Name: הבנת organogenesis המוקדם שימוש פשוטה באתר הכלאת פרוטוקול ב Xenopus (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 50 s
Description: למדו הכלאה in situ שלמורה ב-Xenopus laevis לזיהוי ביטוי גנים בעוברים שלמים. פרוטוקול זה מאפשר הדמיית RNA מקומי בביולוגיה התפתחותית בצורה מהירה ויעילה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות ל-CIHR על תמיכתם במלגות של סטיב דיימלינג ולמחלקה לרפואת ילדים, אוניברסיטת מערב אונטריו על תמיכתם בסטיב דיימלינג, רמי חלבי וסטפני גרובר. עבודה זו נתמכה על ידי R2654A11 המענקים של NSERC ותוסף NSERC Discovery Accelerator

<ol><li>Ninomiya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherin-dependent+differential+cell+adhesion+in+Xenopus+causes+cell+sorting+in+vitro+but+not+in+the+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cadherin-dependent differential cell adhesion in Xenopus causes cell sorting in vitro but not in the embryo.</a> J Cell Sci. 125, 1877-1883 (2012).</li>
<li>Movassagh, M., Philpott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+differentiation+in+Xenopus+requires+the+cyclin-dependent+kinase+inhibitor%2C+p27Xic1%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac differentiation in Xenopus requires the cyclin-dependent kinase inhibitor, p27Xic1.</a> Cardiovasc Res. 79, 436-447 (2008).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+alphaA-+and+betaB1-crystallin+during+normal+development+and+regeneration%2C+and+proteomic+analysis+for+the+regenerating+lens+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">The expression of alphaA- and betaB1-crystallin during normal development and regeneration, and proteomic analysis for the regenerating lens in Xenopus laevis.</a> Mol Vis. 17, 768-778 (2011).</li>
<li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li>
<li>Kirilenko, P., Weierud, F. K., Zorn, A. M., Woodland, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+Xenopus+primordial+germ+cell+migration+depends+on+the+germplasm+mRNA+encoding+the+PDZ+domain+protein+Grip2%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The efficiency of Xenopus primordial germ cell migration depends on the germplasm mRNA encoding the PDZ domain protein Grip2.</a> Differentiation. 76, 392-403 (2008).</li>
<li>Deimling, S. J., Drysdale, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf+is+required+to+regulate+anterior-posterior+patterning+in+the+Xenopus+lateral+plate+mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Fgf is required to regulate anterior-posterior patterning in the Xenopus lateral plate mesoderm.</a> Mech Dev. , (2011).</li>
<li>Fletcher, R. B., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+FGF+signaling+in+the+establishment+and+maintenance+of+mesodermal+gene+expression+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The role of FGF signaling in the establishment and maintenance of mesodermal gene expression in Xenopus.</a> Dev Dyn. 237, 1243-1254 (2008).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+development+of+Xenopus+laevis+%3A+a+laboratory+manual%22">Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Park, E. C., Hayata, T., Cho, K. W., Han, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+cDNA+microarray+identification+of+genes+with+endodermal+organ+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Xenopus cDNA microarray identification of genes with endodermal organ expression.</a> Dev Dyn. 236, 1633-1649 (2007).</li>
<li>Horb, M. E., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoderm+specification+and+differentiation+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoderm specification and differentiation in Xenopus embryos.</a> Dev Biol. 236, 330-343 (2001).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29+%3A+a+systematical+and+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis</a>. , Garland Pub. (1994).</li>
<li>Gebhardt, D. O., Nieuwkoop, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Influence+of+Lithium+on+the+Competence+of+the+Ectoderm+in+Ambystoma+Mexicanum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">The Influence of Lithium on the Competence of the Ectoderm in Ambystoma Mexicanum.</a> J Embryol Exp Morphol. 12, 317-331 (1964).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+artificially+activated+ectoderm+%28Rana+pipiens+and+Ambystoma+punctatum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in artificially activated ectoderm (Rana pipiens and Ambystoma punctatum).</a> Dev Biol. 6, 255-279 (1963).</li>
<li>Sato, S. M., Sargent, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+approach+to+dorsoanterior+development+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular approach to dorsoanterior development in Xenopus laevis.</a> Dev Biol. 137, 135-141 (1990).</li>
<li>Smith, S. J., Kotecha, S., Towers, N., Latinkic, B. V., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XPOX2-peroxidase+expression+and+the+XLURP-1+promoter+reveal+the+site+of+embryonic+myeloid+cell+development+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">XPOX2-peroxidase expression and the XLURP-1 promoter reveal the site of embryonic myeloid cell development in Xenopus.</a> Mech Dev. 117, 173-186 (2002).</li>
<li>Drysdale, T. A., Tonissen, K. F., Patterson, K. D., Crawford, M. J., Krieg, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+troponin+I+is+a+heart-specific+marker+in+the+Xenopus+embryo%3A+expression+during+abnormal+heart+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cardiac troponin I is a heart-specific marker in the Xenopus embryo: expression during abnormal heart morphogenesis.</a> Dev Biol. 165, 432-441 (1994).</li>
<li>Carroll, T., Wallingford, J., Seufert, D., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+pronephric+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of pronephric development.</a> Curr Top Dev Biol. 44, 67-100 (1999).</li>
<li>Tonissen, K. F., Drysdale, T. A., Lints, T. J., Harvey, R. P., Krieg, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XNkx-2.5%2C+a+Xenopus+gene+related+to+Nkx-2.5+and+tinman%3A+evidence+for+a+conserved+role+in+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">XNkx-2.5, a Xenopus gene related to Nkx-2.5 and tinman: evidence for a conserved role in cardiac development.</a> Dev Biol. 162, 325-328 (1994).</li>
<li>Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+wound+healing+by+apical+contraction+and+ingression+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 53, 163-176 (2002).</li>
<li>Hurtado, R., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sensitivity+and+stability+in+two-color+in+situ+hybridization+by+means+of+a+novel+chromagenic+substrate+combination%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Enhanced sensitivity and stability in two-color in situ hybridization by means of a novel chromagenic substrate combination.</a> Dev Dyn. 235, 2811-2816 (2006).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים לחשוף.

