גורם הגדילה Electrospinning שחרור מיקרוסכמות לתוך סיביים פיגומים

פרוטוקול זה משלב אלקטרו-ספינינג ומיקרוספירות כדי לפתח פיגומים מהונדסי רקמות להכוונת נוירונים. גורם הגדילה העצבי היה עטוף בתוך מיקרוספירות PLGA והוכנס לפיגומים סיביים של חומצה היאלורונית (HA). הפעילות הביולוגית של החלבון נבדקה על ידי זריעת הפיגומים עם גרעיני שורש הגב של אפרוח ראשוני ותרבית במשך 4-6 ימים.

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור סביבה רב-גונית לתמיכה בצמיחה ותיקון עצבים. זה מושג על ידי עטיפת גורמי גדילה ראשונים בתוך מיקרוספירות מתכלות. השלב השני הוא הכנת חומר התמיכה לחלק הארי של הסביבה.

לאחר מכן, המיקרוספירות וחומר התמיכה משולבים ומסובבים אלקטרו לפיגום סיבי מיושר. השלב האחרון הוא בדיקת הפיגום עם נוירונים של גרעיני שורש גב אפרוח. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית משמשת כדי להראות שצמיחת הנויריטים וכיוונם מואצים בהשוואה לביקורת.

למרות שמערכת זו מיועדת לרקמות עצביות עם שינויים קלים בחלבונים ובחומרים המשמשים, ניתן ליישם אותה גם על סוגי רקמות שונים, כולל לב, ריאות ועצם. לפני תחילת הליך זה, הכינו את הריאגנטים הדרושים, תמיסות של 2% ו-0.5% משקל לנפח של אלכוהול פוליוויניל או PVA במים נטולי יונים, תמיסה של 2% נפח לנפח, אלכוהול איזופרופיל ומים נטולי יונים, ותמיסה מימית של החלבון ההידרופילי הרצוי. מקום. 40 מיליליטר מתמיסת ה-0.5% PVA לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר והניחו בצד בבקבוקון קטן מומס 300 מיליגרם של 65 עד 35 חומצה פולילקטית קו-גליקולית או PLGA ושלושה מיליליטר של די כלורו מתאן.

ניתן להשתמש במערבל מערבולת כדי להאיץ את פירוק PLGA בשילוב של 200 מיקרוליטר של תמיסת חלבון וארבעה מיקרוליטרים של תמיסת PVA 2%. שופכים את תערובת החלבון PVA לתמיסת PLGA. הפתרונות יישארו נפרדים ברובם.

מניחים את הבקבוקון בכוס מי קרח באמצעות W ator בכ-10 וואט, מערבבים את התמיסה למשך חמש עד 10 שניות עד שנוצר תחליב לבן קרמי אחיד. שופכים את התחליב לצינור 50 מיליליטר שהוכן בעבר המכיל 0.5% PVA. מערבבים את התמיסה במהירות גבוהה על מערבל מערבולת למשך כ -20 שניות.

הפתרון יפתח מראה מעונן. מעבירים את האמולסיה לכוס של 200 מיליליטר ומניחים על צלחת ערבוב ב -350 סל"ד למשך שתי דקות. הוסף 50 מיליליטר אלכוהול איזופרופיל 2% לכוס שעל צלחת הערבוב.

הניחו לתערובת להמשיך לערבב במשך שעה לפחות כדי לאפשר לכלורו מתאן להתאדות ול-PLGA להתקשות. לאחר מכן, העבירו את תמיסת המיקרוספירה לצינורות צנטריפוגה, צנטריפוגה ב -425 פעמים G למשך שלוש דקות. המיקרוספירות יתאספו בתחתית הצינור וייראו לבנים הסר בזהירות את הסופרנטנט מהצינור שמעל המיקרוספירות ואחסן בבקבוק של 500 מיליליטר.

שטפו את המיקרוספירות במים נטולי יונים על ידי מילוי כל צינור במלואו שלושה רבעים וניעורו כדי להפיץ מחדש את המיקרוספירות בנוזל. חזור על הסרת הצנטריפוגה של הסופרנטנט ושטיפה של המיקרוספירות במים נטולי יונים ארבע פעמים לאחר השטיפה הסופית. הסר את הסופרנטנט והניח בבקבוק 500 מיליליטר עם שאר הדגימות.

הקפיאו את המיקרוספירות שנאספו בצינורות הצנטריפוגות בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס למשך הלילה, ולאחר מכן ליופיליזציה למשך 24 שעות לפחות. יש להכין מראש את תמיסת האלקטרו ספינינג הבאה במים נטולי יונים, 2% משקל לנפח, חומצה היאלורונית הקשורה למת' או מיהה עם 3% משקל לנפח, 900 קילודלטון תחמוצת פוליאתילן או PEO ו-0.05% משקל לנפח. פתרון יוזם תמונות.

לאחר הכנת הנפח הרצוי של תמיסת ספינינג אלקטרו, הוסף מיקרוספירות בריכוז הרצוי עד 400 מיליגרם למיליליטר. מערבבים את התמיסה על מערבל מערבולת עד שהמיקרוספירות מתפזרות באופן שווה בתמיסה. העבירו את התמיסה למזרק והצמידו מחט קצה קהה בגודל 18 אינץ'.

