Name: שני פוטונים In vivo הדמיה של קוצים הדנדריטים בCortex העכבר באמצעות דלילה, גולגולת הכנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-12T22:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: למד הדמיה תלת־ממדית של קוצים דנדריטיים בעכבר חי באמצעות מיקרוסקופיית שני פוטונים ושיטת הגולגולת הדלילה. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר שינויים מבניים בסינפסות לאורך זמן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לג&#39;יימס Perna להמחשה הגרפית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות הנפש לYZ

אישור צריך להיות ממוסדים הביתה לפני תחילתו של הניתוח ומחקר הדמיה. ניסויים שתוארו בכתב היד הזה בוצעו בהתאם להנחיות ותקנות מאוניברסיטת קליפורניה בסנטה קרוז מוסדי הטיפול בבעלי חיים ועדת שימוש. 1. ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי כל מכשירי הניתוח ולעקר את סביבת העבודה עם אלכוהול 70% ביסודיות לפני הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר על ידי intraperitoneal הזרקה (IP) של פתרון KX הרדמה (200 מ&quot;ג / קטמין קילוגרם ו20 מ&quot;ג / קילוגרם xylazine) בהתאם למשקל גופו של עכבר הערה:. מינון KX יכול להיות מותאם על פי הזן, הגיל ומצב בריאות של העכברים. התייעצות וטרינרית כדי לקבוע את המינון האופטימלי מומלצת גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע בדיקת הבוהן קמצוץ מעת לעת על ידי לחיצה על בוהן של העכבר ובדיקת תגובה רפלקסיבית לנטר את מצב ההרדמה.ודא שהעכבר הוא בהרדמה מלאה לפני תחילת ניתוח הערה:. במהלך פגישות הדמיה ממושכות, לבדוק את מצב ההרדמה של העכבר מעת לעת, לנהל KX נוסף במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף במהלך הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את הראש של העכבר באמצעות סכין גילוח כדי לחשוף את הקרקפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את האזור המגולח ידי מנגב את העור עם לסירוגין רפידות אלכוהול ובטאדין. הסר את כל גזירות שיער שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להחיל משחה העין כדי לשמן את שני העיניים, ולכן מניעת ניזק בלתי הפיך הנגרם על ידי התייבשות במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך ישר לאורך קו האמצע של הקרקפת, ולהעביר את העור רוחבי לכיוון הקצוות של הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את רקמת החיבור הצמודה לגולגולת. </li></ol> 2. דליל, גולגולת הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את אזור ההדמיה המבוסס על ster. קואורדינטות eotaxic הערה: נסה להימנע מכלי דם גדולים, שחדירה לחסום אור ולטשטש את מבני הדמיה. בכלי דם הוא ציין הטוב ביותר כאשר הגולגולת לחה עם תמיסת מלח סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתרגיל מיקרו במהירות גבוהה כדי לדלל אזור מעגלי של גולגולת (0.5-1.0 מ&quot;מ קוטר). העבר את התרגיל המקביל למשטח הגולגולת, ולא מחזיק את זה נגד הגולגולת ולחיצה. מקדחה עד ששתי השכבה החיצונית הקומפקטית עצם ושכבת עצם הספוגית האמצע יוסרו הערה:. כדי למנוע נזק שנגרם על ידי התחממות יתר, להימנע ממגע ממושך בין המקדח והגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך דילול שכבת העצם הקומפקטי הפנימית עם להב microsurgical במרכז האזור-דליל התרגיל. החזק את להב microsurgical בזווית של כ 45 ° כדי לגרד את הגולגולת בלי לחיצה על הגולגולת באופן שווה עד דליל אזור קטן (200-300 בקוטר מיקרומטר) בעובי של משוערמיקרומטר ly 20-30 מתקבל. בשל אוטומטי הקרינה של הגולגולת, העובי ניתן למדוד על ידי סריקה את המרחק בין משטח העליון ותחתון של הגולגולת מתחת לשני פוטונים מיקרוסקופ הערה:. למרות עובי גולגולת של פחות מ 20 מיקרומטר מספק איכות הדמיה טובה, זה לא מומלץ, כי זה הופך את תהליך ההרזיה בהפעלות מחדש הדמיה הבאות קשה. כדי להימנע מעל דליל, העובי של הגולגולת צריך להיבדק מעת לעת במהלך הניתוח (ראה דיון). </li></ol> 3. קיבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את עצם פסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום טיפה קטנה של דבק cyanoacrylate בכל קצה של פתיחת מרכז צלחת ראש סטרילית, אשר כבר autoclaved (ראה איור 1). החזק את הצלחת בראש בחוזקה נגד הגולגולת עם האזור דליל הממוקם במרכזה של פתיחת הערה:. אם הדבק מזהם את r דלילegion במקרה, הסר אותה בזהירות עם להב microsurgical. