Name: שתי שיטות לקביעת אדם תאי רירית הרחם סטרומה ראשיים מדוגמאות כריתת הרחם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: למד שתי שיטות לבידוד תאי סטרומה ראשיים מרירית הרחם מדגימות כריתת הרחם באמצעות שפשוף מכני או טריפסין. הפרוטוקולים כוללים אימות באמצעות qPCR ואימונופלואורסצנציה לחקר פיזיולוגיה ופתולוגיה של מערכת הרבייה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למאמצים המשותפים של ד&quot;ר Thao דאנג וחברי המעבדה שלה לשימוש בציוד ההדמיה ומיקרוסקופ. אנו מודים גם Biorepository ומתקן רקמות מחקר ליבה (BTRF), ג&#39;ף הרפר, והתושבים באוניברסיטת וירג&#39;יניה שספק לנו רקמת רחם. אנו מודים קרול ה&quot;שלאכטה לעזרה עם סכמטי סקירה.

דגימות כריתת רחם בשימוש בכתב היד הזה נאספו הקונקורדנציה עם פרוטוקול אתיקה אישר-IRB האוניברסיטה הממוספר # IRB-HSR 14424. 1. רכישה לדוגמא ממקור קליני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג ממשלה וקווים מנחים אתיים המבוסס על מוסד ותיעוד אישור לפני תחילת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל את כל השלבים בתנאים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמר רקמה שמקורם בחולה בתקשורת (RPMI או DMEM / גבוה גלוקוז) בצינור 50 מיליליטר ב 4 ° C, אם המדגם לא יכול להיות מעובד בתרבות באופן מיידי. דוגמאות ניתן לאחסן במצב זה לתקופה מקסימלית של 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף דגימת רקמה שלוש פעמים עם בופר פוספט סטרילי 1X (PBS) ולהשליך את הפתרון בין שוטף. </li></ol> 2. הכנה של שורות תאים ראשוניות בשיטת האוספות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 4-10 מיליליטר של תקשורת צמיחה (RPMI או DMEM / גלוקוז גבוהה בתוספת 10% שור סרום עוברי ו -1% פניצילין, streptomyCIN) לרקמות ולהוסיף Fungizone (0.25 מיקרוגרם / מיליליטר בריכוז סופי) ל30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את תקשורת הצמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף רקמה פעמיים עם 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הרקמה על צלחת תרבית תאי 6 סנטימטר להבחין בין myometrium ושכבות רירית הרחם (ראה איורים 2 א-2C לתיאור נוסף). הפרד את רירית הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות להב סכין מנתחים או סכין גילוח, ויחצה את הרקמה לחתיכות קטנות תוך מגרד על צלחת תרבית תאי 6 סנטימטר. סריטות אלה להקל על ההתקשרות של תאי רירית הרחם העיקריים המתעוררים. בהשוואה לשיטת טריפסין, יש צורך יותר רקמה (ראה איור 2 ד לקירוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות, להוסיף 2 מיליליטר של תקשורת צמיחה לצלחת שרוטה (שברי רקמה יהיו גלויים ומשותק באופן אידיאלי מתנועת הגירוד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הצלחת (ים) לחממה ייעודית תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2). לייעד מקום לשורות תאים ראשוניים, מן othאה מנות תרבות תא. תרבויות עיקריות הן רגישות יותר להידבקות וזיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון את התאים תחת מיקרוסקופ אור יומי. אוכלוסיות קטנות של תאים צריכים להופיע ביום שניים או שלושה מרחבי הרקמות הפרוסים (ראו איור 3 ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור על תרבויות, לשטוף בעדינות עם 1X PBS ולהוסיף תקשורת טרי צמיחה (2ml) כל שלושה ימים. כאשר העלאות ריבית התפשטות, מדיה נוספת צמיחה (3-4 מיליליטר) ניתן להוסיף לצלחת 6 סנטימטר התרבות (ים). הערה: במהלך שינויי כביסה ותקשורת, חתיכות של רקמות צפויות להישאף. זו לא תשפיע על צמיחה של תאים חסיד. חתיכות של רקמה צריכה להישאף על ידי השלב שלאחר מכן (2.10) כמושבות חדשות צפויים לצאת אחרי שבוע אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר צלחת 6 סנטימטר היא כ 75 - מחוברות 80% (ראה איור 3 ב), מעבר באמצעות טריפסין 0.05%. לא ניתן passaged תאים ראשוניים ללא הגבלת זמן - להקפיא את צלחת אחד מתאים בהקדם שתיים או שלוש צלחות הן maintained. אם יותר קטעים נדרשים, בצע את פרוטוקול הנצחה (הנסקרת ב נ&quot;צ 3). </li></ol> 3. הכנה של שורות תאים ראשוניות בשיטת טריפסין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים פיסה קטנה של רקמת רירית הרחם (ראה איור 2 ד לקירוב) ב 2 מיליליטר של טריפסין 0.25% בתוספת Kanamycin (0.03 מ&quot;ג / מיליליטר בריכוז סופי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה רקמה על 37 מעלות צלזיוס במסתובבת פלטפורמה ל30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה