Name: Nephrectomy דוגמנות קרצינומה ספונטני גרורתי של תאי כליות (mRCC) בעכברים בעקבות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: למדו ליצור מודל ספונטני של קרצינומה גרורתית של תאי כליות בעכברים באמצעות השתלה אורתוטופית ונפרקטומיה. פרוטוקול זה מאפשר הערכה סטנדרטית של יעילות טיפולים ניסיוניים במחקר אונקולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למעבדה של ד&quot;ר רוברט ס &#39;קרבל (אוניברסיטת טורונטו, Sunnybrook מכון מחקר, טורונטו, קנדה) לעזרה טכנית ומומחיות בפיתוח של הליך זה. כמו כן, אנו רוצים להודות לד&quot;ר סנדרה סקסטון וRoswell Park Cancer Institute מחלקת משאבי חיות מעבדה. עבודה זו נתמכה על ידי הפרס מטעם קרן Roswell Park Alliance (לJMLE).

1. השתלת גידול בכליות Orthotopic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבית תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השתלת orthotopic, לגדל תאי עכבר RENCA לוק כmonolayer לconfluency 75%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות trypsinization וresuspension בתקשורת 5% FBS המכיל, תאי צנטריפוגות ב 1,000 סל&quot;ד, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, חוזרים 3 פעמים כדי לשטוף ב-PBS. אז resuspend התאים בסרום ללא מדיה לריכוז של 5 x 10 4 לוק / 5 סרום ללא מדיה μl RENCA. הערה: בהתאם לגרסה או הקו סלולרי בשימוש, ניתן resuspended תאי ביחס של 1:1 מmatrigel ותקשורת חופשית בסרום כדי להאט צמיחה אגרסיבית מאוד עכבר תא והפצה לאחר השתלה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתלת ניתוח ותא הערה: כל המחקרים בבעלי החיים שמתוארים בו, כוללים תחזוקה ונחישות של נקודות קצה ניסיוניות, בוצעו על פי עמ &#39;ועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש מוסדית (IACUC)rotocol אושר על ידי Roswell Park Cancer Institute. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי אחד עכבר BALB / C באמצעות Isoflurane (2-3%). צבוט את הרגל ולבדוק לרפלקס כדי להבטיח הרדמה מספיק. החל משחה וטרינר לעיניים כדי למנוע התייבשות. העבר את העכבר שכיבה לרוחב נכון ולגלח את צד שמאל בין קדמי ואחורי גפה. החל אלכוהול ויוד לאורך אזור המותני הגבי להכין סביבה נקיה מחיידקים באזור לחתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים כירורגית ליזום חתך בעור 1 סנטימטר בכיוון אורך בין הצלע האחרונה ומפרק הירך. שחרר רקמת חיבור מתחת לעור באמצעות מספריים לנתיחה בוטים. השתמש במספריים כירורגית כדי לעשות חתך 0.5 סנטימטר בכיוון אורך בדופן הבטן. השתמש במלקחיים מעוקלים כדי לדחוף למטה בעדינות סביב פצע פתוח - זה יהיה exteriorize הכליות ולאפשר לקיבוע עדין של איבר לפני הזריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את מזרק המילטון עם 5 μl תערובת התא מוכנה. לimplan תת קופסיתtations, יכולה להיות מועסקות בשתי שיטות השתלה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטחי: ריצה במקביל לכליות, מחט להכניס חוקיים אורכים תחת הקפסולה הכליות (אבל מעל parenchyma) עם הקצה המשופע מעלה. ברגע שהמחט נמצאת במקומו, מזריק את כל התאים עד צורות בועה הלבנות קטנות. לאט לאט להסיר את המחט מכמוסה ומייד למחוק מעל הזרקה עם המוליך כותנה שקצהו סטרילי כדי לספוג כל דליפה ולמנוע הפצת תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנימי: עם קצה למעלה ומתחילים מהצד של ההפך כליה לאתר השתלה סופי משופעים, להכניס מחט דרך הפנים של כליות עד המחט גלויה (אך לא ניקוב) החלל תת קופסית. הזרק את כל התאים עד צורות בועה לבנה ואתר הזרקת ספוגית כדי למנוע כל דליפה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להחזיר את הכליות לחלל הגוף. סגור את קיר גוף הבטן באמצעות תפר 5-0 Vicryl נספג. לאחר ההשלמה, למשוך את שכבת העור יחד ומניח 2-3 wound קליפים. קליפים להבטיח איתנים ומחולק באופן שווה כדי להבטיח שאין חשיפת פצע. לפני ההתאוששות לנהל 500 μl של .0.9% NaCl ושל עצירות (0.01 מ&quot;ג / מיליליטר) 100 μl מתחת לעור באמצעות מחט 25 G. באופן שיגרתי לפקח מיקום סרטון ויציבות, ולהסיר אחרי 10 ימים. </li></ol></li></ol> 2. Nephrectomy / הסרת גידול ראשונית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב פרוטוקול זהה להרדמת עכבר, חוסר תנועה, חתך, וחשיפה של כליות כמתואר בסעיפי 1.2.1 ו 1.2.2 (לעיל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זוג שני של מלקחיים על מנת לבודד את הכליות בעדינות על ידי הסרת רקמת חיבור שומן מקצה הזנב ואת בלוטת יותרת הכליה מקצה הגולגולת של הכליה. בעוד לתפוס את הכליות בעדינות, להשתמש תפר נספג 5-0 Vicryl לעשות קשר כפול סביב השופכן, עורק כליה, ווריד. לאט מאובטח ולאחר מכן לחתוך מעל הקשר כדי להסיר את הכליה. אם כל סימן של איבוד דם באופן מיידי, או שיש סיכון לאחיזה מספיקהתפר בשופכן, עורק, וריד, ואז להשתמש cauterizer במקום מספריים לחתוך מעל קשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהכליות מוסרות, לבדוק היטב עבור כל דימום מהעורק קשור ולהשתמש cauterizer במידת צורך. סגור את קיר גוף הבטן באמצעות 5-0 Vicryl. משוך את שכבת העור יחד ומניח 2-3 קליפים פצע הבא באותו אמצעי זהירות כפי שתואר ב1.2.4. לעקוב מקרוב אחר בעלי חיים יומיים לאחר ניתוח לסימני מצוקה, דימום, או ניידות מוגבלת. פעל לפי הנחיות מוסדיות לבעלי חיים בבטחה. </li></ol> 3. ניטור גרורתי התקדמות ולוקליזציה בנקודתי קצה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כימות מחלה גרורתית: ניטור Bioluminescent <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראה המתודולוגיה שתוארה קודם לכן ביופיטר לניטור גרורות באמצעות תאי transfected עם לוציפראז ולכמת באמצעות 11,12 מערכת ההדמיה Xenogen IVIS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדריך לנתיחה לאחר מוות ויזואלי להערכה השוואתית של חלוקה גרורתיtion <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את החיות על פי הנחיות מוסדיות באמצעות נקודות קצה, כולל סימני מצוקה, נשימה מאומצת, ירידה במשקל, וכו &#39; הערה: ניטור מדוקדק של בעלי חיים הוא קריטי כמו התקדמות גרורתית ספונטנית יכולה להיות משתנה ומהירה מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים כירורגית ליזום חתך מעל השופכה שממשיכה את חלל בית החזה ללסת תחתונה נמוכה יותר. השתמש במספריים הסתיימו בוטים להפריד את העור מהשרירים של דופן הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום חתכים לאורך זרועות ורגליים. עור פיל משם. מקרוב לבחון את fascia העור וקיר בטן לגושים, ואז בלוטות הלימפה השטחיות: מפשעתי, זרוע, בית השחי וצוואר הרחם שטחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושה חתך בדופן הבטן ולחתוך לאורך הצדדים לרוחב שמאלה וימינה עד לסרעפת. עם חתך אחד אופקי להסיר את החלק הקדמי של דופן הבטן חשופה הקרביים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון את המראה בלתי מופרע של f הקרבייםאו גס גידולים ראויים לציון. כמו כן שים לב את התוכן של הקיבה ומעיים; אם הם ריקים, העכבר אולי לא היה מסוגל לאכול. אם התוכן הוא כהים, זה עשוי להצביע על ראיות של דימום עליון / תחתון של קיבה ומעיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחינה ויזואלית להבקיע כל איבר לנוכחות גידול או היעדרות, הקצאת ציון הכולל לכל קבוצה בעכבר (4 חיות לכל קבוצה משמשת כדוגמא באיור 1D-i). הערות: 1) הגדלה של בלוטות הלימפה לא בהכרח אומרת שזה גידול הסרטני; אם כן, הוא במידה רבה בגודל, תקיף מאוד, וצבע לבנבן, סביר להניח גולה גרורתי. 2) חלבי מוגזם או נוזל עכור בבטן מצביע על מיימת. מיימת עשויה לכלול הצטברויות מוצקות על אברי הבטן, במיוחד בין האונות של הכבד והקיבה. 3) לאיברים כגון ריאות, גושים מרובים יכולים להיות נוכחים ונספר להשוואות בין בעלי חיים הבודדים (ראה 13 לדוגמא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות גידולי ברוטו או מומים של אברי בטן הבודדים: כבד, טחול, כליות ולבלב על ידי הסרת בזהירות ושטיפה עם PBS מבקבוק להשפריץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת אברי הבטן, לבדוק את בלוטות הלימפה בבטן, כוללים המותני, עצם העצה, כליות, ובלוטות לימפה mesenteric. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך סרעפת עדויות להתפשטות גרורה. הערה: התפשטות נרחבת על הסרעפת יכולה לגרום לו לאבד את התכווצותו, מה שמוביל לעמל או אובדן הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הסרעפת ולעשות שני חתכים רוחב בחלל בית החזה, הסרת החלק הקדמי על מנת לחשוף את הריאות ולב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את ריאות ולב בעדינות על ידי אחיזה ומרים את הוושט וחיתוך קנה הנשימה מעל הלב. להעריך רקמות לגושים. סוחטים את לב. חוסר העקביות קפיצית עשוי להצביע על הווה גידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים כירורגית לחתוך באופן ליניארי דרך גולגולת. להסיר בעדינות חתיכות קטנות של גולגולת עד שלאהמוח כולו הוא נחשף. חפש בכל רחבי מוח לגושים גלויים או כתמי מומים. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+advanced+spontaneous+metastasis+for+experimental+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics.</a> Nat. Rev. Cancer. 11, 135-141 (2011).</li>
<li>Souza, B. M., Chaves, K. B., Chammas, R., Schor, N., Bellini, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endostatin+neoadjuvant+gene+therapy+extends+survival+in+an+orthotopic+metastatic+mouse+model+of+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Endostatin neoadjuvant gene therapy extends survival in an orthotopic metastatic mouse model of renal cell carcinoma.</a> Biomed. Pharmacother. 66, 237-241 (2012).</li>
