השומנים bilayer שלפוחיות דור שימוש Microfluidic jetting
21 בפברואר 2014
jetting microfluidic נגד bilayer שומנים ממשק אגל מספק דרך אמינה כדי ליצור שלפוחית עם שליטה על חוסר סימטריה בממברנה, שילוב של חלבונים הטרנסממברני, ואנקפסולציה של חומר. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד מגוון רחב של מערכות ביולוגיות שבי ביומולקולות הממודרת הן רצויה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור שלפוחיות דו-שכבתיות פוספוליפידיות עם שליטה מוגברת על הממברנה, ה-unla, המולריות, פיזור המונו והתכולה הפנימית. באמצעות cad מיוצר תא מיריעות אקריליות וגומי טבעי. שכבת שומנים תלויה מיוצרת על ידי העמסת החדר בשומנים ותמיסה.
לאחר מכן, הזרקת דיו המכילה את התמיסה שיש לעטוף מוגדרת עם מנגנון ההזרקה. לאחר קביעת ההגדרות המתאימות, פולסים של נוזל סילוני ייצרו שלפוחיות דו-שכבתיות של שומנים. בסופו של דבר, סילון מיקרופלואידית מניב שלפוחיות דו-שכבתיות מפוזרות חד-שכבתיות הניתנות לחזרה.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו היווצרות אלקטרו, תחליב או יצירת טיפות, הוא רמת בקרה מוגברת של ממברנה, מולריות חד צדדית, פיזור מונו ותכולה פנימית. תדגים את ההליך ג'והנה הארו, סטודנטית לתואר שני ממעבדה ותסייע קארה פאטל, סטודנטית לתואר ראשון המשתמשת בתוכנת CAD, לצייר צורה לתא שניתן לייצר מאקריליק באמצעות מקדחה ראשונה של חותך לייזר, אחד בגודל 16 אינץ' דרך חורים משני צידי החדר האקרילי המורכב. זה יתנקז לבאר בצורת אינסוף.
שנית, חותכים מלבן קטן עם מספריים מגיליון אקרילי של 0.2 מילימטר כדי לשמש כתחתית בצורת האינסוף. אבטח אותו היטב עם דבק המתייבש במהירות, והקפד לא לקבל דבק באזורי הצפייה. יש לשטוף את יריעת האקריליק לקיר החדר ולהדק אותה לתחתית החדר.
שלישית, השתמש בדבק המתייבש במהירות כדי להדביק חתיכה דקה של יריעת גומי טבעית מעל החורים הקדוחים. לחץ אותם במקומם בעזרת פינצטה. בדוק את כל התפרים המודבקים לאיתור נזילות.
לא צריך להיות כזה. לבסוף, באמצעות מחט בגודל 23, תקעו חורים בגומי דרך החורים הקדוחים, קצה הזרקת הדיו הפיזואלקטרי יוכנס דרך החורים הללו. יש להמיס פוספוליפידים במלאי בכלורופורם ולאחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס.
D-P-H-P-C או DOPC. ליפידים משמשים בהדגמה זו. שומנים מומסים בכלורופורם מועברים לבקבוקון זכוכית תוך החזקת הבקבוקון בזווית, מייבשים בעדינות את השומנים מתחת לארגון או גז חנקן.
לאחר מכן הנח את הבקבוקון כשהמכסה שלו מעט רופף תחת ואקום למשך שעה עד שעתיים כדי להסיר שאריות ממס. ניתן להשתמש גם בחומר ייבוש לשלב זה. כעת ממיסים את השומנים בסיפון הקצה לריכוז שומנים סופי של 25 מיליגרם למיליליטר.
מערבולת הפתרון. אטמו בקצרה את הכובע עם פרם ואז סוניקציה למשך 15 דקות. אחסן תמיסה זו בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, הכינו תמיסת סוכרוז מלאי עם אוסמולריות פיזיולוגית. זהו פתרון הסילון. שקול להוסיף טיפה של צבע מאכל כהה או חרוזים פלואורסצנטיים לתמיסה לתוספת ניגודיות או פלואורסצנטיות.
טען את תמיסת הסוכרוז למזרק מיליליטר אחד כדי להסיר אוויר כלוא. הקישו את המזרק כך שכל הבועות יעלו לפתח הפיתוי וניתן יהיה להוציא אותן. לאחר מכן, חבר פילטר 33 מילימטר 0.22 מיקרון למזרק ודחף טיפה אחת החוצה דרך המסנן.
כעת הברג את מתאם הפיתוי הנשי של הזרקת הדיו ולחץ אותו על קצה המסנן. דחוף החוצה מעט נוזל כדי להסיר אוויר כלוא. לבסוף, חבר את המזרק לחלק העליון של נוזל הזרקת הדיו.
צריך לעבור לקצה הזרקת הדיו אם המזרק חובר כהלכה. ראשית, הרכיבו את מכלול המזרק לשלב המיקרוסקופ וחברו את בקר הזרקת הדיו לניסוי זה. הבמה והמזרק זקוקים לשליטה עצמאית כאשר הבמה והמזרק נעים שניהם בתלת מימד לצורך הדמיה.
