אפיון של קשקשים דגים שכבתיים Multi-(

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את המבנה, הכימיה והתכונות המכניות של קשקשי דגים מינרליים רב-שכבתיים באמצעות ביצוע טומוגרפיה ממוחשבת בקרני X (x-ray computed tomography), ננו-אינדנטציה (nano indentation) עבור ספקטרוסקופיית פוריيه בשיקוף תכלילי (Fourier transform infrared spectroscopy) ומיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת בשילוב עם ספקטרוסקופיית קרני X לפיזור אנרגיה (energy dispersive X-ray spectroscopy). דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת הקשקשים הבודדים לאנליזה באמצעות הסרת הרקמה הרכה מהקשקשים, קיבוע וחיתוך של הקשקשים, ולאחר מכן ביצוע ליטוש מדורג. השלב השני הוא ביצוע ננו-אינדנטציה במתאם מרחבי לאורך חתך הרוחב של הקשקש עם ראש יהלום מסוג Berkovich כדי לקבוע את התכונות הננו-מכניות המקומיות.

בשלב הבא, השכבות הפנימיות והחיצוניות של קשקשי הדגים נבחנות באמצעות מיקרוסקופ FTIR כדי לזהות את הקבוצות הפונקציונליות העיקריות בכל אחת מהשכבות. השלב האחרון הוא שימוש בגלאי EDX במיקרוסקופ אלקטרונים סורק כדי לקשר בין ההרכב הכימי המקומי לבין ההסגות הננו-מטריות שבוצעו בקשקשי הדגים, ולהציל תמונות של ההסגות בשכבות השונות ובמשטחי השבר. בסופו של דבר, על ידי שילוב של טכניקות ניסיוניות שונות אלו, עקרונות התכנון הטבעיים של קשקשי דגים מינרליים מוברים באמצעות הבנת הקשרים שבין המבנה למאפיינים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות בדיקה קיימות אחרות, כגון ננו-הזהה סטטיסטית של מסה (bulk statistical nano indentation), הוא שהיא מספקת קורלציה ישירה בין מבנה ההרכב הכימי לבין תכונות מכניות מקומיות. באזורי עניין, יישמנו שיטה זו כדי לחקור את ההתפלגות המרחבית, מבנה ההרכב הכימי והתכונות המכניות בביומטריאלים מבניים. לשיטה זו יישומים רבים, כולל חומרים מבוססי מלט, קומפוזיטים רב-פאזיים, וכל סוג של חומר הטרוגני המפגין הטרוגניות זו בסדרי גודל של מיקרומטרים וננומטרים.

כדי לבחון חתך רוחבי של הציר הקצר של קשקש דג, החזיקו את קשקש הדג בתוך תבנית דגימה בעלת קוטר של 32 מילימטר, תוך שימוש במחזיק דגימות פלסטיסטי זמין מסחרית כדי לשמור על כיוון נכון של הדגימה בעת הקיבוע באפוקסי. לאחר קיבוע הדגימה בתבנית, שפכו אפוקסי שטרם התקשח על הדגימה. לאחר השארת האפוקסי להתקשח בהתאם להוראות היצרן, בצעו חיתוך של הדגימה המקובעת באמצעות מסור חיתוך בעל דיוק גבוה עם להב יהלום בקו האמצע של הדגימה.

לאחר שהדגימה הוכנסה לתוך מכשיר ה-nanoindenter, השתמש בבקרים של התוכנה כדי להעביר את הדגימה למיקום עבור ההחתה הראשונה, ובצע ארבע שורות מקבילות של החתות במרווחים של 15 µm אחת מהשנייה כדי לקבל מערך נתונים בעל מובהקות סטטיסטית החל ממיקום זה. לאחר מכן, הגדר את ה-nanoindenter לעומס מקסימלי של 5 mN, קצבי העמסה ופריקה של 0.1 mN/s, זמן החזקה של 30 s, ומרווח מינימלי בין החתות של 5 µm עבור כל שורה. עם השלמת הסדרה, השתמש ב-nanoindenter כדי ליצור החתות סימון (fiducial indents) בעומס מקסימלי של 100 mN בנקודת ההחתה הראשונה והאחרונה, אשר צריכות להיות בתוך האפוקסי לפני שכבת ה-anoe ואחרי שכבת העצם, בהתאמה.

לאחר ננו-הבליטה (nano indentation), החזירו את הדגימה לתמיסת ה-PBS כדי למנוע התייבשות נוספת. קבעו את הדגימה בצורה נוקשה כך שהמימד הארוך ביותר יהיה מקביל לגלאי. לאחר הגדרת הסורק,יצבו את הדגימה על שולחן הסורק באמצעות חומרים השקופים לקריני x, כגון קלקר ופראפורם.

מקמו את הדגימה כך שתהיה במרכז הסיבוב. לאורך הסריקה, בחרו ברזולוציה הגבוהה ביותר המאפשרת לכל קנה המידה להיות בשדה הראייה, שבמקרה זה היא 7.5 micrometers. לאחר רכישת הנתונים, בצעו שחזור לתמונות היטלי קרני ה-x כדי ליצור מערך נתונים המכיל תמונות של חתכים רוחביים.

לאחר מכן, השתמש בתוכנה כדי לקבל את תמונת גווני האפור התלת-ממדית הסופית. כוונן את טווח גווני האפור לרמה מתאימה כדי להסיר ארטיפקטים מהסטירופום ומהפאראפורם. לצורך דימות SEM או מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת של שקעי ננו על הדגימה המלוטשת, הצמד את הדגימה לבסיס SEM באמצעות סרט פחמן דו-צדדי, כאשר המשטח עם השקעים פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, הכנס את הדגימה לתא ה-SEM ושאב את התא למצב של ואקום נמוך.

