Name: Electroporation תת סוג סלקטיבי של בקליפת המוח interneurons (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: למדו לכוון תת-סוגים של אינטרנוירונים במוח הקדמי המתפתח של עכבר באמצעות אלקטרופורציה בתוך הרחם. שיטה זו מאפשרת ביטוי גני סלקטיבי באינטרנוירונים ומסייעת בחקר פונקציות נוירונליות בקליפת המוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לLihong יין לקבלת סיוע טכני. NVD הוא נמען פרס חוקר צעיר NARSAD של ונתמך גם על ידי מענקים מNIH (5 K99 MH095825-02). מחקר במעבדה Fishell נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות, המכון הלאומי לבריאות הנפש (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), מכון לאומי להפרעות ושבץ (5 R01 NS081297-02 נוירולוגיות, 1 P01 NS074972 -01A1) וסימונס הקרן.

טופלו כל בעלי החיים בהתאם לתקנות וההנחיות של ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של בית הספר באוניברסיטת ניו יורק לרפואה. זני עכבר נקבות עכברים שוויצריים וובסטר הניתנים על ידי Taconic שמשו לניסויים אלה. על מנת למקד ספציפית interneurons שכבה שטחי, עוברי E15.5 היו בשימוש. הערה: פלסמיד המשמש בעבודה זו (Dlx5 / 3 מיקרוגרם / μl פלסמיד 6.eGFP) נוצרה תוך שימוש בטכניקות שיבוט סטנדרטיים. EGFP cDNA שובט לתוך פלסמיד / 6-Pmin-הפולה Dlx5. פלסמיד זו זמין על פי בקשה (demarn02@nyumc.org). .1 הכנת Microinjection מטפטף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את חום חולץ # 2-860. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום ולאבטח את נימי הזכוכית ליד נימה. בדוק שהקוטר החיצוני (OD) של פיפטה הוא בערך 30 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצן &quot;למשוך&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את הנימים. החלק התחתון הוא המחט. מחק את החלק העליון. </li></ol> .2 הרדמה נוהל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תא isoflurane מכיל. הערה: Isoflurane היא ההרדמה המועדפת בשל הפעולה מהירה שלה ושכיחות נמוכה של תופעות לוואי. Pentobarbital אפשרות נוספת; עם זאת, סובלנות של תרופה זו היא משתנה ועלולה להוביל לשיעור תמותה גבוה יותר מisoflurane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את זרימת isoflurane ל4-5% ב0.5-1 L O / 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שסתום לתא פתוח ואילו שסתום למתאם הראש סגור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר בהריון בתא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר העכבר כדי ללכת תחת השפעת ההרדמה. זה ייקח בערך 2-3 דק &#39;. בדוק את קצב הנשימה. אם העכבר מתחיל נשימת יתר, להוריד את המינון של isoflurane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי העכבר מורדם, מייד להסיר אותו מהחדר. מניחים בצד גחונו על כרית החימום ואניnsert הראש במסכה שתמשיך לספק isoflurane לאורך כל הניתוח. הקפד להחליף את זרימת isoflurane מהתא עד לצינורות המחברים את חתיכת מתאם הראש. שים טיפה של חומר סיכה עין בכל עין ולסגור את העיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את כרית החימום ל36 ° מעלות צלזיוס כדי למזער היפותרמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגעה להיעדר רפלקסים רגל וזנב על ידי צובט את רגליו האחוריות וזנב. </li></ol> .3 ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות את העור המכסה את הבטן עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים כדי למשוך את העור כלפי מעלה. לאחר כל ניתוח, לשטוף את כל הכלים עם חומר ניקוי ומים, ומעוקר ב72 ° CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קטן אנכי (כ -2 ס&quot;מ) לאורך קו האמצע מתחיל באמצע הדרך בין הזוגות שלישיים והרביעי של בלוטות החלב. השתמש במספרי ניתוח עדינים. יש להיזהר שלא לפגוע בקיר הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להפריד את העור מהצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את העורקיםוורידים על קיר הבטן. לעשות עוד חתך אנכי 2 סנטימטר דרך הצפק (הימנעות כלי) כדי לחשוף את חלל הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את