היכולת להשתמש בכלאה באתר כדי להמחיש את דפוס הביטוי של גנים מסוימים נשארת השיטה הנפוצה ביותר המשמשת לזיהוי איברים ספציפיים או סוגי תאים בעובר Xenopus. סיבה לכך הוא מספר יתרונות המוצעים על ידי טכניקה זו. הביטוי של גן יכול לזהות מבנים ספציפיים היטב לפני כל סימן היסטולוגית של בידול כגון במקרה של ביטוי nkx2.5 באבות הלב לפני כל תיחום ברור של תאים אלה 18. לאחר שכל חומרים כימיים נמצאים ביד, זה גם מאוד חסכוני. דור של רבים בדיקות בודדות, שניתן לעשות שימ...

דפוס הביטוי של גן ספציפי הוא פיסת מידע חשובה בקביעת התפקיד הפוטנציאלי של אותו גן בהתפתחות של איבר או סוג תא מסוים. במילים פשוטות, אם היא לא באה לידי ביטוי בזמן ובמקום הנכונים, סביר להניח שהיא לא תשחק תפקיד מפתח. בקסנופוס, כמו ברוב העוברים המוקדמים, הבדיקה הנפוצה ביותר לזיהוי ביטוי של גן היא הכלאה שלמה באתרה באמצעות בדיקות RNA אנטי-סנס. השימוש בצביעת נוגדנים כדי להעריך את ביטוי הגן בקסנופוס הופך נפוץ יותר כאשר חוקרים מגלים נוגדנים, הגדלים בדרך כלל כנגד חלבוני יונקים, המגיבים להומולוג Xenopus או מייצרים 1-3 משלהם. עם זאת, הרוב המכריע של המחקרים על קסנופוס אורגנוגנזה עדיין משתמשים בבדיקות RNA אנטיסנס. כאשר משתמשים בנוגדנים, כל נוגדן בודד דורש לעתים קרובות אופטימיזציה לפרוטוקולי ריכוז הנוגדנים העיקריים או קיבועם. לעומת זאת, הפרוטוקול עבור הכלאות באתרן הוא למעשה קבוע עבור בדיקות שונות. הרעיון הבסיסי הוא פשוט יחסית ופרוטוקול סטנדרטי מצוין הוקם היטב 4. הפרוטוקול שלנו הוא גרסה יעילה של פרוטוקול 4 המקורי שעדיין מספק זיהוי מצוין של דפוסי ביטוי גנים בעובר המוקדם. העוברים מקובעים ולאחר מכן מוכנים להכלאה על ידי שינוי תמיסות וטמפרטורות כך שיאפשרו קשירה קפדנית גבוהה של בדיקת ה-RNA האנטי-סנס המסומנת ל-mRNA היעד שלה. הגשושית הלא קשורה נשטפת ולאחר מכן מכינים את העוברים לקשירת נוגדן כנגד התווית על בדיקות ה-RNA. לאחר מכן נשטף עודף נוגדנים ונעשה שימוש בתגובת צבע אנזימטית כדי לאתר היכן בדיקת ה-RNA קשורה בעובר. ישנם כיום מספר קווים טרנסגניים של Xenopus המניעים ביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים ברקמות ספציפיות ואלה זמינים במרכזי המלאי של Xenopus כגון משאב Xenopus הלאומי בוודס הול. בעוד שאפשרות זו שימושית מאוד עבור ניסויים רבים הדורשים בחינת אורגנוגנזה בעוברים חיים, אפשרות זו דורשת דיור נפרד לקווים הטרנסגניים. 
הכלאה באתרה יכולה לתאר בבירור היכן ייווצרו איברים או סוגי תאים מסוימים בעובר המוקדם (איור 1). הטכניקה רגישה להפליא בהתחשב בכך שניתן לזהות ביטוי גנים במספר קטן של תאים בעובר בודד 5. עם זאת, הכלאה באתרה באמצעות עוצמת הצביעה הקולורימטרית אינה נחשבת ניתנת לכימות מכיוון שתגובת הצבע אינה ליניארית. למרות הקושי לכמת את עוצמת הצביעה, שינויים בהבעה מורגשים לרוב למדי; במיוחד כאשר ההכלאה באתרה מראה עליות או ירידות ניתנות לכימות בגודל תחומי הביטוי 6,7. 
היתרונות הברורים של הכלאה שלמה באתרה הופכים אותה לבדיקה קריטית בחקר ההתפתחות המוקדמת. עם זאת, זה גוזל זמן ודורש שלבים רבים על פני מספר ימים. פרוטוקול זה הוא גרסה פשוטה של הפרוטוקול הסטנדרטי המבטל מספר שלבים מבלי לפגוע באיכות התוצאה באתר. הפישוט גם מבטל מקורות של שונות, מה שמקל על פתרון בעיות אם הכלאה במקום אינה אופטימלית. באופן ספציפי, ביטלנו את השימוש בטיפולי פרוטאינאז K ו-RNAse בעובר, שני שלבים שיכולים להיות תלויים באיכות המגיב ויכולים גם להפחית את עוצמת האות אם הם מוגזמים. הפרוטוקול מספק גם מידה מסוימת של חיסכון בעלויות עקב ביטול השימוש במספר ריאגנטים. לבסוף, פרוטוקול זה מספק גם כמה הנחיות פשוטות ללכידת תמונות משופרות של תוצאות הכלאה באתר. למרות שפרוטוקול זה מותאם לעבודה בעוברי קסנופוס, סביר להניח שלפחות חלק מהפשטות יהיו ישימות לעבודת הכלאה באתרה במערכות עובר אחרות.

