שני פוטונים In vivo הדמיה של קוצים הדנדריטים בCortex העכבר באמצעות דלילה, גולגולת הכנה
12 במאי 2014
הדמיית זמן-lapse בבעל חיים חי מספקת מידע רב ערך על ארגון מחדש מבני במוח השלם. כאן, אנו מציגים תכשיר גולגולת דק המאפשר הדמיה טרנס-גולגולתית של מבנים סינפטיים בעלי תווית פלואורסצנטית בקליפת העכבר החי על ידי מיקרוסקופ דו-פוטוני.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפשר הדמיה טרנס-גולגולתית, מבנים סינפטיים המסומנים באופן פלואורסצנטי בקליפת העכבר החי על ידי שני מיקרוסקופ פוטונים. השלב הראשון לאחר הרדמת העכבר הוא ביצוע הכנת גולגולת דלילה. לאחר מכן, ראש העכבר משותק באמצעות לוחית אחיזה בהתאמה אישית.
לאחר מכן נרכשות ערימות תמונות דרך הגולגולת הדלילה באמצעות שני מיקרוסקופ פוטונים. בסופו של דבר, רילוקיישן והדמיה. האזור שצולם קודם לכן איפשר לעקוב אחר הדינמיקה של הקוצים הדנדריטיים לאורך תקופות זמן שונות בתנאים שונים.
כדי להתכונן לניתוח, יש להרדים עכבר עם קטמין וקסילזין ולבצע צביטה בבוהן כדי להבטיח הרדמה מלאה. לאחר מכן הנח את העכבר על כרית חימום והשתמש בסכין גילוח כדי לגלח את הראש. נגב את העור עם רפידות אלכוהול לסירוגין כדי לעקר את האזור המגולח ולהסיר שאריות שיער.
כמו כן, יש למרוח בעדינות משחת עיניים על שתי העיניים. לאחר מכן, בצע חתך ישר לאורך קו האמצע של הקרקפת והזיז את העור לרוחב לכיוון שולי הגולגולת. לאחר מכן הסר את רקמת החיבור המחוברת לגולגולת כדי להתחיל בהכנת הגולגולת הדלילה.
ראשית, זהה את אזור ההדמיה הרצוי על סמך מיקומו היחסי לקו האמצע ול-bgma. לאחר מכן הרטיבו את הגולגולת במי מלח כדי להתבונן בכלי הדם כדי למנוע דילול הגולגולת באזור עם כלי דם גדולים מכיוון שהם חוסמים את חדירת האור ומטשטשים את מבני התמונה. לאחר שנבחר שטח בקוטר של 0.5 עד מילימטר, השתמש במקדחה מיקרו במהירות גבוהה כדי לדלל אזור מעגלי של הגולגולת.
הזז את המקדחה במקביל למשטח הגולגולת במקום להחזיק אותה כנגד הגולגולת וללחוץ כלפי מטה כדי למנוע נזק שנגרם כתוצאה מהתחממות יתר. הימנע ממגע ממושך בין המקדחה למקדחת הגולגולת עד להסרת שכבת העצם הקומפקטית החיצונית ושכבת העצם הספוגית האמצעית. לאחר מכן, השתמש בלהב מיקרו-כירורגי המוחזק בכ-45 מעלות כדי לדלל את שכבת העצם הקומפקטית הפנימית במרכז האזור המדולל של המקדחה.
מגרדים את הגולגולת מבלי ללחוץ כלפי מטה על הגולגולת עד לקבלת אזור דליל באופן שווה בקוטר של 200 עד 300 מיקרומטר בעובי של כ-20 עד 30 מיקרומטר. לאחר שהגולגולת מדוללת מספיק, הסר בזהירות את שאריות העצם. השלב הבא הוא חיבור לוחית הראש, המעוצבת מסכיני גילוח עם קצוות חדים המכוסים בקלטות.
התחל בהנחת טיפה קטנה של דבק ציאנואקרילט על כל קצה הפתח המרכזי של לוחית הראש. ואז מרכז את לוחית הראש על האזור הדליל. החזק אותו בחוזקה כנגד הגולגולת.
כעת, משוך בעדינות את העור מצידי הגולגולת לשולי הפתח המרכזי של לוחית הראש. החזק את לוחית הראש במקומה למשך דקה עד שתיים. לאחר מכן המתן עוד שמונה עד תשע דקות עד שלוחית הראש מחוברת היטב לגולגולת.
לאחר 10 דקות, הנח את לוחית הראש על שני הבלוקים הרוחביים של לוחית האחיזה. לאחר מכן, הדק את הברגים מעל שולי לוחית הראש כדי לשתק את העכבר על לוחית האחיזה. הסתכלו על ראש העכבר דרך מיקרוסקופ מנתח תוך כדי ריפוד עדין של גב העכבר כדי לוודא שהראש משותק כהלכה.
