השומנים bilayer שלפוחיות דור שימוש Microfluidic jetting
21 בפברואר 2014
jetting microfluidic נגד bilayer שומנים ממשק אגל מספק דרך אמינה כדי ליצור שלפוחית עם שליטה על חוסר סימטריה בממברנה, שילוב של חלבונים הטרנסממברני, ואנקפסולציה של חומר. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד מגוון רחב של מערכות ביולוגיות שבי ביומולקולות הממודרת הן רצויה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור שלפוחיות דו-שכבתיות פוספוליפידיות עם שליטה מוגברת על הממברנה, ה-unla, המולריות, פיזור המונו והתכולה הפנימית. באמצעות cad מיוצר תא מיריעות אקריליות וגומי טבעי. שכבת שומנים תלויה מיוצרת על ידי העמסת החדר בשומנים ותמיסה.
לאחר מכן, הזרקת דיו המכילה את התמיסה שיש לעטוף מוגדרת עם מנגנון ההזרקה. לאחר קביעת ההגדרות המתאימות, פולסים של נוזל סילוני ייצרו שלפוחיות דו-שכבתיות של שומנים. בסופו של דבר, סילון מיקרופלואידית מניב שלפוחיות דו-שכבתיות מפוזרות חד-שכבתיות הניתנות לחזרה.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו היווצרות אלקטרו, תחליב או יצירת טיפות, הוא רמת בקרה מוגברת של ממברנה, מולריות חד צדדית, פיזור מונו ותכולה פנימית. תדגים את ההליך ג'והנה הארו, סטודנטית לתואר שני ממעבדה ותסייע קארה פאטל, סטודנטית לתואר ראשון המשתמשת בתוכנת CAD, לצייר צורה לתא שניתן לייצר מאקריליק באמצעות מקדחה ראשונה של חותך לייזר, אחד בגודל 16 אינץ' דרך חורים משני צידי החדר האקרילי המורכב. זה יתנקז לבאר בצורת אינסוף.
שנית, חותכים מלבן קטן עם מספריים מגיליון אקרילי של 0.2 מילימטר כדי לשמש כתחתית בצורת האינסוף. אבטח אותו היטב עם דבק המתייבש במהירות, והקפד לא לקבל דבק באזורי הצפייה. יש לשטוף את יריעת האקריליק לקיר החדר ולהדק אותה לתחתית החדר.
שלישית, השתמש בדבק המתייבש במהירות כדי להדביק חתיכה דקה של יריעת גומי טבעית מעל החורים הקדוחים. לחץ אותם במקומם בעזרת פינצטה. בדוק את כל התפרים המודבקים לאיתור נזילות.
לא צריך להיות כזה. לבסוף, באמצעות מחט בגודל 23, תקעו חורים בגומי דרך החורים הקדוחים, קצה הזרקת הדיו הפיזואלקטרי יוכנס דרך החורים הללו. יש להמיס פוספוליפידים במלאי בכלורופורם ולאחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס.
D-P-H-P-C או DOPC. ליפידים משמשים בהדגמה זו. שומנים מומסים בכלורופורם מועברים לבקבוקון זכוכית תוך החזקת הבקבוקון בזווית, מייבשים בעדינות את השומנים מתחת לארגון או גז חנקן.
לאחר מכן הנח את הבקבוקון כשהמכסה שלו מעט רופף תחת ואקום למשך שעה עד שעתיים כדי להסיר שאריות ממס. ניתן להשתמש גם בחומר ייבוש לשלב זה. כעת ממיסים את השומנים בסיפון הקצה לריכוז שומנים סופי של 25 מיליגרם למיליליטר.
מערבולת הפתרון. אטמו בקצרה את הכובע עם פרם ואז סוניקציה למשך 15 דקות. אחסן תמיסה זו בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, הכינו תמיסת סוכרוז מלאי עם אוסמולריות פיזיולוגית. זהו פתרון הסילון. שקול להוסיף טיפה של צבע מאכל כהה או חרוזים פלואורסצנטיים לתמיסה לתוספת ניגודיות או פלואורסצנטיות.