<table><tbody><tr><td>שייקרים צינורות Labguake</td><td>VWR</td><td>17-08-2011</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני VWR</td><td></td><td>VWR 10-07-2012</td><td></td></tr><tr><td>L-ציסטאין</td><td>BioShop</td><td>CYS342.500</td><td></td></tr><tr><td>ריבונוקלאוזיד טריפוספט סט, 100 מ"מ</td><td>Roche</td><td>11277057001</td><td></td></tr><tr><td>Digoxigenin-11-UTP</td><td>Roche</td><td>11209256910</td><td></td></tr><tr><td>מעכב Rnase (Rnase OUT)</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA פולימראז</td><td>פרמנטס</td><td>EPO111</td><td></td></tr><tr><td>T3 רנ"א פולימראז</td><td>פרמנטס</td><td>EPO101</td><td></td></tr><tr><td>SP6 רנ"א פולימראז</td><td>פרמנטס</td><td>EPO131</td><td></td></tr><tr><td>דנאז 1</td><td>אינוויטרוגן&nbsp;</td><td>18047-019</td><td></td></tr><tr><td>סרום כבשים</td><td>&nbsp; Wisent</td><td>31150</td><td></td></tr><tr><td>מגיב חוסם</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>BM סגול Ap Substrate</td><td>Roche</td><td>11442094001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-AP שברי פברואר</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>VWR</td><td>CAMX0485-7</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioShop</td><td>SOD002.10</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>EM&nbsp;</td><td>7910</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioShop</td><td>EDT001.500</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>BioShop</td><td>TRS003.5</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>EM&nbsp;</td><td>9480</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>מגבים</td><td>BioShop</td><td>MOP001.250</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E-3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>BioShop</td><td>PAR070.500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>פורממיד</td><td>&nbsp; VWR&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>CAFX0420-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RNA</td><td>Roche</td><td>10109223001</td><td></td></tr><tr><td>חומצה מאלית</td><td>&nbsp; VWR&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>CAMX0100-3</td><td></td></tr><tr><td>תלת-נתרן ציטראט</td><td>BioShop</td><td>CIT001</td><td></td></tr><tr><td>מי חמצן (תמיסה 30%)</td><td>EM&nbsp;</td><td>HX0635-2</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>BioShop</td><td>ALB001.100</td><td></td></tr><tr><td>PVP-40</td><td>ICN</td><td>195451</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0300-10</td><td></td></tr><tr><td>בנזיל אלכוהול</td><td>סיגמא</td><td>B-1042</td><td></td></tr><tr><td>בנזיל בנזואט</td><td>סיגמא</td><td>B-6630</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>16500-500</td><td></td></tr></tbody></table>