<li>Amagai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy+of+interleukin-2+and+sorafenib+improves+survival+benefits+and+prevents+spontaneous+pulmonary+metastasis+in+murine+renal+cell+carcinoma+models%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn.+J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Combination therapy of interleukin-2 and sorafenib improves survival benefits and prevents spontaneous pulmonary metastasis in murine renal cell carcinoma models.</a> Jpn. J. Clin. Oncol. 40, 503-507 (2010).</li>
<li>Steeg, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+Drug+Development+Must+Consider+the+Impact+on+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Preclinical Drug Development Must Consider the Impact on Metastasis.</a> Clin. Cancer Res. 15, 4529-4530 (2009).</li>
<li>Guerin, E., Man, S., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+postsurgical+advanced+metastatic+breast+cancer+more+accurately+replicates+the+clinical+efficacy+of+antiangiogenic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A model of postsurgical advanced metastatic breast cancer more accurately replicates the clinical efficacy of antiangiogenic drugs.</a> Cancer Res. 73, 2743-2748 (2013).</li>
<li>Day, C. P., Carter, J., Bonomi, C., Hollingshead, M., Merlino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+therapeutic+response+of+residual+metastatic+disease+is+distinct+from+its+primary+tumor+of+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Preclinical therapeutic response of residual metastatic disease is distinct from its primary tumor of origin.</a> Int. J. Cancer. 130, 190-199 (2012).</li>
<li>Ebos, J. M., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiangiogenic+therapy%3A+impact+on+invasion%2C+disease+progression%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Antiangiogenic therapy: impact on invasion, disease progression, and metastasis.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 210-221 (2011).</li>
<li>Naito, S., Walker, S. M., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+selection+of+human+renal+cell+carcinoma+cells+with+high+metastatic+potential+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">In vivo selection of human renal cell carcinoma cells with high metastatic potential in nude mice.</a> Clin. Exp. Metastasis. 7, 381-389 (1989).</li>
<li>Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+implantation+in+essential+for+the+selection%2C+growth+and+metastasis+of+human+renal+cell+cancer+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Orthotopic implantation in essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice.</a> Cancer Metastasis Rev. 9, 145-165 (1990).</li>
<li>Saiki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+invasive+and+metastatic+phenotype+in+human+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Characterization of the invasive and metastatic phenotype in human renal cell carcinoma.</a> Clin. Exp. Metastasis. 9, 551-566 (1991).</li>
<li>Mohanty, S., Xu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+metastasis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Experimental metastasis assay.</a> J. Vis. Exp. 42 (1942), (2010).</li>
<li>Nunez-Cruz, S., Connolly, D. C., Scholler, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+model+of+serous+ovarian+cancer+in+immunocompetent+mice+for+in+vivo+tumor+imaging+and+monitoring+of+tumor+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An orthotopic model of serous ovarian cancer in immunocompetent mice for in vivo tumor imaging and monitoring of tumor immune responses.</a> J. Vis. Exp. (45), (2010).</li>
<li>Ebos, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+metastasis+after+short-term+treatment+with+a+potent+inhibitor+of+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accelerated metastasis after short-term treatment with a potent inhibitor of tumor angiogenesis.</a> Cancer Cell. 15, 232-239 (2009).</li>
<li>Yang, O. C., Maxwell, P. H., Pollard, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+cell+carcinoma%3A+translational+aspects+of+metabolism+and+therapeutic+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Renal cell carcinoma: translational aspects of metabolism and therapeutic consequences.</a> Kidney Int. 84 (4), 667-681 (2013).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