טען את תמיסת הסוכרוז למזרק מיליליטר אחד כדי להסיר אוויר כלוא. הקישו את המזרק כך שכל הבועות יעלו לפתח הפיתוי וניתן יהיה להוציא אותן. לאחר מכן, חבר פילטר 33 מילימטר 0.22 מיקרון למזרק ודחף טיפה אחת החוצה דרך המסנן.
כעת הברג את מתאם הפיתוי הנשי של הזרקת הדיו ולחץ אותו על קצה המסנן. דחוף החוצה מעט נוזל כדי להסיר אוויר כלוא. לבסוף, חבר את המזרק לחלק העליון של נוזל הזרקת הדיו.
צריך לעבור לקצה הזרקת הדיו אם המזרק חובר כהלכה. ראשית, הרכיבו את מכלול המזרק לשלב המיקרוסקופ וחברו את בקר הזרקת הדיו לניסוי זה. הבמה והמזרק זקוקים לשליטה עצמאית כאשר הבמה והמזרק נעים שניהם בתלת מימד לצורך הדמיה.
הגדר מצלמה במהירות גבוהה המסוגלת ל-1000 פריימים לשנייה לפחות. הגדר אותו לשימוש בהפעלה אוטומטית מבוססת תמונה כדי ליזום הקלטות. כעת, אבטח את החדר לבמה בעזרת סרט ויישר בזהירות את קצה הזרקת הדיו עם החור שנעשה ביריעת הגומי בצד החדר.
ראשית, התאם לפי העין ולאחר מכן בצע התאמות עדינות באמצעות המיקרוסקופ. לאחר היישור, החזר את המזרק לאורך מימד אחד כדי לטעון את צורת האינסוף. ובכן, הפעל לחץ עדין על הבוכנה, כך שנוצרת טיפה על הזרבובית.
זה מספק קצת לחץ גב ראשוני. יש להגדיר את פרמטרי הסילון. הערכים הספציפיים הבאים עבור גל דו קוטבי טרפזי מוצגים על המסך מתח מופעל ומספר פעימות הסילון לכל גודל שלפוחית בקרת ההדק.
כעת טען את החדר ב-25 עד 30 מיקרוליטר של תמיסת השומנים בסוף העשור, המכסה את כל פני השטח של צורת האינסוף. ובכן אז לכל אחד, ובכן הוסף 25 מיקרוליטר תמיסת גלוקוז לקצה החיצוני ביותר פיפטינג לאט וחלק, הגלוקוז לא אמור להתערבב בתמיסת השומנים. תוך 10 דקות תיווצר שכבת שומנים דו-שכבתית במרכז החדר.
הגדרת השכבה הדו-שכבתית היא השלב הקריטי ביותר מכיוון שהשכבה הדו-שכבתית אינה יציבה ועלולה להישבר בהתאם להכנה. היו סבלניים. זה יסתדר ברגע שתתרגל למלא את החדר כמה פעמים.
כעת, הכנס בזהירות את קצה הזרקת הדיו בחזרה לתא כאשר הקצה נמצא בטווח של 200 מיקרון מממשק הטיפות. דו-שכבתי, התחל את תהליך הסילון והקלט את הנתונים באמצעות הזרקת הדיו סיפק תובנה לגבי תהליך יצירת השלפוחית. לדוגמה, שינוי המרחק בין פיית הזרקת הדיו לשכבת השומנים הדו-שכבתית השפיע על הכוח המעוות את הממברנה. קרוב.
הקרבה לשכבה הדו-שכבתית מיקדה את זרם הסילון ומנעה מהממברנה לפזר אנרגיה הרחק מנקודת יצירת השלפוחית. כמו כן, תנועת המערבולת גדלה עם המתח המופעל על המפעיל החשמלי של הפיזו. היווצרות השלפוחית הודגמה כרצף של אירועים לאחר היווצרותם.
יציבות השלפוחית נטתה להשתנות עם קוטר השלפוחית, כאשר שלפוחיות קטנות יותר היו יציבות יותר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור שלפוחיות מפרות שומנים באמצעות סילון מיקרופלואידי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה דן בשיטה לייצור שלפוחיות דו-שכבתיות של פוספוליפידים באמצעות סילוק מיקרופלואידי נגד ממשק טיפת דו-שכבת שומנים. הטכניקה מאפשרת שליטה מדויקת על אסימטריה של הממברנה, שילוב חלבונים טרנסממברניים והכללה של חומרים.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביופיזיקה
- ביוטכנולוגיה
רקע
- שלפוחיות דו-שכבתיות של פוספוליפידים חיוניות לחקר ביומולקולות ממויינות.