מערבולת הרקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה המדגם ב 200-400 XG במשך 2 דקות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת טריפסין הטרי וKanamycin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הרקמה על 37 מעלות צלזיוס בזמן מסתובב לשעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת הרקמות ל5-10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 2ml של תקשורת צמיחה (בתוספת 10% שור סרום עוברי ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין) כדי לבטל את טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה ב 200-400 XG במשך 2-3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ולהוסיף 2 מיליליטר של לגדולתקשורת ה לתאי pelleted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת על צלחת תרבית תאי 6 סנטימטר. מגרד את הצלחת כמו בשלב 2.5 של הכנת שורות תאים ראשוניות בשיטת האוספות הוא לא הכרחי, אבל משפר את הקובץ המצורף ותולדה של תרבויות עיקריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על תאים תחת מיקרוסקופ אור יומי. תאים הם בדרך כלל גלויים תחת מיקרוסקופ אור לאחר 24-48 שעה (ראו איור 3 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור על התרבויות, לפקח על התאים ולשנות את התקשורת בכל 2-3 ימים כמו בשלב 2.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למעבר התאים, השתמשו 0.05% או 0.25% טריפסין כאשר תאים מגיעים confluency 75-80% (ראה איור 3 ג). </li></ol> 4. שמירת רקמות נוספות לניתוח בהקפאה (הצמד ופורמלין קיבוע) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף מדגם פעמיים עם 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב הרבה נוזלים ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפאת הצמד, למקם את דגימת רקמת רירית הרחם בצינור 1.7 צנטריפוגות (ראה 2F דמויות ו2G). הנח את 1.7צינור צנטריפוגות בחנקן נוזלי ל10 שניות או עד שניתן לראות שהרקמה הקפיאה למטה. שים לב: יש להיזהר שלא לגעת בחנקן נוזלי ישירות בעת הכנת דגימות. דוגמאות ניתן לאחסן ב -80 ° C עד עיבוד או ניתוח נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקיבעון פורמלין, לחתוך פיסה קטנה של רקמת רירית הרחם (ראה איור 2H), ולצלול ב10% פורמלין אבץ שנאגרו. לאחר 24 שעות, להשליך פורמלין ולהוסיף 70% אתנול לדגימות רקמה ועד עיבוד נוסף. </li></ol> 5. Immunofluorescence (IF) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קיבוע תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את התאים בשקופית תרבות או צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות, לשטוף תאים עם 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת מתנול טרום צונן (4 מעלות צלזיוס) ואצטון (מעורבב ביחס של 1:1) במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוויר יבש השקופית לפני שתמשיך. שקופית יכולה להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שבועות במידת צורך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיבוד IF <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננות תאים עם 1X PBS עבור 10 דקות. עבור עבורllowing שלבי 1-6, לנהל את כל הכביסות וincubations על פלטפורמה מסתובבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק באמצעות 1X PBS בתוספת 1% הסרום אלבומין שור (BSA) וסרום מיני 1% ספציפיים (מקור 2 nd נוגדן) ל30 דקות בטמפרטורת חדר (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בנוגדן ראשוני (ראה המלצות יצרנים לדילולי נוגדנים). מתייחס לחומרים לנוגדנים ספציפיים. לדלל את הנוגדן הראשוני במאגר חסימה טרי כמו בשלב 5.2.2. דגירה זה יכול להתנהל במשך לפחות שעה 2 ב RT או הלילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים עם 1X PBS במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בנוגדנים משני (ראה המלצות יצרנים לדילולי נוגדנים). לדלל את הנוגדנים משני במאגר חסימה טרי כמו בשלב 5.2.2. כדי למנוע צילום הלבנה, חשוב לנהל את זה, והשלבים הבאים בהיעדר האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים עם 1X PBS במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Thoroughly לייבש את השקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מדיה גוברת ופתרון counterstaining DAPI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל coverslip וסוגר את הקצוות באמצעות איטום (ים). שקופיות ניתן לאחסן ב 4 ° C בחושך עד 2 שבועות. </li></ol></li></ol> 6. RNA חילוץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה 1 x 10 7 תאים על ידי צנטריפוגה. כל החומרים וחומרים כימיים בפרוטוקול זה צריכים להיות RNase חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Lyse במגיב 1 Trizol מיליליטר, דגירה הדגימות הומוגני ל10 דקות בטמפרטורת חדר כדי להשלים את הניתוק של מתחמי nucleoprotein. