Name: הביולוגי קטליזה חמה: Isothermal טיטרציה Calorimetry לאפיין תגובות אנזימטיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-04T13:45:00.000+00:00
Duration: 13 min
Description: למדו כיצד להשתמש בקלורימטריית טיטרציה איזותרמית (ITC) לאפיון תגובות אנזימטיות. השיטה מאפשרת קביעת פרמטרים קינטיים כמו kcat ו-Km ללא צורך בסימון, באמצעות מדידת זרימת חום בתגובות אנזימטיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

התמחות מוצרי חברת דשנים (SFP) הוא הודה למתן את הכספים הדרושים למחקר זה.

1. דוגמאות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין 2 מיליליטר של תמיסת אנזים ו0.5 מיליליטר של תמיסת מצע עבור כל ניסיון ריצה. לדלל פתרונות מניות מרוכזים של אנזים ומצע בפתרונות חיץ שהרכב זהה ללמזער את החום של דילול וערבוב בתוספת המצע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את תנאי חיץ שמספיקים כדי למנוע שינוי pH במהלך ניסוי. לדוגמא, 20 pH HEPES מ&quot;מ 7 הוא נאות למדידות ב-pH הניטרלי. הערה: אם חילופי פרוטון הוא מעורבים, enthalpies protonation של המאגרים בשימוש יש לקחת בחשבון, כי הם משפיעים על ΔH הנמדד של התגובה. השפעות ספציפיות אפשריות של החיץ או מולקולות תוספים על המערכת תחת ניתוח חייבת להילקח בחשבון. אם ממסים אורגניים (למשל DMSO) נכללים בפתרון האנזים, להוסיף אותם בדיוק באותו הריכוז לתוך תמיסת המצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך ניסוי M1, להתחילעם ריכוז אנזים בטווח ננומטר (למשל 1 ננומטר) ועם ריכוז מצע גבוה יותר לפחות שלושה סדרי גודל מריכוז האנזים ומעל K M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך ניסוי M2, להתחיל עם ריכוז אנזים בטווח PM-ננומטר (למשל 15 PM). ריכוז מצע במזרק הוא בטווח מ&quot;מ (למשל 400 מ&quot;מ). הערה: בניסוי M1 זריקה אחת, ריכוזים צריכים להיות מספיק כדי להשיג את המרת המצע הכוללת לתוך המוצר לאורך זמן הניסוי. לכן, הריכוז של האנזים תלוי בשיעור האנזים: אם אנזימים עם k חתול נמוך נמצאים תחת מחקר, ריכוזים גבוהים יותר אנזים (עד 10 מיקרומטר) חייבים להיות בשימוש. מצד השני, ריכוזי אנזים המשמשים בניסוי M2 חייבים להבטיח כי המצע שהוחדר הוא שולי בלבד (פחות מ -5%) צרך וכי תגובת האנזים ממשיכה במצב היציב. מסיבה זו, גבוהה יותריעילות אנזים, נמוך יותר ריכוז האנזים הנדרש. בסוף הניסוי, ריכוז מצע בתא המדגם צריך להיות גבוה יותר מאשר K M. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבדוק היטב אנזים וריכוזי מצע עם הליך מתאים אנליטיים (למשל הספיגה ב 280 ננומטר, מבחני 11 colorimetric, BCA. זה נדרש כדי לקבל חישוב מדויק ומהימן של הפרמטרים תרמודינמיים וקינטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את ה-pH של הפתרונות ולוודא שחוסר ההתאמה ה-pH של שני אנזימים ואת פתרונות שהמצע הוא מינימאלית בתנאי הניסוי (± 0.05 יחידות pH). </li></ol> 2. ביצוע הניסוי הערה: באותו ההליך חייב להיות מיושם גם עבור M1 ו-M2 הניסוי, המבוצעים אחד אחרי השני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהתא המדגם ומזרק ההזרקה ניקו על פי היצרן שלהוראות. מלא את מזרק הטעינה מסופק עם המכשיר במים מזוקקים, בעדינות להכניס את המחט בתא המדגם, למלא את התא ולהסיר את הנוזל תוך שימוש באותו המזרק. באמצעות שיטה זו, לשטוף את התא המדגם פעמיים עם מים מזוקקים ופעמים עם החיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את התא המדגם עם 2 מיליליטר של תמיסת אנזים באמצעות מזרק הטעינה, הימנעות היווצרות של בועות אוויר בזהירות. לאט לאט להזריק את הפתרון לתוך התא עד שנשפך החוצה העליון של תאי הגזע. לייצר פרץ של CA. 0.25 מיליליטר של תמיסה אל תוך התא. חזור על פעולה פעמיים. צעד זה מסיר בועות אוויר שנלכדו בתא המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המחט של מזרק הטעינה על המדף בין תאי הגזע ונמל התא ולהסיר כל פתרון עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תכנית VP-Viewer ו, מממשק המחשב, לאזן את מכשיר ITC לטמפרטורת 3 מעלות צלזיוס מתחת לטמפרטורת הניסוי הרצויה. זה נדרש כדי למנוע איזון ארוךתקופות שלפני הניסוי, בשל מכשיר קירור אינסטרומנטלי הפסיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את תא ההתייחסות עם מים מזוקקים עם אותו ההליך מתואר לעיל. כאשר מאגרים עם כוח היוני גבוה או גבוהים osmolality נמצאים בפתרון לדוגמא, יש להשתמש באותו החיץ כפתרון התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קישור מזרק פלסטיק לנמל המילוי של מזרק ההזרקה, באמצעות צינור סיליקון דק. מלא את המזרק להזרקת הצבת קצה המחט לתוך מים ועריכה, עד שמים שיוצאים מנמל המילוי העליון, המציינים את המזרק להזרקה הוא מלא. לאחר מכן להעביר את קצה המזרק ממים ולמשוך את אוויר, לרוקן את המזרק להזרקה. עם הליך זה, לשטוף את המזרק להזרקה עם חיץ, ולצייר באוויר דרך המערכת. בהמשך לכך, הנח את מחט הזריקה בצינור צר המכיל 0.5 מיליליטר של תמיסת מצע, בזהירות להכין ולמלא את המזרק להזרקה לחלוטין, ומשאיר כמות קטנה של פתרון בחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מממשק מחשב, &quot;נמל לסגור מילוי&quot; לעיתונות. הסר את צינור טעינת סיליקון. &quot;טיהור ולמלא&quot; לחץ על לחצן כדי לאפשר את המזרק להזרקה כדי לסלק בועות אוויר ולגרש אותם בחזרה לפתרון בתפזורת. חזור על פעולה פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את מזרק ההזרקה, לנגב בצדדים כדי להסיר טיפות שום ומניח את המחט של מזרק ההזרקה לתוך התא המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במחשב, להגדיר את הפרמטרים הריצה המתאימים. יכולים להיות מצויינים האנזים הניסיוני וריכוזי מצע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסוי M1, לקבוע לפחות שתי תוספות (5-30 μl) של מצע כדי לאמת את שחזור. קבע את הזמן המרווח בין כל הזרקה (למשל 1,000 שניות) גדולות מספיק כדי להבטיח כי תשואות אות חום לנקודת ההתחלה לפני התוספת הבאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסוי M2, להגדיר מספר (למשל 15 x 5-10 μl) זריקות. הגדר את המרווח בין הזריקות (למשל 180 שניות) המאפשרות למערכת של לtabilize כוח התרמיות לנקודת ההתחלה החדשה אחרי כל זריקה. הערה: בפעם המרווח בין זריקות בניסוי M2 צריכה להיות קצרה מספיק כדי למנוע את ההמרה של כמות משמעותית של מצע, המאפשר מדידות שיש לבצע בתנאי מצב יציבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסוי M2, השתמשו בנפחים קטנים (למשל 2 μl) לזריקה הראשונה, שמקבילה ערך נמחק במהלך ניתוח נתונים שלאחר מכן. אכן, לעתים קרובות מציג חפצים בשל דיפוזיה המצע הראשונית ועד קצה המזרק, ואת קיומו של בועות אוויר שנלכדו במחט המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את כוח ההתייחסות, ברמה המשוערת שבו הבסיס יוצב לפני התגובה מתחילה, לפי שווי של 20. ואז להגדיר את האנזים הניסויי וריכוזי מצע ובחר שם עבור הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הטמפרטורה הניסיונית, בדרך כלל ב25 ° C. ITC מאפשר טמפרטורות עבודה בין 2<html> מעלות צלזיוס ו80 ° C. הניסוי הוא מוכן להפעלה. לחץ על לחצן &quot;התחל&quot; כדי להתחיל את הניסוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהניסוי הסתיים, לנקות את התא המדגם והמזרק בהתאם להוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הניסוי לפחות אחד או שתיים יותר פעמים כדי לבדוק את שחזור של נתונים. </li></ol> 3. