman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+plasticity+mechanisms+and+memory%3A+a+party+of+four%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Brain plasticity mechanisms and memory: a party of four.</a> Neuroscientist. 13 (5), 492-505 (2007).</li>
<li>Schafer, D. P., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+elimination+during+development+and+disease%3A+immune+molecules+take+centre+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Synapse elimination during development and disease: immune molecules take centre stage.</a> Biochem Soc Trans. 38 (2), 476-481 (2010).</li>
<li>Alexander, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complement+system%3A+an+unexpected+role+in+synaptic+pruning+during+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The complement system: an unexpected role in synaptic pruning during development and disease.</a> Annu Rev Neurosci. 35, 369-389 (2012).</li>
<li>Brown, A., Weaver, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dark+side+of+neuroplasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The dark side of neuroplasticity.</a> Exp Neurol. 235 (1), 133-141 (2012).</li>
<li>Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+27%3A+Neural+plasticity+after+nerve+injury+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration.</a> Int Rev Neurobiol. 87, 483-505 (2009).</li>
<li>Tan, A. M., Waxman, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+injury%2C+dendritic+spine+remodeling%2C+and+spinal+memory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Spinal cord injury, dendritic spine remodeling, and spinal memory mechanisms.</a> Exp Neurol. 235 (1), 142-151 (2012).</li>
<li>Wolpaw, J. R., Tennissen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+spinal+cord+plasticity+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent spinal cord plasticity in health and disease.</a> Annu Rev Neurosci. 24, 807-843 (2001).</li>
<li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%26%2334%3Bquad-partite%26%2334%3B+synapse%3A+Microglia-synapse+interactions+in+the+developing+and+mature+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The &#34;quad-partite&#34; synapse: Microglia-synapse interactions in the developing and mature CNS.</a> Glia. 61 (1), 24-36 (2013).</li>
<li>Mukhopadhyay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese-induced+trafficking+and+turnover+of+the+cis-Golgi+glycoprotein+GPP130%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Manganese-induced trafficking and turnover of the cis-Golgi glycoprotein GPP130.</a> Mol Biol Cell. 21 (7), 1282-1292 (2010).</li>
<li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fractalkine+receptor+CX%283%29CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li>
<li>Knobloch, M., Mansuy, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+loss+and+synaptic+alterations+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine loss and synaptic alterations in Alzheimer's disease.</a> Mol Neurobiol. 37 (1), 73-82 (2008).</li>
<li>Masliah, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+remodeling+during+aging+and+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease.</a> J Alzheimers Dis. 9 (3 Suppl), 91-99 (2006).</li>
<li>Yoshiyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+loss+and+microglial+activation+precede+tangles+in+a+P301S+tauopathy+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model.</a> Neuron. 53 (3), 337-351 (1016).</li>
<li>Milnerwood, A. J., Raymond, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+synaptic+pathophysiology+in+neurodegeneration%3A+insights+from+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Early synaptic pathophysiology in neurodegeneration: insights from Huntington's disease.</a> Trends Neurosci. 33 (11), 513-523 (2010).</li>
<li>Noda, M., Suzumura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sweepers+in+the+CNS%3A+Microglial+Migration+and+Phagocytosis+in+the+Alzheimer+Disease+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Sweepers in the CNS: Microglial Migration and Phagocytosis in the Alzheimer Disease Pathogenesis.</a> Int J Alzheimers Dis. , (2012).</li>
<li>Rotshenker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+macrophage+activation+and+the+regulation+of+complement-receptor-3+%28CR3%2FMAC-1%29-mediated+myelin+phagocytosis+in+injury+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia and macrophage activation and the regulation of complement-receptor-3 (CR3/MAC-1)-mediated myelin phagocytosis in injury and disease.</a> J Mol Neurosci. 21 (1), 65-72 (2003).</li>
<li>Smith, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+of+myelin+in+demyelinative+disease%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis of myelin in demyelinative disease: a review.</a> Neurochem Res. 24 (2), 261-268 (1999).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

על מנת למדוד במדויק phagocytosis, חייבים להיות מסומנים בחומרים נבלעו בצורה כזאת, כי החוקר יכול לדמיין את זה פעם אחת השפלה lysosomal התרחשה. בנוסף, נדרש הדמיה ברזולוציה גבוהה, ואחריו את השימוש בתוכנה שיאפשר לחוקר לדמיין את עוצמת הקול של כל התא ולכמת את התוכן שלה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה אמינה וכמותי מאוד למדידת היבלעות בתיווך תא בלען באמצעות CTB מצומדת לצבעי Alexa לתווית חומר נבלע בשילוב עם מיקרוסקופיה confocal ברזולוציה גבוהה ושחזור 3D. מתודולוגיה זו נעשתה שימוש במעבדה שלנו ...