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של כלורופורם לכל 1 מיליליטר של Trizol. לנער במרץ ביד ל15 שניות ודגירה של 2-3 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במהירות המרבית (15,000 XG) במשך 15 דקות ב 4 ° C. שלוש שכבות יגרמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את השלב מימיים העליון לתוך צינור microcentrifuge טרי. הוספת גליקוגן μl 1 כדי להגדיל את תשואת RNA; עם זאת, צעד זה הוא הכרחי רק כאשר קטןכמות הרנ&quot;א צפויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מיליליטר של אלכוהול לשכבה המימית, ולהפוך את הדגימות 3-5 פעמים. דגירה דגימות ב RT עבור 10 דקות. כדי להגדיל את התשואה, ניתן להציב דגימות ב-20 ° C או -80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במהירות המרבית ל10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, גלולה קטנה של RNA צריכה להיות גלויה. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את RNA עם 1 מיליליטר של 75% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במהירות המרבית למשך 5 דקות וזורקים supernatant. ניתן לכבס דגימות פעם נוספת ללהיפטר מזהמים אורגניים, אך צעד זה אינו הכרחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה, לייבש את גלולה RNA עד RNA גלולה היא יבשה (בדרך כלל לוקח 7-10 דק &#39;). הערה: צעד נוסף אחד יכול להשתמש בו כדי להקטין את העניין אורגני ולצמצם את זמן ייבוש. לאחר השלכת supernatant מלשטוף אתנול, דגימות ספין במהירות המרבית למשך דקה נוספת ונוזל שיורי לשאוב. שים לב שלא לשאוב גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר RNA במי RNase ללא, תלוי בגודל של גלולה RNA. כרכים בדרך כלל נעים 10-50 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות ב55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולמדוד את הריכוז של רנ&quot;א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות חנות ב -20 ° C עד עיבוד נוסף. </li></ol> 7. הפוך תמלול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא את RNA המדגם (1-3 מיקרוגרם) בהיקף של 9 μl עם H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RNA חום ל70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור תערובת הורים AMV, לשלב את ריאגנטים הבאים: 5 μl של dNTP (ריכוז עבודה של 50 מיקרומטר), 5 μl של oligos N6-DNA (ריכוז עבודה של 80 מיקרומטר), 5 μl של חיץ 5X AMV, וμl 1 של AMV . פתרון תערובת אמן זה נועד לדגימה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 16 μl של מיקס מאסטר RNA המחומם. סופי עוצמת התגובה תהיה 25 תגובת μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתנאים הבאים PCR לשעתוק לאחור: (השלב ​​1) C ° 42 ל90 דקות, (STAge 2) 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ו( שלב 3) 4 ° C עד עיבוד נוסף. </li></ol> 8. Time PCR נדל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל PCR תגובות באמצעות פריימרים, טמפרטורות חישול, מספרי מחזור, וחומרים כימיים הנמצאים בטבלה 1. שים לב: הוא אידיאלי לעקוב אחר הוראות יצרן בעת שימוש בחומרים כימיים PCR (מתייחס למספרי חברה וקטלוג בחומרים). </li></ol> 9. במבחנה Decidualization Protocol (נגזר 4 Ref ו5) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאי רירית הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול confluency של 75-85%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התאים הופכים מחוברות, לשטוף פעם אחת עם 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות, להוסיף מדיה ללא הורמון (RPMI בחינם פנול בתוספת 5% FBS רצועת פחם ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, להוסיף מדיה הורמון חופשי בתוספת אצטט medroxyprogesterone (MPA) בריכוז סופי של 1 מיקרומטר ו8-bromoadenosine 3 &#39;, 5&#39;monophosphate מחזורי (cAMP) בריכוז סופי של 0.5 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי לפחות 48 שעות, לעצור את התגובה ולשמור את הצלחת (ים) לעיבוד נוסף. </li></ol>