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניתוח התכנית, לחץ על הכפתור &quot;קראו נתונים&quot;, ולנווט לתיקייה שבה קובץ ITC. של הניסוי שבוצע M2 ממוקם. לחץ על החץ למטה גלילה של &quot;הקבצים מסוג&quot; ובחר &quot;האנזים Assay (זה?)&quot;. בהמשך לכך, לחץ ולפתוח את קובץ ITC. של ניסוי M2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את ΔH של התגובה משילוב העקומה של ניסוי M1 פי משוואה 5. &quot;Width =&quot; 126 &quot;/&gt; (5) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור &quot;קראו נתונים&quot;, ובחר את הקובץ. ITC של ניסוי M1 שבוצע. שימוש במקור, לחלק את העקבות בחלקים שונים המכילים שיא אחד אחד ולשמור כל שיא כקובץ opj.. פתח את הקובץ המתאים לשיא הראשון, וכתוצאה מסטייה בסיסית בthermogram של הניסוי הבודד הזרקת M1, לשלב אותו ולחלק את ערך השטח שהושג, באו לידי ביטוי בμcal, על ידי ריכוז המצע הסופי בתא המדגם, המתבטא במיקרומטר, ועל ידי נפח התא מתבטא בליטרים, קביעה, על פי משוואה 5, ΔH של התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על אותו ההליך לשיא השני של ניסוי M1 ולקבל ערך ממוצע עבור שתי מדידות ΔH. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע DQ / dt מניסוי M2 מדידת ההבדל בין הבסיס המקורי והבסיס החדש לאחר כל זריקה. להמיר את הדוארנתוני xperimental לשיעורי תגובה לפי משוואת 4, באמצעות ערך אנתלפיה שהושג בניסוי M1 ולהתאים את הנתונים למשוואת מיכאליס-מנטן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניתוח התכנית, לחץ על הכפתור &quot;קראו נתונים&quot;, ובחר את הקובץ. ITC של ניסוי M2 שבוצע. לחץ על החץ למטה גלילה של &quot;הקבצים מסוג&quot; ובחר &quot;האנזים Assay (זה?)&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיבת הדו שיח האנזים Assay נפתחה, המאפשרת בחירה באחת מארבעת הדגמים. בחר &quot;שיטה 2 - מצע רק&quot; מהחלון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלון ΔH, כדי להצביע על שווי ΔH שהושג בשלב 4.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצן &quot;ריכוז&quot; כדי לבדוק את ערכי הריכוז כדי לשמש בהליך המתאים. לחץ על הכפתור &quot;זמן הממוצע (P)&quot;. תיבת שיח נפתחת נותנת ההזדמנות לשנות או לקבל את ערך ברירת המחדל. ערך זה מייצג את הזמן לפני כל להזריקיון שבממוצעי מכשיר אות הכוח לקבוע את רמת הכוח בכל ריכוז מצע. לחץ על אישור כדי לאשר את ערך ברירת המחדל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הלחצן &quot;אפס Y הציר&quot;. הסמן הופך לשיער צולב המאפשר להכפיל לחץ על נקודה, למקום בy = 0. לחץ לחיצה כפולה ממש לפני נקודת הזריקה הראשונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצן לחשב את השיעור. שיעור הוא להתוות לעומת ריכוז המצע, נגזר על ידי חלוקת המצע הוסיף במהלך טיטרציה למדגם נפח התא (תוך לקיחה בחשבון השפעות דילול). פעולה זו מעניקה לעלילת מיכאליס-מנטן טיפוסי שיכול להיות מצוידת כדי להשיג K M ו-k חתול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש למחוק כמה נקודות, בחר בלחצן &quot;חתוכים נתונים&quot;. הזז את סמני נתונים להוציא נקודות נתונים רעות ולחץ לחיצה כפולה על אחד מהסמנים או לחצו על Enter. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפונקצית &quot;התאמה למודל&quot; כדי להתאים את העקומה וללהשיג קבועים קינטית. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Leavitt, S., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+protein+binding+energetics+by+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 560-566 (2001).</li>
<li>Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+isothermal+titration+calorimetry+in+the+biological+sciences%3A+things+are+heating+up%21+BioTechniques%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Application of isothermal titration calorimetry in the biological sciences: things are heating up! BioTechniques.</a> 37, 885-887 (2004).</li>
<li>Zambelli, B., Bellucci, M., Danielli, A., Scarlato, V., Ciurli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ni2%2B+binding+properties+of+Helicobacter+pylori+NikR%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">The Ni2+ binding properties of Helicobacter pylori NikR.</a> Chem. Commun. , 3649-3651 (2007).</li>
<li>Zambelli, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+Ni2%2B+binding+selectively+promotes+binding+of+Helicobacter+pylori+NikR+to+its+target+urease+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-affinity Ni2+ binding selectively promotes binding of Helicobacter pylori NikR to its target urease promoter.</a> J. Mol. Biol. 383, 1129-1143 (2008).</li>
<li>Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+for+measuring+macromolecule-ligand+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+isothermal+titration+calorimetry+in+pure+and+applied+research--survey+of+the+literature+from+2010%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010.</a> J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).</li>
<li>Todd, M. J., Gomez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+kinetics+determined+using+calorimetry%3A+a+general+assay+for+enzyme+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Enzyme kinetics determined using calorimetry: a general assay for enzyme activity.</a> Anal. Biochem. 296, 179-187 (2001).</li>
<li>Bianconi, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorimetry+of+enzyme-catalyzed+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Calorimetry of enzyme-catalyzed reactions.</a> Biophys. Chem. 126, 59-64 (2007).</li>
