שלב מעבר לברט: הקרינה על ידי מאוגד עירור מההארה (דלק)
23 במאי 2014
הרחבת הבסיס ותחולתה של הקרינה על ידי מאוגד עירור מהארה (דלק) על ידי מדידות העקרונות הרלוונטיים והוכחת התאימות שלה עם שפע של fluorophores ותנאים ממוקדי נוגדן.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להדגים את פשטות הדלק ולצפות ביצירת פוטונים אדומים עקב אירועי פליטת עירור קרינה. זה מושג על ידי שילוב של חיידקים ביולומינסנט וננו-חלקיקים זוהרים לייצור דלק. לאחר מכן, קורא לוחות ביולומינסנציה משמש כדי לצפות בפוטונים האדומים המתקבלים הנובעים מתוצאות דלק המתקבלות המראות שניתן לייצר כמות משמעותית של פוטונים אדומים כאשר החיידקים הביולוגיים והנקודות הקוונטיות נשמרים באותה תמיסה.
בהתבסס על העלייה הנצפית בשטף הפוטונים האדומים, ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לקראת הטלת ספק בפרדיגמה של העברת כניסה למגורים NCE או ברט. זה מדווח לעתים קרובות בספרות החל ממושבות בודדות. על צלחות תרבית סטנדרטיות מתחילים תרביות לילה של חיידקים זוהרים.
כאן, נעשה שימוש ב-Vibrio Fisher Eye ביום הניסוי. התחלת תת-תרבויות טריות מאפשרות להן להתקדם עד להשגת צפיפות אופטית או OD ב-600 ננומטר של 1 עד 1.5. השתמש בחיידקים במצבי גידול דומים שבהם הם מייצרים אותות עזים כדי להשיג תוצאות דומות.
שלב מינויים של 100 מיקרוליטר מכל אחד עם חמישה מיקרוליטרים של הגשושית הפלואורסצנטית, QD 7 0 5 או מי מלח פיזיולוגיים. לאחר מכן מוסיפים את התערובת ל -895 מיקרוליטר של תמיסת מלח פיזיולוגית וקובטות ספקטרוסקופיות סטנדרטיות. הנח את הקובטות המלאות בהדמיית ביולומינסנציה של בעלי חיים שלמים ובצע את המדידות תחת ערכות המסננים המתאימות.
כאן נעשה שימוש במסנן הפליטה של 710 עד 730 ננומטר לביצוע דלק למרחקים משתנים. מלאו שתי קובטות פוטומטריות מפלסטיק בנפח מופחת ב-50 מיקרוליטר של QD 7, 0, 5 או 97.2 מיקרוליטר של מיקרוספירות פוליסטירן 48 ננומטר שאינן פלואורסצנטיות בנפח כולל של מיליליטר אחד של מי מלח פיזיולוגיים. זה מבטיח שטח פנים מוצק דומה לנפח כולל בין שתי הישויות.
הכן qve מקור אור על ידי עטיפת qve שלישי עם סרט שחור סטנדרטי או חומר אטום אחר המסוגל לחסום אור. הכן בזהירות שני חלונות אופטיים זהים בצדדים מנוגדים של הווט. הוסף מינון של מיליליטר אחד של Vibrio fii או תרבית אחרת מתת-תרבות טרייה לתוך מקור האור וכסה אותו בחומר אטום כגון נייר שחור כדי להפחית כל זיהום אור.
לאחר מכן, הנח את הקובטות שמולאו קודם לכן ישירות משני צידי מקור האור בהדמיה. דמיין את שלושת וטרינרי ה-Q תחת מסנני הפליטה המתאימים כגון מסנני האור הכולל ומסנני פליטה של 710 עד 730 ננומטר עם זמני חשיפה של 10, 30 ו-30 שניות בהתאמה. רכוש תמונת פלואורסצנטיות בעירור של 450 עד 480 ננומטר ופליטה של 710 עד 730 ננומטר כדי לאמת את מיקום QD 7 0 5.