העור ודופן בטן בכל צד הימנעות כיווץ העורקים. הערה: אם העורקים ניקבו בטעות, להקריב בעלי החיים באופן מיידי על ידי ביצוע נקע בצוואר הרחם או ממנת יתר isoflurane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מראש לחמם את PBS סטרילי ל37 מעלות צלזיוס. כסה את ווי התלייה עם PBS הלח קים מגבונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחות בחלל הבטן החשופה עם PBS. חזור על פעולה זו מספר פעמים בעת ביצוע הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים עגולים, משוך בעדינות את השרשרת העוברית (E15.5) מהחלל. תן את שאר השרשרת במגבונים לחים. התחל על ידי חשיפת מחצית מהרחם ראשונה. ברגע שעובר בו הם electroporated, להביא אותו חזרה פנימה, ואז לעבוד על המחצית השנייה. </li></ol> .4 Electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמשיך להשתמש במלקחיים עגולים כדי לתפעל את העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ויsualize חדרים לרוחב. החדרים לרוחב לרוץ לאורך קו האמצע (איור 1b). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף ירוקים (צילומים: 10% w / v) מהיר לפתרון DNA לתערובת 01:20 לדמיין אותו במהלך ההזרקה. הכן את פתרון DNA על ידי המסת גלולה המתקבלת מפרוטוקול טיהור maxi-prep סטנדרטי במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש micropipettes מראש משך עם בוכנה להזרקה 1 מ&quot;ל של תמיסת DNA (Dlx5 / 6-eGFP, 3 מיקרוגרם / μl) עם גרין המהיר. חותך את קצה micropipette עם מלקחיים # קנס 5 (דומון) לעזוב מ&quot;מ אורך 6 מתחילת הכתף אל הקצה של הקצה של המחט לפני טעינת פיפטה. החזק את ראשו של העובר עם פינצטה העגולה. הזן את המוח עם פיפטה ב45 ° זווית מכוונת לרוחב החדר ממוקם בסמוך לקו האמצע. אם המחט חודרת דרך החדר, לחזור לאט פיפטה כפי שאתה משתמש הבוכנה להזריק DNA. החדר צריך להפוך ירוק כאשרפתרון מתחיל למלא אותו. בשלב זה, מפסיק לנוע פיפטה ולהזריק 1 מ&quot;ל של DNA. בעדינות, למשוך את פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את electroporator CUY21 לחמישה 45V פולסים של 50 אלפיות שניים במרווחים על ידי 950 אלפיות שניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אלקטרודות ההנעה 5 מ&quot;מ לעוברי E15.5. טובלים את האלקטרודות בPBS כדי להבטיח העברת נוכחית יעילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את משוטי אלקטרודה סביב ראשו של העובר עם ההנעה החיובית על החדר המכיל את פתרון DNA. מעט נמוך יותר ההנעה החיובית עם בגין שלילי אחד כדי ליצור נוכחי הגחון דרך הוד ganglionic. מניפולציה זה תהיה למזער ביטוי מחוץ לרחם בתאים פירמידליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהניח את האלקטרודות, לספק דופק על ידי לחיצה על דוושת רגל פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את אלקטרודות ולנגב אותם נקי. חזור על שלבים 4.6-4.9 עם כל עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , לאחר electroporating כל העוברים לשפוך 3 מ&quot;ל של PBS לתוך חלל הבטן ולהחזיר אותם לחלל הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">התפר ראשון דופן הבטן עם מחט מעוקלת ו5-0 תפר משי ולאחר מכן העור. החל לידוקאין (4%) על הפצע. לנהל 120 מ&quot;ג / קילוגרם של הצפק התוך האספירין לשיכוך כאבים. הערה: כל ההליך צריכה להתבצע ב20 דקות או פחות. מומלץ כי מתחילים electroporate רק כמה עוברים כדי לשמור על זמן פעולה קצר. ניתוחים ממושכים יקטינו את שיעור ההישרדות של העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החיה מצינורות ההרדמה ולאפשר התאוששות בכרית החימום על נייר לנגב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור חיה לכלוב, לשמור אותו על כרית החימום על 37 מעלות צלזיוס ולנטר את מצב הבריאות. בעלי החיים בדרך כלל לסבול את הניתוח היטב ומתחילים לנוע באיטיות זמן קצר לאחר שהם הוסרו מצינורות ההרדמה. אם דימום או עייפות מוגזם הוא ציין, להקריב בעלי החיים באופן מיידי על ידי ביצוע IACUC אישר נהלי המתת חסד כגון נקע בצוואר הרחם או ממנת יתר הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור כלוב לvivarium. הנקבות ללדת באופן טבעי. </li></ol>