<li>Demarse, N. A., Killian, M. C., Hansen, L. D., Quinn, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+enzyme+kinetics+via+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Determining enzyme kinetics via isothermal titration calorimetry.</a> Methods Mol. Biol. 978, 21-30 (2013).</li>
<li>Michaelis, L., Menten, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Die+kinetik+der+invertinwirkung%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Z%22%5BJournal%5D)">Die kinetik der invertinwirkung.</a> Biochem. Z. 49, 333-369 (1913).</li>
<li>Walker, J. Principle and techniques of practical biochemistry. Wilson, K., Walker, J. , Cambridge University Press. 312-356 (2000).</li>
<li>Ciurli, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCiurli%2C+S+%22Nickel+and+its+surprising+impact+in+nature%22">Nickel and its surprising impact in nature</a>. Sigel, A., Sigel, H., Sigel, R. K. O. 2, John Wiley & Sons. 241-278 (2007).</li>
<li>Zambelli, B., Musiani, F., Benini, S., Ciurli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+of+Ni2%2B+in+urease%3A+sensing%2C+trafficking%2C+and+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Chemistry of Ni2+ in urease: sensing, trafficking, and catalysis.</a> Acc. Chem. Res. 44, 520-530 (2011).</li>
<li>Zonia, L. E., Stebbins, N. E., Polacco, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+urease+in+germination+of+nitrogen-limited+Arabidopsis+thaliana+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Essential role of urease in germination of nitrogen-limited Arabidopsis thaliana seeds.</a> Plant Physiol. 107, 1097-1103 (1995).</li>
<li>Follmer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+role+and+structure+of+plant+ureases%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Insights into the role and structure of plant ureases.</a> Phytochemistry. 69, 18-28 (2008).</li>
<li>Sumner, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+crystallization+of+the+enzyme+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The isolation and crystallization of the enzyme urease.</a> J. Biol. Chem. 69, 435-441 (1926).</li>
<li>Krajewska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ureases+I.+Functional%2C+catalytic+and+kinetic+properties%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cat.+B%22%5BJournal%5D)">Ureases I. Functional, catalytic and kinetic properties: A review.</a> J. Mol. Cat. B. 59, 9-21 (2009).</li>
<li>Callahan, B. P., Yuan, Y., Wolfenden, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+burden+borne+by+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">The burden borne by urease.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 10828-10829 (2005).</li>
<li>Krajewska, B., van Eldik, R., Brindell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-+and+pressure-dependent+stopped-flow+kinetic+studies+of+jack+bean+urease.+Implications+for+the+catalytic+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Inorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">Temperature- and pressure-dependent stopped-flow kinetic studies of jack bean urease. Implications for the catalytic mechanism.</a> J. Biol. Inorg. Chem. 17, 1123-1134 (2012).</li>
<li>Hausinger, R. P., Karplus, P. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHausinger%2C+RP+%22Handbook+of+Metalloproteins%22">Handbook of Metalloproteins</a>. Huber, R., Poulos, T., Wieghardt, K. , John Wiley & Sons. 867-879 (2001).</li>
<li>Goldberg, R., Kishore, N., Lennen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+quantities+for+the+ionization+reactions+of+buffers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+Ref.+Data%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic quantities for the ionization reactions of buffers.</a> J. Phys. Chem. Ref. Data. 31, 231-370 (2002).</li>
<li>Baumann, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+isothermal+titration+calorimetry+for+xylanase+kinetics+in+comparison+to+chemical-reducing-end+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Advantages of isothermal titration calorimetry for xylanase kinetics in comparison to chemical-reducing-end assays.</a> Anal. Biochem. 410, 19-26 (2011).</li>
<li>Noske, R., Cornelius, F., Clarke, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+enzymatic+activity+of+the+Na%2B%2CK%2B-ATPase+via+isothermal+titration+microcalorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Investigation of the enzymatic activity of the Na+,K+-ATPase via isothermal titration microcalorimetry.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1797, 1540-1545 (2010).</li>
<li>Harmon, K. M., Niemann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+competitive+inhibition+of+the+urease-catalyzed+hydrolysis+of+urea+by+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The competitive inhibition of the urease-catalyzed hydrolysis of urea by phosphate.</a> J. Biol. Chem. 177, 601-605 (1949).</li>
<li>Benini, S., Rypniewski, W. R., Wilson, K. S., Ciurli, S., Mangani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+rationalization+of+urease+inhibition+by+phosphate%3A+novel+insights+into+the+enzyme+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Inorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure-based rationalization of urease inhibition by phosphate: novel insights into the enzyme mechanism.</a> J. Biol. Inorg. Chem. 6, 778-790 (2001).</li>
<li>Segel, I. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSegel%2C+IH+%22Enzyme+kinetics%3A+behavior+and+analysis+of+rapid+equilibrium+and+steady-state+enzyme+systems%22">Enzyme kinetics: behavior and analysis of rapid equilibrium and steady-state enzyme systems</a>. , Wiley, NY. (1993).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