<html> מעגלי Synaptic לשפץ לאורך החיים של בעלי חיים. במוח המתפתח, הסינפסות יוצרות עודפות וחייבות לעבור גיזום הסינפטי הכולל את ההסרה סלקטיבית של קבוצת משנה של סינפסות ותחזוקה וחיזוק של סינפסות אלה שנותר 8-10. תהליך זה הוא הכרחי כדי להשיג אופייני קישוריות המדויקת של מערכת העצבים הבוגרת. במבוגרים, סינפסות יכולות להיות גם פלסטיק, במיוחד בהקשר של למידה וזיכרון. הקושרת המבנית של פלסטיות זה חשב לכלול את התוספת ו / או חיסול של קוצים הדנדריטים וboutons presynaptic 11-13. בנוסף לתפקידים אלה במערכת העצבים בריאה, שיפוץ הסינפטית מעורב גם ב12,14,15 מחלה של מערכה / פציעת עצבים. כך למשל, בעקבות פגיעה בחוט השדרה, האקסונים נותקו חייבים לאחר מכן לשפץ ויוצרים סינפסות חדשות כדי להשיג 16-19 התאוששות תפקודי. NT &quot;&gt; מתעוררים כהיבט חשוב של פלסטיות הסינפטית הוא התהליך של phagocytosis או היבלעות של סינפסות המיועדות להסרת 3,5,20. לאחרונה הראו תופעה זו בהקשר של גיזום הסינפטי במוח בריא, לאחר הלידה העכבר 7. באופן ספציפי , מיקרוגליה, תושב התאים חיסוניים במערכת העצבים המרכזית וphagocytes, הוצגו לבלוע תשומות presynaptic במהלך תקופת שיא ובאזור של גיזום הסינפטי התפתחותי, הגרעין לאחר הלידה הגבי לרוחב הברכיתיים (dLGN) של התלמוס. מצור גנטי או תרופתי של היבלעות זו הביא לגירעונות מתמשך בקישוריות הסינפטית. בפרוטוקול זה, אנו מתארים assay אמין וכמותי מאוד למדוד היבלעות בתיווך תא בלען של תשומות סינפטי. לענין סעיף זה, assay זה יוצג בהקשר של מערכת פיתוח retinogeniculate, הכוללת תאי הגנגליון ברשתית (RGCs) המתגוררת ברשתית כיפרויקט תשומות presynaptic לdLGN (איור 1 א). כדי להתחיל, אסטרטגית תיוג lysosomal השפלה עמידה אנטרוגדית תתואר, המשמשת כדי להמחיש תשומות presynaptic RGC ספציפיות בdLGN (איור 1) 7,21. בעקבות התיאור הזה, מתודולוגיה מפורטת להדמיה ומדידת כמותית היבלעות באמצעות מיקרוסקופיה confocal בשילוב עם 3 ממדים (3D) משטח נפח טיוח יינתן. מתודולוגיה זו מבוססת על הכנת רקמה קבועה, אך עשוי גם להיות מותאמת לשימוש בבדיקות הדמיה בשידור חי. חשוב מכך, בזמן שassay אומת בהקשר של מערכת retinogeniculate בריאה, לאחר הלידה, ניתן היה להחיל את אותן טכניקות כדי להעריך אינטראקציות אחרות התא בלען נוירון בכל רחבי המוח, ובמהלך המחלה, כמו גם תפקוד תא בלען במערכות איברים אחרים.