<ol><li>Fishell, G., Rudy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+inhibition+within+the+telencephalon%3A+%26%2334%3Bwhere+the+wild+things+are%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of inhibition within the telencephalon: &#34;where the wild things are&#34;.</a> Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).</li>
<li>Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+distinct+progenitor+populations+in+the+lateral+ganglionic+eminence%3A+implications+for+striatal+and+olfactory+bulb+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis.</a> J Neurosci. 23, 167-174 (2003).</li>
<li>Eisenstat, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DLX-1%2C+DLX-2%2C+and+DLX-5+expression+define+distinct+stages+of+basal+forebrain+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation.</a> J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).</li>
<li>Batista-Brito, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+integration+of+cortical+interneurons+into+a+functional+network%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The developmental integration of cortical interneurons into a functional network.</a> Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).</li>
<li>Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiologically+distinct+temporal+cohorts+of+cortical+interneurons+arise+from+telencephalic+Olig2-expressing+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors.</a> J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).</li>
<li>Miyoshi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+fate+mapping+reveals+that+the+caudal+ganglionic+eminence+produces+a+large+and+diverse+population+of+superficial+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons.</a> J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).</li>
<li>Bulfone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Dlx-2+%28Tes-1%29+gene+is+expressed+in+spatially+restricted+domains+of+the+forebrain%2C+face+and+limbs+in+midgestation+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+development%22%5BJournal%5D)">The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos.</a> Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).</li>
<li>Bulfone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+restricted+expression+of+Dlx-1%2C+Dlx-2+%28Tes-1%29%2C+Gbx-2%2C+and+Wnt-3+in+the+embryonic+day+12.5+mouse+forebrain+defines+potential+transverse+and+longitudinal+segmental+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries.</a> J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).</li>
<li>Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+restricted+expression+of+a+member+of+a+new+family+of+murine+Distal-less+homeobox+genes+in+the+developing+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+biologist%22%5BJournal%5D)">Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain.</a> The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).</li>
<li>Close, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satb1+is+an+activity-modulated+transcription+factor+required+for+the+terminal+differentiation+and+connectivity+of+medial+ganglionic+eminence-derived+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons.</a> J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).</li>
<li>De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+is+required+for+the+development+of+specific+cortical+interneuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes.</a> Nature. 472, 351-355 (2011).</li>
<li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239(2007).</li>
</ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

מגבלות של הטכניקה בעוד טכניקה זו מאפשרת ניתוח אוטונומי תא של תהליכים בתא, זה לא מתאים לניתוח אוכלוסייה. Electroporations מאוד דליל עם פחות מאלף תאים electroporated לכל מוח. כתוצאה מכך, הטכניקה לא ניתן להשתמש כדי להעריך את השלכות התנהגות הנובעות מהמניפולציה הגנטית של interneurons נגזר CGE. בעוד electroporations בוצע בתת נגזר MGE יעד E13.5-E14.5, ...

