הבנת organogenesis המוקדם שימוש פשוטה
12 בינואר 2015
עובר Xenopus laevis ממשיך להיות שימושי במיוחד בחקר ההתפתחות המוקדמת בשל גודלו הגדול וקלות המניפולציה שלו. מסופק פרוטוקול פשוט לפרוטוקול הכלאה של הרכבה שלמה באתרו שניתן להשתמש בו בזיהוי איברים ספציפיים במערכת מודל זו.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להראות היכן גן מסוים בא ליבטוי בתוך עובר שלם. מטרה זו מושגת על ידי קיבוע ה-RNA המיועד למיקום במיקומו בתוך העובר כשלב שני. גשש RNA אנטי-סנס ספציפי לגן הנחקר עובר היברידיזציה עם ה-RNA המטרה בתוך העובר.
גשושית זו מכילה אפיתופ, בדרך כלל digoxigenin, שניתן לזיהוי לאחר מכן. בשלב הבא, נוגדן המצומד לאלקליין פוספטאז עובר היברידיזציה לאפיתופ שעל גשושית ה-RNA, ולאחר מכן נעשה שימוש בצבע כרומטי. כדי להמחיש את מיקומו של ה-RNA בתוך העובר, מתקבלות תוצאות המראות בדיוק היכן הגן הנחקר בא לידי ביטוי, בהתבסס על התגובה הצבעונית והידע על אנטומיית העובר.
היתרון המרכזי של הפרוטוקול של המכון שלנו על פני פרוטוקולים קיימים הוא שהוא מהיר יותר ומשתמש בפחות ריאגנטים ללא פגיעה ניכרת באיכות. שיטה זו יכולה להשיב על שאלות מפתח באמבריולוגיה, כגון האופן שבו רקמות נקבעות ומעוצבות. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי התפתחות opus, ניתן להשתמש בה גם עבור עוברים קטנים רבים אחרים, כגון דגי זברה ועוברי עכבר בשלבים מוקדמים.
התחלנו לפתח שיטות אלו מכיוון שהשיטות המקוריות דרשו זמן רב, והתחלנו לבחון את השמטת שלבי ה-Ed כדי להגביר את יעילות הפרוצדורה מבלי להתפשר על האיכות. קיבוע העוברים מבוצע בשלבים. ראשית, הכינו את מבחנות הזכוכית שישמשו לכל השלבים, כולל אחסון סופי של העוברים, כדי לאפשר ניטור של העוברים במהלך כל שלבי התהליך.
השתמשו במבחנות שקופות עם אטם טפלון איכותי במכסה, וסמנו אותן בעזרת טוש קבוע עם המידע הניסויי המתאים. כסו את התווית בסרט דבק שקוף כדי למנוע מחיקה או אובדן של הסימון במהלך הפרוצדורה. בשל השימוש באלקוהול ובממסים אחרים, הכינו את תמיסת הקיבוע MFA כפי שמתואר בטקסט של הפרוטוקול.
מלאו כל מבחנה מזכוכית מסומנת בשלושה עד ארבעה מיליליטרים של תמיסת ה-MFA. אחסנו תמיסת methanol בריכוז 100% בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. הכינו פיפטת זכוכית חתוכה והשתמשו בה להעברת העוברים למבחנות הזכוכית המכילות תמיסת Memphis לצורך קיבוע.
העבירו את העובריים תוך מינימום העברה של נוזל מתוך תמיסת הגידול לעובריים. קבעו לא יותר מ-20 עד 30 עובריים לכל מבחנה. השאירו את העובריים בתמיסת Memphis למשך שעתיים בטמפרטורת החדר על שייקר.
עם סיום הקיבוע בפרפורמלדהיד, החליפו את תמיסת ה-Memphis בכ-4 mL של 100% methanol בטמפרטורה של -20 °C לצורך אחסון העוברים. לפני הרכבת תגובת סינתזת הגשוש (probe), אפשרו לתערובת ה-DNA water NTP ולבופר הפולימראז להתחמם לטמפרטורת החדר. אחד השלבים הקריטיים ביותר להצלחת הליך זה הוא הרכבת תגובת הגשוש באופן נכון.