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך בעדינות את העור מן הצדדים של הגולגולת לקצוות של פתיחת מרכז צלחת הראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן כ10 דקות עד שצלחת הראש מצורפת גם לגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת על ראש שני בלוקים לרוחב של הצלחת החזקה ולאחר מכן הדקתי את הברגים על הקצוות של צלחת הראש כדי לשתק את העכבר על צלחת ההחזקה (ראה איור 1) הערה:. ודא שאין עור או שפם בין צלחת הראש והלוקים לפני הידוק הברגים. הכנה משותקת טובה צריכה להראות שום תנועה הנצפית של הגולגולת מתחת למיקרוסקופ לנתח כאשר החלק האחורי של בעל החיים הוא טפח בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> . יש לשטוף את הגולגולת חשופה עם מי מלח כדי להסיר את דבק unpolymerized הערה: חשוב כדי להסיר כל דבק שנותר, כדבק unpolymerized מטשטש תמונות ונזקים מיקרוסקופ מטרות &lt;./ Li&gt; </ol> 4. הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את תמונה של כלי הדם של הגולגולת חשופה עם האזור דליל כמו מפה 1, המשמש למיקום מחדש של האזור צילם בפגישות הדמיה הבאות (ראה איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר מתחת למיקרוסקופ ההדמיה. אתר את האזור דליל תחת מטרת מיזוג 10X באמצעות epifluorescence ולהזיז את האזור הדק ביותר למרכז התצוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה של תמיסת מלח בחלק העליון של הגולגולת ולעבור למטרת 60x, אשר כבר שטפה עם מים סטריליים. בחר אזור בו קוצים הדנדריטים בודדים בבירור הם דמיינו לאורך הדנדריטים. לזהות ולתייג את האזור המקביל ב -1 במפה על ידי השוואת כלי דם בין תצוגת epifluorescent והתמונה בכלי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנגינת הלייזר באורך גל שני פוטונים פי fluorophores. לדוגמא, 920 ננומטר לYFP; 890 ננומטר של ה-GFP; 1,000 ננומטר לDsRed ו24 tdTomato. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש ערימות תמונה עם 2צעדי מיקרומטר לאורך ציר z באמצעות אובייקטיבי 60x. ערימת תמונה זו משתרעת על שטח של כ 200 מיקרומטר x 200 מיקרומטר (512 x 512 פיקסלים), והוא משמש כמפה 2 להעתקה במהלך פגישות הדמיה שלאחר מכן (ראה איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תשע ערימות תמונה בתוך מפה 2 שימוש בזום דיגיטלי 3X. כל ערימת תמונה משתרעת על שטח משוער של 70 מיקרומטר x 70 מיקרומטר (512 x 512 פיקסלים), עם 0.7 מיקרומטר צעדים לאורך ציר Z-הערה:. עוצמת הלייזר צריכה להיות מתחת 40 mW כאשר נמדדו בדגימות כדי למזער phototoxicity. </li></ol> 5. שחזור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הדמיה, בעדינות לנתק את הצלחת בראש מהגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות ביסודיות את הגולגולת ואת העור כדי להסיר את כל הדבק שנותר הערה:. כל דבק שנותר על העור יגרום לגירויים ולהאט את החלמת עור בזמן שכל דבק שנותר בגולגולת יגרום לשחיקה של הגולגולת וngiogenesis בשכבת העצם גדלה לאחרונה, מה שהופך את ההעתקה הבאה ומחדש הדמיה קשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הגולגולת ואת העור עם מספר פעמים מלוחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפר את הקרקפת עם תפר כירורגי סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את החיה על כרית חימום בכלוב נפרד. לנהל משכך כאבים עצירות (0.1 מ&quot;ג / קילוגרם) תת עורי כדי להקל על כאב שלאחר ניתוח. להחזיר את בעל החיים לכלוב בבית לאחר החלמה מלאה. לפקח על בעלי החיים בשיתוף פעולה הדוק (לבדוק לפחות פעם ביום) עד שהחתך נרפא ותפרים יוסרו. להזריק הבא של משכך כאבים עצירות במידת הצורך. </li></ol> 6. Reimaging <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 1.1-1.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 3.1-3.6 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר אזור צילם בעבר על ידי השוואת הדפוס בכלי הדם למפת 1 ודפוס סניף הדנדריטים למפת 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם reimaging מתבצע בתוך 1 שבוע, חזור על שלב 2.3 כדי להסיר את השכבה דקה של עצם גדל עתה על גבי מחדש דלילגיון באמצעות להב microsurgical. אם reimaging מבוצע לאחר שבוע יותר מ 1, חזור על שלבי שני 2.2 ו2.3 הערה:. שכבת העצם גדלה חדש מורכבת ממבנה מרוכז פחות בהשוואה לשכבה המקורית הקומפקטית העצם, מה שמוביל לאיכות תמונה מופחתת. לכן, כדי לרכוש את אותה האיכות, יש צורך לדלל את הגולגולת מעט יותר מפגישת ההדמיה הקודמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את המיקום ואת הכיוון כדי להשיג ערימות תמונה התואמות נלקחו בעבר ערימות תמונה מתחת למיקרוסקופ שני הפוטונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות כמו בשלב 4.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 5.1-5.5 לאחר הדמיה. </li></ol>