הבנת organogenesis המוקדם שימוש פשוטה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאת פרוטוקול ב<em&gt; xenopus</em

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

אורגנוגנזה היא חקר האופן שבו איברים מוגדרים ולאחר מכן רוכשים את צורתם ותפקודיהם הספציפיים במהלך ההתפתחות. העובר Xenopuslaevis שימושי מאוד לחקר אורגנוגנזה מכיוון שגודלם הגדול הופך אותם למתאימים מאוד לזיהוי איברים בשלבים המוקדמים ביותר באורגנוגנזה. בשלב זה, השיטה העיקרית המשמשת לזיהוי איבר ספציפי או פרימורדיום היא הכלאה שלמה באתרה עם בדיקות RNA אנטי-סנס מסומנות ספציפיות לגן המתבטא באיבר המבוקש. בנוסף, קל יחסית לתפעל גנים או מסלולי איתות ב-Xenopus והכלאה באתרה מאפשרת לבדוק שינויים בנוכחות או במורפולוגיה של איבר מטרה. הכלאה שלמה באתרה היא פרוטוקול רב-יומי עם שלבים רבים המעורבים. כאן אנו מספקים פרוטוקול פשוט עם מספר מופחת של שלבים וריאגנטים בשימוש שעובד היטב עבור בדיקות שגרתיות. רובוטים היברידיים באתרם הקלו מאוד על התהליך ואנו מפרטים כיצד ומתי אנו משתמשים בטכנולוגיה זו בתהליך. לאחר השלמת הכלאה באתר, לכידת התמונה הטובה ביותר של התוצאה יכולה להיות מתסכלת. אנו מספקים עצות כיצד לייעל את ההדמיה של תוצאות הכלאה באתר. למרות שהפרוטוקול מתאר הערכת אורגנוגנזה ב-Xenopus laevis, כמעט בוודאות ניתן להתאים את אותו פרוטוקול בסיסי ל-Xenopus tropicalis ולמערכות מודל אחרות.

השימוש בבדיקות רקמות ספציפיות יכול לספק מידע מצטיין בכל הקשור למצב של פיתוח לאיברים ספציפיים. בדוגמאות הבאות, שלבו של העובר מבוסס על שולחן בימוי Nieuwkoop וFaber 11. אם האדם משתמש בגני טופס בדיקות ביטאו לאחר בידול, טרופונין אני לב בשלב 28-30, למשל (איור 1 ג), נוכחות או גודל של איבר מובחן ניתן להעריך בכל שלב שלאחר התמיינות. לפני שנים, embryologists היו מסוגל לעשות ניתוח כזה המבוסס על ידע מדהים של היסטולוגיה של העובר המוקדם 12,13 אבל ה...

עובר Xenopus laevis ממשיך להיות שימושי במיוחד בחקר ההתפתחות המוקדמת בשל גודלו הגדול וקלות המניפולציה שלו. מסופק פרוטוקול פשוט לפרוטוקול הכלאה של הרכבה שלמה באתרו שניתן להשתמש בו בזיהוי איברים ספציפיים במערכת מודל זו.

