שלב מעבר לברט: הקרינה על ידי מאוגד עירור מההארה (דלק)
23 במאי 2014
הרחבת הבסיס ותחולתה של הקרינה על ידי מאוגד עירור מהארה (דלק) על ידי מדידות העקרונות הרלוונטיים והוכחת התאימות שלה עם שפע של fluorophores ותנאים ממוקדי נוגדן.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להדגים את הפשטות של הדלק ולצפות ביצירת פוטונים אדומים כתוצאה מאירועי פליטה של עירור קרינתי. זאת מושג על ידי שילוב של חיידקים ביו-לומנסיים וננו-חלקיקים לומנסיים לייצור דלק. לאחר מכן, נעשה שימוש בקורא לוחות ביו-לומנסי כדי לצפות בפוטונים האדומים הנובעים מהתוצאות של הדלק; התוצאות המתקבלות מראות כי ניתן להפיק כמות ניכרת של פוטונים אדומים כאשר החיידקים הביו-לומנסיים והנקודות הקוונטיות נשמרים בתוך אותו תמיסה.
בהתבסס על העלייה שנצפתה בשטף הפוטונים האדומים, ההשלכות של טכניקה זו מובילות להטלת ספק בפרדיגמה של מעבר כניסה למגורי NCE או Brett. דבר המדווח לעיתים קרובות בספרות. החל מקולוניות בודדות, התחל תרביות לילה של חיידקים לומניסנטיים על צלחות תרבית סטנדרטיות.
בניסוי זה, נעשה שימוש ב-Vibrio Fisher Eye ביום ביצוע הניסוי. יש להכין תרביות משנה טריות ולהמתין עד להשגת צפיפות אופטית (OD) של 1 עד 1.5 באורך גל של 600 ננומטר. כדי להשיג תוצאות עקביות, יש להשתמש בחיידקים הנמצאים במצבי גדילה דומים, שבהם הם מייצרים אותות חזקים.
שלבו מנות של 100 µL מכל דגימה עם 5 µL של הגשש הפלואורסצנטי, QD 7 0 5 או עם תמיסת סליין פיזיולוגית. לאחר מכן, הוסיפו את התערובת ל-895 µL של תמיסת סליין פיזיולוגית בתוך קיובטות ספקטרוסקופיות סטנדרטיות. הניחו את הקיובטות המלאות במכשיר לדימות ביולומינצנציה של בעלי חיים שלמים ובצעו את המדידות תחת סטים של מסננים מתאימים.
כאן נעשה שימוש במסנן פליטה של 710 עד 730 ננומטר לביצוע המדידות במרחקים משתנים. מלאו שתי קיובטות פוטומטריות מפלסטיק בנפח מופחת ב-50 µL של QD 7 0 5 או ב-97.2 µL של מיקרוספירות פוליסטירן של 48 ננומטר שאינן פלואורסצנטיות, בנפח כולל של 1 mL של סליין פיזיולוגי. פעולה זו מבטיחה שטח פנים מוצק דומה ביחס לנפח הכולל בין שתי הישויות.
הכינו מקור אור qve על ידי עטיפת qve שלישי בסרט שחור סטנדרטי או בחומר אטום אחר המסוגל לחסום אור. הכינו בזהירות שני חלונות אופטיים זהים בצדדים מנוגדים של ה-vete. הוסיפו אליקוט של 1 mL של Vibrio fii או תרבית אחרת מתרבית-בת טרייה לתוך ה-vete של מקור האור וכסו אותו בחומר אטום, כגון נייר שחור, כדי לצמצם זיהום של אור.
כעת מקמו את הקובטות שמולאו קודם לכן ישירות משני צידי מקור האור בתוך מכשיר הדמיה (imager). בצעו ויזואליזציה של שלוש הקובטות תחת מסנני פליטה מתאימים, כגון מסנן אור כולל ומסנני פליטה של 710 עד 730 nanometer, עם זמני חשיפה של 10, 30 ו-30 שניות בהתאמה. רכשו תמונת פלואורסצנציה בעירור של 450 עד 480 nanometers ופליטה של 710 עד 730 nanometers כדי לאמת את מיקום ה-QD 7 0 5.
מיקמו מחדש את שני ה-Q vets החיצוניים במרחקים שווים וגדלים מה-Central Q Vet. לאחר מכן, בצעו ויזואליזציה ורכשו תמונת פלואורסצנציה לפני חזרה על תהליך זה שוב, עד להשגת מרחק פנים-אל-פנים סופי של שלושה סנטימטרים. מלאו שתי קובטות בנפח מופחת בפתרונות של מיליליטר אחד, כאשר באחת יהיה fluoro four או ננו-חלקיק פלואורסצנטי רלוונטי, ובשנייה תמיסת סליין פיזיולוגית עם ננו-חלקיקים שאינם פלואורסצנטיים כביקורת שלילית.