<ol><li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).</li>
<li>Fu, M., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+plasticity+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural plasticity in the cortex.</a> Trends in neurosciences. 34, 177-187 (2011).</li>
<li>Yu, X., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spine+plasticity+in+the+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Spine plasticity in the motor cortex.</a> Current opinion in neurobiology. 21, 169-174 (2011).</li>
<li>Harms, K. J., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+plasticity%3A+looking+beyond+development%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine plasticity: looking beyond development.</a> Brain research. 1184, 65-71 (2007).</li>
<li>Segal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spines+and+long-term+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dendritic spines and long-term plasticity.</a> Nature reviews. Neuroscience. 6, 277-284 (2005).</li>
<li>Tada, T., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of dendritic spine morphogenesis.</a> Current opinion in neurobiology. 16, 95-101 (2006).</li>
<li>Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annual review of neuroscience. 30, 79-97 (2007).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li>
<li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature protocols. 5, 201-208 (2010).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature protocols. 4, 1128-1144 (2009).</li>
<li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nature methods. 7, 981-984 (2010).</li>
<li>Szu, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cortical+window+technique+for+in+vivo+optical+coherence+tomography+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cortical window technique for in vivo optical coherence tomography imaging.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Xu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+formation+and+selective+stabilization+of+synapses+for+enduring+motor+memories%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories.</a> Nature. 462, 915-919 (2009).</li>
<li>Fu, M., Yu, X., Lu, J., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repetitive+motor+learning+induces+coordinated+formation+of+clustered+dendritic+spines+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Repetitive motor learning induces coordinated formation of clustered dendritic spines in vivo.</a> Nature. 483, 92-95 (2012).</li>
<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature neuroscience. 8, 752-758 (2005).</li>
<li>Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrillar+amyloid+deposition+leads+to+local+synaptic+abnormalities+and+breakage+of+neuronal+branches%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches.</a> Nature neuroscience. 7, 1181-1183 (2004).</li>
<li>Pan, F., Aldridge, G. M., Greenough, W. T., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+instability+and+insensitivity+to+modulation+by+sensory+experience+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine instability and insensitivity to modulation by sensory experience in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 17768-17773 (2010).</li>
<li>Liu, Z., Condello, C., Schain, A., Harb, R., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1+in+microglia+regulates+brain+amyloid+deposition+through+selective+protofibrillar+amyloid-beta+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">CX3CR1 in microglia regulates brain amyloid deposition through selective protofibrillar amyloid-beta phagocytosis.</a> J Neurosci. 30, 17091-17101 (2010).</li>
<li>Tremblay, M. E., Zettel, M. L., Ison, J. R., Allen, P. D., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+aging+and+sensory+loss+on+glial+cells+in+mouse+visual+and+auditory+cortices%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Effects of aging and sensory loss on glial cells in mouse visual and auditory cortices.</a> Glia. 60, 541-558 (2012).</li>
<li>Lam, C. K., Yoo, T., Hiner, B., Liu, Z., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embolus+extravasation+is+an+alternative+mechanism+for+cerebral+microvascular+recanalization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Embolus extravasation is an alternative mechanism for cerebral microvascular recanalization.</a> Nature. 465, 478-482 (2010).</li>
<li>Kelly, E. A., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+imaging+of+mouse+visual+cortex+using+a+thinned-skull+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thin-skull+window+technique+for+chronic+two-photon+in+vivo+imaging+of+murine+microglia+in+models+of+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+glioma+initiation+in+vivo+through+a+polished+and+reinforced+thin-skull+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging glioma initiation in vivo through a polished and reinforced thin-skull cranial window.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+genetic+manipulation+of+dendrites+and+spines+in+the+mouse+cerebral+cortex+and+hippocampus+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental biology. 240, 237-246 (2001).</li>
<li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+injection+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intracranial injection of adeno-associated viral vectors.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71, 995-1013 (2011).</li>
<li>Zariwala, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> J Neurosci. 32, 3131-3141 (2012).</li>
<li>Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+labeling+and+functional+manipulation+of+specific+neuron+types+in+mouse+brain+by+Cre-activated+viral+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression.</a> PloS one. 3, (2008).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כדי להשיג הכנה דלילה, גולגולת מוצלחת, כמה צעדים בפרוטוקול זה הם קריטיים. 1) העובי של הגולגולת. יש עצם גולגולת מבנה כריך, עם שתי שכבות של עצם קומפקטי בצפיפות גבוהה ושכבה אמצעית של עצם ספוגי בצפיפות נמוכה. בעוד תרגיל מיקרו במהירות גבוהה הוא מתאים להסרת השכבות החיצוניות של עצם קומפקטי ועצם ספוגי, להב microsurgical הוא אידיאלי לדילול השכבה הפנימית של עצם קומפקטי. כעובי וקשיחות של עליות הגולגולת במהלך פיתוח, הדמיה של עכברים בוגרים דורשת עצם יותר שיש להסירו כדי להשיג תמונות באיכות טובה....