משמעות של ITC ללמוד פעילות האנזימטית ביחס לשיטות קיימות בנוסף ליישומים הקלאסיים שלה ללמוד שיווי משקל מחייב, calorimetry טיטרציה בידוד התרמי מספק שיטה מהירה ואמינה לאפיון תגובות אנזימטיות בפתרון באמצעות החום של תגובה כמו בדיקה, ללא צורך בשינוי מערכת או תיוג. הפרמטרים הקינטית k חתול וK M מתקבלים בדרך כלל באמצעות סדרה של ניסויים כמובן זמן, שבו היווצרות של המוצר (או צרי...

קביעת כמותית של תגובות ביוכימיות מספקת תובנות לגבי התהליכים הביולוגיים העומדת בבסיס של חיים. Calorimetry מציע מתודולוגיה ללא תווית לאפיין כמעט בכל תגובה כימית בפתרון כמותית. טכניקה זו מודדת את החום שמשתחרר או נספג לאורך זמן, ולכן מערכת זיהוי אוניברסלית ומתודולוגיה נוחה מאוד לכמת את כמות המולקולות מגיבים (כלומר תרמודינמיקה מחייבת), כמו גם על מנת למדוד את קצב התגובה (כלומר קינטיקה). בפרט, calorimetry טיטרציה בידוד התרמי (ITC) כבר אימץ כשיטת בחירה לאפיין את התרמודינאמיקה של שיווי משקל biomolecular, הכולל חלבון ליגנד, חלבונים, יוני חלבון מתכת ואינטראקציות החלבון-DNA 1-6. בנוסף, היכולת של ITC לספק מידע הקינטית הופכת אותו למערכת חזקה מאוד למדוד קטליזה אנזים, למרות שהפוטנציאל של יישום זה הוא עדייןלזלזל 7-9. משוואת מיכאליס מנטן-10 היא תיאור כמותי של תגובות אנזימטיות, כפי שהוא מספק קשר בין קצב התגובה וריכוז המצע, תלוי בשני פרמטרים הקינטית: קבוע מיכאליס (K M) ושיעור קבוע קטליטי (k חתול) . K החתול / יחס K M הוא כאמור את היעילות הקטליטית של אנזים. בפועל, קביעת K M ו-k חתול לתגובה ספציפית מספק תיאור של קטליזה מלאה. בתגובה האנזימטית טיפוסית (איור 1), מצע (S) אינטראקציה עם האנזים (E) ויוצר מורכבות אנזים-מצע (ES), שמופעל בהמשך למצב המעבר (ES *). זה האחרון הופך למורכב אנזים תוצר הלוואי (EP) שסופו של הדבר dissociates. צעד הבאיםים מתוארים על ידי התגובה הבאה. <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq1.jpg" width="197" /> (1) כאשר k 1 הוא השיעור קבוע להקמת קומפלקס ES, k -1 הוא שיעור קבוע לדיסוציאציה של קומפלקס ES, בעוד k החתול הוא שיעור קבוע קטליטי או מספר מחזור. לפי משוואת מיכאליס מנטן-10, שיעור התגובה יכול להיות מחושב כ: <img fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq2.jpg" width="144" /> (2) שבו חתול K = M (k -1 + K חתול) / k 1 ו-k = מקסימום v / [E], עם מקסימום v להיות המהירות המקסימלי הגיעה כאשר כל האנזים קשור למצע. Calorimeter טיטרציה הבידוד התרמית היא הכלי המשמש במחקר זה כדי לאפיין את הידרוליזה אנזימטית של אוריאה. מכשיר זה עשוי ממגן adiabatic המכיל שני תאים בצורת שטבע (איור 1). אלה מחוברים לחלק החיצוני עם צינורות גישה צרים. התא המדגם (בערך 1.4 מיליליטר) טעון עם פתרון האנזים, ואילו תא ההתייחסות הוא בדרך כלל מלא במים או בממסים המשמשים לניתוח. מזרק מסתובב עם מחט ארוכה והנעת מערבבים המצורפות, המכיל בדרך כלל CA. 0.3 מיליליטר של תמיסת מצע, הוא רכוב על התא המדגם. מכשיר תרמואלקטרי מודד את ההבדל בטמפרטורה בין המדגם ותא ההתייחסות ו, באמצעות &quot;רשת משוב סלולרי&quot;, הוא שומר על ההבדל הזה באפס על ידי הוספה או הפחתת חום. במהלך הניסוי, המצע מוזרק לתוך תמיסת האנזים בטמפרטורה שנבחרה קבועה. כאשר enתגובת zymatic מתרחשת, כמות החום שמשתחררת או נספגת היא פרופורציונלית למספר מולקולות מצע, שהומרו למולקולות מוצר. בנוסף, שיעור זרימת חום קשור באופן ישיר לשיעור של התגובה. נתונים שנמדדו, המופיע כסטייה של עקבות חום מנקודת ההתחלה ראשונית (איור 1), מייצגים את כוח התרמיות (μcal / sec) המסופק על ידי המכשיר הסלולרי המדגם, שהוא פרופורציונאלי לזרימת החום המתרחשת בתא המדגם לאורך זמן. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51487/51487fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. ייצוג סכמטי של calorimeter טיטרציה בידוד התרמית ללמוד תגובות אנזימטיות. תגובה האנזימטית מתרחשת על טיטרציה של המצע (במזרק להזרקה) לתוך תמיסת האנזים (בתא המדגם) גורם לשינוי של יסכוח mal שפורסם על ידי calorimeter, דרוש כדי לשמור על הפער של טמפרטורה בין תא דגימה וקבוע תא התייחסות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51487/51487fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> בסך הכל, השינוי בחום (Q) הוא פרופורציונאלי לאנתלפיה הטוחנות של התגובה (ΔH) ומספר השומות של מוצר שנוצר (n), אשר בתורו ניתן על ידי בסך הכל הפעמים נפח הריכוז: <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq3.jpg" width="200" /> (3) היווצרות המוצר לאורך זמן (DP / DT), אשר תואם את קצב התגובה, ולכן יכול להיות קשור לכמות החום שנוצר על אותו הזמן (DQ / dt) דרך היחס: <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq4.jpg" width="150" /> (4) על פי משוואה זו, על מנת לקבל מיכאליס-מנטן עלילה יש צורך למדוד i) סך ΔH אנתלפיה טוחנת, וii) את זרימת DQ / dt החום בריכוזים מצע שונים. בדרך כלל, זה מתבצע בשני ניסויים שונים: בניסוי הראשון (שיטת 1, M1), המצע מוזרק לתוך תמיסת האנזים והחום לגיור מצע שלם נמדד; בניסוי השני (השיטה 2, M2), זריקות מרובות של מצע מבוצעות וקצב ייצור חום נמדד בריכוזים מצע שונים. שתי מערכות אלו של נתונים מספיקות כדי לגזור את הפרמטרים הקינטית K M ו-k חתול. במאמר הנוכחי, פרוטוקול כללי כדי לקבוע את הפרמטרים הקינטית לתגובות אנזימטיות בוצעו באמצעות ITC מתואר. אנחנו יישמנו את השיטה להידרוליזה אוריאה על ידי האוריאה ensiformis Canavaliase, כמערכת התייחסות. ההסכם הטוב בין התוצאות שהתקבלו בשיטה זו ונתונים שדווחו בספרות מדגים את האמינות של גישה זו.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>מתמוסס במים והתאמת pH עם NaOH</td></tr><tr><td>TRIZMA-Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>נמס במים והתאמת pH עם HCl</td></tr><tr><td>נתרן דימימן פוספט</td><td>Riedel-de-Haen</td><td>4270</td><td>מתמוסס במים</td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי</td><td>Riedel-de-Haen</td><td>30427</td><td>מומס במים</td></tr><tr><td>אוריאה</td><td>Sigma</td><td>U4128</td><td>מתמוסס במים ב-40 מעלות; C</td></tr><tr><td>Canavalia ensiformis אוראז (סוג C-3)</td><td>Sigma</td><td>U0251</td><td>מתמוסס ב-20 מ"מ HEPES pH 7 ומאוחסן ב-80 מעלות; C</td></tr><tr><td>VP-ITC on Origin 7.0</td><td>MicroCal (GE Healthcare)SYS13901</td><td></td> <td>מכשיר&nbsp;</td></tr><tr><td>VPViewer2000 1.30.00 בתוכנת רכישת הנתונים Origin 7.0</td><td>MicroCal (GE Healthcare)</td><td></td> <td>המסופקת עם המכשיר</td></tr></tbody></table>