את חלק הארי של interneurons GABAergic קליפת המוח מקורן שני מבנים עובריים חולפים בשם הוד ganglionic המדיאלי וזנב (MGE וCGE בהתאמה) 4. Parvalbumin וinterneurons סומטוסטטין להביע מקורן בMGE ואילו Calretinin (Cr), Vasointestinal פפטיד (VIP) וReelin (Re) להביע interneurons מקורן CGE. ניתן להבחין תת interneuron אלה על ידי תאריכי הלידה שלהם. תת נגזר MGE נולדים בין יום העוברי 9.5 (E9.5) וE16.5 5,6. בניגוד לכך, interneurons CGE נגזר נולד מE12.5 דרך E18.5 עם הייצור שלהם הגיע לשיא של E15.5 6. המיקוד הגנטי של אוכלוסייה בסוף נולד זה, עם זאת, נותר חמקמק. גנים העכבריים דיסטלי פחות (DLX) באים לידי ביטוי אך ורק במוח הקדמי הגחון פיתוח 3. interneurons GABAergic ונוירונים הקרנת striatal אבל תאים פירמידליים לא בקליפת המוח לבטא Dlx1, 2,5, ו -6 גנים בשלבי התפתחותיים מוקדמים 3. ואכן, גני DLX באים לידי ביטוי באזור subventricular MGE וCGE (SVZ) בכל אבות GABAergic. ביטוי של גנים אלה הופך מוגבל כדי לבחור תת בשלבי postmitotic 7-9. ראיות ניסיוניות קודמות הראו כי האלמנט משפר Dlx5 / 6 מאפשר למיקוד סלקטיבי של שושלות GABAergic במודלים של עכברים מהונדסים 2. אנחנו בדקנו את השימוש באחד מהאלמנטים משפר אלה בהקשר של ביטוי episomal במוח העכבר המתפתח. אנו תת משובטים האלמנט משפר Dlx5 / 6 יחד עם אמרגן מינימאלי והחלבון המשופר הירוק הניאון (eGFP) בפלסמיד עמוד השדרה bluescript (BS) (איור 1). אנחנו הצגנו את הפלסמיד באמצעות ברחם electroporation בE15.5 למקד Cr-, VIP באופן סלקטיבי והוא זכר תת 3,8,10. הטכניקה שלנו מאפשרת לelectroporation הדליל, המאפשרהבנייה מחדש של תכונות מורפולוגיות של תאים לחרוך. בנוסף, הרמות גבוהות במיוחד של ביטוי גנים בתאי עצב בקליפת המוח GABAergic מאפשרת ללימודים פונקציונליים. בצענו הפסד ורווח של מחקרים לתפקד באמצעות מספר סוג בר והגנים שליליים דומיננטיים 11.

<table><tbody><tr><td>אלקטרופורטור&nbsp; עם דוושה</td><td>Protech International</td><td>CUY21</td><td></td></tr><tr><td>אלקטרודות ההנעה 5 מ"מ&nbsp;</td>כרית חימום <td>CUY650P5</td><td></td> <td>פרוטק אינטרנשיונל</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>קנט סיינטיפיק</td><td>DCT-15</td><td></td></tr><tr><td>סאטר אינסטרומנטס P30 מושך&nbsp;</td><td>מכשירי סאטר</td><td>3282322</td><td></td></tr><tr><td>מערכות הרדמה של Fluovac</td><td>מכשירי הרווארד</td><td>726425</td><td></td></tr><tr><td>מספריים להפעלה עדינים 4.75 אינץ' ישר חד / חד</td><td>רובוז</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>5-0 צמה שחורה משי 18 אינץ' C-1 קופסה 36&nbsp;</td><td>Roboz</td><td>SUT-1073-21</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו קליפ מריחת מלקחיים 5.5 אינץ'</td> <td>Roboz</td><td>RS-5410</td><td></td></tr><tr><td>2 מהדק מספריים</td><td>Roboz</td><td>RC-4894</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים אחיזה&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11031-15</td><td></td></tr><tr><td>צינורות נימי זכוכית&nbsp;</td><td>FHC</td><td>27-30-0</td><td>Borosil 1.0 מ"מ קוטר חיצוני x 0.75 מ"מ קוטר</td></tr><tr><td>חיצוני ירוק מהיר</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F7258&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>סטרילי PBS</td><td>Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr></tbody></table>