היונקים הקליפה משתתפת בתפקודי מוח רבים, משליטת תפיסה והתנועה חושית לעיבוד מידע מופשט וקוגניציה. פונקציות שונות בקליפת המוח לבנות על מעגלים עצביים שונים, אשר מורכבים סוגים שונים של נוירונים תקשורת והחלפת מידע בסינפסות בודדות של. המבנה והתפקוד של סינפסות באופן עקבי להיות שונה בתגובה לחוויות ופתולוגיות. במוח הבוגר, פלסטיות הסינפטית לובשת צורה של שני שינויי כוח ובנוסף / הסרה של סינפסות, ממלאת תפקידים חשובים ביצירת ותחזוקה של מעגלים עצביים פונקציונליים. קוצים הדנדריטים הם רכיבי postsynaptic של רוב סינפסות מעוררות במוח של היונקים. התחלופה המתמדת ושינויים מורפולוגיים של קוצים הם האמינו לשמש אינדיקטור טוב של שינויים בקשרים סינפטיים 1-7. מיקרו לייזר סריקת שני פוטוניםscopy מציע חדירה עמוקה דרך, הכנות אטומות עבות וphototoxicity הנמוך, מה שהופך אותו מתאים להדמיה לחיות במוח שלם 8. בשילוב עם תיוג פלורסנט, שני פוטונים הדמיה מספקת כלי רב עוצמה כדי להציץ לתוך המוח החי ופעל לארגון מחדש מבני בסינפסות בודדות עם גבוה במרחב וברזולוציה של זמן. שיטות שונות שימשו להכנת עכברי הדמיה לחיות 9-13. כאן, אנו מתארים הכנה דלילה, גולגולת של in vivo שני פוטונים הדמיה כדי לחקור את הפלסטיות המבנית של קוצים הדנדריטים postsynaptic בקליפת מוח העכבר. שימוש בגישה זו, המחקרים האחרונים שלנו תיארו תמונה דינמית של שינויים בעמוד השדרה הדנדריטים בתגובה למיומנות מוטורית לומדת עם זמינות גוברת של בעלי חיים מהונדסים עם תת נוירונים שכותרתו fluorescently והתפתחות מהירה של in vivo טכניקות תיוג, יכולים להיות מיושמים גם נהלים דומים שתוארו כאן לחקירהסוגי te תאים אחרים ואזורים בקליפת המוח, בשילוב עם מניפולציות אחרות, כמו גם בשימוש במודלים של מחלת 16-23.

