חוט השדרה מלא פגיעה ומוח Dissection פרוטוקול Wholemount לאחר באתר הכלאה בזחל ים צמד ים
14 באוקטובר 2014
Lampreys לשחזר תנועה לאחר פגיעה בחוט השדרה מלאה. עם זאת, חלק מתאי העצב מקרין שדרה הם regenerators טוב ואחרים לא. מאמר זה ממחיש את הטכניקות לזחלי צמד ים ים דיור (ומבוגרים הפכו לאחרונה), הפקת transections חוט השדרה מלאה והכנת מוח wholemount וחוט שדרה לכלאה באתר.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע חוט שדרה מלא, חתך ודיסקציה מוחית לחקר הנחיית אקסון לאחר פציעה. זה מושג על ידי טרנסקציה ראשונה, חוט שדרה למפר ברמה של הזימים החמישיים. לאחר מכן המוח מנותח ומוצמד למגן סיל.
לאחר קיבוע המוח, ניתן לאחסן אותו במתנול או להשתמש בו באופן מיידי להכלאה באתרו בסופו של דבר שינויים בביטוי האקסונלי. ניתן לראות קולטני הנחיה בחוליות מתחדשות לאחר פגיעה בחוט השדרה. היתרון של הטכניקה שאנו הולכים להדגים היום על פני חתך פרפין קונבנציונלי יותר או חתך קריוסטט, הוא שהיא מאפשרת לך לראות את כל המוח, כולל נוירונים שמקרינים לחוט השדרה שהם גדולים ומזוהים.
מדגימה את ההליך היא ד"ר קתי זאנג, מדענית חוקרת במעבדה שלנו מהנחלים המזינים את יובלי אגם מישיגן לנהר דלאוור בפנסילבניה, או נחלים במיין. זחל פראי מסוג צמד ים של המין. הושגו מזל חיות מחמד במארוס.
זחלים בני ארבע עד 7 הם באורך של 10 עד 14 סנטימטרים וגדולים מספיק לפציעה ולדיסקציה. שמור אותם בקבוצות של 52, מאה. במיכלי מים מתוקים של 50 ליטר בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס.
המיכל דורש מצע חצץ בגודל אינץ' אחד כדי שהצמד יוכל לשאול את כל המים שנוספו למיכל יש להתנות בסינון פחם ואוורור למשך 48 שעות לפחות לפני הוספתם למיכל. בתנאי שמשתמשים בבעלי החיים תוך שנה, אין צורך להאכיל אותם לצורך הליך זה. הכינו תמיסת רינגר טרייה.
ראשית העבירו מנורה לתמיסת בנזוקאין מימית רוויה. לאחר ההרדמה, מעבירים אותו לכלי חצי מלא במגן סיל. שים את המנה על קרח ומעל המנה בקרח.
צלצולים קרים. אבטח את החיה עם שלוש סיכות חרקים בקוטר 0.15, אחת בחוטם ושתיים בזימים החמישי. לאחר מכן מקם אותו מתחת למיקרוסקופ סטריאו לניתוח.
התחל בשימוש באזמל מספר 11 כדי לבצע חתך אורכי לאורך קו האמצע הגבי בגובה הזים החמישי. זה יחשוף את חוט השדרה בזמן ביצוע חתך זה. השתמש בשני ווים המעוצבים מסיכות חרקים כדי לאבטח את דפנות הגוף באמצעות קסטרו חושף מספר שמונה, מספריים.
בצע חתך בניצב על פני חוט השדרה החשוף. בדוק את הקצוות החתוכים של חוט השדרה כדי לוודא שהחתך הושלם. לאחר מכן בעזרת מלקחיים, יישר מחדש את הקצוות החתוכים וסגור את הפצע.
העבירו את לבה הלמפר על פיסת נייר פילטר ספוגה בתמיסת צלצול. העבירו את התכשיר על מצע קרח למשך שעה כדי שהפצע יוכל להתייבש לאחר שעה. העבירו את הלבה למיכל קטן משלה של מים קרים כקרח.
הניחו לו להחלים שם במשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, בדוק אם יש תנועה קורטיבית לחתך. אם יש תנועות כלשהן, החתך לא היה שלם.
אם אין, אז הרוחב היה טוב וניתן להעביר את החיה למיכל בטמפרטורת החדר להתאוששות בזמן שהחיה מתאוששת. החלף את המים כל יומיים-שלושה. לאחר שהחיה שעברה התאוששה מספיק, הרדימו אותה והכינו אותה לנתיחה כפי שתואר קודם לכן.
כדי לנתח את המוח, התחל בחתך רוחבי בין הנחיר לאיבר האצטרובל. לאחר מכן עם עגל קסטרו, מספריים חותכים את הרקמה המקיפה את המוח תוך אבטחת החיה. עם מלקחיים.