מטרתו של פרוטוקול זה היא להעריך מחלה גרורתית ספונטנית רלוונטית קליני תוך שימוש במודל עכבר גידול syngeneic לתאר טכניקות השתלה / כריתה. כיום, הרוב המכריע של מחקרים פרה הערכת תרופות ניסיוניות רומן אינו כולל מחקר של מחלה גרורתית ורק מעטים לשחזר את השלבים של צמיחת גידול ראשונית, כריתה כירורגית, והתפשטות גרורה ספונטנית סופו של דבר. עד כה, מודלים עכבר מהונדסים גנטי (GEMMs) שנוצרו כדי לעורר התקדמות ספונטנית כליות תא מחלה (ראה 14 לסיכום) אינו כולל גרורות בשלב מאוחר ואסטרטגיות הת...

הגורם העיקרי לתמותה בחולים עם קרצינומה של תאי כליות (RCC) הוא מחלה גרורתית מערכתית שמתרחשת בדרך כלל בעקבות ניתוח להסרת גידול ראשוני גדל בכליות. עם זאת, מעט מאוד מודלים גידול פרה הערכת תרופות ניסיוניות בעכברים כוללים מחלה גרורתית, ועוד פחות מזה בנאמנות לשחזר את השלבים הקליניים של גידול מקומי, ניתוח, וייזום מיקרו גרורתי ספונטני והתקדמות 1-3. פער בבדיקה זו הפך להיות חשוב יותר ויותר בהערכה של טיפולים חדשים כמו שלפעמים השפעות אנטי סרטניים מרשימות לראות במודלים של בעלי חיים לא תמיד מתורגמות לטיפול מוצלח באופן דומה של חולים 4. הבדלים כאלה בתוצאות עשויים לנבוע מefficacies תרופת ההפרש בין דגמים המקומיים מחוץ לרחם או orthotopic גידול ראשוניים ומחלה גרורתית בשלב מאוחר 5-7. במקרה של RCC, רק מחקרים מעטים הועסקו הוקםפרוטוקולי nimal הכוללים הישנות מחלה ספונטנית שמחק חולים שבדרך כלל יש לו כליות נושאות גידולים באופן מלא או באופן חלקי הוסרו 2,3. הסיבות למחסור זה בבדיקות במודל עכבר להשתנות. ראשית, יש את העלות של בעלי החיים הגבוהה וההשתנות הגלומה בבחירת תאי גידול ואת הפוטנציאל גרורתי. לדוגמא, שורות תאי כליה אנושיות נוטות לשלוח גרורות לעתים נדירות, ויש לבחור על סיבובים רבים של השתלה ראשונית orthotopic ובחירה גרורתי להפיק גרסאות שאופן עקבי להפיץ ויוצרים נגעים רחוקים (ראו תיאור של גזירת שורת תאים אנושית כגון 8-10) . לעומת זאת, תאי עכבר במודלים של מערכת חיסון נוטים להתנהג בצורה אגרסיבית, ומספרי תא נמוכים חייבים להיות מוזרקים עם matrigel להפחית התפשטות מערכתית מיידית 3. שנית, metastati ספונטני קשיים טכניים בביצוע השתלה נכונה, כריתה כירורגית (כריתת כליה), ומעקב (וכימות)צמיחת ג יכולה להיות מאתגרת ומספר משתנים קריטיים צריכים חשבון בעת ​​העסקת טכניקה זו (ראה דיון לפרטים נוספים). מטרתו של פרוטוקול זה היא לתאר את הצעדים החיוניים (כמו גם בעיות פוטנציאליות) של השתלת orthotopic, כריתה (כריתת כליה), וניטור של מחלת RCC גרורתי ספונטנית ולהציע קו מנחה לסטנדרטי (ונפוץ יותר) להשתמש בין מעבדות מדעיות כי להעריך את היעילות של תרופות ניסיוניות.

<table><tbody><tr><td>גלוקוז גבוה ב-DMEM עם Pyr. ו L-גלוטמין</td><td>קורנינג</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>0.25% טריפסין EDTA</td><td>קורנינג</td><td>25-053-CL</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS ללא סידן & מגנזיום</td><td>קורנינג</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>יש לשמור על קרח</td></tr><tr><td>דמעות מלאכותיות-חומר סיכה משחה אופתלמית</td><td>Akorn Animal Health</td><td>17478-162-35</td><td></td></tr><tr><td>Pocket pro גוזם חיות מחמד</td><td>Braintree מדעי</td><td>CLP9931B</td><td></td></tr><tr><td>ספוגית אלכוהול</td><td>VWR</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>ספוגית תמיסת בטדין</td><td>VWR</td><td>67618-152-01</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו חיתוך להבים ישרים, קהים - 25 מ"מ - 4.5 אינץ'&nbsp;</td><td>Southpointe כירורגי</td><td>RS-5982</td><td></td></tr><tr><td>איריס מלקחיים, משוננים, מעוקלים, באורך 10 ס"מ</td><td>קנט מדעי</td><td>INS15915</td><td>זקוקים לשניים מאלה</td></tr><tr><td>10 ומיקרו; l מזרק המילטון</td><td>המילטון</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>30 גרם, 45 מעלות, מחט RN</td><td>המילטון</td><td>7803-07</td><td></td></tr><tr><td>אפיקטור כותנה סטרילי</td><td>VWR</td><td>10805-144</td><td></td></tr><tr><td>ערכת צריבה בטמפרטורה גבוהה</td><td>קנט מדעי</td><td>INS500392</td><td></td></tr><tr><td>5-0 מצופה ויקריל, מחט חיתוך קונבנציונלית&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>J834</td><td></td></tr><tr><td>רפלקס קליפ אפליק לקליפסים 7 מ"מ</td> קליפס רפלקס <td>INS500343</td><td></td><td>מדעי קנט</td></tr><tr><td>, 7 מ"מ, לא סטרילי</td><td>קנט מדעי</td><td>INS500344</td><td></td></tr><tr><td>הסרת מלקחיים, אורך 12 ס"מ</td><td>קנט מדעי</td><td>INS500347</td><td></td></tr><tr><td>0.9% נתרן כלורי</td><td>בקסטר הלת'קר</td><td>2B1322</td><td></td></tr><tr><td>בופרנורפין 0.01 מ"ג/מ"ל</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחט 25 גרם 5/8 אינץ'</td><td>VWR</td><td>BD305122</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 1 מ"ל ללא מחט</td><td>VWR</td><td>BD309659</td><td></td></tr><tr><td>טכנולוגיית D-Luciferin</td><td>Gold Bio</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

nephrectomy דוגמנות קרצינומה ספונטני גרורתי של תאי כליות (mrcc) בעכברים בעקבות

Modeling Spontaneous Metastatic Renal Cell Carcinoma (mRCC) in Mice Following Nephrectomy