<table><tbody><tr><td>כרית חום</td><td>Vet Equip, Inc.</td><td>965500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מקור מים חמים לכרית חום</td><td>קנט סיינטיפיק</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו</td><td>DSC אופטי</td><td>Zeiss Opmi -6 מיקרוסקופ</td><td></td>כירורגי</tr><tr><td>מיקרוטום הזזה עם שלב הקפאה</td><td>Leica</td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td>להב מיקרוטום</td><td>Leica</td><td>14021607100</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי</td><td>ניקון</td><td>SMZ800 עם מצורף</td><td></td>אפי-פלואורסצנטי</tr><tr><td>דיסק מסתובב מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>פרקין אלמר</td><td>UltraView Vox דיסק מסתובב קונפוקלי</td><td></td></tr><tr><td>10 ומיקרו; l מזרקים אטומים לגז המילטון</td><td>המילטון</td><td>80030</td><td>השתמש במזרק שונה לכל צבע צבע/עוקב</td></tr><tr><td>מחטי המילטון</td><td>המילטון</td><td>7803-05, מפרטים: קהה, רעלן כולרה מצומד אלקסה 1.5 אינץ'</td><td></td></tr> <tr><td>ובטא; תת-יחידה (CTB)</td> <td>Invitrogen</td><td>488: C22841</td><td>להרכיב מחדש במי מלח סטריליים, 80 ומיקרו; l (488), 100 ומיקרו; l (594), 20 ומיקרו; l (647)</td></tr><tr><td>594: C22842</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>647: C34778</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח&nbsp;( PBS)</td> <td>סיגמא</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>ניאומיצין ופולימיקסין B סולפטים ובציטראצין אבץ משחת עיניים USP (משחה אנטיביוטית)</td><td>באוש & Lomb</td><td>24208-780-55</td><td></td></tr><tr><td>30.5 גרם מחט</td><td>Becton Dickinson</td><td></td> מספריים קפיציים 305106 <td></td></tr><tr><td></td><td>Roboz</td><td>RS-5630</td><td></td></tr><tr><td>מוליך עם קצה כותנה</td><td>פישר</td><td>23-400-125</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeyde (PFA)</td> <td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>15710</td><td>לדלל 16% עד 4% ב- PBS. Paraformaldehye רעיל, יש להשתמש במכסה אדים וללבוש ציוד מגן אישי.</td></tr><tr><td>כלי חיתוך &ndash; מספריים, מלקחיים, מרית</td><td>מספריים קטנים: כלי מדע עדינים</td><td>מספריים קטנים: 14370-22</td><td></td></tr><tr><td>מספריים גדולים: Roboz</td><td>מספריים גדולים: RS-6820</td><td></td><td></td></tr> <tr><td># 55 מלקחיים: כלי מדע עדינים</td> <td># 55 מלקחיים: 11255-20</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מרית: טד פלה, בע"מ</td><td>מרית: 13504</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא</td><td>S8501-5 ק"ג</td><td>הכינו 30% סוכרוז ב-PBS (משקל/נפח)</td></tr> <tr><td>OCT תרכובת</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>סירת שקילה</td><td>ארה"ב מדעית</td><td>2347-1426</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 24 בארות</td><td>BD Biosciences</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט מונו-בסיסי</td><td>סיגמא</td><td>S6566-500G</td><td>הפוך 0.2 M נתרן פוספט מונו-בסיסי (PB-A) ב-ddH2O ו-0.2 M נתרן פוספט דו-בסיסי (PB-B) ב-ddH2O. להכנת 0.1 M PB, שלבו 19 מ"ל PB-A ו-81 מ"ל PB-B, מלאו ל-200 מ"ל עם ddH2O</td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5136-500G</td><td></td></tr><tr><td>כיסויים, 22 X 50 מ"מ, מס' 1.5</td><td>VWR</td><td>48393 194</td><td></td></tr><tr><td>שקופית מיקרוסקופ טעונה</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Vectasheild</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

assay היבלעות: פרוטוקול להעריך אינטראקציות בין מערכת העצבים המרכזית וphagocytes נוירונים