הביולוגי קטליזה חמה: isothermal טיטרציה calorimetry לאפיין תגובות אנזימטיות

Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions

<html> calorimetry טיטרציה Isothermal (ITC) הוא טכניקה שתוארה היטב שמודדת את החום שמשתחרר או נספג במהלך תגובה כימית, שימוש בו כבדיקה פנימית כדי לאפיין כמעט כל תהליך כימי. כיום, טכניקה זו מיושמת באופן נרחב כדי לקבוע פרמטרים תרמודינמיים של שיווי משקל מחייב biomolecular. בנוסף, ITC הודגם להיות מסוגל ישירות מדידת קינטיקה ופרמטרים תרמודינמיים (k חתול, K M, ΔH) של תגובות אנזימטיות, למרות שהיישום הזה הוא עדיין underexploited. כמו שינויים בחום באופן ספונטני להתרחש במהלך קטליזה האנזימטית, ITC אינו דורש כל שינוי או תיוג של המערכת תחת ניתוח וניתן לבצעו בתמיסה. יתר על כן, השיטה זקוקה לכמות קטנה של חומר. תכונות אלו הופכות את ITC כלי רב ערך, רב עוצמה והייחודית ללמוד קינטיקה אנזים במספר יישומים, כגון, למשל, גילוי תרופות. ילדה = &quot;jove_content&quot;&gt; בעבודה זו שיטה המבוססת על ITC ניסיוני לכמת קינטיקה ותרמודינאמיקה של תגובות אנזימטיות מתוארת ביסודיות. שיטה זו מיושמת על מנת לקבוע k חתול וK M של הידרוליזה אנזימטית של אוריאה על ידי ensiformis Canavalia urease (שעועית שקע). חישוב של אנתלפיה הפנימית טוחנת (int ΔH) של התגובה מתבצע. הערכים וכך השיגו עולים בקנה אחד עם נתונים קודמים שדווחו בספרות, הוכיחו את האמינות של המתודולוגיה.

Urease (EC 3.5.1.5; amidohydrolase אוריאה) הוא אנזים המכיל ניקל multisubunit מצא בarchea, חיידקים, אאוקריוטים וצמחים חד תאיים. מעשי חלבון זה בשלב האחרון של מינרליזציה חנקן האורגנית, מזרזות הידרוליזה של אוריאה לאמוניה וcarbamate, אשר מתפרק באופן ספונטני לתת מולקולה שנייה של אמוניה וביקרבונט (משוואה 6) 12. <img fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq6.jpg" width="450" ...