הבנת organogenesis המוקדם שימוש פשוטה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאת פרוטוקול ב<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להראות היכן גן מסוים בא ליבטוי בתוך עובר שלם. מטרה זו מושגת על ידי קיבוע ה-RNA המיועד למיקום במיקומו בתוך העובר כשלב שני. גשש RNA אנטי-סנס ספציפי לגן הנחקר עובר היברידיזציה עם ה-RNA המטרה בתוך העובר.גשושית זו מכילה אפיתופ, בדרך כלל digoxigenin, שניתן לזיהוי לאחר מכן. בשלב הבא, נוגדן המצומד לאלקליין פוספטאז עובר היברידיזציה לאפיתופ שעל גשושית ה-RNA, ולאחר מכן נעשה שימוש בצבע כרומטי. כדי להמחיש את מיקומו של ה-RNA בתוך העובר, מתקבלות תוצאות המראות בדיוק היכן הגן הנחקר בא לידי ביטוי, בהתבסס על התגובה הצבעונית והידע על אנטומיית העובר.היתרון המרכזי של הפרוטוקול של המכון שלנו על פני פרוטוקולים קיימים הוא שהוא מהיר יותר ומשתמש בפחות ריאגנטים ללא פגיעה ניכרת באיכות. שיטה זו יכולה להשיב על שאלות מפתח באמבריולוגיה, כגון האופן שבו רקמות נקבעות ומעוצבות. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי התפתחות opus, ניתן להשתמש בה גם עבור עוברים קטנים רבים אחרים, כגון דגי זברה ועוברי עכבר בשלבים מוקדמים.התחלנו לפתח שיטות אלו מכיוון שהשיטות המקוריות דרשו זמן רב, והתחלנו לבחון את השמטת שלבי ה-Ed כדי להגביר את יעילות הפרוצדורה מבלי להתפשר על האיכות. קיבוע העוברים מבוצע בשלבים. ראשית, הכינו את מבחנות הזכוכית שישמשו לכל השלבים, כולל אחסון סופי של העוברים, כדי לאפשר ניטור של העוברים במהלך כל שלבי התהליך.השתמשו במבחנות שקופות עם אטם טפלון איכותי במכסה, וסמנו אותן בעזרת טוש קבוע עם המידע הניסויי המתאים. כסו את התווית בסרט דבק שקוף כדי למנוע מחיקה או אובדן של הסימון במהלך הפרוצדורה. בשל השימוש באלקוהול ובממסים אחרים, הכינו את תמיסת הקיבוע MFA כפי שמתואר בטקסט של הפרוטוקול.מלאו כל מבחנה מזכוכית מסומנת בשלושה עד ארבעה מיליליטרים של תמיסת ה-MFA. אחסנו תמיסת methanol בריכוז 100% בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. הכינו פיפטת זכוכית חתוכה והשתמשו בה להעברת העוברים למבחנות הזכוכית המכילות תמיסת Memphis לצורך קיבוע.העבירו את העובריים תוך מינימום העברה של נוזל מתוך תמיסת הגידול לעובריים. קבעו לא יותר מ-20 עד 30 עובריים לכל מבחנה. השאירו את העובריים בתמיסת Memphis למשך שעתיים בטמפרטורת החדר על שייקר.עם סיום הקיבוע בפרפורמלדהיד, החליפו את תמיסת ה-Memphis בכ-4 mL של 100% methanol בטמפרטורה של -20 °C לצורך אחסון העוברים. לפני הרכבת תגובת סינתזת הגשוש (probe), אפשרו לתערובת ה-DNA water NTP ולבופר הפולימראז להתחמם לטמפרטורת החדר. אחד השלבים הקריטיים ביותר להצלחת הליך זה הוא הרכבת תגובת הגשוש באופן נכון.הרכיבו את תגובת סינתזת הגשוש (probe) בטמפרטורת החדר. הוסיפו את הרכיבים הבאים לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר בסדר הבא: DNA תבנית, מים בכמות שתביא את הנפח הכולל של התגובה ל-20 מיקרוליטר, תערובת NTP, מעכב RNA, באפר ל-RNA polymerase ו-RNA polymerase. דגרו את תגובת השעתוק למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס.דגירה למשך זמן מעט יותר משעתיים אינה גורמת להשפעות שליליות, אך גם אינה מראה עלייה משמעותית בתפוקה; אם הדגירה תימשך שעה אחת בלבד, התפוקה תפחת, אם כי היא עדיין תהיה מספיקה להכנת גשש (probe) איכותי. עם השלמת תגובת השעתוק, יש להוציא מיקרוליטר אחד מתערובת התגובה לבדיקה על ג'ל TAE בריכוז 1% ולהוסיף את שאר תערובת התגובה.