<ol><li>Heller, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeller%2C+D+%22in+The+endometrium%3A+a+clinicopathologic+approach%22">in The endometrium: a clinicopathologic approach</a>. Heller, D. , 56-75 (1994).</li>
<li>Emera, D., Romero, R., Wagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+menstruation%3A+a+new+model+for+genetic+assimilation%3A+explaining+molecular+origins+of+maternal+responses+to+fetal+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">The evolution of menstruation: a new model for genetic assimilation: explaining molecular origins of maternal responses to fetal invasiveness.</a> Bioessays. 34, 26-35 (2011).</li>
<li>Gudjonsson, T., Villadsen, R., Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+protocols+used+in+cell+culture+models+of+human+breast+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Immortalization protocols used in cell culture models of human breast morphogenesis.</a> Cell Mol Life Sci. 61, 2523-2534 (2004).</li>
<li>Brosens, J. J., Hayashi, N., White, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+receptor+regulates+decidual+prolactin+expression+in+differentiating+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells.</a> Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).</li>
<li>Jones, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+SUMO+pathway+sensitizes+differentiating+human+endometrial+stromal+cells+to+progesterone%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Regulation of the SUMO pathway sensitizes differentiating human endometrial stromal cells to progesterone.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 16272-16277 (2006).</li>
<li>Salamonsen, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+the+human+endometrium+and+uterine+fluid%3A+a+pathway+to+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Proteomics of the human endometrium and uterine fluid: a pathway to biomarker discovery.</a> Fertil Steril. 99, 1086-1092 (2013).</li>
<li>Haouzi, D., Dechaud, H., Assou, S., De Vos, J., Hamamah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+human+endometrial+receptivity+from+transcriptomic+and+proteomic+data%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biomed+Online%22%5BJournal%5D)">Insights into human endometrial receptivity from transcriptomic and proteomic data.</a> Reprod Biomed Online. 24, 23-34 (2012).</li>
<li>Chen, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+midproliferative+and+midsecretory+human+endometrium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of midproliferative and midsecretory human endometrium.</a> J Proteome Res. 8, 2032-2044 (2009).</li>
<li>Talbi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+phenotyping+of+human+endometrium+distinguishes+menstrual+cycle+phases+and+underlying+biological+processes+in+normo-ovulatory+women%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Molecular phenotyping of human endometrium distinguishes menstrual cycle phases and underlying biological processes in normo-ovulatory women.</a> Endocrinology. 147, 1097-1121 (2006).</li>
<li>Punyadeera, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oestrogen-modulated+gene+expression+in+the+human+endometrium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Oestrogen-modulated gene expression in the human endometrium.</a> Cell Mol Life Sci. 62, 239-250 (2005).</li>
<li>Ponnampalam, A. P., Weston, G. C., Susil, B., Rogers, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+human+endometrium+during+the+menstrual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Aust+N+Z+J+Obstet+Gynaecol%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of human endometrium during the menstrual cycle.</a> Aust N Z J Obstet Gynaecol. 46, 154-158 (2006).</li>
<li>Zhang, L., Rees, M. C., Bicknell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+long-term+culture+of+normal+human+endometrial+epithelium+and+stroma.+Expression+of+mRNAs+for+angiogenic+polypeptides+basally+and+on+oestrogen+and+progesterone+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The isolation and long-term culture of normal human endometrial epithelium and stroma. Expression of mRNAs for angiogenic polypeptides basally and on oestrogen and progesterone challenges.</a> J Cell Sci. 108 (1), 323-331 (1995).</li>
<li>Richards, R. G., Brar, A. K., Frank, G. R., Hartman, S. M., Jikihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+cells+from+term+human+decidua+closely+resemble+endometrial+stromal+cells%3A+induction+of+prolactin+and+insulin-like+growth+factor+binding+protein-1+expression%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Fibroblast cells from term human decidua closely resemble endometrial stromal cells: induction of prolactin and insulin-like growth factor binding protein-1 expression).</a> Biol Reprod. 52, 609-615 (1995).</li>
<li>Gellersen, B., Brosens, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+and+progesterone+receptor+cross-talk+in+human+endometrium%3A+a+decidualizing+affair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP and progesterone receptor cross-talk in human endometrium: a decidualizing affair.</a> J Endocrinol. 178, 357-372 (2003).</li>
<li>Marsh, M. M., Hampton, A. L., Riley, S. C., Findlay, J. K., Salamonsen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+endothelin+released+by+human+endometrial+epithelial+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of endothelin released by human endometrial epithelial cells in culture.</a> J Clin Endocrinol Metab. 79, 1625-1631 (1994).</li>
<li>Siegfried, J. M., Nelson, K. G., Martin, J. L., Kaufman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+identification+of+cultured+cells+from+human+endometrium%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Histochemical identification of cultured cells from human endometrium.</a> In Vitro. 20, 25-32 (1984).</li>
<li>Rawdanowicz, T. J., Hampton, A. L., Nagase, H., Woolley, D. E., Salamonsen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase+production+by+cultured+human+endometrial+stromal+cells%3A+identification+of+interstitial+collagenase%2C+gelatinase-A%2C+gelatinase-B%2C+and+stromelysin-1+and+their+differential+regulation+by+interleukin-1+alpha+and+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase production by cultured human endometrial stromal cells: identification of interstitial collagenase, gelatinase-A, gelatinase-B, and stromelysin-1 and their differential regulation by interleukin-1 alpha and tumor necrosis factor-alpha.</a> J Clin Endocrinol Metab. 79, 530-536 (1994).</li>
<li>Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+11+advances+progesterone-induced+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells.</a> Mol Hum Reprod. 8, 636-643 (2002).</li>
<li>Sakai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+histone+acetylation+in+ovarian+steroid-induced+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Involvement of histone acetylation in ovarian steroid-induced decidualization of human endometrial stromal cells.</a> J Biol Chem. 278, 16675-16682 (2003).</li>
<li>Logan, P. C., Ponnampalam, A. P., Steiner, M., Mitchell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cyclic+AMP+and+estrogen%2Fprogesterone+on+the+transcription+of+DNA+methyltransferases+during+the+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of cyclic AMP and estrogen/progesterone on the transcription of DNA methyltransferases during the decidualization of human endometrial stromal cells.</a> Mol Hum Reprod. 19, 302-312 (2013).</li>
<li>Tamura, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+IGFBP-1+expression+by+cAMP+is+associated+with+histone+acetylation+status+of+the+promoter+region+in+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Induction of IGFBP-1 expression by cAMP is associated with histone acetylation status of the promoter region in human endometrial stromal cells.</a> Endocrinology. 153, 5612-5621 (2012).</li>
<li>American Society for Reproductive Medicine: Quick facts about infertility. , Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://www.asrm.org/detail.aspx?id=2322">http://www.asrm.org/detail.aspx?id=2322</a> (2013).</li>
<li>Salker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+selection+of+human+embryos%3A+impaired+decidualization+of+endometrium+disables+embryo-maternal+interactions+and+causes+recurrent+pregnancy+loss%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Natural selection of human embryos: impaired decidualization of endometrium disables embryo-maternal interactions and causes recurrent pregnancy loss.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
</ol>

