Assay היבלעות: פרוטוקול להעריך אינטראקציות בין מערכת העצבים המרכזית וPhagocytes נוירונים
8 ביוני 2014
מיקרוגליה הם התאים חיסוניים תושב של מערכת העצבים המרכזית (CNS) עם קיבולת גבוהה לphagocytose או לבלוע את חומר בסביבה תאית שלהם. הנה, assay החלים רחב, אמין, וכמותי מאוד להדמיה ומדידת היבלעות בתיווך מיקרוגליה של רכיבים סינפטיים מתואר.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין ולכמת את הבליעה של קלטים פרה-סינפטיים על ידי מיקרוגליה. זה מושג על ידי הזרקת העוקבים הפלואורסצנטיים בדרגה קדמית לעיניים כדי לסמן קלט פרה-סינפטי של תאי גנגליון ברשתית בגרעין הגננט הרוחבי. השלב השני הוא לנתח, לתקן ולאזן את המוח.
לאחר מכן, המוח נחתך. השלב האחרון הוא להרכיב את חלקי המוח על שפת כיסוי לצורך הדמיה וניתוח. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה קונפוקלית משמשת להערכת בליעת קלטים פרה-סינפטיים על ידי מיקרוגליה.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון כיצד קרקעות פגוציטיות תורמות לפלסטיות של מעגלים סינפטיים ולעיצוב מחדש. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי עיצוב מחדש של מעגלים סינפטיים במוח בריא, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון עיצוב מחדש של מעגלים סינפטיים במהלך מחלת מערכת העצבים. ידגימו את ההליך כריס הלר, טכנאי, ואמילי לאמן, סטודנטית לתואר שני ממעבדת סטיבנס.
התחל הליך זה על ידי הרדמת עכבר עם 4% ISO פלואור בתא אינדוקציה פרספקס. לאחר דקה עד שלוש דקות, ודא שרמת הרדמה מתאימה מושגת על ידי צביטה בזנב. לאחר מכן הנח את העכבר על צדו מתחת למיקרוסקופ הסטריאו והנח את חרוט האף, המספק שלושה עד 4% ISO פלואור מעל החוטם.
כדי לחשוף את הסקלרה, השתמש בזוג מספריים קפיציים קטנים כדי לפתוח את העפעף ולמשוך את העור לאחור. עבור יילודים, לפעמים יש צורך בחתך מאונך נוסף בזווית העין. היזהר בעת חיתוך זווית העפעף מכיוון שיש כלי דם.
השתמש במחט סטרילית בקוטר 30.5 כדי לנקב חור קטן בצד העין שבו מתחילה הסקלרה הקפד להימנע מפגיעה בעדשה על ידי החדרת המחט מספיק רחוק כך שהשיפוע ייכנס לעין. הניחו לזגוגית לזרום החוצה מהחור והשתמשו באפליקטור סטרילי עם חתך וקצה כדי לספוג את הנוזל.
לאחר שהזגוגית הפסיקה לזרום החוצה מהחור, הכנס לאט לאט מחט קהה המחוברת למזרק המילטון שנטען מראש במעקב דרגה קדמית. צבעו לתוך החור, הזריקו לאט את הצבע לעין. בדרך כלל, תת-יחידה בטא של רעלן כולרה המצומד ל-Alexa 5 94, 6 47 או 4 88 משמש לדרגה קדמית.
מעקב מאוחר כניסות R GC השאר את המחט בחור למשך מספר שניות ולאחר מכן הסר אותה לאט. השתמשו באפליקטור עם קצה כותנה כדי לספוג עודפי נוזלים ולמנוע מהצבע לדלוף החוצה. לאחר מכן מרחו כמות קטנה של משחה אנטיביוטית על העין.
אם העין נפתחה בניתוח. מקם מחדש בעדינות את העפעפיים יחד לאחר ההזרקה. השאירו את העכבר מתחת למנורת חום או על כרית חום עד שהוא יתחיל להתאושש מההרדמה.
החזירו את העכבר לכלוב ביתי נקי ועקבו אחריו כדי לוודא שהוא ער לחלוטין לפני החזרתו למושבה. כ-24 שעות לאחר ההזרקה, הקריבו את העכבר ונתחו את המוח. קבעו את המוח בשפופרת פלקון מלאה ב-4% PFA למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס למחרת.
שטפו את המוח שלוש פעמים ב-PBS על ידי שפיכת המוח וה-PFA לתוך סירת מי גבינה ריקה, ואז השתמשו במרית כדי להעביר את המוח לסירת מי גבינה אחרת מלאה ב-PBS. שטפו את המוח פעמיים נוספות ב-PBS לפני העברתו לשפופרת פלקון מלאה בתמיסת סוכרוז 30%. השאירו אותו בסוכרוז בארבע מעלות צלזיוס עד שהוא שוקע לתחתית הצינור.