הרכיבו את תגובת סינתזת הגשוש (probe) בטמפרטורת החדר. הוסיפו את הרכיבים הבאים לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר בסדר הבא: DNA תבנית, מים בכמות שתביא את הנפח הכולל של התגובה ל-20 מיקרוליטר, תערובת NTP, מעכב RNA, באפר ל-RNA polymerase ו-RNA polymerase. דגרו את תגובת השעתוק למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס.
דגירה למשך זמן מעט יותר משעתיים אינה גורמת להשפעות שליליות, אך גם אינה מראה עלייה משמעותית בתפוקה; אם הדגירה תימשך שעה אחת בלבד, התפוקה תפחת, אם כי היא עדיין תהיה מספיקה להכנת גשש (probe) איכותי. עם השלמת תגובת השעתוק, יש להוציא מיקרוליטר אחד מתערובת התגובה לבדיקה על ג'ל TAE בריכוז 1% ולהוסיף את שאר תערובת התגובה.
הוסיפו 80 µL של 1%SDS בבופר TE, 10 µL של ammonium acetate בריכוז 5M ו-220 µL של ethanol קר. ערבבו את התערובת במכשיר vortex בעוצמה והניחו אותה על קרח עד לקבלת תוצאות בדיקת איכות ה-RNA. לאחר הוספת מים וצבע טעינה סטנדרטי ל-1 µL של RNA שהופרדו לפני השקיעה, הריצו את ה-RNA על ג'ל agarose בריכוז 1% המכיל EtBr בבופר TAE.
הצג את ה-RNA המסומן ב-ethidium bromide על הג'ל באמצעות טרנס-ילומינטור UV כדי לבדוק את איכות הגשש. יש לראות פס בודד ללא מריחה מעליו או מתחתיו. לאחר אימות איכות ה-RNA, שקיע את שארית ה-RNA שהושארה על קרח על ידי סבב במיקרו-צנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך 10 עד 15 דקות.
הסיר את הנוזל העליון באמצעות פיפטת זכוכית דקה ואפשר ל-RNA להתייבש לזמן קצר. לאחר מכן, השעה מחדש את הגשש במאחר היברידיזציה של RNA ואחסן אותו במבחנה פוליסטירן עם מכסה הברגה בנפח 15 מיליליטר בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. כדי להתחיל בהליך זה, הוצא את העוברים שאוחסנו במתנול בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס ואפשר להם להתחמם לטמפרטורת החדר.
ההליך כולו מבוצע בתוך מבחנות זכוכית. אם עובדים על עוברים שונים מקבוצה אחת באמצעות גששים שונים, יש לשמור אותם במבחנה אחת עד רגע לפני הוספת הגששים. כדי להפחית שונות ומאמץ ביום הראשון, כהכנה להוספת הגשש, יש לבצע רהידרציה לעוברים באמצעות סדרת מתנול כפי שמתואר בטבלה זו; השתמשו בפיפטות זכוכית כדי להסיר ולהוסיף כל תמיסה בזהירות, שכן העוברים עלולים להיפגע בקלות בשלב זה.
בעת העברת הנוזלים, בדקו את פנים הפקקים כדי לוודא שעובריים לא נלכדו שם. סובבו בעדינות את העובריים לאחר כל החלפה כדי להבטיח שהם אינם נדבקים לדפנות או זה לזה. נענעו את העובריים על ידי הצבת המבחנות על mutator לפני השימוש; יש לחמם מראש את באפר ההיברידיזציה של ה-RNA ואת הגשש (probe) ל-65 °C.
בצעו היברידיזציה של העובריים בתמיסת הגשוש (probe) למשך הלילה, עם נענוע בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס ביום למחרת. הסירו את תמיסת הגשוש ושמרו אותה בפרוטובול פוליסטירן עם מכסה הברגה בנפח 15 מיליליטר, המסומן בתאריך ובמספר הפעמים שבהם הגשוש שימש. אחסנו את תמיסת הגשוש בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס.
לאחר הסרת הגשש, הכין את העוברים לצביעה בנוגדנים נגד הגשש באמצעות סדרת שטיפות כפי שמתואר כאן; שנה את הטמפרטורה לפי הצורך על ידי העברת המוטטור עם מבחנות העוברים המחוברות אליו ישירות לתנורי היברידיזציה המכוונים לטמפרטורה המתאימה. בזמן שהעוברים מדגרים בתמיסת החסימה, הכן את הנפח המתאים של תמיסת החסימה בתוספת נוגדן anti-D dig, כך שהנוגדן ייחסם לפני הוספתו לעוברים. דגרי את העוברים בתמיסת הנוגדנים למשך הלילה עם נדנוד בטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius, ושלב זה יסתיים ביום למחרת.
