Name: גורם הגדילה Electrospinning שחרור מיקרוסכמות לתוך סיביים פיגומים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-16T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: למד ליצור פיגומים סיביים לתמיכה בצמיחת עצבים באמצעות אלקטרוספינינג ומיקרוספירות PLGA. השיטה מאפשרת שחרור מבוקר של גורמי גדילה לתיקון עצבי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה בחלקה על ידי קרן ריצ'רד ברבר ומלגת תומאס ראמבל (TJW).

.1 מים / שמן / מים זוגי אמולסיה Microsphere ייצור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית להכין 2% ו0.5% w / v פתרונות של אלכוהול פוליוויניל (PVA) במים ללא יונים. מערבבים את הפתרונות על 50 מעלות צלזיוס עד ברור, זה עלול לקחת כמה שעות. הכן פתרון של 2% v / v איזופרופיל אלכוהול במים ללא יונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תמיסה מימית של חלבון הידרופילי רצוי. הטבלה שלהלן מספקת ניסוחים ירושלים. </li></ol><img alt="טבלת 1" src="/files/ftp_upload/51517/51517table1highres.jpg" /> טבלת 1:. פתרונות חלבון דוגמא פתרונות החלבון הבאים כבר במארז בהצלחה וelectrospun שימוש בפרוטוקול זה. ניתן להשתמש בפתרוני חלבון הידרופילי אחרים לפי צורך. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 40 מ&quot;ל של פתרון PVA 0.5% לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ&quot;ל ומניח בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל לפזר 300 מ&quot;ג של 65:35פולי (חומצה לקטית גליקולית שיתוף) (PLGA) ב 3 מ&quot;ל של dichloromethane. מיקסר מערבולת ניתן להשתמש כדי להאיץ את פירוק PLGA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב 200 μl של פתרון חלבון ו4 μl של 2% פתרון PVA. יוצקים את תערובת החלבונים לתוך תמיסת PLGA (צעד 1.4). הפתרונות יישארו בעיקר נפרדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור לתוך כוס של מי קרח. באמצעות sonicator שרביט ב ~ 10 ווטס (RMS), להתסיס את הפתרון לכמה שניות (5-10) ועד תחליב לבן וקרם אחיד נוצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את התחליב לתוך צינור 50 מ&quot;ל מכיל 0.5% PVA (שלב 1.3). מערבבים את הפתרון במהירות גבוהה במיקסר מערבולת ~ 20 שניות. הפתרון יהיה לפתח עכירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התחליב לכוס 200 מ&quot;ל ומניחים על צלחת ומערבבים ב350 סל&quot;ד למשך 2 דקות. הוסף 50 מ&quot;ל של 2% באלכוהול רפואי לכוס בצלחת ומערבבים. אפשר התערובת להמשיך ערבוב מינימאלי של שעה 1 כדי לאפשר DCM להתאדות וPLGA להקשיח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההעברה tהוא microsphere פתרון לתוך צינורות צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב425 XG במשך 3 דקות. Microspheres יאסוף בחלק התחתון של הצינור ומופיע לבן. מוציא בזהירות את supernatant מהצינור, מעל microspheres, ולאחסן בבקבוק 500 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את microspheres עם מים ללא יונים על ידי מילוי הצינור שלושה רבעים מלאים וטלטלת אותה כדי להפיץ את microspheres בנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.10 &amp; 1.11 ארבעה פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות השטיפה הסופית, להסיר את supernatant שוב ומניחים בבקבוק 500 מ&quot;ל עם דוגמאות האחרות. להקפיא את microspheres שנאסף בצינור צנטריפוגות, אז Lyophilize לפחות 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיין את microspheres תחת מיקרוסקופ אור או עם מיקרוסקופ אלקטרוני סורק. Microspheres לא גדול יותר 60 מיקרומטר הוא לelectrospinning היעיל. אם microspheres הם גדול מדי, פעמים sonicating או vortexing יותר עשויות להידרש בשלב 1.6 או 1.7. </li> &lt;li&gt; חנות microspheres המיובש במקפיא -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: השתמש assay חלבון, לפי הוראות יצרן, כדי לבדוק את כמות החלבון בבקבוק 500 מ&quot;ל מצעד 1.10 30. זה משמש לחישוב אחוזים של חלבון במארז בmicrospheres, על ידי הפחתת הכמות בפתרון ממה שהיה בשימוש בתהליך הייצור. </li></ol> הערה: כדי להמחיש את מיקום החלבון בmicrosphere להוסיף Rhodamine 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל לפתרון PLGA 31 ובלתמצת חלבון מצומדות FITC איור 1 מציג דוגמא.. .2 Electrospinning עם מיקרוסכמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הכנת פתרון electrospinning, ליצור פתרון 0.5% w / v של photoinitiator, במים ללא יונים על ידי ההמסה על 37 מעלות צלזיוס. תהליך זה יכול להימשך מספר שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור 2% w / v methacrylated חומצה היאלורונית (מהא) (ראה Burdick et al. לסינתזה) 29, 3%w / v 900 פולי KD (אתילן אוקסיד) (PEO) ו0.05% w / פתרון יוזם התמונה v במים ללא יונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הכמות הנכונה של מהא וPEO לעצמה הרצויה. לדוגמא, 10 מ&quot;ל של electrospinning פתרון דורש 200 מ&quot;ג של מהא ו300 מ&quot;ג של PEO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את PEO במים ללא יונים ב90% מהנפח הסופי הרצוי (9 מ&quot;ל לדוגמא זו). זה עלול לקחת כמה שעות, צלחת מחוממת ומערבבים או אמבט מים ב 37 C ° ניתן להשתמש כדי להאיץ את התהליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא להוסיף מהא ולהשתמש במיקסר מערבולת לעורר הפתרון עד בהיר. זה ייקח רק כמה דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף להוסיף את פתרון יוזם תמונה 0.5% למלא את שאר 10% הנפח (מ&quot;ל 1 לדוגמא זו). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת microspheres בריכוז הרצוי עד 400 מ&quot;ג / מ&quot;ל. מערבבים את הפתרון על מיקסר מערבולת עד microspheres מפוזר באופן שווה בפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון למזרק ולצרף bl 18 מד 6 אינץמחט קצה UNT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המזרק במשאבת מזרק ולהגדיר אותו לוותר ב1.2 מ&quot;ל / שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלטת שכבה של נייר אלומיניום על צלחת האוסף או mandrel. זה מאפשר לעד קל נקי ואחסון של הפיגום המוגמר. Mandrel מסתובב משמש ליצירת סיבים מיושרים. צלחת שטוחה או mandrel הנייח תגרום לסיבים מסודרים באופן אקראי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את חוט הקרקע מכוח מקור מתח גבוה למנגנון הגבייה. חבר את התקע החיובי למחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את פני השטח משאבת מזרק וגבייה, כך שיש 15 סנטימטר בין קצה המחט ומשטח אוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל שאיבת הפולימר, כאשר הפתרון נראה לעין בסוף המזרק, להפעיל את מקור המתח ולהגדיר את המתח ל24 ק זהירות:. ברגע שהמתח מופעל לא לגעת בשום חלק מתכתי של המערכת. תשלום יכול גם לקפוץ למרחקים קצרים מחלקים חשמליים לעור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הפתרון עד דעובי פיגום esired מושגת. כשיושלם לכבות מקור מתח ומשאבת מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר רדיד עם פיגום מצורף. פיגומים שהושלמו מכילים חלבון מאוחסנים ב-20 ° C מקפיא. </li></ol> .3 חלבון את הפעילות הביולוגית של הבדיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת תרבית תאים. הוסף 10% v / v בסרום שור עוברי, 1% L-גלוטמין / v v, ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין V / V לבינוני של הנשר השתנה Dulbecco. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips זכוכית בחר שמתאים לחלוטין לצלחת גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 3 methacrylate propyl (Trimethoxysilyl) לטיפול בcoverslips כפי שתואר על ידי היצרן. Methacrylation משפר דבקות פיגום לcoverslips. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף coverslips methacrylated לאזור האוסף של electrospinner עם קלטת דו צדדית נשלפת לפני electrospinning. ספינינג על coverslips מקל טיפול וצפייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electrospin לעובי רצוי כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">חרה electrospinning להסיר בזהירות coverslips מmandrel. מניחים את הפיגום coverslips המצופה לתוך תא חנקן ברור ולהבטיח כי כל החמצן מטוהר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החדר והפיגום תחת 2 ננומטר 365 אור 10 mW / cm במשך 15 דקות. לאחר crosslinking מקום לצלחת גם בגודל המתאים. ודא שצד הפיגום פונה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיגומי מקום מתחת לפנס קוטל חיידקים ל30 דקות לעקר. אם פיברונקטין הרצוי או חלבון אחר משמש כציפוי כדי לשפר את הידבקות תא. עקוב אחר ההוראות של היצרן לפיגומי מעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר הגבי שורש הגרעינים (DRG) כפי שתוארו בעבר על ידי הולנבק 32. DRG אחד יהיה צורך לכל coverslip פיגום מכוסה נבדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 100-200 μl של תקשורת על כל פיגום בצלחת גם. בזהירות להניח DRG אחד על כל פיגום בטיפת התקשורת. לפיגום עבה ייתכן שתהיה צורך יותר בתקשורת; DRG צריך להיות שקוע באופן מלא ולא floaטינג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הפיגום וDRG על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות כדי לאפשר לתא לדבוק בפיגום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את התקשורת לרמה המתאימה להיטב ומניח בחזרה לתוך החממה. המשך דוגרים במשך 4-6 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הדגירה להסיר בזהירות את התקשורת מכל טוב ולשטוף בעדינות פעם עם PBS. תקן תאים ל30 דקות באמצעות 4% w / paraformaldehyde v. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי כתם באמצעות כתם נוגדן לneurofilament. זה יאפשר הדמיה של התוצאה neurite לכימות. גם DAPI יכול לשמש לצפייה בגרעינים של התאים. פרוטוקול דוגמא מכתים תואר על ידי Sundararaghavan ועמיתים 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת גם על הבמה של מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את מסת התאים באמצעות הגדרות מסננת ועירור לDAPI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהתא הוא לעבור את המסנן לFITC לדמיין neurites המורחבת. Uלשיר פונקצית התפר במיקרוסקופ לאסוף ולשלב תמונות רבות ככל נחוץ כדי לראות את המבנה כולו. חזור על פעולה עבור DAPI, FITC ושדה בהיר. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wrobel, M. R., Sundararaghavan, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+migration+in+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Directed migration in neural tissue engineering.</a> Tissue Eng Part B Rev. , (2013).</li>
<li>Schmidt, C. E., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+tissue+engineering%3A+strategies+for+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 5, 293-347 (2003).</li>
<li>Madduri, S., di Summa, P., Papaloizos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+controlled+co-delivery+of+synergistic+neurotrophic+factors+on+early+nerve+regeneration+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats.</a> Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).</li>
<li>Madduri, S., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+delivery+systems+and+repair+strategies+for+damaged+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Growth factor delivery systems and repair strategies for damaged peripheral nerves.</a> J Control Release. 161, 274-282 (2012).</li>
<li>Madigan, N. N., McMahon, S., O'Brien, T., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+tissue+engineering+and+novel+therapeutic+approaches+to+axonal+regeneration+following+spinal+cord+injury+using+polymer+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Current tissue engineering and novel therapeutic approaches to axonal regeneration following spinal cord injury using polymer scaffolds.</a> Respir Physiol Neurobiol. 169, 183-199 (2009).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+growth+in+3D+collagen+gels+with+gradients+of+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties.</a> Biotechnol. Bioeng. 102, 632-643 (2009).</li>
<li>Hudson, T. W., Evans, G. R., Schmidt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+strategies+for+peripheral+nerve+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Plast+Surg%22%5BJournal%5D)">Engineering strategies for peripheral nerve repair.</a> Clin Plast Surg. 26, 617-628 (1999).</li>
<li>Kokai, L. E., Bourbeau, D., Weber, D., McAtee, J., Marra, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+growth+factor+delivery+promotes+axonal+regeneration+in+long+gap+peripheral+nerve+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Sustained growth factor delivery promotes axonal regeneration in long gap peripheral nerve repair.</a> Tissue Eng Part A. 17, 1263-1275 (2011).</li>
<li>Bronzino, J. D., Peterson, D. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBronzino%2C+JD+%22The+Biomedical+Engineering+Handbook%2C+Third+Edition+-+3+Volume+Set%3A+Tissue+Engineering+and+Artificial+Organs%22">The Biomedical Engineering Handbook, Third Edition - 3 Volume Set: Tissue Engineering and Artificial Organs</a>. , 3 edition edn, CRC Press. (2006).</li>
<li>Bell, J. H. A., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+nerve+guides%3A+materials%2C+fabrication%2C+growth+factors%2C+and+cell+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Next generation nerve guides: materials, fabrication, growth factors, and cell delivery.</a> Tissue Eng Part B Rev. 18, 116-128 (2012).</li>
<li>Ruiter, G. C. W., Malessy, M. J. A., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J., Spinner, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+ideal+conduits+for+peripheral+nerve+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgical+focus%22%5BJournal%5D)">Designing ideal conduits for peripheral nerve repair.</a> Neurosurgical focus. 26, (2009).</li>
<li>Olakowska, E., Woszczycka-Korczyńska, I., Jędrzejowska-Szypułka, H., Lewin-Kowalik, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+nanotubes+and+nanofibres+in+nerve+repair.+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Application of nanotubes and nanofibres in nerve repair. A review.</a> Folia Neuropathol. 48, 231-237 (2010).</li>
<li>Gunn, J., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyblend+nanofibers+for+biomedical+applications%3A+perspectives+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Polyblend nanofibers for biomedical applications: perspectives and challenges.</a> Trends Biotechnol. 28, 189-197 (2010).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Masand, S. N., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+generation+of+haptotactic+gradients+through+3D+collagen+gels+for+enhanced+neurite+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Microfluidic generation of haptotactic gradients through 3D collagen gels for enhanced neurite growth.</a> Journal of Neurotrauma. 28, 2377-2387 (2011).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+fibrous+scaffolds+with+multiscale+and+photopatterned+porosity%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Electrospun fibrous scaffolds with multiscale and photopatterned porosity.</a> Macromol Biosci. 10, 265-270 (2010).</li>
<li>Edalat, F., Sheu, I., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Material+strategies+for+creating+artificial+cell-instructive+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Material strategies for creating artificial cell-instructive niches.</a> Current Opinion in Biotechnology. 23, 820-825 (2012).</li>
<li>Annabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+highly+porous+crosslinked+elastin+hydrogels+and+their+interaction+with+fibroblasts+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Synthesis of highly porous crosslinked elastin hydrogels and their interaction with fibroblasts in vitro.</a> Biomaterials. 30, 4550-4557 (2009).</li>
<li>Castaño, O., Eltohamy, M., Kim, H. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+technology+in+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrospinning technology in tissue regeneration.</a> Methods Mol. Biol. 811, 127-140 (2012).</li>