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Phagocytosis הוא תהליך שבו תא בולע חומר (כל תא, חלקי תא, פסולת, וכו &#39;) בסביבה תאית המקיפה אותה ולאחר מכן מעכל את החומר הזה, בדרך כלל באמצעות השפלה lysosomal. מיקרוגליה הם התאים חיסוניים תושב של מערכת העצבים המרכזית (CNS) שphagocytic פונקציה שתואר במגוון רחב של תנאים ממחלה ניוונית של מערכת עצבים (, אישור לדוגמא בטא עמילואיד במחלת אלצהיימר) להתפתחות של המוח בריא (למשל, הסינפטי גיזום) 1-6. הפרוטוקול הבא הוא assay היבלעות פותח כדי לחזות ולכמת היבלעות בתיווך מיקרוגליה של תשומות presynaptic במערכת retinogeniculate עכבר פיתוח 7. בעוד assay זה שימש להערכת תפקוד מיקרוגליה בהקשר המסוים הזה, בגישה דומה ניתן להשתמש כדי להעריך phagocytes אחר בכל רחבי המוח (למשל, האסטרוציטים) ושאר הגוף(למשל, מקרופאגים היקפיים), כמו גם בהקשרים אחרים שבהם שיפוץ הסינפטי מתרחש (למשל, פגיעה במוח / מחלה).

לאחרונה, השתמשנו assay היבלעות זו כדי לחזות ולכמת היבלעות בתיווך המיקרוגלים של תשומות presynaptic במערכת retinogeniculate הפיתוח (איור 1) 7. RGCs מעכברים הטרוזיגוטיים CX3CR1-EGFP אותרו anterogradely עם CTB-594 וCTB-647 בעיני ימין ועל השמאל, בהתאמה. בעקבות מעקב זה, מיקרוגליה EGFP החיוביים בתוך dLGN היו הדמיה. תמונות אלו בהמשך פני השטח שניתנו למדידות נפח. באמצעות טכניקה זו, מצאנו כי במהל...

מיקרוגליה הם התאים חיסוניים תושב של מערכת העצבים המרכזית (CNS) עם קיבולת גבוהה לphagocytose או לבלוע את חומר בסביבה תאית שלהם. הנה, assay החלים רחב, אמין, וכמותי מאוד להדמיה ומדידת היבלעות בתיווך מיקרוגליה של רכיבים סינפטיים מתואר.

Assay היבלעות: פרוטוקול להעריך אינטראקציות בין מערכת העצבים המרכזית וPhagocytes נוירונים