המחברים אין לגילוי.

קבוצות אחרות שתיארו והותאמו המתודולוגיה להכנת תרבויות סטרומה רירית הרחם, שרובם לנצל collagenase 4,12,13,15-18. בכתב היד הזה, שאנו מספקים מתודולוגיה וראיות לשתי שיטות עיקריות פשוטות של רירית הרחם תרבות סטרומה, אשר שניהם מנוצלים על ידי המעבדה שלנו מסיבות כלכליות והזמינות הנוחה של טריפסין ו / או סכין גילוח. כאשר משווים את שתי השיטות שלנו, הן ליצור בהצלחה תרבויות עיקריות קיימא. השיטה המועדפת שלנו היא שיטת ...

קורפוס הרחם האנושי מורכב משלוש שכבות, perimetrium (או serosa), myometrium, ורירית הרחם. הבחנה כל אחת משכבות אלה הוא צעד חשוב להקמת שורות תאים של רירית הרחם. Perimetrium הוא רוב השכבה החיצונית של הרחם ומורכב של תאים דקים, הצפק. Myometrium הוא השכבה העבה, באמצע של הרחם ומורכב מתאי שריר חלק. רירית הרחם מזוהה כשכבה הפנימית של הרחם וכולל אוכלוסיות האפיתל ותאים סטרומה. רירית הרחם הוא מחולק חלוקה נוספת לשכבת basalis גזע שאוכלוסיית תאי השערה היא לאכלס מחדש את שכבת functionalis בערך כל 28 ימים 1. שכבת functionalis של רירית הרחם האנושית עוברת שינויים ביוכימיים ומורפולוגיים משמעותיים בתגובה למחזור הורמונים. הורמונים אלה נגזרים מבלוטת יותרת המוח והשחלות. ייצור מתואם ופרסום תוצאות הורמונים במחזור רבייה. מחזור הרבייה נועד להכין את רירית הרחם לאירועי השרשת עובר פוטנציאליים. בבני אדם, מחזור הרבייה ידוע בשם &quot;המחזור החודשי&quot; ומחולק לשלושה שלבים - שגשוג, הפרשה, ווסת. שלב השגשוג כרוך ההתפשטות של שכבת רירית הרחם functionalis ואילו שלב ההפרשה מתאפיין בהבשלת functionalis. באופן ספציפי, שינויים תאיים, הפרשות, והתמיינות תאים לאותת השתלה פוטנציאלית. אם השתלה אינה מתרחשת לפני תום שלב ההפרשה, שכבת רירית הרחם functionalis נשפכה במהלך שלב הווסת. חשיבותה של וסת והאירועים המפעילים את שפיכת שכבת functionalis הם עדיין נדונה. בבני אדם, זה כבר מציב כי וסת היא התוצאה של אירוע אמצע הפרשה בידול שלב מסוים ידועכ&quot; decidualization הספונטני &quot;2. בכתב יד זה, אנו מספקים מתודולוגיה מפורטת לשתי שיטות בידוד תא סטרומה רירית הרחם, ולהשתמש בשילוב של immunofluorescence ותמונות דיגיטליות להדגים את היעילות של גישות אלה. בנוסף, אנו מיישמים את השימוש נפוץ במודל חוץ גופית של decidualization הספונטני כדי לאשר בידוד תא סטרומה רירית הרחם.

<table><tbody><tr><td>0.25 טריפסין או 0.05% טריפסין&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH3023602 או SH30004202</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה 1.7 מיקרו&nbsp; &nbsp;</td><td>ג'נסי סיינטיפיק</td><td>22-272A</td><td></td></tr><tr><td>1 ומיקרו; l, 20 ומיקרו; l, 200 מ"ל ו-1,000 ומיקרו; l פיפטה&nbsp; &nbsp;</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-401,24-402, 24-412, 24-430</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינור חרוט&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>שפופרת חרוטית 50 מ"ל&nbsp;</td><td>היקלון</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>6 ס"מ צלחת תרבית תאים&nbsp;</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>12-556-002</td><td></td></tr><tr><td>8 בארות Chambers&nbsp;</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>AB-4162</td><td></td></tr><tr><td>אצטט&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>C4-100</td><td></td></tr><tr><td>AMV RT אנזים/בופר&nbsp;</td><td>Bio Labs</td><td>M077L</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1605-100</td><td></td></tr><tr><td>פורמלין אבץ חומצי&nbsp;</td>פס פחם <td>תרמו</td><td>59201ZF</td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>פישר</td><td>NC9019735</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>תלוש כיסוי&nbsp;</td><td>מותג פישר</td><td>12-544D</td><td></td></tr><tr><td>AMP מחזורי (cAMP)&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>B7880</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/גלוקוז גבוה&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30243FS</td><td></td></tr><tr><td>dNTP&nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td></td></tr><tr><td>חמור נגד עיזים -TRITC&nbsp;</td><td>סנטה קרוז</td><td>SC-3855</td><td></td></tr><tr><td>סרום חמורים&nbsp;</td><td>ג'קסון' s lab</td><td>017-000-002</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן E Cadherin&nbsp; &nbsp;</td><td>אפיטומיקס</td><td>1702-1</td><td></td></tr><tr><td>אתנול&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-1</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>03-600-511</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone Amphotericin B&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>בדיקת GAPDH&nbsp;</td><td>לייף טכנולוגיות</td><td>HS99999905</td><td></td></tr><tr><td>גליקוגן&nbsp;</td><td>5Prime</td><td>2301440</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר עיזים - FITC&nbsp;</td><td>ג'קסון' s מעבדה</td><td>115-096-003</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופנול&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td>קנמיצין&nbsp; &nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>מדרוקסיפרוגסטרון אצטט (MPA)&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>M1629</td><td></td></tr><tr><td>MeOH (מתנול)&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A4-08-1</td><td></td></tr><tr><td>אמצעי הרכבה (עם DAPI)&nbsp;</td><td>Vector Labratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>N6 DNA אוליגוס&nbsp;</td><td>מגרד Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מספר 15&nbsp; &nbsp;</td><td>BD</td><td>371615</td><td></td></tr><tr><td>פאן ציטוקרטין&nbsp; עכבר mAB&nbsp;</td><td>איתות תאים</td><td>4545</td><td></td></tr><tr><td>PBS (מי מלח חוצץ פוספט)&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP-399-4</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת גלוטמין פניצילין-סטרפטומיצין 100X&nbsp; &nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SV30082.01</td><td></td></tr><tr><td>PML נגד גוף נגד עזים&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9862</td><td></td></tr><tr><td>פריימר(ים)&nbsp;</td><td>Eurofins</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI&nbsp;</td><td>היקלון</td><td>SH30027FS</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (ללא פנול)&nbsp;</td><td>גיבקו</td><td>11835</td><td></td></tr><tr><td>סייבר גרין&nbsp; &nbsp;</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>AB-4162</td><td></td></tr><tr><td>תקמן&nbsp;</td><td>תרמו</td><td>AB-4138</td><td></td></tr><tr><td>טריזול&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן וימנטין&nbsp;</td><td>אפיטומיקס</td><td>4211-1</td><td></td></tr></tbody></table>