<li>Chew, S. Y., Wen, J., Yim, E. K. F., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+release+of+proteins+from+electrospun+biodegradable+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Sustained release of proteins from electrospun biodegradable fibers.</a> Biomacromolecules. 6, 2017-2024 (2005).</li>
<li>Han, D., Gouma, P. -I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+bioscaffolds+that+mimic+the+topology+of+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Electrospun bioscaffolds that mimic the topology of extracellular matrix.</a> Nanomedicine. 2, 37-41 (2006).</li>
<li>Prabhakaran, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+biocomposite+nanofibrous+scaffolds+for+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Electrospun biocomposite nanofibrous scaffolds for neural tissue engineering.</a> Tissue Eng Part A. 14, 1787-1797 (2008).</li>
<li>Xie, J., MacEwan, M. R., Schwartz, A. G., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanofibers+for+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanofibers for neural tissue engineering.</a> Nanoscale. 2, 35-44 (2010).</li>
<li>Yao, L., O'Brien, N., Windebank, A., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orienting+neurite+growth+in+electrospun+fibrous+neural+conduits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+Part+B+Appl.+Biomater%22%5BJournal%5D)">Orienting neurite growth in electrospun fibrous neural conduits.</a> J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 90, 483-491 (2009).</li>
<li>Sill, T. J., von Recum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning%3A+applications+in+drug+delivery+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering.</a> Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).</li>
<li>Ifkovits, J. L., Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+fibrous+polymer+scaffolds+for+tissue+engineering+and+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Electrospinning fibrous polymer scaffolds for tissue engineering and cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+with+depth+in+electrospun+fibrous+scaffolds+for+directed+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Gradients with depth in electrospun fibrous scaffolds for directed cell behavior.</a> Biomacromolecules. 12, 2344-2350 (2011).</li>
<li>Meinel, A. J., Germershaus, O., Luhmann, T., Merkle, H. P., Meinel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+matrices+for+localized+drug+delivery%3A+current+technologies+and+selected+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Electrospun matrices for localized drug delivery: current technologies and selected biomedical applications.</a> Eur J Pharm Biopharm. 81, 1-13 (2012).</li>
<li>Ji, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+electrospun+scaffolds+delivering+growth+factors+and+genes+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications.</a> Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).</li>
<li>Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+degradation+and+mechanical+behavior+of+photopolymerized+hyaluronic+acid+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks.</a> Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).</li>
<li>Péan, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+HSA+and+NGF+encapsulation+yields+in+PLGA+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Optimization of HSA and NGF encapsulation yields in PLGA microparticles.</a> International Journal of Pharmaceutics. 166, 105-115 (1998).</li>
<li>Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Uptake+and+Intracellular+Fate+of+PLGA+Nanoparticles+in+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The Uptake and Intracellular Fate of PLGA Nanoparticles in Epithelial Cells.</a> Biomaterials. 30, 2790-2798 (2009).</li>
<li>Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , Gulf Professional Publishing. (2003).</li>
<li>Boer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+sciatic+nerve+repair+with+a+poly-lactic-co-glycolic+acid+scaffold+and+nerve+growth+factor+releasing+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Rat sciatic nerve repair with a poly-lactic-co-glycolic acid scaffold and nerve growth factor releasing microspheres.</a> Microsurgery. 31, 293-302 (2011).</li>
<li>Pujic, Z., Goodhill, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+compartment+diffusion+chamber+for+studying+axonal+chemotaxis+in+3D+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A dual compartment diffusion chamber for studying axonal chemotaxis in 3D collagen.</a> Journal of Neuroscience Methods. 215, 53-59 (2013).</li>
<li>Madduri, S., di Summa, P., Papaloïzos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+controlled+co-delivery+of+synergistic+neurotrophic+factors+on+early+nerve+regeneration+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats.</a> Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphosphoester+microspheres+for+sustained+release+of+biologically+active+nerve+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor.</a> Biomaterials. 23, 3765-3772 (2002).</li>
<li>Yan, Q., Yin, Y., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+new+PLGL-RGD-NGF+nerve+conduits+for+promoting+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">Use new PLGL-RGD-NGF nerve conduits for promoting peripheral nerve regeneration.</a> Biomed Eng Online. 11, (2012).</li>
<li>Gungor-Ozkerim, P. S., Balkan, T., Kose, G. T., Sarac, A. S., Kok, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+growth+factor+loaded+microspheres+into+polymeric+electrospun+nanofibers+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Incorporation of growth factor loaded microspheres into polymeric electrospun nanofibers for tissue engineering applications.</a> J Biomed Mater Res A. , (2013).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+proteins+in+poly%28L-lactide-co-caprolactone%29+fibers+by+emulsion+electrospinning%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of proteins in poly(L-lactide-co-caprolactone) fibers by emulsion electrospinning.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 75, 418-424 (2010).</li>
<li>Wang, C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+aligned+core-shell+nanofibres+delivering+NGF+on+the+promotion+of+sciatic+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomater+Sci+Polym+Ed%22%5BJournal%5D)">The effect of aligned core-shell nanofibres delivering NGF on the promotion of sciatic nerve regeneration.</a> J Biomater Sci Polym Ed. 23, 167-184 (2012).</li>
<li>Liu, J. -J., Wang, C. -Y., Wang, J. -G., Ruan, H. -J., Fan, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve+regeneration+using+composite+poly%28lactic+acid-caprolactone%29%2Fnerve+growth+factor+conduits+prepared+by+coaxial+electrospinning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve regeneration using composite poly(lactic acid-caprolactone)/nerve growth factor conduits prepared by coaxial electrospinning.</a> J Biomed Mater Res A. 96, 13-20 (2011).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מחקרים רבים הראו שיכולים להיות מופנה תאי עצב על ידי רמזים טופוגרפיים (יישור סיבים) ואותות כימיים (גורמי גדילה) 1,2,10,11,35. Electrospinning הוא שיטה קלילה כדי ליצור סיבים מיושרים. גורמי גדילה לעודד צמיחת עצב אלא כדי לכלול אותם לתוך תעלות עצבים (NC), נדרשת שיטה לשחרור מושהה. כדי ליצור מערכת חזקה יותר עם שני הרמזים, צריכים להיות משולבים שני האותות הללו. מספר שיטות נחקרו בעבר על מנת לספק שחרור ממושך של חלבון בתוך הפיגום הסיבי electrospun להתחדשות של עצבים אבל אף אחד עד הי...