מקם מחדש את שני וטרינרי ה-Q החיצוניים במרחקים שווים יותר מה-Q Vet המרכזי. לאחר מכן דמיין ורכוש תמונת פלואורסצנטיות לפני שתחזור על תהליך זה שוב עד להשגת מרחק סופי פנים אל פנים של שלושה סנטימטרים. מלאו שתי קובטות בנפח מופחת בתמיסות מיליליטר אחת המכילות פלואורו ארבע או ננו-חלקיק פלואורסצנטי מעניין באחד ותמיסת מלח פיזיולוגית עם ננו-חלקיקים שאינם פלואורסצנטיים כבקרה השלילית בשני.
הוסף מיליליטר אחד של Vibrio FII טרי או חיידקים זוהרים אחרים ל-vete שלישי מושחר המכיל שני חלונות אופטיים שווים פיזית הממוקמים בצד הנגדי, כסה את ה-vete שלהם בחומר אטום כגון פיסת נייר שחור במרחק קצר אך שווה. הנח את שתי הקובטות בנפח מופחת משני צידי וטרינר ה- Q המושחר ודמיין מתחת למסננים המתאימים כאן מרחק של 0.7 סנטימטרים. חזור על הפעולה עם כוח הרצפה השני על ה- qd 7 0 5 לחיידקים.
נצפתה עלייה משמעותית במספר הפוטונים האדומים בהשוואה לחיידקים בלבד. דלק בקרה יכול להתרחש למרחקים ארוכים בהיעדר בולם כלשהו. ניתן לאפיין תלות מרחק זו על ידי חוק הריבוע ההופכי.
למקורות נקודתיים. נראה כי למיקוד ארבע הפלורה לקרום החיידקים יש השפעה מועטה עד אפסית על הכמות הכוללת של אות הדלק שנוצר. בהקשר זה נשמר דלק ממוקד גם לאחר מספר שלבי כביסה.
לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג טוב כיצד לבנות מחדש דלק במספר אופנים כאמצעי ליצירת פוטונים אדומים מאירועי פליטת עירור קרינה.
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את טכניקת ה-Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL), ומדגים את תאימותה לפלואורופורים שונים ולתנאים המכוונים לנוגדנים. הניסוי מציג יצירת פוטונים אדומים באמצעות אינטראקציה בין חיידקים ביולומינצנטיים לבין ננו-חלקיקים לומינצנטיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- טכניקות פלואורסצנציה
- ביולומינסנציה
- אינטראקציות של ננו-חלקיקים
רקע
- FUEL היא טכניקת פלואורסצנציה חדשנית.
- היא עושה שימוש בחיידקים ביולומינסיים ליצירת פוטונים.
- תאימות עם פלואורופורים שונים היא קריטית ליישומה.
- הבנת תהליך יצירת הפוטונים עשויה להשפיע על מחקרי פלואורסצנציה.
מטרת המחקר
- להדגים את פשטותה של טכניקת ה-FUEL.
- להבחין ביצירת פוטונים אדומים כתוצאה מאינטראקציות ביו-לומניסצנטיות.
- להעריך את ההשלכות של FUEL על פרדיגמות פלואורסצנציה קיימות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שילוב של חיידקים ביו-לומנסנטיים וננו-חלקיקים לומנסנטיים.
- שימוש בקורא לוחות ביו-לומנסנציה למדידת פוטונים.
- הכנת תמיסות במרחקים משתנים לצורך תצפית על פוטונים.
- ויזואליזציה תחת מסנני פליטה ספציפיים לאימות התוצאות.
תוצאות עיקריות
- נצפתה ייצור משמעותי של פוטונים אדומים.
- אופיינה התלות של ייצור הפוטונים במרחק.
- סמום של פלואורופורים לממברנות חיידקיות הראה השפעה מינימלית על האות.
- FUEL יכול לפעול ביעילות למרחקים ארוכים ללא סופחים.