זרימת חום אמצעי calorimetry טיטרציה Isothermal שוחררה או נספגת בתגובות כימיות. בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לכמת אנזים-קטליזה. במאמר זה, הפרוטוקול להתקנה אינסטרומנטלית, ניתוח ניסוי ריצה, ונתונים מתוארים בדרך כלל, ופנה לאפיון של הידרוליזה אוריאה האנזימטית של urease שעועית שקע.

הביולוגי קטליזה חמה: Isothermal טיטרציה Calorimetry לאפיין תגובות אנזימטיות

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a well-described technique that measures the heat released or absorbed during a chemical reaction, using it as ...

הניסוי הבא מתאר שיטה מהימנה, מהירה ונפקית (label free), המשתמשת בקלורימטריה של טיטול איזותרמית (isothermal titration calorimetry) כדי לקבוע באופן כמותי את התרמודינמיקה והקינטיקה של תגובות אנזימטיות בתמיסה, תוך שימוש בחום המשתחרר והנספג לאורך זמן כגשש פנימי. דבר זה מושג על ידי מתן אפשרות לתגובה האנזימטית להתרחש בתא הדגימה של המכשיר בטמפרטורה קבועה, ומעקב אחר הסטייה של עקומת החום מקו הבסיס הראשוני. בניסוי ראשון הנקרא "שיטה אחת" או M1, התסבס (substrate) מוזרק לתמיסת האנזים, והחום עבור המרה מלאה של התסבס נמדד, דבר המאפשר קביעה של האנתלפיה מולרית כוללת של התגובה.בניסוי שני, הנקרא שיטה שתיים או M2, מבוצעות הזרקות מרובות של התסריט, המאפשרות מדידה של קצב ייצור החום לאורך זמן בריכוזי תסריט שונים. התוצאות שהופקו משני ניסויי הקלורימטריה אפשרו קביעה של הפרמטרים קינטיים, kcat ו-km, בהנחה של קטליזה אנזימטית לפי מודל מייכליס-מנטן. היתרון המרכזי בשימוש בקלורימטריה איזותרמית (ITC) על פני שיטות אחרות, כגון בדיקות פוטו-מטריות העוקבות אחר היווצרות המוצר לאורך זמן, הוא ש-ITC אינה דורשת כל שינוי או סימון של המערכת הנבדקת ודורשת כמות קטנה מאוד של חומר, מכיוון שהיא משתמשת בחום התגובה העצמי כגשש פנימי, מה שמוכיח כי הפרוצדורה תהיה יעילה.סטודנט לדוקטורט מהמעבדה שלנו ראשית מדלל תמיסה רכזת של האנזים עם שני מיליליטר של בופר כדי להגיע לריכוז סופי של האנזים בטווח הננו-מולרי עבור ניסוי M1. לאחר מכן, הוא מוסיף 0.5 מיליליטר של בופר לתמיסה רכזת של הסובסטרט כדי להגיע לריכוז סובסטרט הגבוה בלפחות שלושה סדרי גודל מריכוז האנזים ומעל ה-km. עבור ניסוי M2, הוא מכין תמיסת אנזים בנפח של שני מיליליטר עם ריכוז סופי בטווח הפיקו-מולרי עד הננו-מולרי.דללו את התסבס (substrate) עם 0.5 milliliters של בופר כדי להגיע לריכוז תסבס בטווח המילימולרי. לאחר וידוא שתא הדגימה ומזרק ההזרקה נקיים בהתאם להוראות היצרן, מלאו את מזרק הטעינה במים מזוקקים. לאחר מכן, הכניסו בעדינות את המחט לתא הדגימה, מלאו את התא והוציאו את הנוזל באמצעות השיטה שתיארה קודם לכן, שטפו את תא הדגימה פעמיים עם מים מזוקקים ופעמיים עם בופר.הזריקו באיטיות את תמיסת האנזים אל תוך התא עד שהיא תגלוש מהחלק העליון של גבעול התא. כדי להסיר בועות אוויר שנלכדו בתא הדגימה, הניקו בזרם מהיר כ-0.25 milliliters של תמיסה אל תוך התא. חזרו על פעולת הניקוּב פעמיים נוספות.הניחו את מחט מזרק הטעינה על השוליים שבין גוף התא לפתח התא, והסירו כל תמיסה עודפת. הפעילו את תוכנת VP viewer והביאו את מכשיר ה-ITC לשיווי משקל בטמפרטורה הנמוכה בשלוש מעלות צלזיוס מהטמפרטורה הרצויה לניסוי. לאחר מילוי תא הייחוס במים מזוקקים באופן דומה כפי שבוצע קודם לכן, חברו מזרק פלסטיק לפתח המילוי של מזרק ההזרקה באמצעות צינור סיליקון דק, הניחו את קצה מזרק ההזרקה בתוך מים ומלאו את המזרק עד שיצאו מים מפתח המילוי העליון, דבר המעיד על כך שמזרק ההזרקה מלא.לאחר מכן, הוציאו את קצה המזרק מהמים ושאבו אוויר כדי לרוקן את מזרק ההזרקה. באותו הליך, שטפו את מזרק ההזרקה עם בופר ושאבו אוויר דרך המערכת. לאחר מכן, הניחו את תמיסת הסובסטרט בתוך מבחנה נקייה וצרה.מקמו אותו מתחת למזרק והחדירו לתוכו את מחט מזרק ההזרקה באופן מלא. מלאו את מזרק ההזרקה באמצעות ממשק המחשב, תוך השארת כמות קטנה של תמיסה בתחתית המבחנה. לחצו על "סגור נמל מילוי" (close fill port).לאחר שצינור טעינת הסיליקון הוסר, לחצו על purge and refill כדי לשחרר בועות אוויר ממזרק ההזרקה ולהוציאן חזרה אל התמיסה הראשית. לאחר מכן, נגבו את דפנות מזרק ההזרקה בנייר סופג כדי להסיר שאריות תמיסה והניחו אותו בתא הדגימה. בניסוי M1, הגדירו לפחות שתי הוספות של 5 עד 30 µL של סובסטרט כדי לוודא את ההדירות.לאחר מכן, קבעו את זמן הרווח בין כל הזרקה באופן שיבטיח שאות החום יחזור לקו הבסיס לפני ההוספה הבאה. בניסוי M two, הגדירו הזרקות מרובות של 5 עד 10 µL. הגדירו את הרווח בין ההזרקות, כך שתאפשרו למערכת לייצב את ההספק התרמי לקו הבסיס החדש לאחר כל הזרקה.