שתי שיטות לקביעת אדם תאי רירית הרחם סטרומה ראשיים מדוגמאות כריתת הרחם

Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

מאמצים רבים הוקדשו להקמת מערכות בתרבית תאים במבחנה. מערכות אלה נועדו לבנות מודל של מספר עצום של in vivo תהליכים. מערכות תרבית תאים הנובעות מדגימות של רירית הרחם אדם אינן יוצאי דופן. יישומים נעים בין תהליכים פיסיולוגיים מחזוריים רגילים לפתולוגיות של רירית הרחם כגון סרטן גינקולוגיות, מחלות זיהומיות, וליקויי פוריות. כאן, אנו מספקים שתי שיטות להקמת תאי סטרומה רירית הרחם עיקריים מדגימות כריתת רחם רירית הרחם שעברו כריתה בניתוח. השיטה הראשונה מכונה &quot;שיטת הגירוד&quot; ומשלבת גירוד מכאני באמצעות סכין כירורגית או גילוח ואילו בשיטה השנייה נקראת &quot;שיטת טריפסין.&quot; שיטה זו האחרונה משתמשת בפעילות האנזימטית של טריפסין כדי לקדם את ההפרדה של תאים והעיקריים תא תולדה. אנו מדגימים המתודולוגיה צעד אחר צעד באמצעות תמונות ומיקרוסקופ דיגיטליים. אנחנו גם providדוגמאות דואר לאימות שורות תאי סטרומה רירית הרחם באמצעות תגובות כמותיים בזמן אמת שרשרת פולימרז (qPCR) וimmunofluorescence (IF).

כפי שהודגש בסעיף הפרוטוקול, כדי להיות בטוח לנהל את כל השיטות תחת ממשלתי, מוסדיות, וקווים המנחים אתיים בעת טיפול והכנת רקמה אנושית. בכתב היד הזה כלול הוא איור של זרימת העבודה הכללית של &quot;שיטת הגירוד&quot; (איור 1 א) ואת &quot;שיטת טריפסין&quot; (איור 1) המשמשת להקמת תרבויות רירית הרחם ראשונית. שיטות אלה מתוארות בפירוט בסעיף הפרוטוקול (ראה חלקי...

הקמת מערכות עיקריות של רירית הרחם סטרומה תא תרבות מדגימות כריתת רחם היא טכניקת ערך ביולוגית וצעד חיוני לקראת רודף מגוון רחב של מחקר שואף. כאן, אנו מתארים שתי שיטות המשמשות להקמת תרבויות סטרומה מרקמות של רירית הרחם שעברו כריתה כירורגית של חולים אנושיים.