אחד האתגרים המתמשכים בהנדסת רקמות עצבית הוא יצירת צינור עצבי (NC) המחקה את המטריצה ​​סלולרית נוספת, שבו עצבים לגדול באופן טבעי. מחקרים הראו כי תאים מגיבים למספר גורמים בסביבה שלהם, כולל מכאני, טופוגרפי, דבק ואותות כימיים 1-3. אחד האתגרים העיקריים בתחום זה הוא קביעת השילוב המתאים של אותות ובודת מערכת שיכול לשמור על רמזים לתקופה ממושכת כדי לתמוך בצמיחת תא 4. נוירונים היקפיים ידועים מעדיפים מצע רך, יופנה על ידי סיבים מיושרים, ומגיב לגורם גדילה העצבית (NGF) 5-7. NCS שיכול לספק רמזים כימיים לשבועות הוכח לספק התאוששות תפקודית משופרת קרוב יותר לזה של allografts, תקן הזהב הנוכחי לתיקון עצב 8,9. שונות חומרים ושיטות ייצור יכול לשמש לייצור מכאני וטופוגרפיאל מקלות 10-13. רמזים מכאניים הם גלום בחומר שנבחר, מה שהופך את הבחירה של החומר המתאים ליישום הקריטי 1,13. שיטות ייצור כדי לשלוט רמזים טופוגרפיים כוללים הפרדה פאזות, הרכבה עצמית וelectrospinning 1,13. גם עבור יישומי microscale, מיקרופלואידיקה, photopatterning, תחריט, מדיח מלח, או קצף גז יכול לשמש 14-17. Electrospinning התפתח כדרך הפופולרית ביותר למהנדס מצעים סיביים לתרבית רקמה בשל גמישות וקלות הייצור 13,18-23. nanofibers electrospun מיוצר על ידי יישום מתח גבוה לפתרון פולימר גורם לו להדוף את עצמו ולמתוח על פני פער קצר לפרוק 24. פיגום מיושר ניתן ליצור על ידי איסוף הסיבים על mandrel מסתובבת מקורקע ופיגומים הבלתי מזדהים נאספים על צלחת נייחת 25. איתות הידבקות יכולה להיות מושגת על ידי ציפוי שנינות פיגום הסיבייםפיברונקטין h או להטות פפטיד הידבקות, כגון RGD, לHA לפני electrospinning 26. אותות כימיים, כגון גורמי גדילה, הם הכי קשים לשמור לאורך תקופות ממושכות, כי הם זקוקים למקור לשחרור מבוקר. מערכות רבות כבר ניסינו להוסיף שחרור מבוקר לרשתות סיבי electrospun עם רמות שונות של הצלחה. שיטות אלה כוללות electrospinning תערובת, electrospinning תחליב, electrospinning פגז הליבה והצמיד חלבון 27. בנוסף, electrospinning נעשה באופן מסורתי בממס נדיף, אשר יכול לפגוע בכדאיות של החלבון 28, לכן שמירה על הפעילות הביולוגית של החלבון יש לקחת בחשבון. גישה זו מציינת במפורש בשילוב אותות מכאניים, טופוגרפיים, כימי ודבק כדי ליצור פיגום מתכונן לצמיחת עצבים היקפית. מכניקת פיגום נשלטת דווקא על ידי סינתזהmethacrylated חומצה היאלורונית (HA). אתרי methacrylation משמשים לצרף crosslinkers תגובתי תמונה. חומר crosslinked הוא כבר לא מסיסים במים ומתפרק באופן בלעדי על ידי אנזימים 29. הסכום של crosslinking משנה את קצב הפירוק, מכניקה ומאפיינים פיזיים אחרים של החומר. באמצעות HA עם 30 methacrylation%, שבו יש מודול מתיחה של ~ 500 אבא, יוצר מצע רך שקרוב למכניקת הילידים של רקמה עצבית, והוא העדיף בדרך כלל על ידי נוירונים 26,29. Electrospinning על mandrel מסתובב משמש ליצירת סיבים מיושרים לאות טופוגרפית. באמצעות electrospinning יחד עם microspheres מספק אותות כימיים בתוך הפיגום לאורך תקופות ממושכות. כדי לתמוך בmicrospheres צמיחת neurite מכיל NGF המשמשים ליצירת האות הכימית. שלא כמו רוב חומרי electrospun HA הוא מסיס במים ולכן NGF אינו נתקל ממסים קשים במהלך ייצור. כדי להוסיף אות דבק, SCAffold מצופה פיברונקטין. המערכת הושלמה מכילה את כל ארבעת סוגים של אותות שתוארו לעיל: סיבים רכים (מכאניים) מיושרים (טופוגרפיים) עם NGF שחרור microspheres (כימי) מצופה בפיברונקטין (דבק). ייצור ובדיקה של מערכת זו מתוארת בפרוטוקול זה. התהליך מתחיל בייצור של microspheres עם זוגי אמולסיה מים-ב- שמן מים. התחליב הוא התייצב עם חומרים פעילי שטח, פוליוויניל אלכוהול (PVA). שלב המים הפנימי מכיל את החלבון. כפי שהוא הוסיף לשלב שמן, המכילים את חומר מעטפת PLGA מומס בdichloromethane (DCM), פעילי השטח יוצר מחסום בין שלבי הגנה על החלבון מDCM. אמולסיה זו היא יותר מאשר מפוזרת בשלב מים אחר המכיל PVA כדי ליצור את המשטח החיצוני של microspheres. התחליב היציב הוא עורר לאפשר DCM להתאדות. לאחר השטיפה וlyophilizing אתה נשאר עם המשך microspheres היבשaining החלבון. לאחר microspheres הושלם הם מוכנים להיות electrospun לפיגומים. ראשית, עליך להכין את פתרון electrospinning. הצמיגות של הפתרון היא קריטית להיווצרות סיבים נכונה. פתרונות של HA הטהור אינם עומדים בדרישה זו; PEO נוסף כפולימר מנשא כדי לאפשר electrospinning. Microspheres מתווספים לפתרון וelectrospun וכתוצאה מפיגום סיבי עם microspheres מופץ ברחבי. ברגע שהייצור הוא מלא, החלבון צריך להיבדק כדי לוודא את כדאיותה. כדי לעשות זאת, ניתן להשתמש בו תא ראשוני המגיב לNGF. פרוטוקול זה משתמש הגבי שורש הגרעינים (DRG) מעוברי עופות ישנים 8-10 יום. חבילות התא הם זורעים על גבי פיגומים המכילים microspheres מלא NGF או אלה כי הם ריקים. אם NGF הוא עדיין בת קיימא אתה צריך לראות צמיחת neurite משופרת על הפיגומים המכילים NGF. אם NGF הוא כבר לא בת קיימא זה יהיהלא לקדם neurites להרחיב ואמורה להופיע דומה לשליטה. ההליך המדויק שתואר במסמך זה מתמקד בתמיכה עצבית, לעומת זאת, עם שינויים פשוטים לחומר, שיטת electrospinning, וחלבוני המערכת יכולה להיות מותאמת לסוגים שונים של תאים ורקמות.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>BASF</td><td>24650-42-8</td><td>הגן מפני אור</td></tr><tr><td>PEO 900 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>189456</td><td></td></tr><tr><td>Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23591-100</td><td>הכן תמיסת מלאי</td></tr><tr><td>במשאבת מזרק</td> DMSO <td>KD Scientific</td><td>KDS100</td><td></td></tr><tr><td>מקור כוח</td><td>גמא מתח גבוה</td><td>ES30P-5W</td><td></td></tr><tr><td>מנוע</td><td>Triem Electric Motors, Inc</td><td>0132022-15</td><td>חייב לחבר לשדרה שנבנתה בהתאמה אישית</td></tr><tr><td>טכומטר</td><td>מחסן כלי רשת</td><td>ESI-330</td><td>השתמש לניטור מהירות</td></tr> <tr><td>השדרהמערכת ריפוי נקודתית UV Omnicure עם מתאם קולימציה</td><td>EXFO</td><td>S1000</td><td></td></tr><tr><td>מחטים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-825-16H</td><td></td></tr><tr><td>כיסויים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-545-81</td><td></td></tr><tr><td>אלכוהול פוליוויניל</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P8136-250G</td><td></td></tr><tr><td>איזופורופיל אלכוהול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>I9030-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSAפישר</td> <td>סיינטיפיק</td><td>BP9703-100</td><td></td></tr><tr><td>BSA-FITC</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>080M7400</td><td></td></tr><tr><td>&בטא;-גורם גדילה עצבי (NGF)</td><td>R& D Systems</td><td>1156-NG</td><td></td></tr><tr><td>65:35 חומצה פולי-לקטית-גליקולית (PLGA)</td> <td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>1001554270</td><td></td></tr><tr><td>דיכלורומתאן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>34856-2L</td><td></td></tr><tr><td>בדיקת חלבון Coomassie (ברדפורד)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1856209</td><td></td></tr><tr><td>3-(Trimethoxysilyl) פרופיל מתאקרילט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>1001558456</td><td></td></tr><tr><td>פיברונקטין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>לונזה</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FBS אטלנטה ביולוגית</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>גלוטמין</td><td>פישר מדעי</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>עט-סטרפטוקוקוס</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>אלפא Aesar</td><td>A11313&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