בשלב זה, הגדירו את הספק הייחוס ל-20. לאחר מכן, הגדירו את ריכוזי האנזים והסובסטרט הניסיוניים ובחרו שם לניסוי. הגדירו את הטמפרטורה ל-25 degrees Celsius והתחילו את הניסוי.עם סיום הניסוי, נקה את תא הדגימה ואת המזרק בהתאם להוראות היצרן. לאחר פתיחת תוכנת origin 7.0, לחץ על כפתור הפתיחה ובחר את הקובץ המתאים להזרקה הראשונה בעקבה התרמית של ניסוי M1. כדי לקבוע את ה-delta H של התגובה, בצע אינטגרציה של השיא הראשון הנובע מהסטה של קו הבסיס בתרמוגרמה של ההזרקה הבודדת.ניסוי M1. לאחר מכן, חלק את ערך השטח שהתקבל, המייצג את חום התגובה הכולל המבוטא במיקרו-קלוריות, בריכוז הסובסטרט הסופי בתא הדגימה המבוטא במיקרו-מולרי ובנפח תא הדגימה המבוטא בליטר. חזור על אותו הליך עבור הפסגה השנייה של ניסוי M1 והוצא ממוצע לערכים שהתקבלו עבור שתי מדידות ה-delta H; לאחר מכן, קבע את DQ over DT מניסוי M2 על ידי מדידת ההפרש בין קו הבסיס המקורי לקו הבסיס החדש לאחר כל הזרקה.ניתן לבצע זאת על ידי המרת הנתונים הניסיוניים לקצבי תגובה לפי המשוואה הבאה, תוך שימוש בערך האנתלפיה שהתקבל בניסוי M1. לאחר מכן, התאם את הנתונים למשוואת מיכאליס-מנטן (Michaelis-Menten), בפרט באמצעות תוכנת הניתוח.לחצו על כפתור קריאת הנתונים (read data) ונווטו לתיקייה שבה ממוקם ניסוי ה-M two. לאחר מכן, לחצו על חץ הגלילה של סוג הקבצים ובחרו ב-enzyme assay. לאחר מכן, לחצו על הקובץ כדי לפתוח אותו.בצע ITC של ניסוי M two. לאחר שתיבת הדיאלוג של בדיקת האנזים נפתחת, בחר באפשרות "method two substrate only" מהחלון; בחלון ה-delta H ציין את ערך ה-delta H שהתקבל בניסוי M1. לאחר מכן, לחץ על כפתור "zero y axis" ולחץ פעמיים רגע לפני נקודת ההזרקה הראשונה.לחצו על כפתור calculate rate כדי להוציא גרף של הקצב אל מול ריכוז התסביך. לבסוף, השתמשו בפונקציית fit to model כדי להתאימה את העקומה ולהפיק את הקבועים הקינטיים. הפעילות הליטית של cannavale ו-CMIS או JAK bean URIs נבחרה כתגובה מייצגת כדי להדגים את היכולת של ITC לקביעה כמותית של קטליזה אנזימטית.בניסוי M1 נמדד ערך delta H של 10.5- קילו קלוריות למול, וזאת על ידי אינטגרציה של ההספק התרמי הנובע מהזרקת מצע urea לתוך תמיסת urease והמתנה עד להשלמת התגובה. ההספק התרמי שנרשם בניסוי M2 הומר לקצב תגובה באמצעות המשוואה הבאה. התאמה של הנתונים שהתקבלו למשוואת Michaelis-Menten סיפקה את הפרמטרים הקינטיים עבור urease מפוליה של JAK ב-20 millimolar HEPES.pH 7, כאשר kcat שווה ל-30,200 לשנייה, ו-KM שווה ל-3.45 millimolar, במידה העולה בקנה מידה עם נתונים שדווחו בעבר. שינוי החום הכולל שנמדד בניסוי M1 מייצג את סכום כל האירועים המתרחשים במהלך התגובה הנבדקת, והוא תלוי באנתלפיה המולרית של כל התהליכים המעורבים, ולא רק בהמרה של הסובסטרט למוצר. בתהליך גנרי שבו המערכת המגיבה קולטת פרוטונים בתמיסה מובחית, הבופר משחרר פרוטונים ובכך מייצר חום נוסף בתוך תא התגובה.לפיכך, ה-delta H שנמדדה היא ערך גלוי והיא כוללת את ה-delta H הפנימי של התגובה, כמו גם את האנתלפיית היינון של הבופר ואת מספר הפרוטונים המוחלפים, על פי המשוואה המודגשת. באמצעות שימוש במשוואה זו בניסויי M1, ניתן לקבוע את מספר הפרוטונים המוחלפים ואת ה-delta H הפנימי על ידי ביצוע אותו ניסוי בבופרים בעלי אנתלפיית יינון שונה. תגובת הידרוליזת השמיריה הכוללת מובילה לקליטת פרוטון מהבופר.בהתאם לכך, כפי שמתואר לעיל, חום התגובה כולל את התרומה של פרוטונציה של הבאפר. כדי לחשב את הדלתא G המהותית של תגובת ההידרוליזה, בוצעו שלושה ניסויי M1 בבאפרים שונים, המתאפיינים בשלוש אנタルפיות יינון שונות וידועות. ניתן לחשב את האנタルפיה המהותית ואת מספר הפרוטונים השתחררו מהבאפר מהחיתוך ומהשיפוע של ההתאמה הליניארית של הנתונים הניסויים.הם היו 14.7- קילוקלוריות למול ו-0.98 בהתאמה, בהתאמה מלאה לנתונים שדווחו בעבר. יישומי פרוצדורה זו נשירים ממחקר בסיסי למחקר יישומי ולסריקת תרופות, שכן לאחר שנקבעו הקינטיקה של התגובה האנזימטית, ניתן לחזור על הניסוי בנוכחות סוגים וריכוזים שונים של מעכבי אנזימים על מנת לנטר קבועי עיכוב.

hot-biological-catalysis-isothermal-titration-calorimetry-to

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

המרכז לטניס בישראל הוא כלי רב עוצמה ללימוד קשירת ליגנד לארח שלה. במערכות מורכבות עם זאת, מספר דגמים עשוי להתאים את הנתונים באותה מידה. השיטה המתוארת כאן מספק אמצעי על מנת להבהיר את מודל מחייב מתאים מערכות מורכבות לחלץ את פרמטרים תרמודינמיים המקביל.