לאחר מכן, הסר את כל חלקי המוח שאינם נחוצים בעזרת סכין גילוח. הקפיאו את המוח על פיסת נייר אלומיניום על קרח יבש. בינתיים, הקפיאו את שלב המיקרוטום ומלאו כל באר של צלחת 24 בארות בחצי מיליליטר של 0.1 PP מולארי כדי להרכיב את המוח הקפוא על שלב ההקפאה.
מרחו כמות קטנה של OCT על השלב. ברגע שה-OCT מתחיל לקפוא, הניחו את המוח בתוכו. הצד של המוח שייחתך צריך להיות פונה כלפי מעלה.
לאחר מכן, כסו את המוח ואת ה-OCT בקרח יבש כתוש דק מאוד. השאירו את הקרח היבש על המוח למשך כ-30 שניות. לאחר מכן השתמש במברשת צבע גדולה כדי להסיר את הקרח היבש.
התחל לחתוך את הפרוסות בעובי 40 מיקרון. לאחר מכן השתמש במברשת לחה קטנה כדי להסיר את החלקים המכילים את אזור העניין מהלהב ולהעביר אותם לצלחת 24 הבארות המכילה 0.1 pb מולארי. לאחר איסוף החלקים, דמיין את תיוג הכיתה הקדמית תחת מיקרוסקופ חיתוך פלואורסצנטי ובחר קטעים המכילים את אזור העניין כדי להרכיב את החלקים על שקופית.
ראשית, החל מאגר קטן של 0.1 PB מולארי על מיקרוסקופ טעון. החלק הבא, העבר את חלקי הרקמה לבריכת ה- pb. לאחר מכן השתמש במכחול כדי לכוון ולפזר את הרקמות.
השתמש במגבון קים כדי לנדף את XSPB והקפד להימנע מנידוף הקטע. הניחו להם להתייבש לחלוטין באוויר. לאחר מכן מרחו טיפה קטנה של אמצעי הרכבה על כל חלק והרכיבו החלקת כיסוי מעל בקצה.
אוטמים את שולי השקופית בעזרת לק. אחסן את השקופית בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס עד להצגת הפעלת ההדמיה. להלן סכימה של אסטרטגיית מעקב אחר דרגה קדמית.
כניסות ה-RGC של העין השמאלית והימנית עוקבות אחר CTB 6 47 ו-CTB 5 94 בהתאמה. לאחר מכן מוערכת בליעת התשומות בתיווך מיקרוגליה. הנה תמונה מייצגת בהגדלה נמוכה של DLGN עכבר ביום החמישי לאחר הלידה בעקבות מעקב בין-דרגתי של קלטי עין שמאל וימין.
זוהי מיקרוגליה שנדגמה מאזור הגבול של כניסות העין השמאלית והימנית. כל הקרינה של CTB מחוץ לנפח המיקרוגליה הופחתה, וחשפה את כניסות ה-RGC שנבלעו ואת עיבוד פני השטח של מיקרוגליה ונבלעו. כניסות RGC מוצגות כאן.
הנה המשטח המייצג של מיקרוגליה מהעכבר P 5, P 9 ו-P 30. בליעת DLGN של תשומות RGC מוגברת משמעותית במהלך גיזום שיא ב-DLGN לעומת גילאים מבוגרים יותר. מיקרוגליה מעכברים חסרים בקולטן משלים שלוש בולעים פחות כניסות RGC באופן משמעותי בהשוואה לחברי המלטה מסוג בר לאחר שליטה.
טכניקה זו יכולה להיעשות תוך 72 שעות אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לתייג נוירונים ולהעריך אינטראקציות של סינפסות מיקרוגליה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר בדיקה כמותית ואמינה להדמיה ומדידה של בליעה (engulfment) של רכיבים סינפטיים על ידי מיקרוגליה, תאי החסינות של מערכת העצבים המרכזית. ההליך כולל סימון של קלטים פרה-סינפטיים ושימוש במיקרוסקופיה קונפוקאלית לצורך הניתוח.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- אימונולוגיה
רקע
- מיקרוגליה הם תאי החיסון העיקריים במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- הם ממלאים תפקיד מכריע בשמירה על הומאוסטזיס ובמענה לפגיעה.
- הבנת תפקידם בגיזום סינפטי חיונית למחקר בתחום מדעי המוח.
- פגוציטוזה על ידי מיקרוגליה היא תהליך מרכזי בהתפתחות העצבית ובניוון עצבי.
מטרת המחקר
- להדמיית בליעה של קלטים פרה-סינפטיים על ידי מיקרוגליה.
- לכימות היקף הבליעה של רכיבים סינפטיים.
- לפיתוח בדיקה בעלת יישום רחב למחקרים עתידיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הזרקת סומני פלואורסצנציה לעיניים לסיתמון קלטי תאי העצבים של הרשתית.
- הסרה, קיבוע והשוואת מאזנים של רקמת המוח.