לאחר מכן, שטפו את הגולגולת החשופה במי מלח כדי להסיר כל דבק לא פולימרי על מנת להעביר את האזור שצולם קודם לכן. במפגשי הדמיה הבאים, צלם את כלי הדם של האזור הדק של הגולגולת החשופה, המכונה מפה אחת. לאחר מכן הנח את העכבר מתחת למיקרוסקופ ההדמיה ואתר את האזור המדולל מתחת למטרת האוויר פי 10.
באמצעות epi fluorescence, העבר את האזור הדק ביותר למרכז התצוגה. כעת הוסיפו טיפת מי מלח לחלק העליון של הגולגולת ועברו למטרה של פי 60. בחר אזור שבו קוצים דנדריטיים בודדים מוצגים בבירור לאורך דנדריטים.
זהה ותייג את האזור המתאים במפה הראשונה על ידי השוואת כלי הדם בין תצוגת ה-epi פלואורסצנטית לתמונת כלי הדם. לאחר מכן, כוון את שני אורכי הגל של לייזר הפוטונים בהתאם לרביעיות הפלואורו. לאחר מכן, באמצעות המטרה של 60 x רכשו ערימות תמונות עם שני צעדים מיקרומטריים לאורך ציר Z, המכסים שטח של כ-200 מיקרומטר על 200 מיקרומטר.
מפה זו מוגדרת כמפה שתיים ומשמשת למיקום מחדש של המקטע הדנדריטי של התמונה במהלך מפגשי הדמיה הבאים. כעת רכוש תשע ערימות תמונות בתוך מפה שתיים באמצעות זום דיגיטלי של שלושה x. כל ערימת תמונות מכסה שטח משוער של 70 מיקרומטר על 70 מיקרומטר עם צעדים של 0.7 מיקרומטר לאורך ציר Z.
לאחר ההדמיה, נתק בעדינות את לוחית הראש מהגולגולת. לאחר מכן, השתמש בלהב מיקרו-כירורגי כדי להסיר את הדבק שנותר מהגולגולת. לאחר מכן יש לשטוף את הגולגולת והעור במי מלח מספר פעמים ולתפור את הקרקפת בתפרים כירורגיים סטריליים.
במהלך ההחלמה, החזיקו את החיה על כרית חימום בכלוב נפרד ותנו משכך כאבים בופרנורפין תת עורי לכאבים לאחר הניתוח. לאחר החלמה מלאה, החזר את החיה למד הביתי כדי לדמות מחדש דנדריטים ביום אחר, להרדים את החיה ולחשוף את הגולגולת. כמו קודם, חזור על קיבוע הראש על ידי הרכבת לוחית הראש והצמדתה ללוחית האחיזה.
לאחר מכן אתר את האזור שצולם קודם לכן על ידי השוואת דפוס כלי הדם למיפוי אחד ותבנית הענף הדנדריטי למיפוי שניים. אם מבוצעת הדמיה חוזרת תוך שבוע, ניתן להסיר את השכבה הדקה של העצם שזה עתה גדלה בעזרת להב מיקרו-כירורגי. אם הדמיה חוזרת מתבצעת לאחר יותר משבוע, השתמש תחילה במקדחה המיקרו, ולאחר מכן בלהב המיקרו-כירורגי כדי לדלל את הגולגולת.
כעת התאם את המיקום והכיוון מתחת לשני מיקרוסקופ הפוטונים כדי לקבל ערימות תמונות התואמות את ערימות התמונות שצולמו בעבר. לאחר רכישת תמונות, אפשר לעכבר להתאושש ולהחזיר אותו לכלוב שלו כמו קודם, ותמונה של דפוס כלי הדם המקיף את אזור הגולגולת הדק המוגדר כמפה אחת משמשת להתייחסות לכל מפגשי ההדמיה הבאים. הקופסה השחורה מציינת את האזור שבו נרכשו שני תמונות פוטון in vivo.
תמונה זו של ענפים דנדריטיים בקליפת המוח המוטורית של עכבר בן חודש מסומנת כמפה שתיים. התיבה הלבנה מציגה את המקטע הדנדריטי שנבחר להדמיה. עם הזמן, בוצעו שני הדמיות פוטונים של אותו מקטע דנדריטי ביום האפס, ביום השני, ביום הרביעי וביום השמיני.
קוצים חדשים שנוצרו. כלומר, עמודי שדרה שלא היו קיימים בפגישת ההדמיה הקודמת מוצגים על ידי קוצים של ראש חץ שסולקו בין מפגשי ההדמיה מוצגים על ידי החצים. פיליפ פודיה מסומן על ידי כוכבים שפעם שלטו בהם.
טכניקה זו יכולה להיעשות תוך שעה עד שעתיים אם היא מבוצעת כראוי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה לדימות טרנסקרניאלי (דרך הגולגולת) של מבנים סינפטיים המסומנים בفلורסצנציה בקליפת המוח של עכבר חי באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית. הכנת הגולגולת המדוררת מאפשרת תצפית מפורטת על ארגון מחדש מבני במוח השלם לאורך זמן.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- טכניקות דימות
- דינמיקה סינפטית
רקע
- הבנת מבנים סינפטיים היא קריטית למחקר במדעי המוח.
- שיטות דימות מסורתיות עשויות שלא לאפשר תצפית in vivo.