אחד האתגרים המרכזיים לבדיקה משופרת של תרופות ניסיוניות חדשות בקרצינומה של תאי כליות (RCC) הוא הפיתוח של מודלים שנאמנו לסכם את התקדמות מחלה גרורתית מוקדמת ושלב מאוחר. מודלים השתלת גידול אופייניים לנצל השתלת גידול ראשוני מחוץ לרחם או orthotopic, אבל כמה כוללים מחלה גרורתית ספונטנית מערכתית המחקה את הסביבה הקלינית. פרוטוקול זה מתאר את השלבים העיקריים לפתח את התקדמות מחלה בשלבי RCC דומה לחולים. ראשית, הוא משתמש בשורת תאים גרורתי מאוד בעכבר גידול במודל syngeneic להראות השתלת תאים סרטניים orthotopic. שיטות כוללות השתלה שטחית ופנימית לתוך החלל תת קופסית עם תאים בשילוב עם matrigel כדי למנוע דליפה והתפשטות מוקדמת. הבא זה מתאר את ההליכים לכריתה של גידול נושאות כליה (כריתת כליה), בזהירות עכבר ומראש לאחר ניתוח קריטי. לבסוף, הוא מתאר את הצעדים הדרושים כדי לפקח ולהעריךמיקרו ומקרו גרורתי התקדמות מחלה, כולל ההדמיה bioluminescent כמו גם מספק מדריך נתיחה לאחר מוות חזותי מפורט להבקיע הפצת מחלה מערכתית. המטרה של תיאור פרוטוקול זה היא להקל על השימוש הנרחב של מודלים RCC גרורתי רלוונטיים מבחינה קלינית כדי לשפר את ערך החיזוי של בדיקות טיפוליות עתידיות.

איור 1 א מציג סכמטי המתווה את הנהלים המפורטים בסיכום פרוטוקול זה. מספר גורמים חשובים יש לקחת בחשבון לכל צעד. לדוגמא, בשלב 1 זה מראה שתי שיטות להשתלת תאים סרטניים תת קופסית לתוך הכליה. יכולים להיות מושתלים תאים סרטניים לתוך החלל תת קופסית עם לבן בועה קטנה המאשרת את המיקום מקומי של תאים עם זליגה למנוע על ידי הסרה זהירה של מחט ונוזל נמלט עודף בניקוי (איור 1 ב-i). כדי למנוע דליפה, יכולים להיות מושתלים תאים פנימיים ראשון שהגיעו למקום תת קופסית ...

מודלים של התקדמות מחלה הספונטנית גרורתי קרצינומה של תאי כליות (RCC) יכולים לשמש להערכת טיפולים בסביבה רלוונטית מבחינה קלינית. פרוטוקול זה מדגים הליכים שונים להשתלת תאים סרטניים בכליות orthotopic, כריתת כליה תקינה, ולבסוף מתאר מדריך נתיחה לאחר מוות לניקוד חזותי וbioluminescent של נטל ולוקליזציה גרורתי.