הגדר מצלמה במהירות גבוהה המסוגלת ל-1000 פריימים לשנייה לפחות. הגדר אותו לשימוש בהפעלה אוטומטית מבוססת תמונה כדי ליזום הקלטות. כעת, אבטח את החדר לבמה בעזרת סרט ויישר בזהירות את קצה הזרקת הדיו עם החור שנעשה ביריעת הגומי בצד החדר.
ראשית, התאם לפי העין ולאחר מכן בצע התאמות עדינות באמצעות המיקרוסקופ. לאחר היישור, החזר את המזרק לאורך מימד אחד כדי לטעון את צורת האינסוף. ובכן, הפעל לחץ עדין על הבוכנה, כך שנוצרת טיפה על הזרבובית.
זה מספק קצת לחץ גב ראשוני. יש להגדיר את פרמטרי הסילון. הערכים הספציפיים הבאים עבור גל דו קוטבי טרפזי מוצגים על המסך מתח מופעל ומספר פעימות הסילון לכל גודל שלפוחית בקרת ההדק.
כעת טען את החדר ב-25 עד 30 מיקרוליטר של תמיסת השומנים בסוף העשור, המכסה את כל פני השטח של צורת האינסוף. ובכן אז לכל אחד, ובכן הוסף 25 מיקרוליטר תמיסת גלוקוז לקצה החיצוני ביותר פיפטינג לאט וחלק, הגלוקוז לא אמור להתערבב בתמיסת השומנים. תוך 10 דקות תיווצר שכבת שומנים דו-שכבתית במרכז החדר.
הגדרת השכבה הדו-שכבתית היא השלב הקריטי ביותר מכיוון שהשכבה הדו-שכבתית אינה יציבה ועלולה להישבר בהתאם להכנה. היו סבלניים. זה יסתדר ברגע שתתרגל למלא את החדר כמה פעמים.
כעת, הכנס בזהירות את קצה הזרקת הדיו בחזרה לתא כאשר הקצה נמצא בטווח של 200 מיקרון מממשק הטיפות. דו-שכבתי, התחל את תהליך הסילון והקלט את הנתונים באמצעות הזרקת הדיו סיפק תובנה לגבי תהליך יצירת השלפוחית. לדוגמה, שינוי המרחק בין פיית הזרקת הדיו לשכבת השומנים הדו-שכבתית השפיע על הכוח המעוות את הממברנה. קרוב.
הקרבה לשכבה הדו-שכבתית מיקדה את זרם הסילון ומנעה מהממברנה לפזר אנרגיה הרחק מנקודת יצירת השלפוחית. כמו כן, תנועת המערבולת גדלה עם המתח המופעל על המפעיל החשמלי של הפיזו. היווצרות השלפוחית הודגמה כרצף של אירועים לאחר היווצרותם.
יציבות השלפוחית נטתה להשתנות עם קוטר השלפוחית, כאשר שלפוחיות קטנות יותר היו יציבות יותר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור שלפוחיות מפרות שומנים באמצעות סילון מיקרופלואידי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה דן בשיטה ליצירת שלפוחיות של שכבה כפולה של פוספוליפידים באמצעות הזרקת מיקרופלואידיקה אל מול שכבה כפולה של ליפידים בממשק טיפה. טכניקה זו מאפשרת בקרה מדויקת על אסימטריה של ממברנה, שילוב של חלבונים טרנס-ממברנליים וכמיסה של חומרים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי מוח
- ביופיזיקה
- ביוטכנולוגיה
רקע
- שלפוצות דו-שכבה של פוספוליפידים הן חיוניות ללימוד של ביו-מולקולות המופרדות בתאים.
- טכניקות מיקרו-פלואידיות משפרות את השחזוריות והבקרה של תהליך היווצרות השלפוצות.
- הבנת תכונות הממברנה היא קריטית ליישומים ביולוגיים מגוונים.
- טכנולוגיית הזרקה (Jetting) יכולה לייעל את תהליך יצירת השלפוצות.
מטרת המחקר
- ליצירת וזיקולות בעלות מאפייני ממברנה מבוקרים.
- לסייע בשילוב של חלבונים ספציפיים לתוך השכבה הדו-שכבתית.
- לאפשר כימוס של חומרים שונים למטרות מחקר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ייצור תא מלוחות אקריליות וגומי טבעי.
- הסרטת שכבת ליפידים כפולה תלויה (suspended lipid bilayer) על ידי טעינת התא בליפידים ובפתרון.
- הקמת מכשיר הזרקת דיו (inkjet) לכלילה של פתרונות.
- קביעת הגדרות מתאימות עבור פולסי נוזל מותז ליצירת וסיקולות.
תוצאות עיקריות
- הזרקה מיקרופלואידית מייצרת וזיקולות דו-שכבתיות הניתנות לשחזור ובעלות פיזור אחיד.
- השיטה מאפשרת בקרה מדויקת על תכונות הוזיקולות.
- כימוס של חומרים מושג באופן יעיל.
- ניתן להתאים את הוזיקולות למחקרים ביולוגיים שונים.
מסקנות
- הזרקה מיקרופלואידית היא טכניקה אמינה ליצירת וזיקולות.