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדמינ ולהכבית כמותית את הבליעה של קלטים פרה-סינפטיים על ידי מיקרוגליה. זאת משיגים תחילה על ידי הזרקת סממני מעקב פלואורסצנטיים קדמיים (anterior grade tracers) לעיניים כדי לסמן קלטים פרה-סינפטיים של תאי גנגליון רטינליים בגרעין הברכי הצדי (lateral geniculate nucleus). השלב השני כולל דיסקציה, קיבוע ואיזון של המוח.בשלב הבא, המוח נחתך לפרוסות. השלב הסופי הוא העמדת פרוסות המוח על זכוכית כיסוי לצורך הדמיה ואנליזה. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להעריך את הבליעה של קלטים פרה-סינפטיים על ידי מיקרוגליה.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון האופן שבו תאי פגוציטיקה תורמים לפלסטיות ולעיצוב מחדש של מעגלים סינפטיים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי עיצוב מחדש של מעגלים סינפטיים במוח בריא, ניתן ליישמה גם במערכות אחרות, כגון עיצוב מחדש של מעגלים סינפטיים במהלך מחלות של מערכת העצבים. את הפרוצדורה ידגימו כריס הלר, טכנאי, ואמילי לאמן, סטודנטית לתואר מתקדם ממעבדת סטיבנס.התחילו את הפרוצדורה על ידי הרדמת עכבר באמצעות 4% ISO fluorine בתא השראה מפלקסגלאס. לאחר דקה עד שלוש דקות, ודאו שהושגה רמת הרדמה מתאימה על ידי צביטה בזנב. לאחר מכן, הניחו את העכבר על צדו תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי והניחו את קונו האף, המספק 3% עד 4% ISO fluorine מעל האף.כדי לחשוף את הלובן (sclera), השתמשו במספרי קפיץ קטנים כדי לפתוח את העפעף ולהסיט את העור לאחור. עבור ילודים, לעיתים נדרשת חיתוך ניצבת נוספת בפינת העין. יש להיזהר בעת חיתוך פינת העפעף כיוון ששם נמצא כלי דם.השתמשו במחט סטרילית בכיול (gauge) 30.5 כדי ליצור חור קטן בצד העין, במקום שבו מתחילה הסקלרה. היזהרו לא לפגוע בעדשה על ידי הכנסת המחט למרחק מספיק רק כדי שהחיתוך (bevel) יחדור אל תוך העין. אפשרו לזגוגית (vitreous) לזרום החוצה מהחור והשתמשו באפליקטור סטרילי חתוך ומחודד כדי לספוג את הנוזל.ברגע שהזגוגית הפסיקה לזרום החוצה מהחור, הכניסו באיטיות מחט בעלת קצה קהה המחוברת למזרק Hamilton שטוען מראש בצבע למעקב רטרוגרדי (anterior grade tracing). לאחר הכנסת הצבע לחור, הזריקו את הצבע לאט אל תוך העין. בדרך כלל, משתמשים ביחידת בטא של רעל החולרה (cholera toxin beta subunit) המצומדת ל-Alexa 594, 647 או 488 לצורך מעקב רטרוגרדי.השאר את המחט בחור באמצעות כניסות R GC למסלול מאוחר למשך מספר שניות ולאחר מכן הוצא אותה באיטיות. השתמש במקלון צמר לספיגת עודפי נוזלים ומניעת דליפת הצבע. לאחר מכן, מרח כמות קטנה של משחה אנטיביוטית על העין.אם העין נפתחה בניתוח, החזירו בעדינות את עפעפי העין למקומם זה לצד זה לאחר ההזרקה. השאירו את העכבר תחת מנורת חימום או על משטח חימום עד שיתחיל להתאושש מההרדמה.החזירו את העכבר לכלוב בית נקי ועקבו אחריו כדי לוודא שהוא ער לחלוטין לפני החזרתו למושבה. כ-24 שעות לאחר ההזרקה, השמידו את העכבר ובצעו דיסקציה של המוח. קבעו את המוח בתוך מבחנת Falcon מלאה ב-4% PFA למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למחרת.שטפו את המוח שלוש פעמים ב-PBS על ידי שפיכת המוח וה-PFA תחילה לתוך סירת שקיעה (whey boat) ריקה, ולאחר מכן השתמשו בשפכטול כדי להעביר את המוח לסירת שקיעה אחרת מלאה ב-PBS. שטפו את המוח פעמיים נוספות ב-PBS לפני העברתו לשפופרת Falcon מלאה בתמיסת סוכרוז 30%. השאירו אותו בסוכרוז בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד שישקע לתחתית השפופרת.לאחר מכן, הסר בעזרת להב תער כל חלקי מוח שאינם נחוצים. הקפא את המוח על פיסת נייר אלומיניום מעל קרח יבש. בינתיים, הקפא את משטח המיקרוטום ומלא כל באער של פלטת 24 באערים ב-0.5 mL של PP בריכוז 0.1 M כדי להרכיב את המוח הקפוא על משטח ההקפאה.מרחו כמות קטנה של OCT על הבמה. ברגע שה-OCT מתחיל לקפוא, הניחו עליו את המוח. הצד של המוח שייחתך צריך להיות פונה כלפי מעלה.בשלב הבא, כסו את המוח ואת ה-OCT קרח יבש גרוס דק מאוד. השאירו את הקרח היבש על המוח למשך כ-30 שניות. לאחר מכן, השתמשו במברשת צבע גדולה כדי להסיר את הקרח היבש.התחילו בביצוע חיתוכים של הפרוסות בעובי 40 micron. לאחר מכן, השתמשו במברשת צבע קטנה ולחה כדי להסיר את החיתוכים המכילים את האזור הרלוונטי מהלהב ולהעביר אותם לפלטת 24 בארות המכילה 0.1 molar pb. לאחר איסוף החיתוכים, בצעו הדמיה של סימון ה-anterior grade תחת מיקרוסקופ דיסקציה פלואורסצנטי ובחרו את החיתוכים המכילים את האזור הרלוונטי לצורך הרכבתם על סלייד.ראשית, יש להניח כמות קטנה של PB בריכוז 0.1 molar על זכוכית מיקרוסקופ טעונה. לאחר מכן, העבירו את נתחי הרקמה אל בריכת ה-pb. לאחר מכן, השתמשו במברשת צבע כדי לכוון ולפרוס את הרקמות.השתמשו בנייר ניגוב מסוג Kim wipe כדי לספוג את ה-XSPB, והקפידו שלא לספוג את החתך. הניחו להם להתייבש לחלוטין באוויר. לאחר מכן, טפטפו טיפה קטנה של מדיום קיבוע (mounting medium) על כל חתך והניחו זכוכית כיסוי מעל בסיום.אטמו את קצוות הפיתה באמצעות לק ציפורניים. אחסנו את הפיתה בטמפרטורה של 20- °C עד למועד סשן הדימות המוצג. להלן תרשים של אסטרטגיית מעקב בדרגה קדמית (anterior grade tracing).הקלטים של תאי RGC מהעין השמאלית והימנית עוקבים באמצעות CTB 6 47 ו-CTB 5 94, בהתאמה. לאחר מכן מוערכת הבליעה של הקלטים המתווכת על ידי מיקרוגליה. להלן תמונה מייצגת בהגדלה נמוכה של DLGN של עכבר ביום החמישי לאחר הלידה, בעקבות מעקב בינ-דרגתי של קלטים מהעין השמאלית והימנית.זוהי מיקרוגליה שנדגמה מאזור הגבול של קלטי העין השמאלית והימנית. כל פלואורסצנציית ה-CTB מחוץ לנפח המיקרוגליאלי הוסרה, מה שחושף את קלטי ה-RGC שנבלעו ואת רינדור הפני השטח של המיקרוגליה וה-RGC שנבלעו. קלטי ה-RGC מוצגים כאן.להלן ייצוג של מיקרוגליה ברינדור פני שקידה מעכברים בשלבים P five, P nine ו-P 30. בליעת קלטי RGC ב-DLGN מוגברת באופן משמעותי במהלך שיאו של תהליך הגיזום ב-DLGN בהשוואה לגילאים מאוחרים יותר. מיקרוגליה מעכברים החסרים את קולטן המשליש שלושה בולעת משמעותית פחות קלטי RGC בהשוואה לאחים למשואה מסוג wild type לאחר השליטה בטכניקה.ניתן לבצע טכניקה זו תוך 72 שעות אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו להבין היטב כיצד לשלב סימון נוירונים ולהעריך אינטראקציות בין מיקרוגליה לסינפסות.