<table><tbody><tr><td>קטמין</td><td>ביונישה פארמה</td><td>67457-034-10</td><td>מעורבב עם קסילזין להרדמה</td></tr><tr>מעבדות<td>קסילזין</td><td>לויד</td><td>139-236</td><td>מעורבב עם קטמין להרדמה</td></tr><tr><td>מי מלח</td><td>הוספירה</td><td>0409-7983-09</td><td>0.9% NaCl להזרקה והדמיה</td></tr><tr><td>סכיני גילוח</td> מדעי <td>מיקרוסקופ אלקטרונים</td><td>72000</td><td>סכיני גילוח נירוסטה כפולים</td></tr><tr><td>רפידות אלכוהול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>06-669-62</td><td>רפידות הכנה לאלכוהול סטריליות</td></tr><tr><td>משחת עיניים</td><td>הנרי שיין</td><td>102-9470</td><td>משחת עיניים פטרולאטום חומר סיכה עיני סטרילי</td></tr><tr><td>מקדחה מיקרו במהירות גבוהה</td><td>Fine Science</td><td>Tools 18000-17</td><td>מקדחת המיקרו המהירה מתאימה לדילול השכבה החיצונית של עצם קומפקטית ומיקוד לשטח קטן</td></tr><tr><td>קוצי</td> <td>פלדה מיקרו מקדחהFine Science Tools</td><td>19007-14</td> להב מיקרוכירורגי <td>בקוטר 1.4 מ"מ</td></tr><tr><td></td><td>Surgistar</td><td>6961</td><td>הלהב המיקרוכירורגי מתאים לדילול השכבה הפנימית של עצם קומפקטית ושכבה אמצעית של עצם ספוגית</td></tr><tr><td>דבק ציאנואקרילט Fisher</td><td>Scientific</td><td>NC9062131</td><td>תקן את לוחית הראש על הגולגולת</td></tr><tr><td>תפר</td><td>Havard מכשיר</td><td>510461</td><td>תפר משי סטרילי שאינו סופג, 6-0 מונופילמנט</td></tr><tr><td>חיתוך מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td></td><td>SZ61</td></tr><tr><td>מצלמת CCD</td><td>אינסוף</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דו-פוטוני</td><td>טכנולוגיות ערבה Ultima</td><td></td><td>IV</td></tr><tr><td>10X אובייקטיבי</td><td>אולימפוס</td><td></td><td>NA 0.30, אוויר</td></tr><tr><td>60X אובייקטיבי</td><td>אולימפוס</td><td></td><td>NA 1.1, IR חדיר, טבילה במים</td></tr><tr><td>לייזר Ti-sapphire</td><td>ספקטרה-פיזיקה</td><td></td><td>מאי טאי HP</td></tr></tbody></table>

שני פוטונים<em&gt; in vivo</em&gt; הדמיה של קוצים הדנדריטים בcortex העכבר באמצעות דלילה, גולגולת הכנה

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

בקליפת המוח של היונקים, תאי עצב יוצרים רשתות מאוד מסובכות ולהחליף מידע בסינפסות. שינויים בחוזק סינפטי, כמו גם תוספת / הסרה של סינפסות, מתרחשים באופן חוויה תלויה, המספקים את היסוד המבני של פלסטיות עצבית. כרכיבי postsynaptic של סינפסות המעוררות ביותר בקליפת המוח, קוצים הדנדריטים נחשבים פרוקסי טוב של סינפסות. יתרונות לוקחים גנטיקה עכבר וטכניקות תיוג פלורסנט, נוירונים בודדים והמבנים הסינפטי שלהם יכולים להיות מתויגים במוח שלם. כאן אנו מציגים פרוטוקול הדמיה transcranial באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר שני פוטונים לעקוב קוצים שכותרתו fluorescently postsynaptic הדנדריטים לאורך זמן in vivo. פרוטוקול זה משתמש בהכנה דלילה, גולגולת, אשר משומרת על הגולגולת שלמה ותמנע תופעות דלקתיות הנגרמות על ידי חשיפה של קרומי המוח וקליפת המוח. לכן, ניתן לרכוש תמונות מייד לאחר surgery מתבצע. הליך הניסוי ניתן לבצע שוב ושוב על פני מרווחי זמן שונים, החל משעות לשנים. היישום של הכנה זו גם ניתן להרחיב כדי לחקור אזורים שונים בקליפת המוח ושכבות, כמו גם סוגי תאים אחרים, בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים.