Nephrectomy דוגמנות קרצינומה ספונטני גרורתי של תאי כליות (mRCC) בעכברים בעקבות

One of the key challenges to improved testing of new experimental therapeutics in renal cell carcinoma (RCC) is the development of models that faithfully ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להנחית קרצינומה של תאי הכליה גרורתית ספונטנית בעלת רלוונטיות קלינית. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת תאי reka Luke להשתלה. השלב השני הוא ביצוע השתלה אורתוטופית של תאי גידול בכליה.בשלב הבא, לאחר צמיחת הגידול, מוסר הגידול הראשוני באמצעות ביצוע נפרקטומיה (nephrectomy). השלב הסופי הוא ניטור התקדמות גרורות ספונטניות לאחר הנפרקטומיה והערכת התפשטות המחלה במיקומים שונים. בסופו של דבר, פרוטוקול זה מאפשר ניטור של מחלת קרצינומה של תאי הכליה עם גרורות ספונטניות ומספק קו מנחה לסטנדרטיזציה של הערכת היעילות של טיפולים ניסיוניים.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שיטות השתלת תאי גידול אקטופיות, שלעיתים קרובות הן שטחיות או תת-עוריות, הוא שהיא משחזרת את קרצינומה של תאי הכליה או RCC כפי שהיא מופיעה בחולים, כולל יכולתם של תאי הגידול להתפשט לשאר חלקי הגוף. ההשלכות של טכניקה זו פונות לעבר הטיפול בקרצינומה של תאי הכליה, מכיוון שמחלה גרורתית סיסטמטית היא הגורם העיקרי לתמותה בחולים. מודלים של עכברים בדרך כלל אינם מדמים מחלה גרורתית ספונטנית שעלולה להתרחש לעיתים לאחר נפרקטומיה.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מחלת RCC גרורתית ספונטנית, ניתן להחילה אותה גם על סוגי סרטן אחרים שבהם הסרת הגידול הראשוני היא טיפול טיפוסי והגורם העיקרי לתמותה הוא חזרה של מחלה גרורתית לאחר הניתוח. זה כולל מודלים של סרטן השד ומלנומה, בין היתר.בדרך כלל, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקלו בקושי בשל, ראשית, הקושי באיתור הכליה והבטחת השארת תאי הגידול מקומית בעת ההשתלה ומניעת דליפתם. ושנית, הבטחה שהביצועים יעילים ומאפשרים התאוששות לאחר הניתוח. לפני השתלה אורתוטופית, גדלו תאי reca המסומנים בלוסיפראז של עכבר או תאי reka Luke כשכבה אחת (monolayer) עד ל-75% confluence; לאחר טריפסינזציה ותליה מחדש במדיום המכיל 5% FBS, סנטריפוגו את התאים, וחזרו על הפעולה שלוש פעמים עם שטיפה ב-PBS, ולאחר מכן תלו מחדש את התאים במדיום ללא סרום בריכוז של 5×10⁴ renco Luke ל-5 µL של מדיום ללא סרום.לאחר הרדמה של עכבר עם מעי ב-2% עד 3% isof fluorine, צבטו רגל כדי לוודא הרדמה מספקת. לאחר מריחת משחה וטרינרית על העיניים למניעת התייבשות, הניחו את העכבר בשכיבה צדית ימנית וגלחו את הצד השמאלי בין הגפיים הקדמיות והאחוריות. לאחר מכן, מרחו אלכוהול ויוד לאורך אזור הגב המותני. השתמשו במספריים כירורגיים כדי לבצע חתך עורי של סנטימטר אחד בכיוון אורך בין הצלע האחרונה למפרק הירך.לאחר מכן, השתמש במספרי דיסקציה קהים כדי לשחרר את רקמת החיבור מתחת לעור. בשלב הבא, השתמש במספריים כירורגיים כדי לבצע חתך של 0.5 סנטימטר בכיוון אורך בדופן הבטן. כעת, השתמש בפינצטה מעוקלת כדי לדחוף בעדינות כלפי מטה מסביב לפצע הפתוח.פעולה זו חושפת את הכליה ומאפשרת קיבוע עדין של האיבר לפני ההזרקה. טענו מזרק Hamilton עם 5 µL מתערובת התאים שהוכנה להשתלה תת-קפסולרית שטחית. החזיקו את המחט במקביל לכליה המכוונת לאורכה, כאשר הצד האלכסוני של קצה המחט פונה כלפי מעלה, והחדירו את המחט מתחת לקפסולת הכליה, אך מעל הפארנכימה.לאחר שהמחט במקומה, הזרקו את כל התאים עד להיווצרות בועה לבנה קטנה. הוציאו לאט את המחט מהקפסולה והשתמשו מיד במקלון צמר סטרילי כדי לחסום את נקודת ההזרקה לצורך השתלה תת-קפסולרית פנימית. התחילו מהצד של הכליה שמעומת לאתר ההשתלה הרצוי.החזיקו את המחט כך שהחלק המשופע פונה כלפי מעלה ופנימה. הכניסו אותה דרך פנים הכליה עד שהמחט נראית לעין, אך מבלי לדקור את החלל התת-קפסולרי (subcapsular space) בצד המרוחק. מזריקו את התאים עד להיווצרות בועה לבנה, ונגבו את נקודת ההזרקה כדי למנוע דליפה.