כווננו את מרחק העבודה לטווח שבין 3.0 ל-5.0 מילימטרים. הפעילו את המתח הגבוה ונווטו לאזורי העניין בדגימה, שבמקרה זה הם המבנים הנמצאים בשכבות ה-anoe והעצם. לאחר מכן, השגיחו תמונות במתח גבוה שבין 5 ל-15 קילו-וולט ובזרם אלומה נמוך של 3.9 ננו-אמפר.

כדי לשפר את הרזולוציה, צלם תמונות מלפחות שלושה אזורי עניין בהגדלות של 250 x עד 10,000 x באמצעות גלאי BSE (אלקטרונים מפוזרים לאחור) בוואקום נמוך, כדי לסייע בזיהוי שינויים בתוכן המינרלי הביולוגי ובדחיסות. לאחר מכן, נווט לאזור עניין בדגימה המלוטשת הכולל רשת של ננו-הבליטות (nano indentation grid), המסומנת על ידי סימני ייחוס (fiducial marks) בקצה כל שורת הבליטות. ודא שהמתח הגבוה הוא לפחות 15 kilovolts.

זרם האלומה הוא לפחות 3.9 nano amps, ומרחק העבודה גדול מ-5.0 millimeters. לאחר מכן, תעו כך את תמונת האלקטרונים המפוזרים לאחור (back scattered electron) של האזור המיועד לניתוח באמצעות EDX. השתמש בתוכנה לניתוח EDX.

צלמו את אותה התמונה כדי לסייע באיתור אזורים לביצוע ניתוח כימי לאורך קו השקעים. לאחר מכן, באמצעות טכניקת ניתוח קו (line analysis), מקמו קו לביצוע ניתוח כימי לאורך קו השקעים הרלוונטי, החל מהשקע הראשון ועד לשקע האחרון. הגדירו את מספר נקודות הניתוח שיוצבו לאורך הקו כמספר השקעים הקיימים, כדי לספק מתאם מרחבי ישיר בין ההרכב הכימי לבין התכונות המכניות.

כאשר הקו ממוקם והנקודות מוגדרות כראוי, התחילו את ניתוח הקו באמצעות תוכנת ה-EDX; לאחר השלמת ניתוח הקו, זהו את היסודות הרלוונטיים למדידה כמותית מתוך ספקטרום הנקודות שהתקבל לאורך הקו שהוגדר על פני השטח המלוטש של הדגימה.

לאחר זיהוי היסודות המבוקשים, בצעו כיול רקע כדי לפצות על קרינת בלימה (bremsstrahlung) של ריאות הקש ואפקטים אחרים. בחרו באפשרות ניתוח הדה-קונוולוציה (deconvolution analysis) של התוכנה כדי לקבל ניתוח כמותי עבור כל נקודה לאורך הקו שהוגדר, במטרה לכמת את ההרכב הכימי בכל נקודה. לבסוף, שמרו את תוצאות הניתוח הכימי הכמותי יחד עם תמונת הקו המנותח כדי לסייע בהקבלה מרחבית עם תכונות מכניות שנמדדו באמצעות ננו-השחזה (nanoindentation) בשכבה האנואיית; הננו-השחזה חישבה מודולוס ממוצע של 69.0 giga pascals וקשיות של 3.3 giga Pascals.

בדיקת הננו-הזהירה (nano indentation) קבעה מודול ממוצע של 14.3 giga pascals וקשיות של 0.5 giga pascals עבור שכבת העצם. שכבות ה-anoe והעצם מכילות הבדלים מדידים בהרכב הכימי. ניתן לייחס את עליית הפחמן בשכבת העצם למינרליזציה נמוכה, הגורמת לעלייה בפחמן ולירידה בבהירות תמונות ה-BSE. ספקטרומיית FTIR של שכבות העצם וה-ENE מראה חתימות של הידרוקסיאפטיט בשכבת ה-gwe החיצונית וחתימות של קולגן בשכבת העצם הפנימית.

טומוגרפיה ממוחשבת בקרני X מראה ששכבת ה-gwe אינה מכסה את שכבת העצם במקומות שבהם הקשקשים חופפים. שכבות ה-gwe באפור בהיר יותר הן דחוסות, קשות וקשיחות יותר, בעוד ששכבות העצם באפור כהה יותר הן פחות דחוסות ופחות קשיחות. נצפו בורות ברורים ליד מרכז שכבת ה-ging, המדגימים את חוסר האחידות שלה.

תמונת ה-SEM בהגדלה נמוכה של פני השבר שנחרטו חשפה ננו-מבנים המאורגנים בתבנית שכבתית עבור שכבת ה-ging, דבר המתהאם עם ה-FTIR. תמונות SEM בהגדלה גבוהה יותר של פני השבר שנחרטו מראות ננו-מוטות מכוונים בשכבת ה-ging, בעוד שננו-מבנה דמוי סיב נצפה בשכבת העצם לאחר פיתוחה. טכניקה זו סללה את הדרך למחקרים נוספים על ביו-חומרים וחומרים מרוכבים כדי לבחון את ההתפלגות המרחבית של ההרכב הכימי, המבנה והתכונות המכניות, וכן לבחון ממשקים בחומרים מרוכבים רב-פאזיים. כעת, לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן הכנת הדגימות וביצוע ניתוחים כדי להקרין מרחבית בין ההרכב הכימי למבנה ולתכונות המכניות בביו-חומרים מבניים.

טכניקות אלו ישימות וניתנות להתאמה גם לחקר סוגים אחרים של חומרים רב-פאזיים הטרוגניים.