- חיתוך של המוח לצורך אנליזה.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית לדימוג ולכימות של תהליכי בליעה.
תוצאות עיקריות
- הבדיקה ממחישה ביעילות בליעה המתווכת על ידי מיקרוגליה.
- הושגו מדידות כמותיות של ספיגת רכיבים סינפטיים.
- השיטה מהימנה וניתנת לשחזור לאורך ניסויים שונים.
- הושגו תובנות לגבי תפקודי המיקרוגליה בתהליך של גיזום סינפטי.
מסקנות
- בדיקה זו מספקת כלי בעל ערך לחקר הפעילות של מיקרוגליה.
- הבנת תהליך הבליעה של מיקרוגליה עשויה לתרום למחקרים בביולוגיה של מערכת העצבים.
- לממצאים עשויות להיות השלכות על מחקרים של מחלות ניווניות של מערכת העצבים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקה זו מאפשרת הערכה כמותית של פעילות פגוציטרית של מיקרוגליה בעיצוב מחדש של סינפסות, ובכך מספקת מדד מכניסטי לתיקוף מטרות במודלים של מחלות נוירו-דלקתיות ונוירו-דגנרטיביות. על ידי ויזואליזציה ומדידה של בליעה של קלטים פרה-סינפטיים, היא תומכת בהפחתת סיכונים של היפותזות טיפוליות המערבות מנגנוני חיסון במערכת העצבים המרכזית (CNS). השיטה מציעה רצף תרגומי משלב הגילוי ועד להערכה פרה-קלינית של מודולטורים של מיקרוגליה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן השערות טיפוליות על תפקוד מיקרוגליה בפלסטיות ובגיזום של מעגלים סינפטיים.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות במיקרוגליה באמצעות ויזואליזציה ישירה של פעילות פגוציטוטית.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי כימות המעורבות של המטרה בהקשרים של עיצוב מחדש סינפטי הרלוונטיים למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: יוצר מדדים כמותיים מבוססי דימות של בליעה על ידי מיקרוגליה לצורך תיקוף פגיעות (hit validation) בסריקות פנוטיפיות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הערכת התפקוד הפגוציטיבי תחת תנאי טיפול שונים בתרכובות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
- יכולת הרחבה: תואם לתהליכי חיתוך ודימות של פלטות רב-בארים לסריקה בתפוקה בינונית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: ממדל עיצוב מחדש סינפטי רלוונטי למחלות בהקשרים כגון ניוון עצבי ופגיעה מוחית.
- ערך תפעולי: מאפשר הערכה אורךית של מודולציה של מיקרוגליה לאורך נקודות זמן של התפתחות ומחלה.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין ממצאים in vitro לניתוח רקמות ex vivo של תפקוד פגוציטוטית במעגלים עצביים שלמים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
הבדיקה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לאפיון פרה-קליני, ובכך מאפשרת שיפור איטרטיבי של תרכובות המודולטיביות של מיקרוגליה על בסיס מדדי פגוציטוזה פונקציונליים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות לגבי תפקידי מיקרוגליה בגיזום סינפטי ובזיקוק מעגלים עצביים.
- סריקה: מספק פלטי דימות כמותיים וניתנים לשחזור להערכת השפעת תרכובות על בליעה על ידי מיקרוגליה.
- אנליטיקה: מספק נתוני מורפומטריה ועצימות פלורסצנציה להשוואת בליעה בין תנאים ניסיוניים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר תובנות מכניסטיות למודלים פרה-קליניים של אובדן סינפטי במחלה נוירודגנרטיבית.
- שימוש חוזר ארגוני: מכונן פלטפורמה לשימוש חוזר להערכת מודולטורים אימונולוגיים של ה-CNS במגוון פרויקטים ואינדיקציות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות במנגנון הפעולה של המיקרוגליה.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה של הערכת הפגוציטוזה בין אתרים וצוותים שונים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) על ידי קישור מודולציית המטרה לתוצאות של עיצוב סינפטי תפקודי מחדש.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קידום מותאם סיכונים של תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS) בהתבסס על הפחתת סיכונים מכניסטית של נתיבים תיווכי-חיסוניים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיסקציה של מערכת העצבים, מעקב פלואורסצנטי (fluorescent tracing) ומיקרוסקופיה קונפוקלית.
- תלוי במיכשור להזרקה מדויקת, חיתוך רקמות ודימיון ברזולוציה גבוהה.
- מחייב סטנדרטיזציה של עיתוי הזרקת המעקב, פרוטוקולי קיבוע וספי סף (thresholds) לניתוח תמונות.
- כולל שיקולי התאמה לסוגים שונים של פגוציטים (למשל, אסטרוציטים, מקרופאגים) ולאזורי מוח שונים.
- מוגבל על ידי הצורך בשימור רקמה שלמה ובשמירה על תפקוד מיקרוגליאלי תקין לאחר עיבוד ex vivo.