הסר את תמיסת הנוגדנים ושטוף באמצעות mab, תמיסה המכילה חומצה מאליאית ונתרן כלורי. בצע לפחות 1230 דקות של שטיפות בטמפרטורת החדר תוך כדי נדנוד (rocking). החלף את תמיסת השטיפה האחרונה בתסבסב של פוספטאז אלקליני.
בצעו את תגובת הצביעה בטמפרטורת החדר תוך כדי נדנוד למשך הלילה, וסיים ביום למחרת. הפסיקו את תגובת הצביעה והכינו את העובריים לאחסון ולדימיון על ידי החלפת הנוזלים כפי שמתואר בטבלה זו. לאחר רהידרציה של העובריים, קבעו את הצבע באמצעות MFA למשך 30 דקות.
לאחר הקיבוע, יש להסיר את ה-MFA ולשטוף את העוברים ב-25% methanol. אם נדרשת הסרה של פיגמנטים אנדוגניים, יש להסיר את ה-25% methanol ולהוסיף את תמיסת ההלבנה. יש לעקוב מקרוב אחר תהליך ההלבנה כיוון שהוא קורה במהירות יחסית, וניתן לשנות את מידת ההלבנה כדי להשיג אפקטים שונים.
לאחסון לטווח ארוך, יש לבצע דהידרטציה לעובריים באמצעות סדרת מתנול עד ל-100% methanol; לאחר הלבנה לצורך אחסון לטווח קצר והדמיה עוקבת, העבירו את העובריים ל-PBS. עובריים שאינם שקופים נצפים ומודגמים בצורה הטובה ביותר על רקע של 1% aros. כדי להכין את תמיסת ה-aros, הוסיפו aros למים והביאו לרתיחה עד שה-aros ימוס בתמיסה. לאחר שה-aros התקרר ל-50 degrees Celsius, שפכו אותו לתוך צלחת פטרי לעומק של כשני מילימטרים.
כאשר צלחת ה-aros מוכנה, הניחו בה את העוברים שלא עברו בירוח והמשיכו בדימות. ה-aros מספק רקע בצבע אפור-כחול המהווה ניגודיות טובה לעובר ולצבע הכחול של תגובת הצביעה. הוא גם מסייע בפיזור צללים והשתקפויות מסיחים המסיטים את התשומת לב מהעובר, כדי לאפשר דימות של העובר מזוויות חלופיות, כגון מהצד הוונטרלי.
השתמשו בפינצטה עדינה כדי לבצע חיתוכים בטבעות להבאת העוברים למקומם. מקמו את העוברים בתעלות אלו לצורך התמצאות. היו זהירים במניפולציות בעוברים, שכן הם רגישים לפגיעה.
השתמשו במקור אור סיב אופטי כדי להאיר את העובר מזווית רדודה, דבר שיצור צללים על העובר המעניקים עומק לתמונה ומסייעים בזיהוי מבני פני השטח, מכיוון שהבהרה עלולה להסיר פיגמנט המשמש כנקודת ציון מועילה. השתמשו בצללים עבור עוברים שעברו הבהרה חזקה. עוברים שעברו הבהרה שקופה (Cleared embryos) משמשים להדמיית צביעות הנמצאות עמוק בתוך העובר, כגון בשקום, בריאות או באזורים במוח.
בפרוטוקול זה, נעשה שימוש ברמות שונות של הבהרה כדי להנמיך את הצבע ולראות את הצביעה בעובר. אם הצביעה חזקה, הבהרה קלה יותר המותירה חלק מהפיגמנטאציה תאפשר קביעה טובה יותר של שלב ההתפתחות והתמצאות בעובר. עם זאת, אם הצביעה נמצאת באזור בעל רמות גבוהות של פיגמנטאציה, כגון הכליה, הבהרה משמעותית יותר תיתן תוצאה טובה יותר.