הוסיפו 80 µL של 1%SDS בבופר TE, 10 µL של ammonium acetate בריכוז 5M ו-220 µL של ethanol קר. ערבבו את התערובת במכשיר vortex בעוצמה והניחו אותה על קרח עד לקבלת תוצאות בדיקת איכות ה-RNA. לאחר הוספת מים וצבע טעינה סטנדרטי ל-1 µL של RNA שהופרדו לפני השקיעה, הריצו את ה-RNA על ג'ל agarose בריכוז 1% המכיל EtBr בבופר TAE.הצג את ה-RNA המסומן ב-ethidium bromide על הג'ל באמצעות טרנס-ילומינטור UV כדי לבדוק את איכות הגשש. יש לראות פס בודד ללא מריחה מעליו או מתחתיו. לאחר אימות איכות ה-RNA, שקיע את שארית ה-RNA שהושארה על קרח על ידי סבב במיקרו-צנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך 10 עד 15 דקות.הסיר את הנוזל העליון באמצעות פיפטת זכוכית דקה ואפשר ל-RNA להתייבש לזמן קצר. לאחר מכן, השעה מחדש את הגשש במאחר היברידיזציה של RNA ואחסן אותו במבחנה פוליסטירן עם מכסה הברגה בנפח 15 מיליליטר בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. כדי להתחיל בהליך זה, הוצא את העוברים שאוחסנו במתנול בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס ואפשר להם להתחמם לטמפרטורת החדר.ההליך כולו מבוצע בתוך מבחנות זכוכית. אם עובדים על עוברים שונים מקבוצה אחת באמצעות גששים שונים, יש לשמור אותם במבחנה אחת עד רגע לפני הוספת הגששים. כדי להפחית שונות ומאמץ ביום הראשון, כהכנה להוספת הגשש, יש לבצע רהידרציה לעוברים באמצעות סדרת מתנול כפי שמתואר בטבלה זו; השתמשו בפיפטות זכוכית כדי להסיר ולהוסיף כל תמיסה בזהירות, שכן העוברים עלולים להיפגע בקלות בשלב זה.בעת העברת הנוזלים, בדקו את פנים הפקקים כדי לוודא שעובריים לא נלכדו שם. סובבו בעדינות את העובריים לאחר כל החלפה כדי להבטיח שהם אינם נדבקים לדפנות או זה לזה. נענעו את העובריים על ידי הצבת המבחנות על mutator לפני השימוש; יש לחמם מראש את באפר ההיברידיזציה של ה-RNA ואת הגשש (probe) ל-65 °C.בצעו היברידיזציה של העובריים בתמיסת הגשוש (probe) למשך הלילה, עם נענוע בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס ביום למחרת. הסירו את תמיסת הגשוש ושמרו אותה בפרוטובול פוליסטירן עם מכסה הברגה בנפח 15 מיליליטר, המסומן בתאריך ובמספר הפעמים שבהם הגשוש שימש. אחסנו את תמיסת הגשוש בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס.לאחר הסרת הגשש, הכין את העוברים לצביעה בנוגדנים נגד הגשש באמצעות סדרת שטיפות כפי שמתואר כאן; שנה את הטמפרטורה לפי הצורך על ידי העברת המוטטור עם מבחנות העוברים המחוברות אליו ישירות לתנורי היברידיזציה המכוונים לטמפרטורה המתאימה. בזמן שהעוברים מדגרים בתמיסת החסימה, הכן את הנפח המתאים של תמיסת החסימה בתוספת נוגדן anti-D dig, כך שהנוגדן ייחסם לפני הוספתו לעוברים. דגרי את העוברים בתמיסת הנוגדנים למשך הלילה עם נדנוד בטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius, ושלב זה יסתיים ביום למחרת.הסר את תמיסת הנוגדנים ושטוף באמצעות mab, תמיסה המכילה חומצה מאליאית ונתרן כלורי. בצע לפחות 1230 דקות של שטיפות בטמפרטורת החדר תוך כדי נדנוד (rocking). החלף את תמיסת השטיפה האחרונה בתסבסב של פוספטאז אלקליני.