- השליטה על אסימטריה של הממברנה וההטמעה של חלבונים משופרת.
- לשיטה זו יש השלכות משמעותיות על חקר ביו-מולקולות מופרדות למדורים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הזרקה מיקרופלואידית מאפשרת שליטה מדויקת ביצירת וזיקולות של שכבה ליפידית דו-שכבתית, ובכך תומכת בייצור הדיר וחוזר של וזיקולות אונילמלאריות ענקיות (GUVs) בעלות הרכב ממברנה וקיבולת הכנסה מוגדרים. יכולת זו נותנת מענה לאתגר מרכזי במחקר של ביולוגיה סינתטית והמסרה של תרופות, על ידי אספקת פלטפורמה ניתנת לכיוונון למידול מערכות תאיות ובדיקה של תרכובות ביו-אקטיביות. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי תיקוף מוקדמים של מטרות, על ידי אפשור בחינה שיטתית של תהליכים התלויים בממברנה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות באמצעות אסימטריה מבוקרת של הממברנה וההטמעה של חלבונים טרנס-ממברנליים.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי יצירת מערכות וזיקולות הניתנות לשחזור לצורך הבהרת מסלולים.
- ערך ניבוי: מסייע במיון תיקי פיתוח על ידי אספקת מדדים כמותיים של אינטראקציות בין ליפידים לחלבונים ויעילות הכליאה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות עוברות תיקוף עבור תהליכי עבודה המשכיים (downstream workflows), באמצעות ייצור של וסיקולות מונו-דיספרסיביות בעלות גודל ותוכן פנימי שניתנים לכיוונון.
- ערך תפעולי: מענה לסוגיית הסטנדרטיזציה והשחזוריות של הבדיקות באמצעות פרמטרי התזה מדויקים השולטים בהיווצרות הוסיקולות.
- מוכנות לסריקה: הדגשת יכולת ההרחבה (scalability) והשימוש החוזר בפלטפורמה לצורך הערכה מהימנה של תרכובות תחת תנאים מרובים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: דן ברלוונטיות למחלה באמצעות שימוש בפתרונות עם אוסמולריות דמוית פיזיולוגית ומעקב פלואורסצנטי לניטור של שלפוחיות.
- התאמה פרה-קלינית: מתאר המשכיות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני, על ידי התמכו בכיסוי (encapsulation) של מועמדים טיפוליים לצורך מחקרי יציבות ושחרור.
- קידום מותאם סיכון: תומך בקבלת החלטות על ידי אספקת פלטים מדידים לגבי יציבות השלפוחיות וביצועים התלויים בקוטר.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות מוקדמת ועד לזיהוי מובילים (leads), במיוחד במדידות הדורשות סביבות ממברנה מבוקרות והחדרה של תרכובות מוכפסות.
- ביולוגיית גילוי: מסביר כיצד השיטה תומכת בבדיקת היפותזות על ידי מתן אפשרות לשינוי שיטתי של הרכב הליפידים ושילוב חלבוני קרום, כדי להבהיר תלויות במסלולים ביולוגיים.
- סריקה: מתאר את המוכנות לבדיקה (assay) באמצעות יצירת וזיקולות מונו-דיספרסיות המבטיחות חשיפה עקבית של תרכובות ותוצאות הניתנות לשחזור.
- אנליטיקה: מדגיש מדידות כמותיות כגון גודל וזיקולות, קצב היווצרות ויעילות אנקפסולציה, המסייעות לצוותים להשוות בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשר את השיטה לרצף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לאנקפסולציה של תרופות או ביו-מולקולות לצורך בדיקות יציבות ואפיון השחררה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציג את השיטה כבסיס ליכולת רב-פעמית ולא כטכניקה לשימוש חד-פעמי, הניתנת להתאמה למספר פרויקטים הדורשים פלטפורמות של וזיקולות סינתטיות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי, תיקוף מטרה, צמצום עמימות מכניסטית במנגנונים הקשורים לממברנה.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת הרחבה (scalability) של ייצור וזיקולות עבור יישומים בע admitting-throughput גבוה.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך או הפסקה (go/no-go), יעילות הון וצמצום סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים באמצעות הפחתת סיכונים מוקדמת של מנגנוני הובלה.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעוד ותיעדוף מותאם סיכונים והחלטות קידום המבוססות על נתוני ביצועים של וזיקולות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרופלואידיקה, טיפול בליפידים ומיקרוסקופיה לצורך הרכבת התא ויצירת השכבה הכפולה.
- תלוי במכשור הכולל התקני הזרקה בעלי הנעה פייזו-אלקטרית, מצלמות במהירות גבוהה ומערכות ייבוש בוואקום.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של תמיסות ליפידים, פרמטרי הזרקה ונהלי יישור התאים.
- כולל שיקולי התאמה לסוגי ליפידים שונים, חלבוני קרום ומסוככי כמיסה במערכות מודלים השונות.
- כולל מגבלות מעשיות כגון חוסר יציבות של השכבה הכפולה במהלך ההקמה ורגישות לרעידות סביבתיות בזמן ההזרקה.