מניפולציה של בסיס ה-ARO יכולה לסייע בהכוונת העובר. לדוגמה, על ידי חיתוך תעלה דקה ב-aros, ניתן להביא עובר בשלב השבתי (tadpole stage) השוכב על צדו למצב שבו הוא נצפה מהצד הוונטרלי (הבטני) ביציבות מספיקה כדי ללכוד תמונה טובה. עובר זה הונח בחור קטן שייצב את מיקומו כאשר הצד הוונטרלי פונה כלפי מעלה, מה שאפשר צפייה מלאה בדפוס הביטוי של הגן המדובר.
ניתן להבחין באיברים פנימיים הן בעובריים שלא עברו הבהרה והן בעובריים שהשקיפו, כאשר עובריים עמומים שלא עברו הבהרה נצבעו עבור PAX two. בשלב 34, ניתן להמחיש את השת העצרית (optic stalk) וכן את צינור העצבים. עם זאת, הפרטים אינם חדים. על ידי הבהרה של העובר, גבולות אתרי הביטוי, כולל השת העצרית, הופכים לחדים יותר.
מידת השקיפות באה לידי ביטוי ביכולת לראות את שתי העיניים בעובר זה. עם זאת, בעיה נפוצה בעוברי שקיפות היא הצטברות של צבע בחללים הפנימיים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבצע whole mount in situ במהירות, עם פחות ריאגנטים, ולהשיג תמונות באיכות גבוהה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
העובר של Xenopus laevis מהווה מודל בעל ערך לחקר ההתפתחות המוקדמת בשל גודלו הרב וקלות המניפולציה בו. מאמר זה מספק פרוטוקול מפושט לביצוע היברידיזציה במקום (in situ hybridization) על דגימה שלמה לזיהוי איברים ספציפיים בתוך העובר.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה התפתחותית
- ביטוי גנים
- אמבריולוגיה
רקע
- המין Xenopus laevis נמצא בשימוש נרחב במחקרי התפתחות.
- גודלו של העובר מקל על מניפולציות ניסיוניות.
- היברידיזציה במקום (in situ hybridization) של דגימה שלמה היא טכניקה להדמיית ביטוי גנים.
- הבנת המיקום של גן היא קריטית לביולוגיה התפתחותית.
מטרת המחקר
- להדגמת הביטוי של גן ספציפי בעובר שלם.
- לספק פרוטוקול ברור למחקרים למעקב.
- לשיפור ההבנה של תפקוד גנים במהלך ההתפתחות המוקדמת.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- קיבוע של RNA בתוך העובר.
- היברידיזציה של גשש RNA אנטי-סנס (antisense) ל-RNA המטרה.
- גילוי של הגשש באמצעות נוגדן המצומד לפוספטאז אלקלי.
- ויזואליזציה של מיקום ה-RNA באמצעות צביעה קולורימטרית.
תוצאים עיקריים
- מיקום מוצלח של ביטוי הגן בתוך העובר.
- תגובות צבע המצביעות על אזורים ספציפיים של פעילות גנים.
- תוצאות התואמות לאנטומיה הידועה של העובר.
- ניתן לשחזר את הפרוטוקול עבור גנים שונים בעלי עניין.
מסקנות
- הפרוטוקול מזהה ביעילות את מיקומי ביטוי הגנים.
- *Xenopus laevis* נותר מודל מרכזי למחקרי התפתחות.
- הממצאים תורמים להבנת תפקוד הגנים במהלך ההתפתחות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנת השלבים המוקדמים של האורגנוגנזה במערכות מודל כגון Xenopus מספקת תובנות בסיסיות לגבי מסלולים התפתחותיים שיכולים לסייע בתיקוף מטרות (target validation) בתהליכי גילוי תרופות. היכולת להדמיא דפוסי ביטוי גנים ברזולוציה מרחבית גבוהה תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קישור מטרות מולקולריות לתוצאות פנוטיפיות במערכת הרלוונטית למחלה. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי מתן אפשרות לצפייה ישירה בהיווצרות נבטי האיברים (organ primordia) ובספציפיקציה של רקמות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי קישור בין ביטוי גנים לבין היווצרות נבטי איברים במהלך התפתחות מוקדמת.
- ערך תפעולי: מספק תהליך עבודה מפושט וניתן לשחזור לניתוח ביטוי גנים מרחבי, עם צריכת ריאגנטים מופחתת וזמן ביצוע מהיר יותר.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי אישור ביטוי של מטרה באיברים מתפתחים, ובכך מסייע בתעדוף מטרות ובמיון תיקי פיתוח.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר קריאות כמותיות עם רזולוציה מרחבית של ביטוי גנים, שניתן להשתמש בהן כדי לתקף מערכות בדיקה עבור סריקת תרכובות בשלבים הבאים.