המבנים הסגלגלים הלבנים משני צידי גזע המוח הם הכמוסות האוטיות. ברגע שהמוח נחשף, השתמש במלקחיים כדי להסיר את מקלעת הכורואיד. לאחר מכן, השתמש בווים ששונו כדי להפיץ את ראש החיה ולחשוף את עצבי הגולגולת.
ואז חותכים את חוט השדרה לרוחב עם המספריים תוך אבטחת חוט השדרה בעזרת מלקחיים. חתכו את עצבי הגולגולת כדי לנתח את המוח. לאחר מכן העבירו את המוח לחתיכת סיליקון קטנה ואבטחו אותה שם.
שימוש בסיכת חרקים אחת בחוט השדרה וסיכה אחת דרך אחת מנורות הריח. לאחר מכן, בעזרת המספריים, חותכים את פקעת הריח הבין-ריחית, את קומיסור המגן המוחי ואת החלק של גזע המוח לאורך קו האמצע הגבי. לאחר חיתוך הקומיסורים וה-oex, הסיטו את לוחות ה-A LR לרוחב והצמידו אותם שטוחים לסיליקון עם סך של שבעה סיכות חרקים, שניים בנורות הריח, שניים בשולי החיתוך, קומיסור מגן מוחי, שניים ב-oex המורחב ואחד בקו האמצע של חוט השדרה.
כעת באמצעות ריאגנטים נטולי RNA, תקן את התכשיר ב-4%para פורמלדהיד בטמפרטורת החדר למשך שלוש שעות עם תסיסה עדינה. לאחר מכן ניתן לנתח את המוחות על ידי הכלאה כפולה באתרה בשיטה המתוארת ביטוי של ניאוגן בתעתיקים זוהה בחוט השדרה, הקרנת נוירונים של בקרה, בעלי חיים ובעלי חיים. שבועיים לאחר הנגע שנראה כאן יש ביקורת מייצגת שלא נפגעה.
לאחר חתך חוט השדרה המלא, חלו שינויים בביטוי הקולטן הניאוגן. לאחר שבועיים, קולטן הניאוגן בחוסר הביקורת התבטא באופן מועדף במחוללים גרועים כמו M1 I one I Two I ארבע, או נוירונים MTH. פיתוח טכניקה זו סלל את הדרך ליכולתנו לחקור ביטוי של קולטני הנחיה, קולטנים לכונדרויטין סולפט, פרוטיו, גליקנים והפעלת בסיסי יציקה הכל באותו מוח.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מדגים טכניקות לביצוע חיתוך מלא של חוט השדרה וניתוחים של המוח בצלופח ים. הוא מדגיש את ההחלמה של התנועה לאחר פגיעה בחוט השדרה ואת יכולות ההתחדשות של נוירונים ספציפיים המקרינים לחוט השדרה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה רגנרטיבית
- תגובה לפגיעה
רקע
- למפרות ים יכולות להשיב את יכולת התנועה לאחר פגיעה מלאה בחוט השדרה.
- חלק מהנוירונים המקרינים אל החוט השדרה מראים תכונות רגנרטיביות טובות.
- הבנת ההנחיה של אקסונים לאחר פגיעה היא קריטית להשגת תובנות לגבי התחדשות של חוט השדרה.
- מחקר זה עושה שימוש בטכניקות של היברידיזציה באתר (in situ hybridization) לצורך אנליזה.
מטרת המחקר
- לבחון מנגנוני הדרכת אקסונים בעקבות פגיעה בחוט השדרה.
- להדגים טכניקות לניתוק חוט השדרה ולדיסקציה של המוח.
- לנתח שינויים בביטוי של רספטורים להדרכת אקסונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ניתוק מלא של חוט השדרה בגובה הזיקיים החמישיים.
- דיסקציה של המוח וקיבוע לצורך אנליזה.
- אחסון דגימות מוח במתנול או שימוש מיידי לביצוע היברידיזציה in situ.
- הכנת wholemount להדמיית נוירונים גדולים מזוהים השולחים שלוחות לחוט השדרה.
תוצאות עיקריות
- הוכח שיקום של תנועה בצלופים לאחר פציעה.
- זוהו הבדלים ביכולות ההתחדשות בקרב נוירונים המקרינים לעמוד השדרה.
- הודגמו שינויים בביטוי של קולטני הנחיית אקסונים בחוליות עוברות התחדשות.
- הודגשו יתרונותיהן של טכניקות wholemount על פני שיטות חיתוך מסורתיות.
מסקנות
- הטכניקות המוצגות מספקות תובנות בעלות ערך לגבי התחדשות חוט השדרה.
- הבנת התחדשות נוירונים יכולה להנחות אסטרטגיות טיפוליות עתידיות.