גורם הגדילה electrospinning שחרור מיקרוסכמות לתוך סיביים פיגומים

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

הליך זה מתאר שיטה לייצור מצע רב-פנים כדי לכוון את צמיחת תאי העצב. מערכת זו משלבת אותות מכניים, טופוגרפיים, דביקים וכימיים. תכונות מכניות נשלטות על ידי סוג החומר המשמש לייצור הסיבים החשמליים. בפרוטוקול זה אנו משתמשים בחומצה היאלורונית מתאקרילית (HA) 30%, בעלת מודול מתיחה של ~500 Pa, כדי לייצר פיגום סיבי רך. סיבוב חשמלי על ציר מסתובב מייצר סיבים מיושרים ליצירת רמז טופוגרפי. ההדבקה מושגת על ידי ציפוי הפיגום בפיברונקטין. האתגר העיקרי המטופל כאן הוא מתן אות כימי לאורך עומק הפיגום לתקופות ממושכות. הליך זה מתאר ייצור מיקרוספירות פולי (חומצה לקטית-קו-גליקולית) (PLGA) המכילות גורם גדילה עצבי (NGF) והספגה ישירה של הפיגום במיקרוספירות אלה במהלך תהליך האלקטרו-ספינינג. בשל סביבת הייצור הקשה, כולל כוחות שקופים גבוהים ומטענים חשמליים, כדאיות החלבון נמדדת לאחר הייצור. המערכת מספקת שחרור חלבון במשך למעלה מ-60 יום והוכח כמעודדת צמיחה ראשונית של תאי עצב.

Microspheres 50 ± 14 מיקרומטר בקוטר עם אנקפסולציה חלבון מעל 85% הופקו באופן עקבי וelectrospun לפיגומים. גודל נקבע על ידי הדמיה דגימות של microspheres משלוש מנות ייצור נפרדות. התמונות שבו נתפסו על מיקרוסקופ אופטי ואורכים שבו נמדד באמצעות תוכנת מעבדה מסחרית. איור 1 מציגה היסטוגרמה של התפלגות הגודל. שיעור Encapsulation נבדק גם משלוש מנות microsphere נפרדות, על ידי כימותי החלבון שנמלט במהלך תהליך הייצור. <p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:r...

פרוטוקול זה משלב אלקטרו-ספינינג ומיקרוספירות כדי לפתח פיגומים מהונדסי רקמות להכוונת נוירונים. גורם הגדילה העצבי היה עטוף בתוך מיקרוספירות PLGA והוכנס לפיגומים סיביים של חומצה היאלורונית (HA). הפעילות הביולוגית של החלבון נבדקה על ידי זריעת הפיגומים עם גרעיני שורש הגב של אפרוח ראשוני ותרבית במשך 4-6 ימים.