an-engulfment-assay-protocol-to-assess-interactions-between-cns

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מאמר זה מתאר פרוטוקול מגיב רומן ולהגדיר מיועד מדידה רגישה של ההשפעות הנוירו של תרכובות וטיפולים על שיתוף תרבויות של נוירונים האסטרוציטים באמצעות ניתוח תוכן גבוהה. תוצאות מראים כי ניתוח תוכן גבוהה מהווה טכנולוגיה חדשנית מרגש להערכה neurotoxicity.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

מחקר זה מתאר את ההליכים של הקמת אקסון עצבי רומן ופלטפורמה (אסטרו) גליה שיתוף תרבות. במערכת זו שיתוף התרבות, מניפולציה של אינטראקציה ישירה בין האקסון יחיד (ותאי גלייה יחידים) הופכת להיות ריאלית, המאפשרת ניתוח מכניסטית של נוירון ההדדי לאיתות גליה.

ניתוח הדמיה של תא עצב לאינטראקצית גליה בפלטפורמת תרבות Microfluidic (MCP)-מבוסס אקסון העצבי ומערכת גליה שיתוף תרבות

בסרטון זה, אנו מבצעים את בדיקת פגוציטוזה מיקרוגליאלית עבור נוירובלסטומה באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים. הבדיקה מסייעת להעריך את הפגיעה בתפקוד המיקרוגליאה במחלות נוירודגנרטיביות.