electroporation תת סוג סלקטיבי של בקליפת המוח interneurons

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

המחקר של התבגרות מערכת עצבים מרכזית (CNS) מסתמך על מיקוד גנטי של אוכלוסיות נוירונים. עם זאת, המשימה של הגבלת הביטוי של גנים המעניינים את תת עצביים ספציפיים הוכיחה להפליא מאתגרת בשל המחסור היחסי של אלמנטי אמרגן ספציפיים. interneurons GABAergic מהווה אוכלוסייה עצבית עם מגוון גנטי ומורפולוגיים נרחבים. ואכן, יותר מ -11 תת שונה של interneurons GABAergic מתאפיינים בקליפת העכבר 1. כאן אנו מציגים פרוטוקול מותאם למיקוד סלקטיבי של אוכלוסיות GABAergic. השגנו מיקוד סלקטיבי תת סוג של interneurons GABAergic על ידי שימוש באלמנט משפר של שעתוק homeobox גורמי Dlx5 וDlx6, homologues של גן דיסטלי פחות דרוזופילה (DLL) 2,3, לנהוג הביטוי של גנים ספציפיים באמצעות electroporation ברחם.

אנחנו התאמנו את טכניקת electroporation ברחם כדי להשיג מיקוד ספציפי סוג התא של תאי עצב התבגרות. לנהוג הביטוי של eGFP בinterneurons נגזר CGE, השתמשנו באלמנט משפר Dlx5 / 6 ומוגבלים הזריקות שלנו לE15.5, השלב שבו רוב interneurons נגזר CGE נוצרים. אנחנו ביצענו את הניתוח בP8 וP15 11 (איורים 1 ו -2). אנחנו אישרו את המוצא הגחון של נוירונים electroporated על ידי שיתוף electroporating CAG-mCherry וDlx5 פלסמידים / 6-e...

הליך זה מראה כיצד למקד אינטרנוירונים במוח הקדמי של העכבר המתפתח באמצעות אלקטרופורציה ברחם. טכניקה זו הייתה יעילה במיוחד להשגת ביטוי גנים סלקטיבי בתת-סוגים בין-נוירונים המיועדים לשכבות השטחיות של קליפת המוח.