גורם הגדילה Electrospinning שחרור מיקרוסכמות לתוך סיביים פיגומים

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

המטרה הכללית של הליך זה היא ליצור סביבה רב-גונית לתמיכה בצמיחה ובשיקום של עצבים. דבר זה מושג תחילה על ידי כליאה של גורמי גדילה בתוך מיקרוספירות מתכלות. השלב השני הוא הכנת חומר התמיכה עבור עיקר הסביבה.בשלב הבא, המיקרוספירות וחומר התמיכה משולבים ועוברים תהליך של אלקטרוספינינג (electro spinning) ליצירת פיגום סיבי מיושר. השלב הסופי הוא בדיקת הפיגום באמצעות נוירונים של גנגליון השורש הדורסלי של אפרוחים. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה כדי להראות כי צמיחת הנויריטים וכיוונם מואצים בהשוואה לבקרה.למרות שמערכת זו תוכננה עבור רקמה עצבית, עם שינויים קלים בחלבונים ובחומרים המשמשים אותה, ניתן להחיל אותה גם על סוגי רקמות שונים, כולל לבבות, ריאות ועצם. לפני תחילת הטיפול, הכין את הריאגנטים הדרושים: תמיסות של polyvinyl alcohol או PVA במים דאיוניים בריכוז של 2% ו-0.5% משקל לנפח, תמיסה של 2% נפח לנפח של isopropyl alcohol ומים דאיוניים, ותמיסה מימית של החלבון ההידרופילי הרצוי. העבר 40 milliliters של תמיסת 0.5% PVA לתוך מבחנת צנטריפוגה של 50 milliliters והנח בצד; בתוך בקבוקון קטן, המס 300 milligrams של 65 to 35 polylactic co glycolic acid או PLGA ושלושה milliliters של di chloro methane.ניתן להשתמש במיקסר וורטקס (vortex mixer) כדי להאיץ את המסת ה-PLGA תוך שילוב של 200 µL של תמיסת חלבון ו-4 µL של תמיסת 2% PVA. שפכו את תערובת החלבון וה-PVA אל תוך תמיסת ה-PLGA. התמיסות יישארו במידה רבה נפרדות.הנח את הבקבוקון בתוך כלי עם מי קרח תוך שימוש ב-W ator בהספק של כ-10 watts, וערבב את התמיסה במשך חמש עד 10 שניות עד להיווצרות אמולסיה לבנה קרמית ואחידה. שפוך את האמולסיה לתוך מבחנה של 50 milliliter שהוכנה מראש ומכילה 0.5%PVA. ערבב את התמיסה במהירות גבוהה באמצעות מערבל vortex למשך כ-20 שניות.התמיסה תקבל מראה עכור. העבירו את האמולסיה לכוס כימית של 200 milliliter והניחו אותה על פלטת ערבול במהירות של 350 RPM למשך שתי דקות. הוסיפו לכוס הכימית שעל פלטת הערבול 50 milliliters של 2% isopropyl alcohol.המשיכו לערבב את התערובת למשך שעה אחת לפחות כדי לאפשר לכלורומתאן להתאדות ול-PLGA להתקשות. לאחר מכן, העבירו את תמיסת המיקרוספרות למבחנות צנטריפוגה, וסבבו בצנטריפוגה ב-425 ×g למשך שלוש דקות. המיקרוספרות יסאיפו בתחתית המבחנה וייראו לבנות. הסירו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) מהמבחנה מעל המיקרוספרות ואחסנו אותו בבקבוק של 500 milliliter.שטפו את המיקרוספירות במים דה-יוניזציה על ידי מילוי של שלושה רבעים מכל מבחנה וניעור שלה כדי לפזר מחדש את המיקרוספירות בנוזל. חזרו על תהליך הסנטריפוגה, הסרת הנוזל העליון ושטיפת המיקרוספירות במים דה-יוניזציה ארבע פעמים לאחר השטיפה האחרונה. הסירו את הנוזל העליון והעבירו אותו לבקבוק של 500 milliliter יחד עם הדגימות האחרות.הקפיאו את המיקרוספירות שנאספו במבחנות הצנטריפוגה בטמפרטורה של 20°C- למשך לילה, ולאחר מכן בצעו ליופיליזציה למשך 24 שעות לפחות. יש להכין מראש את תמיסת האלקטרו-ספינינג הבאה במים דה-יוניזציה: חומצה היאלורונית מתוחברת למתיל (miha) בריכוז של 2% w/v, פוליאתילן אוקסיד (PEO) במשקל מולקולרי של 900 kDa בריכוז של 3% w/v, ותמיסת פוטו-איניציאטור בריכוז של 0.05% w/v.לאחר הכנת הנפח הרצוי של תמיסת ה-electro spinning, הוסיפו מיקרוספירות בריכוז הרצוי עד 400 mg/mL. ערבבו את התמיסה באמצעות מערבל וורטקס עד שהמיקרוספירות מפוזרות באופן שווה בתמיסה. העבירו את התמיסה למזרק וחברו מחט בעלת קצה קהה (blunt tip) במידה 18 ובאורך שישה אינצ'.הנח את המזרק במשאבת מזרקים והגדר אותה להזרמה בקצב של 1.2 milliliters per hour. הדבק שכבה של נייר אלומיניום על המנדריל. פעולה זו מאפשרת ניקוי קל ואחסון של הפיגום המוגמר.