איסוף משתנה ריכוז מקורר באופן איזוטרמי Calorimetry טיטרציה מערכי נתונים על מנת לקבוע מנגנונים הכבילה

פרוטוקול כללי לשימוש calorimetry טיטרציה מקורר באופן איזוטרמי לפקח על התרמודינמיקה מחייב עבור מערכות ביולוגיות עם זיקות מחייבות מתונה מוצג.

טיטרציה Calorimetry מקורר באופן איזוטרמי עבור מדידת מקרומולקולה-ליגנד זיקה

קח דילולים סדרתיים של תרבית חיידקים והוסף אליקוטים לבקבוקונים קלורימטריים המכילים מצע גידול.טען את הבקבוקונים האטומים לצלחת מרובת הבארות של מיקרוקלורימטר איזותרמי כדי למדוד את ייצור החום המטבולי.המכשיר מוחזק בטמפרטורה קבועה כדי להבטיח שהחום שזוהה מקורו אך ורק בחילוף החומרים של החיידקים.כאשר חיידקים מפרקים חומרים מזינים ומתרבים, הם משחררים חום שחיישנים מזהים בזמן אמת.במקביל, דגרו בקבוקונים זהים באינקובטור. בעזרת ספקטרופוטומטר, מדוד את הצפיפות האופטית (OD) כדי לנטר את צמיחת החיידקים.באמצעות...

מיקרוקלורימטריה איזותרמית לניטור פעילות מטבולית בחיידקים

ערוצים להובלה של מולקולות מים באנזימים להשפיע solvation אתר פעיל וקטליזה. במסמך זה אנו מציגים פרוטוקול להנדסה של מוטיבים אלה נוספים קטליטי המבוססים על מודלים במחשב סיליקון וניסויים. זה ישפר את ההבנה של ההשפעה של דינמיקת ממס על קטליזה אנזימנו.

האצת entropic דרג להתיר מושרה על ידי Dynamics מרכך בממברנה אנזימים

יציבות תרמית של פעילות אנזים נמדד בקלות על ידי טיטור איזותרמי calorimetry (ITC). כיום, רוב מבחני יציבות חלבון המשמש מדד חלבון התגלגלות, אבל אינם מספקים מידע אודות פעילות אנזימטיות. המרכז לטניס בישראל מאפשר קביעה ישירה ההשפעה של שינויים האנזים על היציבות של פעילות אנזים.

מדידת אנזימטי יציבות על ידי טיטור איזותרמי Calorimetry

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השימוש בקלורימטריית טיטרציה איזותרמית (ITC) כדי לנתח את קינטיקה של הקשר והדיסוציאציה של הקשירה בין אפטמר DNA לטטרציקלין, כולל הכנת דגימות, הפעלת תקנים ודגימות, ופענוח הנתונים המתקבלים.

קביעת הקשר התרמודינמי והקינטי של אפטמר DNA וטטרציקלין באמצעות קלורימטריה איזותרמית טיטרציה

במאמר זה מוצגות שיטות אקוטוקסיקולוגיות סטנדרטיות להערכת סמנים ביולוגיים במינים ניאוטרופיים של אנורן. באופן ספציפי, מאמר זה מפרט מספר מתודולוגיות בקני מידה שונים של הערכה אקוטוקסיקולוגית, כגון הרמה הגנטית, ההיסטולוגית-תאית, הביוכימית, המורפולוגית והאינדיבידואלית.

מתודולוגיות אקוטוקסיקולוגיות להערכת סמנים ביולוגיים בקני מידה שונים באנורנים ניאוטרופיים

מאמר זה מתאר את ההכנה של nanofoams ניקל המסודרת באמצעות תצהיר electroless מתכת על גבי תבניות nanoporous מתקבלות מsupramolecules מבוסס קופולימר diblock העצמית התאספו.

ניקל ננו gyroid מSupramolecules קופולימר Diblock

ננו-חלקיקי סיליקה הוכנו באמצעות קטליזה של חומצה של מבשר סילוקסן וטכניקות סינתטיות בסיוע מיקרוגל וכתוצאה מכך צמיחה מבוקרת של ננו-חומרים בקוטר של 30-250 ננומטר. ניתן לשלוט בדינמיקת הצמיחה על ידי שינוי ריכוז החומצה הסיליקית הראשונית, זמן התגובה וטמפרטורת התגובה.

הכנה של חלקיקי סיליקה באמצעות חומצה קטליזה בסיוע מיקרוגל

חשבון חדש לסינתזה של 1,2-diols הסימטרי המבוסס על מנגנון צימוד retropinacol / pinacol הצולב מתואר. בשל הביצוע קטליטי של התגובה הזו שיפור ניכר בהשוואה לזיווגי pinacol הצולבת קונבנציונליים מושגת.

Retropinacol תגובות צימוד / חוצת pinacol - גישה קטליטי לdiols 1,2-הסימטרי

למדו כיצד להשתמש בקלורימטריית טיטרציה איזותרמית (ITC) לאפיון תגובות אנזימטיות. השיטה מאפשרת קביעת פרמטרים קינטיים כמו kcat ו-Km ללא צורך בסימון, באמצעות מדידת זרימת חום בתגובות אנזימטיות.

הביולוגי קטליזה חמה: Isothermal טיטרציה Calorimetry לאפיין תגובות אנזימטיות

גלה סרטונים נוספים