- הכנות של דגימות שלמות (Wholemount) מאפשרות ניתוח מקיף של קשרי נוירונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של מטרות לרגנרציה של אקסונים על ידי אספקת מערכת רלוונטית למחלה לבחינת תגובות נוירונליות אינטרינסיות לפגיעה בחוט השדרה. ההכנה של דגימה שלמה (wholemount) תומכת בתיקוף של המטרות באמצעות ויזואליזציה ישירה של נוירונים גדולים וניתנים לזיהוי המקרינים לחוט השדרה, ובכך מקלה על ניתוח השוואתי של ביטוי גנים בין רגנרטורים "טובים" ל"רעים". גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי קישור פנוטיפים מולקולריים לתוצאות רגנרציה פונקציונליות במודל של מערכת העצבים המרכזית (CNS) של חולייתנים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות השוואת פרופילים של ביטוי גנים בין אוכלוסיות נוירונים הנבדלות תפקודית.
- ערך תפעולי: מספק שיטה הניתנת לשחזור לבידוד וניתוח של סוגי תתי-נוירונים ספציפיים המעורבים בכישלון או בהצלחה של התחדשות.
- ערך אסטרטגי: תומך בתעדוף מטרות על ידי זיהוי חתימות מולקולריות הקשורות ליכולת התחדשות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו ולידציה לצורך הערכה כמותית של שינויים בביטוי קולטני הניווט האקסונלי לאחר פגיעה.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הכנת מערכת העצבים המרכזית (CNS) כשלמה (wholemount) לקבלת תוצאות עקביות של היברידיזציה in situ בין תנאים ניסיוניים שונים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר סקירה רחבה (scalable screening) של קולטני ניווט, קולטני כונדרויטין סולפט ומטרות קשורות על פלטפורמה אחת.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מבסס את הרלוונטיות למחלה על ידי מידול של פגיעה במערכת העצבים המרכזית (CNS) ודינמיקת התחדשות בחוליתבני בעכביש הים.
- ערך תפעולי: מבטיח רציפות תרגומית משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות הכנת דגימות שלמות (wholmount) עקבית.
- ערך אסטרטגי: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים מכניסטיים של מסלולי הנחיית אקסונים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מוביל, על ידי אספקת תוצאים מולקולריים המנחים אסטרטגיות לוויסות מסלולים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי מתן אפשרות להשוואה ישירה של ביטוי גנים בנוירונים מזוהים ככאלו שעוברים רגנרציה לעומת נוירונים שאינם עוברים רגנרציה.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות הכנה סטנדרטית של wholemount התואמת ל-multiplex in situ hybridization עבור רספטורים של הנחיית אקסונים.
- אנליטיקה: מייצרת תוצאות מרחביות כמותיות של שינויים בביטוי רספטורים, המאפשרות לצוותים להקרין שינויים מולקולריים עם תוצאות רגנרציה פנוטיפיות.
- מחקר תרגומי: מקשר להמשכיות פרה-קלינית באמצעות מודל של פגיעה ב-CNS של חולייתנים המראה התאוששות תפקודית ורגנרציה של אקסונים פרוקסימליים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לחקר מספר משפחות של רספטורי הנחיה (למשל, Neogen, chondroitin sulfate, proteoglycans) באותו הקשר נוירונלי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במסלולי התחדשות אקסונים באמצעות רזולוציה נוירונלית ישירה.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזור של דיסקציה וקיבוע נוירונלי לצורך אנליזה מולקולרית המשכית.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות לגבי המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי אספקת ראיות לסממנים ביולוגיים מוקדמים למעורבות המטרה בנוירונים בעלי יכולת התחדשות.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתעדוף מותאם סיכון של מטרות להנחיית אקסונים בהתבסס על דינמיקת ביטוי באוכלוסיות נוירונליות מאומתות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטכניקות מיקרו-כירורגיות לביצוע חיתוך רוחבי של חוט השדרה ודיסקציה של המוח בזחלי חלמי הים.
- תלוי בגישה למיקרוסקופ סטריאוסקופי, סיכות לחרקים, תשתיות סיליקון וריאגנטים נקיים מ-RNase לצורך הכנת דגימות שלמות וקיבוע.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי ההרדמה, ההתאוששות והקיבוע כדי להבטיח איכות רקמה עקבית.
- כולל שיקולי התאמה בעת העברת פרוטוקולים בין שלבי התפתחות או מינים שונים, בשל הבדלים באנטומיה ובגודל של מערכת העצבים המרכזית (CNS).
- מוגבל על ידי חלון זמן של 24 שעות לריפוי לאחר הפציעה, הנדרש כדי לאשר חיתוך רוחבי מלא לפני המעבר להתאוששות ודיסקציה.