- טכניקות מיקרופלואידיות משפרות את החוזרות והשליטה על היווצרות השלפוחיות.
- הבנת מאפייני הממברנה חיונית ליישומים ביולוגיים שונים.
- טכנולוגיית הסילוק יכולה לייעל את תהליך יצירת השלפוחיות.
מטרת המחקר
- ליצור שלפוחיות עם מאפייני ממברנה מבוקרים.
- להקל על שילוב חלבונים ספציפיים בדו-שכבה.
- לאפשר הכללה של חומרים שונים לצורכי מחקר.
שיטות ששימשו
- ייצור תא מגלי לוחות אקריליים וגומי טבעי.
- ייצור דו-שכבת שומנים מושעה על ידי טעינת התא בשומנים ותמיסה.
- הקמת מנגנון מדפסת תרמית להכללת תמיסות.
- קביעת הגדרות מתאימות לפולסי נוזל מוזרקים ליצירת שלפוחיות.
תוצאות עיקריות
- סילוק מיקרופלואידי מייצר שלפוחיות דו-שכבתיות חד-גוניות חוזרות.
- השיטה מאפשרת שליטה מדויקת על מאפייני השלפוחית.
- הכללת חומרים מושגת ביעילות.
- ניתן להתאים את השלפוחיות למחקרים ביולוגיים שונים.
מסקנות
- סילוק מיקרופלואידי היא טכניקה אמינה לייצור שלפוחיות.
- השליטה על אסימטריה של הממברנה ושילוב חלבונים משופרת.
- לשיטה יש השלכות משמעותיות על חקר ביומולקולות ממויינות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Microfluidic jetting enables precise control over lipid bilayer vesicle generation, supporting reproducible production of giant unilamellar vesicles (GUVs) with defined membrane composition and encapsulation capacity. This capability addresses a key challenge in synthetic biology and drug delivery research by providing a tunable platform for modeling cellular systems and testing bioactive compounds. The method enhances predictive confidence in early-stage target validation by allowing systematic interrogation of membrane-dependent processes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through controlled membrane asymmetry and transmembrane protein incorporation.
- Operational Value: Supports functional target validation by generating reproducible vesicle systems for pathway clarification.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing quantitative readouts on lipid-protein interactions and encapsulation efficiency.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by producing mono-dispersed vesicles with tunable size and internal content.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through precise jetting parameters that control vesicle formation.
- Screening Readiness: Highlights platform scalability and reuse for reliable compound evaluation across multiple conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance through the use of physiological-like osmolarity solutions and fluorescent tracking for vesicle monitoring.
- Preclinical Alignment: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling encapsulation of therapeutic candidates for stability and release studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports decision-making by providing measurable outputs on vesicle stability and diameter-dependent performance.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing to lead identification, particularly in assays requiring controlled membrane environments and encapsulated compound delivery.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing by enabling systematic variation of lipid composition and transmembrane protein incorporation to clarify pathway dependencies.
- Screening: Describes assay readiness through the generation of mono-dispersed vesicles that ensure consistent compound exposure and reproducible readouts.
- Analytics: Highlights quantitative measurements such as vesicle size, formation rate, and encapsulation efficiency that help teams compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by enabling encapsulation of drugs or biomolecules for stability testing and release profiling.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, adaptable across multiple projects requiring synthetic vesicle platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in membrane-related mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of vesicle production for high-throughput applications.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early de-risking of delivery mechanisms.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on vesicle performance data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, lipid handling, and microscopy for chamber assembly and bilayer formation.
- Depends on instrumentation including piezo-actuated inkjet devices, high-speed cameras, and vacuum drying systems.
- Necessitates cross-team standardization of lipid solutions, jetting parameters, and chamber alignment procedures.
- Involves adaptation considerations for different lipid types, transmembrane proteins, and encapsulation agents across model systems.
- Includes practical limitations such as bilayer instability during setup and sensitivity to environmental vibrations during jetting.