הנח את המזרק במשאבת מזרק והגדר אותו להוציא 1.2 מיליליטר לשעה. הדביקו שכבה של נייר אלומיניום על השדרה. זה מאפשר ניקוי ואחסון קלים של הפיגום המוגמר.

ציר מסתובב משמש ליצירת סיבים מיושרים. חבר את חוט ההארקה מכרך גבוהtagמקור מתח למנגנון האיסוף. חבר את הכבל החיובי למחט כדי להבטיח סיבוב אלקטרו מוצלח.

חשוב מאוד לוודא שכל החיבורים וההגדרות נכונים. התחל את שאיבת הפולימר וכאשר התמיסה נראית בקצה המזרק, הפעל את מקור המתח והגדר את המתח ל -24 קילו-וולט. הפעל את התמיסה עד להשגת עובי הפיגום הרצוי.

בסיום, כבה את כרךtagמקור ומשאבת המזרק. כדי להתחיל בהליך זה, חבר את פתקי הכיסוי הקשורים לאזור האיסוף של הספינר האלקטרו עם סרט דו צדדי נשלף לפני סיבוב אלקטרו. סיבוב על הכיסוי מחליק, מקל על הטיפול והצפייה לאחר סיבוב אלקטרו לעובי הרצוי.

כפי שהודגם בקטע הווידיאו הקודם, הסר בזהירות את פתקי הכיסוי מהשדרה הנח את המכסה המצופה פיגום לתוך תא חנקן שקוף וודא שכל החמצן מטוהר. הנח את החדר והפיגום מתחת לאור של 10 מיליוואט סנטימטר מרובע של 365 ננומטר למשך 15 דקות.

לאחר מקום הצלבה, הכיסוי מחליק לצלחת באר בגודל מתאים. ודא שצד הפיגום פונה כלפי מעלה. מניחים 100 עד 200 מיקרוליטר מדיה על כל פיגום בצלחת הבאר. בזהירות.

הנח גרעיני שורש גב אחד או DRG על כל פיגום בטיפת המדיה. עבור פיגום עבה, ייתכן שיהיה צורך במדיה נוספת. ה-DRG צריך להיות שקוע לחלוטין ולא צף.

דגרו על הפיגום וה-DRG ב-37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות כדי לאפשר לתא להיצמד לפיגום. לאחר מכן, מלאו את המדיה לרמה המתאימה לבאר. החזירו את הצלחת לחממה ודגרו במשך ארבעה עד שישה ימים לאחר תקופת הדגירה.

הסר בזהירות את המדיה מכל באר ושטוף בעדינות פעם אחת עם PBS. תקן תאים למשך 30 דקות באמצעות 4% משקל לנפח. לאחר מכן, פרה-פורמלדהיד צובע את התאים עבור חוטים עצביים וגרעינים בהתאם לפרוטוקול שנקבע.

כדי לדמיין את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט, הנח את לוחית הבאר על במת המיקרוסקופ ואתר את מסת התא באמצעות הגדרות המסנן והעירור עבור dpi. לאחר זיהוי התא, העבר את המסנן ל-zi. כדי לדמיין את העצבים המורחבים, השתמש בפונקציית התפר במיקרוסקופ כדי לאסוף ולשלב כמה תמונות שצריך כדי לראות את המבנה כולו.

חזור על הפעולה עבור מיקרוספירות dpi, fite ו-brightfield. קוטר של 50 פלוס מינוס 14 מיקרומטר עם מעל 85% אנקפסולציה של חלבון יוצרו באופן עקבי ואלקטרו סובבו לפיגומים על ידי פרוטוקול זה. תמונה פלואורסצנטית זו מציגה מיקרוספירות מייצגות עם רוד דומין במעטפת ה-PLGA והתאמות BSA עטופות בתוכה.

כדי להעריך את האנקפסולציה, המיקרוספירות מולאו ב-BSA ונבדקו לשחרור חלבון במשך למעלה מ-60 יום עם בדיקת חלבון ברדפורד. השחרור מתחיל בפרץ ראשוני ואז ממשיך כאשר מיקרוספירות מתפרקות לאחר סיבוב אלקטרו. ניתן לראות את המיקרוספירות בכל המבנה הסיבי התלת-ממדי.

בתמונת SEM זו של הפיגום השלם. ניתן לראות את הכדורים בשכבות מרובות המסומנות על ידי חיצים. תמונה זו בהגדלה גבוהה היא של מיקרוספירה אחת עם סיבי הננו מהפיגום שמעליה.

גרעיני שורש הגב או DRG שימשו לבדיקת הכדאיות של גורם גדילה עצבי או NGF במיקרוספרות בתוך הפיגום. הנה DRG יושב על פיגום המכיל מיקרוספרות. טעון ב-NGF מוצג ליד מיקרוספרה אחת ללא חלבון בתוך הנויריט הארוך יותר הרחבות המשתרעות מה-DRG על פיגום ה-NGF מצביעות על כך שה-NGF בר-קיימא ויכול לקדם צמיחה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לעטוף חלבון במיקרוספירות ולשלב אותם בפיגומים סיביים.