בעכברי שורת YFP-H 25, חלבון פלואורסצנטי צהוב מבטא בקבוצת משנה של נוירונים פירמידליים בשכבת V, אשר פרויקט דנדריטים קודקודם לשכבות השטחיות בקליפת המוח. דרך ההכנה דלילה, הגולגולת, מגזרים הדנדריטים שכותרתו fluorescently יכולים להיות צילמו שוב ושוב מתחת למיקרוסקופ שני פוטונים על מרווחי הדמיה שונים, הנעים בין שעות לחודשים. כאן אנו מראים דוגמא להדמיה של אותו דנדריטים מעל 8 ימים בקליפת המוח המוטורי של עכבר ישן 1 בחודש, שבו עמוד השדרה פרט, כמו גם filopodia ניתן דמיינו לאורך דנדר...

הדמיית זמן-lapse בבעל חיים חי מספקת מידע רב ערך על ארגון מחדש מבני במוח השלם. כאן, אנו מציגים תכשיר גולגולת דק המאפשר הדמיה טרנס-גולגולתית של מבנים סינפטיים בעלי תווית פלואורסצנטית בקליפת העכבר החי על ידי מיקרוסקופ דו-פוטוני.

שני פוטונים<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של קוצים הדנדריטים בCortex העכבר באמצעות דלילה, גולגולת הכנה

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לאפשר דימות טרנסקרניאלי של מבנים סינפטיים המסומנים בפלואורסצנציה בקורטקס של עכבר חי באמצעות מיקרוסקופיה של שני פוטונים. השלב הראשון לאחר הרדמת העכבר הוא ביצוע הכנה של גומולת גולגולת מודקת. לאחר מכן, ראשו של העכבר מקובע באמצעות פלטת החזקה המיוצרת בהתאמה.לאחר מכן, נרכשים מחסניות תמונות דרך הגולגולת המדּוקקת באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית. לבסוף, איתור מחדש ודימוג של האזור שסרוק קודם לכן אפשרו למעקב אחר הדינמיקה של קוצים דנדריטיים לאורך פרקי זמן שונים ותחת תנאים מגוונים.כדי להיערך לניתוח, הרדימו עכבר באמצעות ketamine ו-xylazine ובצעו צביטה בבהונות כדי לוודא הרדמה מלאה. לאחר מכן, הניחו את העכבר על משטח חימום והשתמשו בלהב תער כדי לגלח את הראש. נגבו את העור באמצעות רפידות אלכוהול לסירוגין כדי לעקר את האזור הגלח ולהסיר שאריות שיער.בנוסף, מרחו בעדינות פומדת עיניים לשתי העיניים. לאחר מכן, בצעו חתך ישר לאורך קו האמצע של הקרקפת והזיזו את העור לצדדים לעבר קצות הגולגולת. לאחר מכן, הסירו את הרקמה החיברית ההדבקה לגולגולת כדי להתחיל בהכנת גולגולת דקה.ראשית, זהו את אזור ההדמיה הרצוי בהתבסס על מיקומו היחסי לקו האמצע ול-bgma. לאחר מכן, הרטיבו את הגולגולת במי מלח כדי להבחין ברשת כלי הדם, ובכך למנוע את דילול הגולגולת באזור שבו קיימים כלי דם גדולים, מאחר שהם חוסמים את חדי

two-photon-vivo-imaging-dendritic-spines-mouse-cortex-using-thinned

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בחומר וידאו משלים זה, אנו מראים פרוטוקול עבור...

הדמיה כרונית של עכבר-Visual Cortex שימוש ההכנה סחוט הגולגולת

אנו מציגים שיטה ליצירת חלון הדמיה בגולגולת העכבר החובקת מילימטרים והוא יציב במשך חודשים ללא דלקת של המוח. שיטה זו גם מתאים מחקרים ארוכי טווח של זרימת דם, דינמיקה סלולריים, ותא / מבנה כלי הדם באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ.