הוסיפו מנה של 1 mL של Vibrio FII טרי או חיידקים לומניסצנטיים אחרים לתוך קובטה שלישית השחורה, המכילה שני חלונות אופטיים שווים פיזית הממוקמים בצדדים מנוגדים; כסו את הקובטה בחומר אטום, כגון פיסת נייר שחורה, במרחק קצר אך שווה. הניחו את שתי הקובטות בעלות הנפח המופחת משני צדדי הקובטה השחורה והדמינו תחת המסננים המתאימים; במקרה זה נעשה שימוש במרחק של 0.7 cm. חזרו על הפעולה עם שאר הדגימות של qd 7 0 5 עבור החיידקים.
נצפית עלייה משמעותית במספר הפוטונים האדומים בהשוואה לחיידקים בלבד. דליפת דלק של ביקורת עשויה להתרחש למרחקים ארוכים בהיעדר בולע כלשהו. תלות זו במרחק יכולה להיות מאופיינת על ידי חוק הריבוע ההפוך.
עבור מקורות נקודתיים. נראה כי להכוונת ה-flora fours לממברנה הבקטריאלית יש השפעה מועטה או שאין לה השפעה כלל על הכמות הכוללת של אות הדלק המופק. בהקשר זה, הדלק המכוון נשמר גם לאחר מספר שלבי שטיפה.
לאחר צפייה בסרטון זה, תגבשו מושג טוב לגבי האופן שבו ניתן להכין מחדש דלק תחת מודליות מרובות כאמצעי ליצירת פוטונים אדומים מאירועי פליטה של עירור קרינתי.
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את טכניקת ה-Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL), ומדגים את תאימותה לפלואורופורים שונים ולתנאים המכוונים לנוגדנים. הניסוי מציג יצירת פוטונים אדומים באמצעות אינטראקציה בין חיידקים ביולומינצנטיים לבין ננו-חלקיקים לומינצנטיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- טכניקות פלואורסצנציה
- ביולומינסנציה
- אינטראקציות של ננו-חלקיקים
רקע
- FUEL היא טכניקת פלואורסצנציה חדשנית.
- היא עושה שימוש בחיידקים ביולומינסיים ליצירת פוטונים.
- תאימות עם פלואורופורים שונים היא קריטית ליישומה.
- הבנת תהליך יצירת הפוטונים עשויה להשפיע על מחקרי פלואורסצנציה.
מטרת המחקר
- להדגים את פשטותה של טכניקת ה-FUEL.
- להבחין ביצירת פוטונים אדומים כתוצאה מאינטראקציות ביו-לומניסצנטיות.
- להעריך את ההשלכות של FUEL על פרדיגמות פלואורסצנציה קיימות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שילוב של חיידקים ביו-לומנסנטיים וננו-חלקיקים לומנסנטיים.
- שימוש בקורא לוחות ביו-לומנסנציה למדידת פוטונים.
- הכנת תמיסות במרחקים משתנים לצורך תצפית על פוטונים.
- ויזואליזציה תחת מסנני פליטה ספציפיים לאימות התוצאות.
תוצאות עיקריות
- נצפתה ייצור משמעותי של פוטונים אדומים.
- אופיינה התלות של ייצור הפוטונים במרחק.
- סמום של פלואורופורים לממברנות חיידקיות הראה השפעה מינימלית על האות.
- FUEL יכול לפעול ביעילות למרחקים ארוכים ללא סופחים.
מסקנות
- FUEL היא טכניקה מבטיחה ליישומים של פלואורסצנציה.
- היא מאתגרת פרדיגמות קיימות במחקר פלואורסצנציה.
- חקירה נוספת של FUEL עשויה לשפר מחקרים בביולומינסצנציה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטת FUEL מרחיבה את מרחק העבודה של עירור מבוסס לומנסנס מעבר למגבלות הננו-סקאלה של BRET, ובכך מאפשרת יצירת אות בטווחים של מיקרומטרים עד סנטימטרים ללא צורך בבולעי אור (absorbers). יכולת זו מגשרת על פער מרחבי קריטי בדימות מולקולרי, ותומכת ביישומים שבהם שיטות מסורתיות להעברת אנרגיה אינן יעילות. עבור מו"פ בביופארמה, FUEL מציעה גישה ניתנת להרחבה (scalable) ותואמת לסמנים (labels), לבחינת אינטראקציות ביולוגיות במבני תאים או רקמות גדולים יותר, ובכך משפרת את תיקוף המטרה (target validation) במערכות מורכבות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של אינטראקציות מולקולריות במרחקים שאינם נגישים ל-BRET, ובכך תומך בתיקוף מטרות בהקשרים של סממנים ביולוגיים דלילים או מפוזרים.