Electroporation תת סוג סלקטיבי של בקליפת המוח interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לטרגט נוירונים אינטרנוינליים במוח של עכבר בשלבי התפתחות באמצעות אלקטרופורציה תוך-רחמית (in utero electroporation). דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת מחטי ההזרקה. השלב השני הוא הוצאת העוברים מהחיה המורדמת.לאחר מכן מבצעים הזרקת DNA ואלקטרופורציה במוח. השלב הסופי הוא מתן זמן לבעל החיים להתאושש מהניתוח. בסופו של דבר, אלקטרופורציה ברחם (in utero electroporation) משמשת כדי לאפשר מיקוד סלקטיבי של תת-סוגים של נוירונים אינטרנורוניים.היתרון של שיטות אלו על פני הטכניקות הקיימות שלנו, כגון אלקטרופורציה לא ספציפית ברחם (in utero electroporation), הוא שהן מספקות את האמצעים לביצוע ניתוח אוטונומי-תאי של תת-קבוצה של נוירונים אינטר-קורטיקליים. רמות הביטוי הגבוהות של GFP מאפשרות ויזואליזציה וניתוח של נוירוני אינטר בודדים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות יסוד בתחום ההתפתחות העצבית, כגון מהם הכללים השולטים בשילובם של נוירוני אינטר בשלבי התבגרותם.כדי להתחיל בהליך זה, הכין את פיפטת המיקרו-הזרקה על ידי משיכת קפילרה מזכוכית באמצעות מושך פיפטות. לאחר מכן, הוצא בזהירות את הקפילרה ואסוף את המחט התחתונה לצורך המיקרו-הזרקה. כעת, הנח עכברה בהריון שהורדמה על גבי פד חימום, כאשר צדה הבטני פונה כלפי מעלה.כסו את פיו באמצעות מסכה שתמשיך לספק isoflurane לאורך כל הניתוח. לאחר מכן, מרחו חומר סיכוך לעיניים בשתי העיניים. כוון את פד החימום ל-36 °C כדי למנוע היפותרמיה לאחר מכן.בדקו את היעדרם של רפלקסים בכפות הרגליים ובזנב על ידי צביטה של כפות הרגליים האחוריות או של הזנב. לאחר מכן, נקו את העור בבטן עם 70% ethanol. השתמשו בפינצטה כדי למתוח את העור כלפי מעלה.לאחר מכן, בצעו חתך אנכי קטן של שני סנטימטרים לאורך קו האמצע, החל מהמרכז שבין זוגות בלוטות החלב השלישי והרביעי. היזהרו לא לפגוע בדופן הבטן בעזרת פינצטה עגולה. משכו בעדינות את השלשלת העוברית הרחק מהחלל.הניחו את השרשרת על מגבונים לחים. התחילו בחשיפת חצי אחד של הרחם. לאחר מכן, בצעו אלקטרופורציה לעוברים לפני המעבר לחצי השני.בפרוצדורה זו, הכין תמיסת DNA על ידי המסה של המשקע שהתקבל מפרוטוקול טיהור maxi prep סטנדרטי במים מזוקקים. לאחר מכן, הוסף fast green לתמיסת ה-DNA ביחס של 1 ל-20 כדי לאפשר ויזואליזציה במהלך ההזרקה. בשלב הבא, חתוך את קצהו של מיקרו-פיפט שנמשך מראש בעזרת פינצטה עדינה, כך שיישארו 6 mm מתחילת הכתף ועד קצה הטיפ.לאחר מכן, טען את המיקרופיפט עם 1 µL של תמיסת DNA עם fast green לצורך ההזרקה. החזק את ראשו של העובר באמצעות פינצטה עגולה. הכנס את הפיפט לתוך המוח בזווית של 45 מעלות, תוך כיוון לעבר הפרוזדור הצדי (lateral ventricle) הממוקם סמוך לקו האמצע.אם המחט חודרת דרך החדר, החזר את הפיפטה לאחור באיטיות. החדר אמור להפוך לירוק כאשר התמיסה מתחילה למלא אותו. בנקודה זו, הפסק את תנועת הפיפטה והזרק 1 µL של DNA.לאחר מכן, הוצא את הפ pipette בעדינות. הגדר את ה-ECM eight 30 ator ל-5 45 פולסי מתח של 50 milliseconds במרווחים של 950 millisecond בין פולס לפולס. טבול את אלקטרודות המשוטים בגודל חמישה מילימטר ב-PBS כדי להבטיח העברה יעילה של הזרם.לאחר מכן, מקמו את פדי האלקטרודה מסביב לראשו של העובר, כאשר הפד החיובי מונח על החדר המכיל את תמיסת ה-DNA. מקמו את הפד החיובי מעט נמוך יותר מהפד השלילי כדי ליצור זרם ונטראלי (גחוני) דרך ה-ganglionic eminences. פעולה זו תמזער ביטוי אקטופי בתאי ה-parametal.כעת העבירו פולס על ידי לחיצה אחת על דוושת הרגל, לאחר מכן הסירו את האלקטרודות ונגבו אותן כדי לנקותן. חזרו על השלבים עבור כל אחד מהעוברים. לאחר ביצוע אלקטרופורציה לכל העוברים.שפכו שלושה מיליליטר של PBS לחלל הבטן והחזירו את העוברים לחלל הבטן. לאחר מכן, תפרו את דופן הבטן באמצעות מחט מעוקלת וחוט משי 5-0, ולאחר מכן את העור. מרחו לידוקאין על הפצע והעניקו 120 מיליגרם לקילוגרם של אספירין בתחילה לצורך אלגזיה.הוצא את החיה מצינור ההרדמה ואפשר לה להתאושש על משטח חימום עם נייר סופג. לאחר מכן, החזר את החיה לכלוב. השאר אותה על משטח החימום בטמפרטורה של 37 °C ועקב אחר מצבה הבריאותי.בניסוי זה, נוירונים ביניים שעברו אלקטרופורציה מובחנים על ידי ביטוי של סמני תת-סוג ממקור CGE. תמונה זו מראה כי נוירוני ביניים ממקור CGE עברו אלקטרופורציה עם פלסמיד DLX five six EGFP. תמונה זו מציגה נוירון ביניים המבטא VIP ב-P eight.הביטוי של EGFP ממפה את כל עץ הדנדריטים והענפים האקסונליים של נוירונים בודדים, וכאן מוצג נוירון בינוני המבטא NPY ביום P 8. הביטוי של NPY ממפה תאי גליא נוירוגליאליים. לבסוף, כאן מוצג נוירון בינוני המבטא NPY ביום P 15.ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצעה בתוך 20 דקות אם היא מבוצעת כראוי. על ידי שילוב של שימוש בפלסמיד ספציפי ובקווי עכברים שעברו שינוי גנטי, ניתן להשיג בקרה זמנית ומרחבית בביטוי של גנים רצויים. בחלק מהניסויים, אנו משתמשים בפלסמיד A-D-L-X-T-T-A כדי להשרות ביטוי של טראנס-גנים תלויי AU.בניסויים אלו, השתקנו את ביטוי הגן התסובל באמצעות מתן doxycycline.