מלוטשת מחוזק דליל, הגולגולת חלון הדמיה לטווח ארוך של מוח עכבר

על ידי שילוב של-גולגולת דקה מלוטשת ומחוזקת (יציאות) גולגולתי חלון והזרקת גליובלסטומה (GBM) תא, אנו יכולים לצפות בייזום וצמיחה מתאים מוזרקים GBM במוח של עכבר חי longitudinally גליומה.

הדמית Glioma ייזום<em&gt; In Vivo</em&gt; דרך חלון גולגולתי מלוטש ומחוזק-גולגולת דקה

מקור: } Pekarek, B. T., et. al., הדמיה וכימות של דנדריטים עצביים שלמים באמצעות ניקוי רקמות CLARITY. J. Vis. Exp. (2021)} בסרטון זה, אנו מדגימים את ההכנה, ההדמיה והניתוח של מוח עכבר מנוקה כדי לבחון סוכות דנדריטיות, מורפולוגיה של עמוד השדרה והתפלגות עצבית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וטכניקות שחזור תלת מימד.

הדמיית מיקרוסקופיה קונפוקלית של סוכות דנדריטיות שלמות ומורפולוגיה של עמוד השדרה במוח עכבר נקי

מאמר זה מתאר פרוטוקול עבודה לקוצים הדנדריטים תמונה מתא העצב בהיפוקמפוס במבחנה באמצעות מובנה תאורה מיקרוסקופית (SIM). מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר באמצעות ה-SIM מספקת רזולוציית תמונה באופן משמעותי מעבר לגבול השתברות האור בכל שלושת הממדים מרחביים, המאפשרת ההדמיה של קוצים הדנדריטים בודדים עם פירוט משופר.

הדמיה קוצים הדנדריטים של העכברוש הראשי נוירונים בהיפוקמפוס באמצעות מובנה תאורה מיקרוסקופית

סרטון זה מציג את הליך הגולגולת המאפשר הדמיה כרונית של נוירונים בקליפת המוח הרטרו-טחולית של העכבר באמצעות מיקרוסקופ פוטונים שני פוטונים in vivo בקו טרנסגני Thy1-GFP. גישה זו משולבת עם הזרקת נגיף הקשור לאדנו המבטא mCherry לתוך ההיפוקמפוס הגבי. טכניקות אלו מאפשרות ניטור ארוך טווח של פלסטיות מבנית תלוית ניסיון ב-RSC.

שני פוטונים סימולטני<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של תשומות Synaptic ויעדי Postsynaptic בקליפת עכבר Retrosplenial

שיטה זו מתארת הכנה כרונית המאפשרת גישה אופטית להיפוקמפוס של עכברים חיים. הכנה זו יכולה לשמש לביצוע הדמיה אופטית לאורך של הפלסטיות הקונסטרוקטיבית העצבית ופעילות-מעורר פלסטיות הסלולר במשך תקופה של מספר שבועות.

אורך שני-פוטון הדמיה של CA1 היפוקמאל בעכברים חיים

מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקת פרצוף בלוק סדרתית (SBEM) מוחלת על תמונה ולנתח קוצים דנדריטיים בהיפוקמפוס המורין.

מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה טורית של פרצוף בלוק (SBEM) לחקר קוצים דנדריטים

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול המשלב הזרקת וירוסים הקשורים באדנו עם השתלת חלון גולגולתי לצורך הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים.

הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים

פרוטוקול זה מכיל תיאור מקיף של גישה שלב אחר שלב למודל עכבר חלון גולגולתי כרוני ותסחיף מיקרווסקולרי מותאם להדמיה מיקרוסקופית דו-פוטונית בתוך ה-vivo באמצעות מיקרוספירות פוליסטירן פלואורסצנטיות.

מודל עכבר של תסחיף מיקרווסקולרי למיקרוסקופיה דו-פוטונית בחיים באמצעות מיקרוספירות פוליסטירן פלואורסצנטיות

למד הדמיה תלת־ממדית של קוצים דנדריטיים בעכבר חי באמצעות מיקרוסקופיית שני פוטונים ושיטת הגולגולת הדלילה. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר שינויים מבניים בסינפסות לאורך זמן.

שני פוטונים

גלה סרטונים נוספים