עמוד סיבוב (mandrel) משמש ליצירת סיבים מיושרים. חברו את חוט ההארקה ממקור מתח גבוה למערכת האיסוף. חברו את המוליך החיובי למחט כדי להבטיח ביצוע מוצלח של תהליך האלקטרו-ספינינג.חשוב מאוד לוודא שכל החיבורים וההגדרות נכונים. התחל את שאיבת הפולימר, וכאשר התמיסה נראית בקצה המזרק, הפעל את מקור המתח וכוונן את המתח ל-24 kilovolts. המשך להזרים את התמיסה עד להשגת עובי הפיגום הרצוי.עם הסיום, כבה את מקור המתח ואת משאבת המזרקים. כדי להתחיל בהליך זה, הצמד לכיסויים הרלוונטיים למקום האיסוף של מכשיר האלקטרו-ספינר באמצעות סרט דו-צדדי נשלף לפני תהליך האלקטרו-ספינינג. ספינינג על לוחות הכיסוי מקל על הטיפול והצפייה לאחר ביצוע האלקטרו-ספינינג לעובי הרצוי.כפי שהודגם במקטע הווידאו הקודם, הסר בזהירות את לוחות הכיסוי מהמנדרל. הנח את לוחות הכיסוי המצופים במטריצה (scaffold) לתוך תא חנקן שקוף וודא שכל החמצן נוקה. הנח את התא ואת המטריצה תחת אור בנורך גל של 365 nanometer בעוצמה של 10 milliwatt centimeter squared למשך 15 דקות.לאחר הצלבה, העבירו את לביבות הזכוכית (cover slips) לפלטת בארות בגודל מתאים. ודאו שצד הפיגום (scaffold) פונה כלפי מעלה. הוסיפו בזהירות 100 עד 200 µL של מצע גידול על כל פיגום בפלטת הבארות.הנח גנגליון שורש אחורי אחד או DRG על כל פיגום בתוך טיפת המצע. עבור פיגום עבה, ייתכן שיהיה צורך בכמות גדולה יותר של מצע. ה-DRG חייב להיות טבול לחלוטין ולא לצוף.דגרו את הפיגום ואת ה-DRG בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך ארבע שעות כדי לאפשר לתאים להיצמד לפיגום. לאחר מכן, מלאו מצע גידול עד לגובה המתאים לבאר. החזירו את הפלטה לאינקובטור ודגרו למשך ארבעה עד שישה ימים לאחר תקופת הדגירה הראשונית.הסר בזהירות את המצע מכל באר ושטוף פעם אחת בעדינות עם PBS. קבע את התאים למשך 30 דקות באמצעות Para formaldehyde בריכוז 4% weight per volume. לאחר מכן, צבע את התאים עבור neuro filaments וגרעיני התאים בהתאם לפרוטוקול מבוסס.כדי להדמיות של התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, הניחו את פלטת הבארים עלבמת המיקרוסקופ ואתרו את מסת התאים באמצעות המסנן והגדרות העירור עבור dpi. לאחר זיהוי התא, העבירו את המסנן ל-zi. להדמיית נוריטים מוארכים, השתמשו בפונקציית התפירה (stitch) במיקרוסקופ כדי לאסוף ולשלב מספר התמונות הדרוש לצפייה במבנה השלם.חזור על הפעולה עבור מיקרוספירות dpi, fite ו-brightfield. באמצעות פרוטוקול זה יוצרו בעקביות מיקרוספירות בקוטר של 50 פלוס או מינוס 14 µm עם מעל 85% כיסוי (encapsulation) של חלבון, אשר נטוו באופן אלקטרוסטטי למסבכים (scaffolds). תמונה פלואורסצנטית זו מציגה מיקרוספירות מייצגות עם Rod Domine במעטפת ה-PLGA ו-BSA fits בתוך הכיסוי.כדי להעריך את הכליאה, המיקרוספירות מולאו ב-BSA ונבדקו לשחרור חלבון במשך מעל 60 ימים באמצעות בדיקת חלבון בשיטת Bradford. השחרור מתחיל בפרץ ראשוני ולאחר מכן נמשך ככל שהמיקרוספירות מתפרקות לאחר תהליך ה-electro spinning. ניתן לראות את המיקרוספירות לאורך כל המבנה הסיבי התלת-ממדי.בתמונת SEM זו של הפיגום השלם, ניתן לראות את הכדורים בשכבות מרובות המצוינות על ידי החיצים. תמונה זו בהגדלה גבוהה מציגה מיקרוספירה אחת עם הננו-סיבים מהפיגום שמעליה.גנגליונים של השורש האחורי (Dorsal root ganglia או DRG) שימשו לבדיקת החיוניות של גורם גדילה עצבי (nerve growth factor או NGF) בתוך המיקרוספירות שבתוך הפיגום. כאן מוצגים DRG המונחים על פיגום המכיל מיקרוספירות. מיקרוספירה טעונה ב-NGF מוצגת לצד מיקרוספירה ללא חלבון; שלוחות נוריטיות ארוכות יותר המשתרעות מה-DRG על פיגום ה-NGF מעידות על כך שה-NGF חיוני ויכול לעודד גדילה.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה מעמיקה לגבי האופן שבו ניתן להקיף חלבון בתוך מיקרוספירות ולהטמיען בתוך פיגומים סיביים.

