Electroporation תת סוג סלקטיבי של בקליפת המוח interneurons

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לטרגט נוירונים אינטרנוינליים במוח של עכבר בשלבי התפתחות באמצעות אלקטרופורציה תוך-רחמית (in utero electroporation). דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת מחטי ההזרקה. השלב השני הוא הוצאת העוברים מהחיה המורדמת.

לאחר מכן מבצעים הזרקת DNA ואלקטרופורציה במוח. השלב הסופי הוא מתן זמן לבעל החיים להתאושש מהניתוח. בסופו של דבר, אלקטרופורציה ברחם (in utero electroporation) משמשת כדי לאפשר מיקוד סלקטיבי של תת-סוגים של נוירונים אינטרנורוניים.

היתרון של שיטות אלו על פני הטכניקות הקיימות שלנו, כגון אלקטרופורציה לא ספציפית ברחם (in utero electroporation), הוא שהן מספקות את האמצעים לביצוע ניתוח אוטונומי-תאי של תת-קבוצה של נוירונים אינטר-קורטיקליים. רמות הביטוי הגבוהות של GFP מאפשרות ויזואליזציה וניתוח של נוירוני אינטר בודדים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות יסוד בתחום ההתפתחות העצבית, כגון מהם הכללים השולטים בשילובם של נוירוני אינטר בשלבי התבגרותם.

כדי להתחיל בהליך זה, הכין את פיפטת המיקרו-הזרקה על ידי משיכת קפילרה מזכוכית באמצעות מושך פיפטות. לאחר מכן, הוצא בזהירות את הקפילרה ואסוף את המחט התחתונה לצורך המיקרו-הזרקה. כעת, הנח עכברה בהריון שהורדמה על גבי פד חימום, כאשר צדה הבטני פונה כלפי מעלה.

כסו את פיו באמצעות מסכה שתמשיך לספק isoflurane לאורך כל הניתוח. לאחר מכן, מרחו חומר סיכוך לעיניים בשתי העיניים. כוון את פד החימום ל-36 °C כדי למנוע היפותרמיה לאחר מכן.

בדקו את היעדרם של רפלקסים בכפות הרגליים ובזנב על ידי צביטה של כפות הרגליים האחוריות או של הזנב. לאחר מכן, נקו את העור בבטן עם 70% ethanol. השתמשו בפינצטה כדי למתוח את העור כלפי מעלה.

לאחר מכן, בצעו חתך אנכי קטן של שני סנטימטרים לאורך קו האמצע, החל מהמרכז שבין זוגות בלוטות החלב השלישי והרביעי. היזהרו לא לפגוע בדופן הבטן בעזרת פינצטה עגולה. משכו בעדינות את השלשלת העוברית הרחק מהחלל.

הניחו את השרשרת על מגבונים לחים. התחילו בחשיפת חצי אחד של הרחם. לאחר מכן, בצעו אלקטרופורציה לעוברים לפני המעבר לחצי השני.

בפרוצדורה זו, הכין תמיסת DNA על ידי המסה של המשקע שהתקבל מפרוטוקול טיהור maxi prep סטנדרטי במים מזוקקים. לאחר מכן, הוסף fast green לתמיסת ה-DNA ביחס של 1 ל-20 כדי לאפשר ויזואליזציה במהלך ההזרקה. בשלב הבא, חתוך את קצהו של מיקרו-פיפט שנמשך מראש בעזרת פינצטה עדינה, כך שיישארו 6 mm מתחילת הכתף ועד קצה הטיפ.

לאחר מכן, טען את המיקרופיפט עם 1 µL של תמיסת DNA עם fast green לצורך ההזרקה. החזק את ראשו של העובר באמצעות פינצטה עגולה. הכנס את הפיפט לתוך המוח בזווית של 45 מעלות, תוך כיוון לעבר הפרוזדור הצדי (lateral ventricle) הממוקם סמוך לקו האמצע.

אם המחט חודרת דרך החדר, החזר את הפיפטה לאחור באיטיות. החדר אמור להפוך לירוק כאשר התמיסה מתחילה למלא אותו. בנקודה זו, הפסק את תנועת הפיפטה והזרק 1 µL של DNA.

לאחר מכן, הוצא את הפ pipette בעדינות. הגדר את ה-ECM eight 30 ator ל-5 45 פולסי מתח של 50 milliseconds במרווחים של 950 millisecond בין פולס לפולס. טבול את אלקטרודות המשוטים בגודל חמישה מילימטר ב-PBS כדי להבטיח העברה יעילה של הזרם.

לאחר מכן, מקמו את פדי האלקטרודה מסביב לראשו של העובר, כאשר הפד החיובי מונח על החדר המכיל את תמיסת ה-DNA. מקמו את הפד החיובי מעט נמוך יותר מהפד השלילי כדי ליצור זרם ונטראלי (גחוני) דרך ה-ganglionic eminences. פעולה זו תמזער ביטוי אקטופי בתאי ה-parametal.

כעת העבירו פולס על ידי לחיצה אחת על דוושת הרגל, לאחר מכן הסירו את האלקטרודות ונגבו אותן כדי לנקותן. חזרו על השלבים עבור כל אחד מהעוברים. לאחר ביצוע אלקטרופורציה לכל העוברים.

שפכו שלושה מיליליטר של PBS לחלל הבטן והחזירו את העוברים לחלל הבטן. לאחר מכן, תפרו את דופן הבטן באמצעות מחט מעוקלת וחוט משי 5-0, ולאחר מכן את העור. מרחו לידוקאין על הפצע והעניקו 120 מיליגרם לקילוגרם של אספירין בתחילה לצורך אלגזיה.

הוצא את החיה מצינור ההרדמה ואפשר לה להתאושש על משטח חימום עם נייר סופג. לאחר מכן, החזר את החיה לכלוב. השאר אותה על משטח החימום בטמפרטורה של 37 °C ועקב אחר מצבה הבריאותי.

בניסוי זה, נוירונים ביניים שעברו אלקטרופורציה מובחנים על ידי ביטוי של סמני תת-סוג ממקור CGE. תמונה זו מראה כי נוירוני ביניים ממקור CGE עברו אלקטרופורציה עם פלסמיד DLX five six EGFP. תמונה זו מציגה נוירון ביניים המבטא VIP ב-P eight.

הביטוי של EGFP ממפה את כל עץ הדנדריטים והענפים האקסונליים של נוירונים בודדים, וכאן מוצג נוירון בינוני המבטא NPY ביום P 8. הביטוי של NPY ממפה תאי גליא נוירוגליאליים. לבסוף, כאן מוצג נוירון בינוני המבטא NPY ביום P 15.

ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצעה בתוך 20 דקות אם היא מבוצעת כראוי. על ידי שילוב של שימוש בפלסמיד ספציפי ובקווי עכברים שעברו שינוי גנטי, ניתן להשיג בקרה זמנית ומרחבית בביטוי של גנים רצויים. בחלק מהניסויים, אנו משתמשים בפלסמיד A-D-L-X-T-T-A כדי להשרות ביטוי של טראנס-גנים תלויי AU.

בניסויים אלו, השתקנו את ביטוי הגן התסובל באמצעות מתן doxycycline.