- ערך תפעולי: מייצר פלטים קולורימטריים סטנדרטיים התואמים לפלטפורמות דימות, מה שמאפשר לכידה עקבית וניתנת להרחבה של נתונים בין ניסויים שונים.
- מוכנות הבדיקה: מסייע בהכנה של מערכות ביולוגיות מתוקפות עבור סריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening) על ידי ביסוס דפוסי ביטוי בסיסיים בעובריים שלמים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רציפות תרגומית: מקשרת בין ביטוי גנים בשלבי התפתחות מוקדמים לבין תפקוד איברים מאוחר יותר, ובכך תומכת בהתאמת סממנים ביולוגיים במודלים פרה-קליניים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאפשרת להעריך כיצד הפרעות גנטיות או הפרעות במסלולים משפיעות על מורפולוגיית האיברים, מה שמסייע לחיזוי בטיחות ויעילות.
- הסתגלות המודל: יכולת ההסתגלות של הפרוטוקול ל-Xenopus tropicalis ולעוברים אחרים תומכת בתיקוף בין-מיני וברלוונטיות תרגומית.
שילוב תהליכי עבודה ופייפליין
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מזיהוי המטרה ועד לאופטימיזציה של המולקולה המובילה (lead optimization), ומספקת נתונים על ביטוי גנים מרחבי התורמים לבחינת השערות ולהבהרת מסלולים ביולוגיים בשלבי הביולוגיה המוקדמים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה ישירה של המיקום והזמן שבהם גנים רלוונטיים באים לידי ביטוי במהלך האורגנוגנזה.
- סריקה: מספקת פלטי דימות כמותיים הניתנים לשחזור, המאפשרים השוואה של ביטוי גנים בין תנאים ניסויים שונים, ובכך מסייעת בהערכת השפעת תרכובות.
- אנליטיקה: מייצרת תוצאות קולורימטריות שניתן לכמת ולהצליב עם נקודות ציון אנטומיות, מה שמאפשר השוואה אובייקטיבית של תחומי ביטוי.
- מחקר טרנסלציונלי: מקשרת בין דפוסי ביטוי גנים מוקדמים לבין היווצרות איברים, ובכך תומכת ברצף מהשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני כאשר נחקרים מסלולים רלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה יכולת מודולרית וסטנדרטית לטרנסקריפטומיקה מרחבית שניתן להשתמש בה שוב בפרויקטים ובמערכות מודל שונות כדי לצמצם פיתוח שיטות כפול.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות במיקום הביטוי הגנתי ותמיכה בתובנות מכניסטיות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה באמצעות שלבים מפושטים, צמצום בשימוש בריאגנטים ותאימות לאוטומציה באמצעות רובוטים להיברידיזציה in situ.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go על ידי אספקת נתונים מרחביים ברורים על ביטוי המטרה, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים של תוכניות לפיתוח תרופות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות מותאם סיכון על בסיס ביטוי מאומת באיברים בהתפתחות, ובכך תומך בהקצאה יעילה של משאבים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות באמבריולוגיה, ביולוגיה מולקולרית וטכניקות דימוי כדי לטפל בעובריים בצורה נכונה ולפרש דפוסי צביעה.
- תלוי בגישה לתנורי היברידיזציה, מיקרוסקופים בעלי יכולות תאורה ב-UV ואור חדיר, ומגיבים סטנדרטיים של ביולוגיה מולקולרית עבור סינתזה וזיהוי של גששים.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הטיפול בעובריים, הצביעה והדימוי כדי להבטיח עקביות בין משתמשים וניסויים.
- התאמה למערכות מודל אחרות (למשל, zebrafish, עכבר) עשויה לדרוש אופטימיזציה של תנאי הקיבוע, הפרמביליזציה וההיברידיזציה.
- מגבלות מעשיות כוללות את שבירות העובריים במהלך המניפולציה ואת הצורך באופטימיזציה קפדנית של שלבי ההלבנה וההבהרה כדי לאזן בין בהירות האות לבין השמירה על השלמות המבנית.