- מיקרוסקופיה דו-פוטונית מספקת יכולות דימוי ברזולוציה גבוהה.
- הכנת גולגולת מדוקקת היא גישה חדשנית להדמיה מסוג זה.
מטרת המחקר
- לאפשר דימות טרנס-קרניאלי של מבנים סינפטיים בעכברים חיים.
- להתבונן בדינמיקה של קוצים דנדריטיים לאורך זמן.
- להקל על מחקר של ארגון מבני מחדש במוח.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הרדמת העכבר.
- ביצוע הכנה של דילול הגולגולת.
- קיבוע ראשו של העכבר באמצעות פלטת החזקה מותאמת אישית.
- רכישת מחסניות תמונות דרך הגולגולת המדוללת באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית.
תוצאות עיקריות
- דימוג מוצלח של מבנים סינפטיים המסומנים פלואורסצנטית.
- יכולת למעקב אחר הדינמיקה של קוצים דנדריטיים לאורך זמן.
- תובנות לגבי שינויים מבניים בקורטקס של עכבר חי.
- הדגמה של יעילותה של הכנת הגולגולת המדוקקת.
מסקנות
- הכנת גולגולת דקה היא טכניקה בעלת ערך למחקר במדעי העצבים.
- מיקרוסקופיית דו-פוטון מאפשרת דימוי מפורט in vivo.
- שיטה זו יכולה לשפר את הבנתנו את הדינמיקה הסינפטית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימיון in vivo רזולוציית גבוה בשיטת שני פוטונים של קוצים דנדריטיים בקליפת המוח של עכבר מאפשר תצפית ישירה על דינמיקה מבנית סינפטית לאורך זמן, ובכך תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים בתהליכי גילוי בנוירוביולוגיה. גישה זו מספקת ביטחון חיזוי עבור תיקוף מטרות ובחינת מסלולים בתיקי גילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS). החזרתיות של השיטה והפולשנות המינימלית שלה מקלות על ביצוע מחקרי אורך הקריטיים להמשכיות תרגומית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ויזואליזציה ישירה של עיצוב מחדש סינפטי, המספקת מידע על מעורבות המטרה ורלוונטיות המסלול.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מנגנוני פלסטיות סינפטית במעגלים עצביים הרלוונטיים למחלה.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנונית על ידי מתן אפשרות להערכה כמותית חוזרת של דינמיקת קוצי דנדריטים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכת in vivo שעברה תיקוף להערכת השפעות של תרכובות על המבנה הסינפטי.
- מאפשר השגת פלטים של דימות כמותי הניתנים לשחזור ומתאימים לניתוח השוואתי בין תנאים שונים.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות מיפוי ומיקום מחדש של מקטעי דנדריטים זהים לאורך מספר מפגשים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתכתב עם מודלים רלוונטיים למחלה על ידי מתן אפשרות לדימות באזורים קורטיקליים ובסוגי תאים שונים תחת מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים.
- מסייע למחקרי ביומרקרים אורכיים באמצעות מעקב אחר שינויים סינפטיים לאורך תקופות ממושכות.
- תומך בהחלטות קידום מבוססות ניהול סיכונים באמצעות מדידות in vivo חסונות וניתנות לשחזור.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
פרוטוקול דימות זה משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומגשר בין מחקרים מכניסטיים מוקדמים למחקר תרגומי בפורטפוליו של מערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובהבהרת מסלולים על ידי מתן אפשרות לתצפית ישירה על שינויים סינפטיים.
- סריקה: מספק נתוני דימוי כמותיים וניתנים לשחזור לצורך הערכת תרכובות ברקע של רקמה עצבית חיה.
- אנליטיקה: מספק מחסניות תמונות בעלות תוכן גבוה ומדדי תחלופה כמותיים של קוצים לצורך השוואה סטטיסטית.
- מחקר תרגומי: מאפשר רציפות על ידי מתן אפשרות לדימוי חוזר באותה חיה לאורך נקודות זמן ותנאים שונים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר עבור מטרות מגוונות במערכת העצבים המרכזית (CNS), סוגי תאים ומודלים של מחלות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף של מטרות סינפטיות ומפחית עמימות מכניסטית.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של תהליכי עבודה של דימות in vivo ותומך בחזרתיות בין מחקרים.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשכת הפיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לאיסוף נתונים אורך (longitudinal) חסון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון ובקידום של תוכניות CNS.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיית פוטונים כפוליים ובטכניקות ניתוחיות בבעלי חיים קטנים.
- מחייב גישה למכשור דימות מתקדם ולחומרת קיבוע ראש מותאמת אישית.
- דורש מיפוי והסטנדרטיזציה קפדניים בין סשנים עבור מחקרים אורכיים.
- ניתן להתאמה לאזורי קורטקס, שכבות וסוגי תאים שונים, כפי שנתמך בפרוטוקול.
- מוגבל על ידי הצורך בדילוק מדויק של הגולגולת והסבירות לצמיחה מחודשת של העצם עם הזמן.