subtype-selective-electroporation-of-cortical-interneurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

ב electroporation ברחם היא שיטה ערך עבור transfecting ובתאים עצביים in vivo. בהתאם למיקום של אלקטרודות ואת timepoint ההתפתחותי של electroporation, תת מסוימים של תאים בקליפת המוח יכול להיות ממוקד. התאים הממוקדים אז יכול להיות מנותח in vivo או במבחנה על ההשפעות של שינוי גנטי.

ברחם electroporation ואחריו תרבות עצבית ראשונית ללימוד פונקציה ג&#39;ין בתת קבוצה של נוירונים קליפתיים

ב electroporation ברחם מאפשר למסירה גן מהירה באופן מרחבית, ובזמן שבשליטת במערכת לפתח את העצבים המרכזית (CNS). כאן אנו מתארים וישימה מאוד בפרוטוקול electroporation ברחם, שניתן להשתמש בהם כדי לספק בונה ביטוי עובריים לתוך מערכת העצבים המרכזית מספר תחומים, כולל diencephalon telencephalon, ואת הרשתית.

ג&#39;ין אספקה ​​יעילה לתוך השטחים CNS מרובים באמצעות בתוך הרחם Electroporation

סרטון זה מדגים את הפרוטוקול לאלקטרופורציה חד-תאית של גנים הן בתאי עצב מעוררים והן בתאי עצב מעכבים במגוון תרביות פרוסות היפוקמפוס במבחנה. הטכניקה שימושית לבחינת תפקודים מולקולריים ופיזיולוגיים ספציפיים של נוירונים, כולל מנגנונים אוטונומיים של תאים ואינטראקציות בין חלבונים טרנססינפטיים.

אלקטרופורציה של תא בודד בתרביות פרוסות מוח אורגנוטיפיות: טכניקה במבחנה להעברת פלסמידים בתוך נוירונים ממוקדים בפרוסות היפוקמפוס במוח

מקור: Denaxa, M., el al., השתלת אבות של אינטרנוירונים קליפתיים מהונדסים כימוגנטית לתוך מוחות עכברים מוקדמים לאחר הלידה. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את ההליך להזרקת וקטור פלסמיד הנושא את הגן המעניין לאבות בין-נוירוניים בפרוסת מוח עוברית, ואחריו אלקטרופורציה לכניסת פלסמיד וביטוי גנים. אבות אבות מותאמים אלה יכולים לשמש מאוחר יותר לטיפול בהפרעות מוחיות.