בצעו את תגובת הצביעה בטמפרטורת החדר תוך כדי נדנוד למשך הלילה, וסיים ביום למחרת. הפסיקו את תגובת הצביעה והכינו את העובריים לאחסון ולדימיון על ידי החלפת הנוזלים כפי שמתואר בטבלה זו. לאחר רהידרציה של העובריים, קבעו את הצבע באמצעות MFA למשך 30 דקות.לאחר הקיבוע, יש להסיר את ה-MFA ולשטוף את העוברים ב-25% methanol. אם נדרשת הסרה של פיגמנטים אנדוגניים, יש להסיר את ה-25% methanol ולהוסיף את תמיסת ההלבנה. יש לעקוב מקרוב אחר תהליך ההלבנה כיוון שהוא קורה במהירות יחסית, וניתן לשנות את מידת ההלבנה כדי להשיג אפקטים שונים.לאחסון לטווח ארוך, יש לבצע דהידרטציה לעובריים באמצעות סדרת מתנול עד ל-100% methanol; לאחר הלבנה לצורך אחסון לטווח קצר והדמיה עוקבת, העבירו את העובריים ל-PBS. עובריים שאינם שקופים נצפים ומודגמים בצורה הטובה ביותר על רקע של 1% aros. כדי להכין את תמיסת ה-aros, הוסיפו aros למים והביאו לרתיחה עד שה-aros ימוס בתמיסה. לאחר שה-aros התקרר ל-50 degrees Celsius, שפכו אותו לתוך צלחת פטרי לעומק של כשני מילימטרים.כאשר צלחת ה-aros מוכנה, הניחו בה את העוברים שלא עברו בירוח והמשיכו בדימות. ה-aros מספק רקע בצבע אפור-כחול המהווה ניגודיות טובה לעובר ולצבע הכחול של תגובת הצביעה. הוא גם מסייע בפיזור צללים והשתקפויות מסיחים המסיטים את התשומת לב מהעובר, כדי לאפשר דימות של העובר מזוויות חלופיות, כגון מהצד הוונטרלי.השתמשו בפינצטה עדינה כדי לבצע חיתוכים בטבעות להבאת העוברים למקומם. מקמו את העוברים בתעלות אלו לצורך התמצאות. היו זהירים במניפולציות בעוברים, שכן הם רגישים לפגיעה.השתמשו במקור אור סיב אופטי כדי להאיר את העובר מזווית רדודה, דבר שיצור צללים על העובר המעניקים עומק לתמונה ומסייעים בזיהוי מבני פני השטח, מכיוון שהבהרה עלולה להסיר פיגמנט המשמש כנקודת ציון מועילה. השתמשו בצללים עבור עוברים שעברו הבהרה חזקה. עוברים שעברו הבהרה שקופה (Cleared embryos) משמשים להדמיית צביעות הנמצאות עמוק בתוך העובר, כגון בשקום, בריאות או באזורים במוח.בפרוטוקול זה, נעשה שימוש ברמות שונות של הבהרה כדי להנמיך את הצבע ולראות את הצביעה בעובר. אם הצביעה חזקה, הבהרה קלה יותר המותירה חלק מהפיגמנטאציה תאפשר קביעה טובה יותר של שלב ההתפתחות והתמצאות בעובר. עם זאת, אם הצביעה נמצאת באזור בעל רמות גבוהות של פיגמנטאציה, כגון הכליה, הבהרה משמעותית יותר תיתן תוצאה טובה יותר.מניפולציה של בסיס ה-ARO יכולה לסייע בהכוונת העובר. לדוגמה, על ידי חיתוך תעלה דקה ב-aros, ניתן להביא עובר בשלב השבתי (tadpole stage) השוכב על צדו למצב שבו הוא נצפה מהצד הוונטרלי (הבטני) ביציבות מספיקה כדי ללכוד תמונה טובה. עובר זה הונח בחור קטן שייצב את מיקומו כאשר הצד הוונטרלי פונה כלפי מעלה, מה שאפשר צפייה מלאה בדפוס הביטוי של הגן המדובר.ניתן להבחין באיברים פנימיים הן בעובריים שלא עברו הבהרה והן בעובריים שהשקיפו, כאשר עובריים עמומים שלא עברו הבהרה נצבעו עבור PAX two. בשלב 34, ניתן להמחיש את השת העצרית (optic stalk) וכן את צינור העצבים. עם זאת, הפרטים אינם חדים. על ידי הבהרה של העובר, גבולות אתרי הביטוי, כולל השת העצרית, הופכים לחדים יותר.מידת השקיפות באה לידי ביטוי ביכולת לראות את שתי העיניים בעובר זה. עם זאת, בעיה נפוצה בעוברי שקיפות היא הצטברות של צבע בחללים הפנימיים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבצע whole mount in situ במהירות, עם פחות ריאגנטים, ולהשיג תמונות באיכות גבוהה.