- ערך תפעולי: משתמש בערבוב פשוט של מקורות ביולומינסנציה ופלואורופורים, ובכך מפחית את מורכבות הבדיקה ומאפשר תאימות לסריקה ברמה גבוהה (high-throughput).
- ערך ניבוי: מספק קריאות כמותיות של פוטונים אדומים המתאימות לקרבה של הגשוש, ובכך מסייע בזיהוי מועמדים מובילים (leads) ובצמצום סיכונים מכניסטיים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: תואם למגוון פלואורופורים וננו-חלקיקים, מה שמאפשר תכנון גמיש של בדיקות עבור מחלקות מטרות שונות.
- ערך תפעולי: ייצור הסיגנל נשמר לאחר שלבי השטיפה, מה שתומך בזיהוי הדיר במידע (reproducible) בדגימות הטרוגניות.
- מוכנות הבדיקה: פועל בתמיסת סלין פיזיולוגית סטנדרטית ללא צורך בבופרים מותאמים אישית, מה שמקל על השילוב בפלטפורמות סריקה קיימות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מאפשרת הדמיה של מדגם שלם במרחקים מורחבים, מה שתומך בהסברה (extrapolation) ממודלים in vitro למודלים in vivo.
- סנכרון סמנים ביולוגיים: FUEL המכוון לנוגדנים שומר על האות לאחר הקישור, מה שמאפשר ניטור של מעורבות מטרה ספציפית על פני קני מידה מרחביים גדולים יותר.
- הפחתת סיכונים: אות תלוי-מרחק פועל לפי חוק הריבוע ההפוך, ובכך מספק מסגרת כמותית צפויה להשוואה בין מחקרים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטת FUEL משתלבת ברצף הגילוי, החל מסריקה ראשונית של מעורבות מטרות ועד לתיקוף פרה-קליני, במיוחד כאשר נדרשת רזולוציה מרחבית מעבר לקרבה מולקולרית.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות של לוקליזציה של מטרות ויצירת קומפלקסים בסביבות תאיות שבהן הגששים עשויים שלא להיות במגע ישיר.
- סינון: מאפשר סטנדרטיזציה של בדיקות באמצעות פלט אות שניתן לכיוונו לפי מרחק, ובכך משפר את השחזוריות בין מעבדות שונות.
- אנליזה: מייצר שטף פוטונים אדומים כמותי הניתן למדידה באמצעות מדמיימי ביומינסנסנס סטנדרטיים, מה שמאפשר ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין אירועי קישור in vitro לגילוי אותות ברמת הרקמה, ובכך תומך בתיקוף של סמנים ביולוגיים במודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: דורש רק מקור ביומינסנסנסי ופלוורופור, מה שהופך זאת ליכולת ניידת וזולה לשימוש בפרויקטים מרובים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מרחיב את הטווח המרחבי של בדיקות המבוססות על לומניסנציה (luminescence), ובכך מפחית תוצאות שגויות שליליות במטרות בעלות שפע נמוך או כאלו המפוזרות באופן דיפוזי.
- ערך תפעולי: מבטל את הצורך בזיגוג מולקולרי (conjugation) מדויק או בקרבה פיזית רבה, מה שמפשט את הכנת הרכיבים ומפחית את השונות.
- ערך אסטרטגי: משפר את הביטחון בקבלת החלטות מסוג go/no-go על ידי מתן אפשרות לגילוי מטרות שחומקות מבדיקות מבוססות BRET עקב מגבלות מרחק.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון באמצעות אספקת תיקוף אורתוגונלי של מעורבות המטרה (target engagement) במטריצות ביולוגיות מורכבות.
שיקולי יישום
- דורש גישה לתרביות חיידקים ביו-לומנסנטיים או למערכות לומנסנטיות מהונדסות.
- תלוי בציוד סטנדרטי לדימוי ביו-לומנסנטי עם מסנני פליטה מתאימים בעלי הסטה לאדום (למשל, 710–730 nm).
- מחייב אופטימיזציה של ריכוז הגשש ועוצמת המקור כדי למנוע רוויית אות במרחקים קצרים.
- חובה להתחשב בדעיכה לפי חוק ריבוע המרחק בעת פירוש עוצמת האות לאורך מרחקים.
- מוגבל על ידי לומנסנציה של רקע בדגימות עם אוטו-פלואורסצנציה או פיזור אור, דבר הדורש בקרות מתאימות.