electrospinning-growth-factor-releasing-microspheres-into-fibrous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

תהליך electrospinning פולימרים של הנדסת רקמות והתרבות תא מופנית במאמר זה. באופן ספציפי, electrospinning של macromers photoreactive עם יכולות עיבוד נוסף של photopatterning ורב פולימר electrospinning מתואר.

Electrospinning פיגומים פולימר סיבי עבור הנדסת רקמות ותרבות Cell

מזדהות סיבים electrospun ישיר על גדילה של נוירונים במבחנה הם מרכיב הפוטנציאל של פיגומים התחדשות עצבים. אנו מתארים את הליך הכנת מצעים electrospun סיבים ותרבות חופשית בסרום של חושי העיקרי עכברוש E15 (DRG) ו הנוירונים המנוע. ויזואליזציה של נוירונים ידי immunocytochemistry כלולה גם.

תרבות מוטור ראשיים עצב סנסורי בתקשורת מוגדר על electrospun פולי-L-lactide nanofiber פיגומים

פיגומים Electrospun יכול להיות מעובד הייצור עבור יישומים הנדסת רקמות. כאן אנו מתארים שיטות ספינינג פיגומים מורכבים (על ידי ספינינג רצופים), להכנת פיגומים עבים יותר (על ידי שכבות רב באמצעות אדי חום או חישול), להשגת עקרות (ייצור מזוהם או פירסום הייצור עיקור) ו להשגת תכונות ביומכניים המתאימים.

Postproduction עיבוד Fibres Electrospun עבור הנדסת רקמות

ניתן לשלב nanosensors סול ביולוגית pH מגיב לפולי (חומצה לקטית-Co-גליקולית) (PLGA) פיגומי electrospun. פיגומי דיווח עצמיים המיוצרים יכולים לשמש לניטור באתר של תנאי microenvironmental תוך תאי culturing על הפיגום. זה מועיל כמבנה התאי 3D יכול להיות במעקב בזמן אמת מבלי להפריע לניסוי.

פיגומים דיווח עצמי לתרבית תאים 3-Dimensional

שיטה להשיג nanofibers וננו המורכב מחלבונים מטריצת חוץ תאיים בודדים או מרובים מתוארת. שיטה זו משתמשת באינטראקציות חלבון פני השטח כדי ליצור חומרים המבוססים על חלבונים חופשיים עומדים עם הרכב מתכונן וארכיטקטורה לשימוש במגוון רחב של יישומי הנדסה וביוטכנולוגיה רקמות.

Nanofibers חלבון ECM ועצרת ביוזמת פני שטח באמצעות ננו תכנון הנדסי

סינתזה וייצור של סיבי electrospun ארוכים המשתרעים על שטח גדול יותר הפקדה באמצעות אספן חדש תוכנן מפולימר מתכלה רומן בשם פולי (גליצרול-dodecanoate) (PGD) דווחה. הסיבים היו מסוגלים לתמוך בצמיחה של תאים שמקורם בתאי גזע pluripotent עכבר.

Electrospun סיבי פיגומים של פולי (גליצרול-dodecanedioate) להנדסה עצבית רקמות מתאי גזע עובריים בעכבר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפברק פיגומי nanofiber electrospun עם ארגון מדורג של סיבים ולחקור את היישומים שלהם בויסות מורפולוגיה תא / אורינטציה. הדרגתיים בכל קשורים לתכונות פיסיקליות וכימיות של פיגומי nanofiber מציע מגוון רחב של יישומים בתחום ביו-רפואיים.

Electrospun nanofiber פיגומים עם דרגות בארגון סיבים

ההתקדמות בטכנולוגיות ביו-חומרים מאפשרת פיתוח מבנים תלת מימדיים מרובי תאים. פיתחנו פרוטוקולי אלקטרו-ספינינג לייצור שלושה פיגומים בודדים לתרבית התאים המבניים העיקריים של דרכי הנשימה כדי לספק מודל תלת מימדי במבחנה של דופן הסימפונות של דרכי הנשימה.

התאמת תהליך Electrospinning לספק שלוש סביבות ייחודיות לTri-שכבתי<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של חומת Airway

פרוטוקול זה משמש כקו מנחה מקיף כדי לבדות פיגומים ויה electrospinning עם הפולימר נמס במצב כתיבה ישירה. אנו באופן שיטתי המתווה את התהליך, להגדיר את הגדרות הפרמטר המתאים להשגת ארכיטקטורות יישוב לגרדום.

להמיס Electrospinning הכתיבה של פיגומים Poly(ε-caprolactone) תלת מימדי עם מורפולוגיות לשליטה עבור יישומי הנדסת רקמות

מאמר זה מדגים את הטכניקה של הרחבת שטיחון nanofiber המסורתי, נמצא תחת ניהול דו-מימד (2D) electrospun לתוך גרדום (3D) 3-מימד דרך ירידת נוזלים2 CO subcritical. פיגומים אלו רבודה תלת-ממד, רמזים nanotopographic הסלולר מחקים מקרוב, לשמר את הפונקציות של מולקולות וחיסונים אנקפסולציה בתוך nanofibers.

ההתרחבות של דו-מימד Electrospun Nanofiber מחצלות שלוש-מימד פיגומים

למד ליצור פיגומים סיביים לתמיכה בצמיחת עצבים באמצעות אלקטרוספינינג ומיקרוספירות PLGA. השיטה מאפשרת שחרור מבוקר של גורמי גדילה לתיקון עצבי.

גורם הגדילה Electrospinning שחרור מיקרוסכמות לתוך סיביים פיגומים

גלה סרטונים נוספים