understanding-early-organogenesis-using-simplified-situ-hybridization

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

Xenopus עובריים epithelia הם מערכת מודל אידיאלי ללמוד התנהגויות התא כגון פיתוח הקוטביות ולשנות צורה במהלך המורפוגנזה אפיתל. היסטולוגיה מסורתית של דגימות קבוע ויותר כהשלמה הדמיה לחיות תאים confocal. כאן אנו מדגימים שיטות לבודד ברקמות הצפרדע לדמיין לתאי האפיתל לחיות לחיות cytoskeleton שלהם באמצעות תאים מיקרוסקופיה confocal.

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis</em

האאקטודרם Xenopus עובריים הפך מודל אטרקטיבי עבור מחקרים של הקוטביות בתא. Assay מתואר, שבה חלוקת subcellular של חלבוני ניאון נבחנת בתאים האאקטודרם. פרוטוקול זה יעזור כתובת לשאלות הקשורות שליטה מרחבית של איתות.

טרנסלוקציה מקוטב של חלבוני ניאון ב Xenopus האאקטודרם בתגובה איתות Wnt

דג הזברה, דגים טרופיים קטנים, הפכה לדגם פופולרי ללימוד תפקוד גן במהלך התפתחות מחלה וחוליות. הביטוי של הזמן ומרחב של גני המטרה יכול להיקבע על...

הר שלם ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה בתוך עוברי דג הזברה לחקר ביטוי גנים ותפקוד

טכניקה להשתלה "אקסטרים Anterior דומיין" רקמות פנים בין Xenopus laevis עובר כבר מפותחת. רקמה ניתן להעביר מהרקע ביטוי גנים אחת לאחרת, ומאפשרת הלימוד של דרישות מקומיות לפיתוח craniofacial ולאיתות אינטראקציות בין אזורי פנים.

השתלת פנים ב<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; עוברים

פרוש הזברה (Taeniopygiaguttata) הוא אורגניזם מודל בעל ערך; עם זאת, שלבים מוקדמים של התפתחות פרוש הזברה לא נחקרו בהרחבה. הפרוטוקול מתאר כיצד לנתח עוברים מוקדמים ליישומים התפתחותיים ומולקולריים.

נתיחה וניתוח במורד הזרם של הזברה פינק עוברים בשלבים מוקדמים של פיתוח

בעוברי קסנופוס, תאים מגג הבלסטוקואל הם פלוריפוטנטיים וניתן לתכנת אותם ליצירת רקמות שונות. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לשימוש בצמחי גג בלסטוקואל דו-חיים כמערכת בדיקה לחקירת תכונות מפתח in vivo  ו-in vitro של התפתחות עצבית מוקדמת.

כמו תא גזע<em&gt; Xenopus</em&gt; Explants העובריים לחקר תכונות המוקדמות עצבי התפתחותית<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

מאמר זה מציג שיטה נוחה ומהירה המאפשר הדמיה אוכלוסיות תאים עצביים שונים במערכת העצבים המרכזית של עוברי Xenopus באמצעות מכתים immunofluorescent על ​​הסעיפים.

הערכת Neurogenesis יסודי<em&gt; Xenopus</em&gt; עוברים באמצעות Immunostaining

אנו מציגים פרוטוקול דו-חלקי המשלב הדמיה של סידן פלורסנט עם היברידיזציה באתרו, ומאפשר לניסויים לתאם דפוסים של פעילות הסידן עם פרופילי ביטוי גנים ברמה של תא אחד.

סידן פלואורסצנטי הדמיה ובעקבות היברידיזציה באתרו לאפיון עצבי בלתי מבשר בקספוס זריזה

אנו מתארים פרוטוקול פשוט לפתח אורגנואידים אפיתל mucociliary מתאי ectoderm עמוקים מבודדים מעוברי Xenopus laevis. האבות הרב-פוטנטיים מחדשים את מבשרי תא גביע האפיתל ומאפשרים מעקב חי אחר החניכה וההתקדמות של מעברי התא על פני השטח של אורגנואידים.

אורגנואידים אפיתל Mucociliary מתאי עובר קסנופוס: דור, תרבות והדמיה חיה ברזולוציה גבוהה

אנו מספקים שיטות מפורטות לתיוג מטבולי ולטיהור תמלילים מתחילים לניתוח טרנסקריפטום בעוברים מוקדמים של Xenopus באמצעות 5-אתיניל-אורידין (5-EU).

תיוג מטבולי של הטרנסקריפטום המתהווה בעובריות מוקדמת של Xenopus

אנו מתארים שיטת היצרה פיזית ליצירת עוברים מיניאטוריים מעוברים חד-תאיים של Xenopus laevis .

מניפולציה פיזית ליצירת עוברים מיניאטוריים של Xenopus

למדו הכלאה in situ שלמורה ב-Xenopus laevis לזיהוי ביטוי גנים בעוברים שלמים. פרוטוקול זה מאפשר הדמיית RNA מקומי בביולוגיה התפתחותית בצורה מהירה ויעילה.

הבנת organogenesis המוקדם שימוש פשוטה

גלה סרטונים נוספים