החזיר בעדינות את הכליה לחלל הגוף. סגור את דופן הבטן באמצעות תפר Vicryl 5.0 ספיג. עם סיום הפעולה, החזק את שכבת העור יחד והנח שני עד שלושה סיכות לסגירת פצע לפני השבת החיה מההרדמה.החדירו 500 µL של 0.9% sodium chloride ו-100 µL של buprenorphine תת-עורית. 26 עד 30 ימים לאחר ההשתלה, הרדימו את בעל החיים וחשפו את הכליה כפי שבוצע קודם לכן. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי להסיר בעדינות את רקמת השומן המקשרת מהקצה הזנבי (caudal) של הכליה והסִירו את בלוטת האדרנלין מהקצה הקרניאלי (cranial).השתמשו בפינצטה כדי לתפוס בעדינות את הכליה, ולאחר מכן העבירו תפר Vicryl 5.0 נספג סביב השופכן, העורק הכליתי והוריד הכליתי. לאחר מכן, קשרו לאט קשר כפול לאחר קיבוע החוטים באמצעות תפסני עצירה (hemostats). השתמשו במספריים כדי לחתוך מעל הקשר ולהוציא את הכליה.לאחר הסרת הכליה, יש לבדוק בקפידה אם קיימים דימומים מהוריד והעורק, ולבצע צריבה במידת הצורך. לאחר תפירת דופן הבטן באמצעות Vicryl 5.0, השתמשו בסגורי פצעים לסגירת העור. עקבו אחר בעל החיים מדי יום כדי לזהות סימני מצוקה, דימום או ניידות מוגבלת.לאחר ביצוע הרדמה עם קטילה של בעל החיים, השתמש במספריים כירורגיים כדי לבצע חתך המתחיל מעל השופכה ונמשך במעלה חלל בית החזה עד ללסת התחתונה. השתמש במספריים בעלי קצה קהה כדי להפריד את העור מהשרירים של דופן הבטן. לאחר מכן, חתוך את העור לאורך הזרועות והרגליים וקלף את העור לאט.בדקו מקרוב את פשיית העור ואת דופן הבטן לאיתור קשריים. לאחר מכן, בדקו את קשרי הלימפה השטחיים. בצעו חתך בדופן הבטן וחתכו לאורך הצדדים הלטרליים השמאלי והימני עד לסרעפת.בחתך אופקי אחד, הסר את החלק הקדמי של דופן הבטן כדי לחשוף את האיברים הפנימיים. בחן את מראה האיברים הפנימיים ללא הפרעה כדי לזהות גידולים בולטים במבט מקרוסקופי.יש לשים לב גם לתכולת הקיבה והמעיים כדי לחפש עדויות למזון או לדימום. יש לבצע דירוג ויזואלי של כל איבר לנוכחות או היעדר של גידולים תוך שימוש ברשימת תיוג של 22 אתרים; הדירוגים נרשמים בטבלה עבור בעלי החיים בקבוצה מסוימת כדי להשוות את התפזורת של המחלה. כעת, יש להוציא בזהירות את הכבד ולשטוף אותו ב-PBS.לאחר מכן, בחנו את האיבר לאיתור גידולים גסים או חריגות ודרגו אותם כפי שנעשה קודם לכן. המשיכו להסרה ודירוג של הטחול, הכליה והלבלב. לאחר מכן, בדקו את קשרי הלימפה בבטן, כולל קשרי הלימפה הלומבסאקרליים (lumbar sacral), הרנליים (renal) והמזנטריים (mesenteric).לאחר בדיקת הסרעפת לאיתור עדות להפצה מטאסטטית, הסר את הסרעפת ובצע שני חתכים צדיים בחלל בית החזה, תוך הסרת החלק הקדמי כדי לחשוף את הריאות והלב; הרם בעדינות את הוושט וגזור את הקנה מעל הלב. לאחר הסרת הריאות והלב, בדוק את הרקמות לאיתור קשריות (nodules). לאחר מכן, השתמש בפינצטה כדי לסחוט את הלב.חוסר בעקביות בקפיצות עשוי להעיד על נוכחות של גידול. לבסוף, השתמש במספריים כירורגיים כדי לחתוך בקו ישר דרך הגולגולת. הסר בעדינות חתיכות קטנות של הגולגולת עד שכל המוח ייחשף.מערכת ניקוד ויזואלית שימשה להערכת המחלה, התהלוּת וחומרת המחלה בחמש קבוצות שונות של בעלי חיים. קבוצות אלו הראו מידה וחומרה שונות של המחלה. מדידה נוספת, שהורכבה מדימות ביו-לומנסנטית מיד לאחר ההקרבה, שימשה להערכה כמותית של נגעים גרורתיים מיקרו ומאקרו.במידה ושולטו שתי הטכניקות, ניתן לבצע השתלה, כריתת כליה או נתיחה לאחר המוות תוך חמש עד 10 דקות לבעל חיים, אם הפעולה מבוצעת כראוי. זאת כדי לבחון האם תגובות לטיפול יהיו שונות בין סוגים שונים של תאי גידול גרורתיים. תאים מקרצינומה של תאי הכליה גרורתית.כיום נעשה שימוש בחומרי פציינטים להשתלה ישירה בבעלי חיים כדי להעריך את צמיחת המחלה המקומית והגרורתית לאחר פיתוחה. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום ה-RCC לבחון התקדמות מחלה רלוונטית מבחינה קלינית ותגובות לטיפול. בפרט, האם תגובות אלו שונות בהתאם למחלה מוקדית מקומית או לצמיחה גרורתית ספונטנית.אל תשכחו שעבודה עם בעלי חיים זעירים העוברים מספר ניתוחים מחייבת הקפדה קפדנית על הנחיות פרוטוקול בעלי החיים המוסדיות ועל תנאים סטריליים. נוחות בעלי החיים והחלמתם הם משתנים קריטיים לביצוע תקין של הליך זה.