בדיקת פגוציטוזה מיקרוגליאלית: בדיקת מבחנה לביסוס מודל פגוציטוזה מיקרוגליאלית עבור תאי נוירובלסטומה באמצעות מקרופאגים iPSC

בסרטון זה, אנו מעריכים את היכולת הפאגוציטית של אסטרוציטים מטוהרים במבחנה על ידי בדיקת הדמיה חיה. הבדיקה משמשת כפלטפורמת סינון יעילה לזיהוי תרכובות כימיות שיכולות לשפר או לעכב את היכולת הפאגוציטית של אסטרוציטים.

בדיקת פגוציטוזה חוץ גופית: שיטה מבוססת הדמיה חיה לחקר פנפטוזיס סינפטוזום בתיווך אסטרוציטים בזמן אמת

מקור: Funes, S., et. al., תאים דמויי מיקרוגליה אנושיים: התמיינות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ובדיקת פגוציטוזיס של תאים חיים במבחנה באמצעות סינפטוזומים אנושיים. J. Vis. Exp. (2022)סרטון זה מדגים מבחן לחקר היכולת הפגוציטית של תאים דמויי מיקרוגליה באמצעות סינפטוזומים פלואורסצנטיים רגישים ל-pH.

בדיקת פגוציטוזיס של תאים חיים של תאים דמויי מיקרוגליה באמצעות סינפטוזומים אנושיים

phagocytosis microglial הוא קריטי לשמירה על הומאוסטזיס רקמות ותפקוד לקוי phagocytic הייתה מעורב פתולוגיה. עם זאת, להערכת תפקוד microglia in vivo מבחינה טכנית מאתגרת. פתחנו טכניקה פשוטה אך חזקה לניטור בדיוק וכימות פוטנציאל phagocytic של microglia בסביבה פיזיולוגית.

להערכת תפקוד רשתית microglial Phagocytic<em&gt; In vivo</em&gt; שימוש cytometry זרימה מבוסס Assay

פרוטוקול זה מתאר את coculture נוירון astrocyte עקיפות ניתוח מידור של נוירון, גליה אינטראקציות.

את assay Coculture Neuron-astrocyte העקיפה: An<em&gt; במבחנה</em&gt; הגדרה לחקירה המפורטת של נוירון, גליה אינטראקציות

פרוטוקול זה מציג במבחנה הדמיה לחיות phagocytosis assay כדי למדוד את יכולת phagocytic של האסטרוציטים. עכברוש מטוהרים האסטרוציטים מיקרוגלייה משמשים יחד עם synaptosomes מצומדת מחוון ה-pH. שיטה זו ניתן לזהות בזמן אמת קינטיקה היבלעות והשפלה ומספקת פלטפורמה הקרנה מתאימים כדי לזהות גורמים להתכוונן אסטרוציט phagocytosis.

PH הרומן חוץ גופית ב- Live-הדמיה בתיווך וזמינותו של אסטרוציט Phagocytosis-שימוש Synaptosomes מצומדת-מחוון

מחלות ניווניות קשורות לתפקודי מיקרוגליה דיסרגטיים. מאמר זה מתאר במבחנה של פאגוציטוזיס של תאי נוירובלסטומה על ידי iPSC-מקרופאגים. קריאות מיקרוסקופיה כמותית מתוארות הן עבור הדמיה בזמן-זמן של תאים חיים והן עבור הדמיה בעלת תוכן גבוה של תאים קבועים.

במבחנה הדמיה כמותית אסאי עבור פאגוציטוזיס של תאי נוירובלסטומה מתים על ידי iPSC-מקרופאגים

כאן אנו מציגים שני פרוטוקולים לכימות בליעת מיקרוגליאה של סינפסות חיוביות vGLUT1 וסינפטוזומים גולמיים מסומנים באדום pHRodo באמצעות ציטומטריית זרימה.

כימות בליעה מיקרוגליאלית של חומר סינפטי באמצעות ציטומטריית זרימה

למדו שיטה לכימות היבלעות של קלטים פרה-סינפטיים על ידי מיקרוגליה במערכת העצבים המרכזית באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקלית. הפרוטוקול משתמש בזיהוי פלואורסצנטי של תאי גנגליון רשתית בעכברים.

Assay היבלעות: פרוטוקול להעריך אינטראקציות בין מערכת העצבים המרכזית וPhagocytes נוירונים

גלה סרטונים נוספים