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להקים תרביות ראשוניות של תאי סטרומה של רירית הרחם (endometrial stromal cells) מרחמים שהוסרו בניתוח היסטרקטומיה. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הבחנה והפרדה בין שכבות הרחם כדי לבודד מקטע של רקמת רירית הרחם. השלב השני הוא בחירת טכניקה לבידוד תאים בין שיטת הגרידה (scraping) לשיטת הטריפסין (trypsin) בעת שימוש בשיטת הגרידה.כוח מכני וגירוד משמשים להפרדה ולפירוק של תאי סטרומה של רירית הרחם. לחלופין, בשימוש בשיטת הטריפסין, נעזרים בפעילות האנזימטית של הטריפסין כדי להפריד ולפרק את תאי הסטרומה של רירית הרחם. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה כדי לצפות בצמיחת התאים ובמורפולוגיה שלהם, בעוד ששיטות אחרות הנידונות בכתב היד משמשות לאימות של תרביות סטרומה של רירית הרחם.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות פיזיולוגיות מרכזיות בתחום הרבייה, כגון מחזור הרבייה והוסת. דגימות כריתת רחם (Hysterectomy) ששימשו בכתב יד זה נאספו בהתאם לפרוטוקול אתי מאושר על ידי IRB אוניברסיטאי שמספרו I-R-B-H-S-R מספר 1 4 4 2 4. יש לשמור רקמות המופקות ממטופלים במבחנה של 50 milliliter המכילה RPMI או DMEM עם רמות גלוקוז גבוהות בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius למשך זמן שאינו עולה על 24 שעות לפני עיבוד הדגימה. כאשר מתחילים בתהליך, יש לשטוף את דגימת הרקמה שלוש פעמים עם 1X PBS ולהשליך את התמיסה בין שטיפה לשטיפה.לאחר מכן, הוסף לדגימת הרקמה ארבעה עד 10 מיליליטר של מצע גידול המועשר ב-10% FBS ו-1% penicillin streptomycin. כמו כן, הוסף fungi zone לריכוז סופי של 0.25 micrograms per milliliter והדגר למשך 30 דקות. לאחר מכן, שאף את מצע הגידול ושטוף את הרקמה פעמיים עם one XPBS.הניחו את הרקמה על פלטת תרבית תאים של שש סנטימטרים וזהו את שכבת האנדומטריום באמצעות תמונות אלו כמדריך. לאחר מכן, הפרידו את האנדומטריום ושמרו את שכבות הרקמה האחרות לשימוש עתידי. השתמשו בסכין מנתחים או בלהב תער כדי לחתוך את הרקמה לחתיכות קטנות תוך כדי גירוד על פלטת תרבית התאים.השריטות מקלות על ההיצמדות של תאי הסטרומה האנדומטריאליים הראשוניים המופיעים. לאחר מכן, הוסיפו בעדינות 2 mL של מצע גידול לצלחית השרוטה. בשלב זה, ניתן יהיה לראות שברי רקמה המקובעים כתוצאה מפעולת השריטה.הניחו את הצלחת באינקובטור ייעודי לתרביות תאים, בנפרד מקווי תאים אחרים כדי למנוע זיהום. עקבו אחר התאים מדי יום באמצעות מיקרוסקופ אור. חפשו אוכלוסיות קטנות של תאים שיוצאים מהרקמה הפרוסה עד היום השני או השלישי, ובצעו זאת מדי שלושה ימים.הסר בעדינות את מדיום השטיפה הישן באמצעות XPBS אחד ולאחר מכן הוסף שני מיליליטרים של מדיום גידול טרי. התחל להוסיף ארבעה מיליליטרים של מדיום גידול. ברגע שקצב השגשוג עולה במהלך שלבי השטיפה, שאב את שאריות הרקמה.סביר להניח שמושבות חדשות לא יופיעו מהרקמה. לאחר שבוע אחד של מעבר גידול, מנתקים את התאים באמצעות 0.05% trypsin. כאשר התאים מגיעים ל-75 עד 80% confluence, מקפיאים פלטה אחת של תאים.לאחר תחזוקה של שתי או שלוש צלחות, לא ניתן להעביר תאי מקור באופן אינסופי. כדי להתחיל בידוד באמצעות טריפסין, מקמים פיסה קטנה של רקמת אנדומטריום לשפופרת קונית עם two milliliters של 0.25% Trypsin בתוספת 0.03 milligrams per milliliter של Gentamicin, ולאחר מכן מדגירים את הרקמה על פלטפורמה מסתובבת ב-37 °C למשך 30 דקות.בשלב הבא, ערבבו קצרות את הרקמה ב-vortex ולאחר מכן סבבבבו בצנטריפוגה ב-200 עד 400 ×g למשך שתי דקות, השליכו את העלייה (supernatant) והוסיפו trypsin ו-puromycin טריים. לאחר מכן, דגרו את הרקמה ב-37 °C למשך שעה אחת תוך כדי סיבוב. לאחר הדגירה, ערבבו את הרקמה ב-vortex למשך 5 עד 10 שניות.לאחר מכן, הוסיפו שני מיליליטר של מצע גידול המכיל 10%FBS ו-1%penicillin streptomycin. כדי לנטרל את ה-trypsin, סבבו את התאים בצנטריפוגה ב-200 עד 400 ×g למשך שתיים עד שלוש דקות. לאחר מכן, השליכו את הנוזל העליון (supernatant) והשעיכו מחדש את משקע התאים.בשני מיליליטר של מצע גידול, פזרו את תרחיף התאים על צלחת תרבית תאים של שישה סנטימטרים וגרדו את הצלחת כדי להגביר את ההיצמדות של התאים הראשוניים. עקבו אחר צמיחת התאים מדי יום באמצעות מיקרוסקופ אור והחליפו את מצע הגידול כל יומיים עד שלושה ימים. לאחר שהתאים הגיעו למסף (confluency) של 75% עד 80%, השתמשו ב-0.05% או 0.25% trypsin כדי להעביר אותם (passage) לצורך בידוד של תאי סטרומה של רירית הרחם.שימוש בשיטת הגרידה יוצר צבירים של תאים המופיעים בשלב מוקדם. לאורך השריטות שנוצרו על ידי הסכין, ניתן לזהות את תאי הסטרומה של רירית הרחם לפי המורפולוגיה הפיברובלסטית שלהם. לשיטת הטריפסין זמן הכנה ארוך יותר מאשר לשיטת הגרידה, אך תאים חיוניים נצפים בשלב מוקדם יותר.שיטת ה-tryin מייצרת תאים בעלי דפוסי גדילה מצוברים ומפוזרים כאחד. סמן ספציפי לרקמה עבור תאי סטרומה של רירית הרחם טרם התגלה. דרך אחת לזיהוי תאי סטרומה של רירית הרחם היא על ידי מדידת אובדן של סמן.עבור תאים אפיתליאליים כגון cytokeratin. היעדר cytokeratin מעיד על היעדר תאים אפיתליאליים של רירית הרחם. אובדן הצביעה של cytokeratin שנצפה במעבר חמישי בהשוואה למעבר שני, מאשר את היעדרם של תאים אפיתליאליים.ניתן לספק ראיות תפקודיות לנוכחות של תאי סטרומה של רירית הרחם באמצעות בדיקת דה-צלולריזציה (decellularization). העלייה בפרולקטין ובחלבון קשירה של גורם גדילה דמוי אינסולין 1 בתגובה לטיפול ב-CAMP וב-hydroxy progesterone acetate מעידה על הקמה מוצלחת של תרבית סטרומה של רירית הרחם. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו מקים תרביות ראשוניות של תאי סטרומה של רירית הרחם מרחמים שהוסרו בניתוח היסטרקטומיה.

