שני פוטונים In vivo הדמיה של קוצים הדנדריטים בCortex העכבר באמצעות דלילה, גולגולת הכנה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפשר הדמיה טרנס-גולגולתית, מבנים סינפטיים המסומנים באופן פלואורסצנטי בקליפת העכבר החי על ידי שני מיקרוסקופ פוטונים. השלב הראשון לאחר הרדמת העכבר הוא ביצוע הכנת גולגולת דלילה. לאחר מכן, ראש העכבר משותק באמצעות לוחית אחיזה בהתאמה אישית.

לאחר מכן נרכשות ערימות תמונות דרך הגולגולת הדלילה באמצעות שני מיקרוסקופ פוטונים. בסופו של דבר, רילוקיישן והדמיה. האזור שצולם קודם לכן איפשר לעקוב אחר הדינמיקה של הקוצים הדנדריטיים לאורך תקופות זמן שונות בתנאים שונים.

כדי להתכונן לניתוח, יש להרדים עכבר עם קטמין וקסילזין ולבצע צביטה בבוהן כדי להבטיח הרדמה מלאה. לאחר מכן הנח את העכבר על כרית חימום והשתמש בסכין גילוח כדי לגלח את הראש. נגב את העור עם רפידות אלכוהול לסירוגין כדי לעקר את האזור המגולח ולהסיר שאריות שיער.

כמו כן, יש למרוח בעדינות משחת עיניים על שתי העיניים. לאחר מכן, בצע חתך ישר לאורך קו האמצע של הקרקפת והזיז את העור לרוחב לכיוון שולי הגולגולת. לאחר מכן הסר את רקמת החיבור המחוברת לגולגולת כדי להתחיל בהכנת הגולגולת הדלילה.

ראשית, זהה את אזור ההדמיה הרצוי על סמך מיקומו היחסי לקו האמצע ול-bgma. לאחר מכן הרטיבו את הגולגולת במי מלח כדי להתבונן בכלי הדם כדי למנוע דילול הגולגולת באזור עם כלי דם גדולים מכיוון שהם חוסמים את חדירת האור ומטשטשים את מבני התמונה. לאחר שנבחר שטח בקוטר של 0.5 עד מילימטר, השתמש במקדחה מיקרו במהירות גבוהה כדי לדלל אזור מעגלי של הגולגולת.

הזז את המקדחה במקביל למשטח הגולגולת במקום להחזיק אותה כנגד הגולגולת וללחוץ כלפי מטה כדי למנוע נזק שנגרם כתוצאה מהתחממות יתר. הימנע ממגע ממושך בין המקדחה למקדחת הגולגולת עד להסרת שכבת העצם הקומפקטית החיצונית ושכבת העצם הספוגית האמצעית. לאחר מכן, השתמש בלהב מיקרו-כירורגי המוחזק בכ-45 מעלות כדי לדלל את שכבת העצם הקומפקטית הפנימית במרכז האזור המדולל של המקדחה.

מגרדים את הגולגולת מבלי ללחוץ כלפי מטה על הגולגולת עד לקבלת אזור דליל באופן שווה בקוטר של 200 עד 300 מיקרומטר בעובי של כ-20 עד 30 מיקרומטר. לאחר שהגולגולת מדוללת מספיק, הסר בזהירות את שאריות העצם. השלב הבא הוא חיבור לוחית הראש, המעוצבת מסכיני גילוח עם קצוות חדים המכוסים בקלטות.

התחל בהנחת טיפה קטנה של דבק ציאנואקרילט על כל קצה הפתח המרכזי של לוחית הראש. ואז מרכז את לוחית הראש על האזור הדליל. החזק אותו בחוזקה כנגד הגולגולת.

כעת, משוך בעדינות את העור מצידי הגולגולת לשולי הפתח המרכזי של לוחית הראש. החזק את לוחית הראש במקומה למשך דקה עד שתיים. לאחר מכן המתן עוד שמונה עד תשע דקות עד שלוחית הראש מחוברת היטב לגולגולת.

לאחר 10 דקות, הנח את לוחית הראש על שני הבלוקים הרוחביים של לוחית האחיזה. לאחר מכן, הדק את הברגים מעל שולי לוחית הראש כדי לשתק את העכבר על לוחית האחיזה. הסתכלו על ראש העכבר דרך מיקרוסקופ מנתח תוך כדי ריפוד עדין של גב העכבר כדי לוודא שהראש משותק כהלכה.