modeling-spontaneous-metastatic-renal-cell-carcinoma-mrcc-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

שתי טכניקות שניתן להשתמש בהם כדי לבסס את המודל הזה: הזרקה של השעיה תא סרטני בקיר cecal או השתלה של פיסת גידול תת עורי על cecum. מודל זה שימושי לחקר התפתחות טבעית של סרטן המעי הגס בדיקות סוכני טיפולית חדשה נגד סרטן המעי הגס.

עכבר דגם orthotopic של סרטן המעי הגס

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול לביסוס מודל עכבר גרורות ספונטני של קסנוגרפטים או PDX שמקורם בסרטן המעי הגס. מודלים אלה של xenograft מחקים חלקית את המאפיינים של קרצינומה אנושית ומבינים את ההיבטים הקריטיים של ממאירויות אנושיות, כולל פלישה וגרורות.

מודלים ספונטניים של גרורות בעכבר: פלטפורמה לחקר הפוטנציאל הגרורתי של תאי סרטן המעי הגס בהזרקה אורתוטופית

בסרטון זה אנו מפתחים מודל עכברי אורתוטופי של קרצינומה של תאי כליה. מודל זה מביא לגידולים ראשוניים הניתנים לשחזור בכליה המוזרקת ולגידולים גרורתיים בריאה, ומאפשר הערכה של התקדמות המחלה והטיפול.

יצירת מודל קרצינומה של תאי כליה: פרוטוקול לפיתוח מודל RCC מורין אורתוטופי על ידי השתלה תוך כלייתית של תאים סרטניים

מודל orthotopic זה של סרטן הערמונית אנושי מאפשר כימות של גודל גידול, תאים סרטניים במחזור, והיווצרות של גרורות שונות לריאות. ככל שתאים חייבים לברוח האיבר העיקרי, להזין את זרם הדם, ולהשתיל לאתר משניים, מודל זה ביעילות משחזר את התרחיש בבני אדם.

מודל Murine orthotopic של אדם סרטן ערמונית גרורה

מודל גידול ראשוני orthotopic סרטן השד סר כירורגית של גידול ראשוני כדי להאריך את חיי עכבר כדי ליצור גרורות ספונטניות מתוארים. גידול הגידול ולהתפתחותו מנוטר לכמת ידי דימות פלואורסצנטי בלוציפראז.

במודל עכבר orthotopic של שד ספונטני סרטן גרור

סרטן הערמונית הוא הגורם השני בשכיחותו למקרי מוות הקשורים לסרטן בארצות הברית. מודל סרטן אורתוטופי מספק גישה שימושית להבנת הביולוגיה של סרטן הערמונית ולהערכת היעילות של משטרי טיפול. פרוטוקול זה מתאר את השלבים המפורטים הדרושים להקמת מודל עכבר אורתוטופי לסרטן הערמונית.

דגם Murine Orthotopic פרה-קליני של סרטן ערמונית האדם

יישום מודל orthotopic של קרצינומה של תאי כליה בעכברים עם מערכת חיסון תקינים מקנה החוקר מערכת קלינית רלוונטית המוגדרת על ידי הנוכחות של גרורות גידול ריאות כליות עיקריות באותה החיה. מערכת זו יכולה לשמש כדי preclinically לבדוק מגוון של טיפולים in vivo.

קרצינומה תא syngeneic עכבר הדגם של גרורתי כליות עבור הערכה כמותית אורך ורוחב של טיפולים פרה-קליניים

אנחנו מציגים את orthotopic מאתר השד סרטן ומודל כריתה רדיקלית בטכנולוגיה ביולומינסנציה לכמת את נטל הגידול לחקות התקדמות סרטן השד אנושי.

יצירת מודל של סרטן שד גרורתי Orthotopic מאתר וביצוע מאתר כריתה רדיקלית

פרוטוקול זה מתאר את הדור של החולה הנגזר הנושא מודלים מבע על ידי פנים-ומבחינה משפטית הקניית תאים קרצינומה של תא ברמה גבוהה urothelial או פנים-rectally הזרקת תאים סרטניים המעי הגס לתוך סוכרת שמנים/חמור משולב כשל חיסוני (הנהון/SCID) עכברים לגידול הגידול הראשוני גרורות מתחת להשפעה של תאים סטרומה בצומת הלימפה, אשר מחקה את ההתקדמות של מחלות גרורתית האדם.

מטופל-נגזר אורתוטופית מודלים של תאים האדם Urothelial קרצינומה של סרטן המעי הגס ואת הגידול גרורות ספונטנית

אנו מתארים בפירוט קלינית המעי הגס הרלבנטי סרטן הכבד גרורות (CRLM) הגידול מודל ההשפעה של איסכמיה של הכבד reperfusion (I/R) גידול גרורות. מודל זה יכול לעזור להבין טוב יותר את המנגנונים בבסיס קידום הניתוח המושרה של צמיחה גרורתית הכבד.

מודל מורנה של גידולים גרורות בכבד בהגדרה של איסכמיה Reperfusion פציעה

ברור גרורות תא כליות קרצינומה של תאים היא מחלה ללא מודל בעל חיים כולל לחקירה יסודית מראש. פרוטוקול זה ממחיש שני מודלים של בעלי חיים חדשניים עבור המחלה: מודל העכבר המושתל אורתולמריחה ומודל ממברנה של עוף כוראלואלי, שניהם הפגינו גרורות בריאות הדומה למקרים קליניים.

השוואת הכליה גרורות תא כליות קרצינומה של תא מודל הוקמה בתוך כליה העכבר על עוף כוראולאלי ממברנה

למדו ליצור מודל ספונטני של קרצינומה גרורתית של תאי כליות בעכברים באמצעות השתלה אורתוטופית ונפרקטומיה. פרוטוקול זה מאפשר הערכה סטנדרטית של יעילות טיפולים ניסיוניים במחקר אונקולוגי.

Nephrectomy דוגמנות קרצינומה ספונטני גרורתי של תאי כליות (mRCC) בעכברים בעקבות

גלה סרטונים נוספים