העברת גנים בסיוע אלקטרופורציה משובצת אגרוז באבות אבות בין-עצביים בקליפת המוח של עכברים

שטח pial הוא אזור אב ייחודי במערכת העצבים המרכזית, כי הוא מקבל תשומת לב גוברת. בזאת, אנו פירוט שיטה למניפולציה גנטית מהירה של אזור זה באמצעות אב שיטת electroporation שונה. הליך זה יכול לשמש לחקירות תאיות ומולקולרית של שושלות תאים ומסלולי איתות המעורבים בהתמיינות תאים ועל מנת להבהיר את גורלו ואת המאפיינים של תאי בת.

Electroporation שטח pial ילודים

כתב יד זה מספק פרוטוקולים המשתמשים ב electroporation ברחם (IUE) כדי לתאר את הקישוריות המבנית של נוירונים ברמת התא בודד ועל הרגישויות של נוירונים שכותרתו fluorescently. היסטולוגיה משמש כדי לאפיין הדנדריטים ותחזיות axonal. הקלטה כל התא פרוס חריפה משמשת לחקור רגישות.

ברחם Electroporation גישות לחקר רגישות של העצבית subpopulations וקישוריות תא יחיד

כאן אנו מציגים פרוטוקול, שנועד להשתמש כלים גנטיים כדי לתמרן את הפעילות של הושלתי בקליפת המוח הפנימי מושתלים לתוך הקליפה של עכברים לידתיים מוקדם.

השתלת כימוגנטית מהונדס בקליפת המוח ושלתי לתוך המוחות המוקדמים של העכבר לנטאל

כפול בתוך הרחם מאפשר מיקוד אוכלוסיות תאים כי הם מופרדים באופן זמני. טכניקה זו שימושית כדי להמחיש אינטראקציות בין אוכלוסיות תאים אלה באמצעות חלבונים פלורסנט בתנאים נורמליים, אך גם לאחר ניסויים פונקציונליים כדי perturb גנים של עניין.

כפול ברחם באמצעות אלקטרופורציה ועד לאוכלוסיית היעד באופן זמני ולאוכלוסיות שאינן מופרדות

מוצג כאן פרוטוקול לאלקטרופורציה חד-תאית שיכולה לספק גנים הן בתאי עצב מעוררים והן בתאי עצב מעכבים על פני מגוון גילאים של תרבות פרוסות היפוקמפוס במבחנה. הגישה שלנו מספקת ביטוי מדויק ויעיל של גנים בתאים בודדים, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לבחון פונקציות תאיות אוטונומיות ובין תאיות.

אלקטרופורציה חד-תאית על פני תרבות פרוסה אורגנוטיפית שונה של נוירונים מעכבים היפוקמפוס ומעמד ספציפיים

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר התמרה ויראלית של אזורי מוח בדידים עם מבנים אופטוגנטיים כדי לאפשר אפיון אלקטרופיזיולוגי ספציפי לסינפסה בפרוסות מוח של מכרסמים חריפים.

אקס ויוו חקירה אופטוגנטית של העברה סינפטית ארוכת טווח ופלסטיות מקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית ועד קליפת המוח האנטורינלית הלטרלית

כאן, אנו מציגים את המניפולציה הגנטית החריפה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים חתוכים על ידי אלקטרופורציה. מודלים אלה של אורגנואידים בקליפת המוח נוחים במיוחד להזרקה מכיוון שניתן לזהות בקלות מבנים דמויי חדרים לאחר החיתוך, מה שמאפשר חקירה תפקודית של התפתחות קליפת המוח האנושית, הפרעות נוירו-התפתחותיות ואבולוציה קליפת המוח.

אלקטרופורציה של אורגנואידים קורטיקליים אנושיים פרוסים לחקר תפקוד גנים

למדו לכוון תת-סוגים של אינטרנוירונים במוח הקדמי המתפתח של עכבר באמצעות אלקטרופורציה בתוך הרחם. שיטה זו מאפשרת ביטוי גני סלקטיבי באינטרנוירונים ומסייעת בחקר פונקציות נוירונליות בקליפת המוח.

Electroporation תת סוג סלקטיבי של בקליפת המוח interneurons

גלה סרטונים נוספים