לאחר מכן, שטפו את הגולגולת החשופה במי מלח כדי להסיר כל דבק לא פולימרי על מנת להעביר את האזור שצולם קודם לכן. במפגשי הדמיה הבאים, צלם את כלי הדם של האזור הדק של הגולגולת החשופה, המכונה מפה אחת. לאחר מכן הנח את העכבר מתחת למיקרוסקופ ההדמיה ואתר את האזור המדולל מתחת למטרת האוויר פי 10.

באמצעות epi fluorescence, העבר את האזור הדק ביותר למרכז התצוגה. כעת הוסיפו טיפת מי מלח לחלק העליון של הגולגולת ועברו למטרה של פי 60. בחר אזור שבו קוצים דנדריטיים בודדים מוצגים בבירור לאורך דנדריטים.

זהה ותייג את האזור המתאים במפה הראשונה על ידי השוואת כלי הדם בין תצוגת ה-epi פלואורסצנטית לתמונת כלי הדם. לאחר מכן, כוון את שני אורכי הגל של לייזר הפוטונים בהתאם לרביעיות הפלואורו. לאחר מכן, באמצעות המטרה של 60 x רכשו ערימות תמונות עם שני צעדים מיקרומטריים לאורך ציר Z, המכסים שטח של כ-200 מיקרומטר על 200 מיקרומטר.

מפה זו מוגדרת כמפה שתיים ומשמשת למיקום מחדש של המקטע הדנדריטי של התמונה במהלך מפגשי הדמיה הבאים. כעת רכוש תשע ערימות תמונות בתוך מפה שתיים באמצעות זום דיגיטלי של שלושה x. כל ערימת תמונות מכסה שטח משוער של 70 מיקרומטר על 70 מיקרומטר עם צעדים של 0.7 מיקרומטר לאורך ציר Z.

לאחר ההדמיה, נתק בעדינות את לוחית הראש מהגולגולת. לאחר מכן, השתמש בלהב מיקרו-כירורגי כדי להסיר את הדבק שנותר מהגולגולת. לאחר מכן יש לשטוף את הגולגולת והעור במי מלח מספר פעמים ולתפור את הקרקפת בתפרים כירורגיים סטריליים.

במהלך ההחלמה, החזיקו את החיה על כרית חימום בכלוב נפרד ותנו משכך כאבים בופרנורפין תת עורי לכאבים לאחר הניתוח. לאחר החלמה מלאה, החזר את החיה למד הביתי כדי לדמות מחדש דנדריטים ביום אחר, להרדים את החיה ולחשוף את הגולגולת. כמו קודם, חזור על קיבוע הראש על ידי הרכבת לוחית הראש והצמדתה ללוחית האחיזה.

לאחר מכן אתר את האזור שצולם קודם לכן על ידי השוואת דפוס כלי הדם למיפוי אחד ותבנית הענף הדנדריטי למיפוי שניים. אם מבוצעת הדמיה חוזרת תוך שבוע, ניתן להסיר את השכבה הדקה של העצם שזה עתה גדלה בעזרת להב מיקרו-כירורגי. אם הדמיה חוזרת מתבצעת לאחר יותר משבוע, השתמש תחילה במקדחה המיקרו, ולאחר מכן בלהב המיקרו-כירורגי כדי לדלל את הגולגולת.

כעת התאם את המיקום והכיוון מתחת לשני מיקרוסקופ הפוטונים כדי לקבל ערימות תמונות התואמות את ערימות התמונות שצולמו בעבר. לאחר רכישת תמונות, אפשר לעכבר להתאושש ולהחזיר אותו לכלוב שלו כמו קודם, ותמונה של דפוס כלי הדם המקיף את אזור הגולגולת הדק המוגדר כמפה אחת משמשת להתייחסות לכל מפגשי ההדמיה הבאים. הקופסה השחורה מציינת את האזור שבו נרכשו שני תמונות פוטון in vivo.

תמונה זו של ענפים דנדריטיים בקליפת המוח המוטורית של עכבר בן חודש מסומנת כמפה שתיים. התיבה הלבנה מציגה את המקטע הדנדריטי שנבחר להדמיה. עם הזמן, בוצעו שני הדמיות פוטונים של אותו מקטע דנדריטי ביום האפס, ביום השני, ביום הרביעי וביום השמיני.

קוצים חדשים שנוצרו. כלומר, עמודי שדרה שלא היו קיימים בפגישת ההדמיה הקודמת מוצגים על ידי קוצים של ראש חץ שסולקו בין מפגשי ההדמיה מוצגים על ידי החצים. פיליפ פודיה מסומן על ידי כוכבים שפעם שלטו בהם.

טכניקה זו יכולה להיעשות תוך שעה עד שעתיים אם היא מבוצעת כראוי.