two-methods-for-establishing-primary-human-endometrial-stromal-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול לבידוד תאים מזותליים אנושיים ראשוניים מדגימת האומנטום האנושי. ניתן להשתמש בתאי המזותל כדי לבסס מודל סרטן שחלות במבחנה כדי לחקור הידבקות תאי סרטן השחלות, פלישה והתפשטות.

בידוד תאי מזותל: טכניקה לבידוד תאים מזותליים ראשוניים מדגימת רקמת אומנטום אנושית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבניית מודל תלת מימדי במבחנה של רירית חלל הצפק, המורכב מתאי מזותל אנושיים ראשוניים ופיברובלסטים בשכבות עם מטריצה חוץ-תאית, ככלי לחקירת הדבקה, פלישה והתפשטות של תאי סרטן השחלות.

דוגמנות השלבים המוקדמים של סרטן השחלות הפצה בתרבות Organotypic של אדם חלל הבטן

מחקר זה מציג שיטה סטנדרטית ומאומתים עבור בידוד והתרבות של סטרומה רירית הרחם העכבר העיקרי ותאי אפיתל, אשר ניתן להשתמש בהם במערכת coculture ללמוד decidualization במבחנה.

בידוד של עכבר רירית הרחם אפיתל סטרומה תאים עבור<em&gt; במבחנה</em&gt; Decidualization

פרוטוקול זה מדגים שיטת הבידוד של תאים אנושיים decidual הראשית שנאסף בקרום עוברי של המונח placentae אשר יכול לשמש למגוון רחב של יישומים (קרי immunocytochemistry, cytometry זרימה, וכו ') מכוון ללמוד את התפקיד של אוכלוסיות תאים שונים בסיבוכים בהריון.

בידוד של ראשי תאים Decidual האנושי בקרום עוברי של המונח Placentae

מחקר זה מציג שגרה מאומת וממוטב עבור הבידוד של התרבות האנושית תאי סטרומה רירית הרחם לנהל במבחנה decidualization assay. יתרה מזאת, מחקר זה מספק שיטה מפורט ביעילות תמונות ציפורים גנים ספציפיים באמצעות siRNAs בתאי סטרומה רירית הרחם אדם.

לבידוד של תאי סטרומה רירית הרחם אדם במבחנה Decidualization

מטרת מתודולוגיה זו היא לזהות את תאי גזע הסרטן (csc) בקווי התאים של סרטן ודגימות הגידול האנושי הראשוני עם הפרוטוקול ליצירת כדור, בצורה איתנה, באמצעות בחני פונקציונלי ואפיון פנוטימית עם זרימה cy, try ומערבי מחוק.

קבלת סרטן גזע כדורים מגינקולוגית סרטן השד גידולים

פרוטוקול להפקת האנושי הראשי אורגנואידים רירית הרחם המורכבים של תאים אפיתל וסטרומה ולשמור מאפיינים של רקמת רירית הרחם היליד מוצג. פרוטוקול זה מתאר שיטות מרכישת רקמת הרחם לעיבוד היסטולוגית של אורגנואידים רירית הרחם.

הדור של אורגנואידים האדם העיקרי של רירית הרחם

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיות לביסוס אורגנואידים אפיתליאליים של רירית הרחם של עכברים לביטוי גנים וניתוחים היסטולוגיים.

הקמת אורגנואידים 3D רירית הרחם מרחם העכבר

פרוטוקול זה מדגים טכניקה אמינה ויעילה לבידוד פיברובלסטים ראשוניים מרקמת הנרתיק האנושית לפני גיל המעבר או לאחר גיל המעבר. הפרוטוקולים הקיימים לבידוד פיברובלסטים בנרתיק אינם לוקחים בחשבון את האתגרים של בידוד תאים מרקמה מזדקנת. רקמת הנרתיק התקבלה מנשים לאחר ניתוח צניחת איברי האגן.

עיבוד רקמות ובידוד פיברובלסטים ראשוניים מהנרתיק האנושי

הפרוטוקול מציג מודל ניסוי חדש במבחנה שיכול לסכם את הביולוגיה של שני סוגים של קווי תאים דבקים עם פיגום מודפס תלת מימדי (תלת מימד). מתוארים בניית מודל זה ונהלי הפעלה, מהכנת תאים ותרבית תאים ועד לניתוח והערכה.

מודל תרבית משותפת באמצעות שני סוגים של קווי תאים דבקים

למד שתי שיטות לבידוד תאי סטרומה ראשיים מרירית הרחם מדגימות כריתת הרחם באמצעות שפשוף מכני או טריפסין. הפרוטוקולים כוללים אימות באמצעות qPCR ואימונופלואורסצנציה לחקר פיזיולוגיה ופתולוגיה של מערכת הרבייה.

שתי שיטות לקביעת אדם תאי רירית הרחם סטרומה ראשיים מדוגמאות כריתת הרחם

גלה סרטונים נוספים