מסקנות
- FUEL היא טכניקה מבטיחה ליישומים של פלואורסצנציה.
- היא מאתגרת פרדיגמות קיימות במחקר פלואורסצנציה.
- חקירה נוספת של FUEL עשויה לשפר מחקרים בביולומינסצנציה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטת FUEL מרחיבה את מרחק העבודה של עירור מבוסס לומנסנס מעבר למגבלות הננו-סקאלה של BRET, ובכך מאפשרת יצירת אות בטווחים של מיקרומטרים עד סנטימטרים ללא צורך בבולעי אור (absorbers). יכולת זו מגשרת על פער מרחבי קריטי בדימות מולקולרי, ותומכת ביישומים שבהם שיטות מסורתיות להעברת אנרגיה אינן יעילות. עבור מו"פ בביופארמה, FUEL מציעה גישה ניתנת להרחבה (scalable) ותואמת לסמנים (labels), לבחינת אינטראקציות ביולוגיות במבני תאים או רקמות גדולים יותר, ובכך משפרת את תיקוף המטרה (target validation) במערכות מורכבות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של אינטראקציות מולקולריות במרחקים שאינם נגישים ל-BRET, ובכך תומך בתיקוף מטרות בהקשרים של סממנים ביולוגיים דלילים או מפוזרים.
- ערך תפעולי: משתמש בערבוב פשוט של מקורות ביולומינסנציה ופלואורופורים, ובכך מפחית את מורכבות הבדיקה ומאפשר תאימות לסריקה ברמה גבוהה (high-throughput).
- ערך ניבוי: מספק קריאות כמותיות של פוטונים אדומים המתאימות לקרבה של הגשוש, ובכך מסייע בזיהוי מועמדים מובילים (leads) ובצמצום סיכונים מכניסטיים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: תואם למגוון פלואורופורים וננו-חלקיקים, מה שמאפשר תכנון גמיש של בדיקות עבור מחלקות מטרות שונות.
- ערך תפעולי: ייצור הסיגנל נשמר לאחר שלבי השטיפה, מה שתומך בזיהוי הדיר במידע (reproducible) בדגימות הטרוגניות.
- מוכנות הבדיקה: פועל בתמיסת סלין פיזיולוגית סטנדרטית ללא צורך בבופרים מותאמים אישית, מה שמקל על השילוב בפלטפורמות סריקה קיימות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מאפשרת הדמיה של מדגם שלם במרחקים מורחבים, מה שתומך בהסברה (extrapolation) ממודלים in vitro למודלים in vivo.
- סנכרון סמנים ביולוגיים: FUEL המכוון לנוגדנים שומר על האות לאחר הקישור, מה שמאפשר ניטור של מעורבות מטרה ספציפית על פני קני מידה מרחביים גדולים יותר.
- הפחתת סיכונים: אות תלוי-מרחק פועל לפי חוק הריבוע ההפוך, ובכך מספק מסגרת כמותית צפויה להשוואה בין מחקרים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטת FUEL משתלבת ברצף הגילוי, החל מסריקה ראשונית של מעורבות מטרות ועד לתיקוף פרה-קליני, במיוחד כאשר נדרשת רזולוציה מרחבית מעבר לקרבה מולקולרית.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות של לוקליזציה של מטרות ויצירת קומפלקסים בסביבות תאיות שבהן הגששים עשויים שלא להיות במגע ישיר.
- סינון: מאפשר סטנדרטיזציה של בדיקות באמצעות פלט אות שניתן לכיוונו לפי מרחק, ובכך משפר את השחזוריות בין מעבדות שונות.
- אנליזה: מייצר שטף פוטונים אדומים כמותי הניתן למדידה באמצעות מדמיימי ביומינסנסנס סטנדרטיים, מה שמאפשר ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין אירועי קישור in vitro לגילוי אותות ברמת הרקמה, ובכך תומך בתיקוף של סמנים ביולוגיים במודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: דורש רק מקור ביומינסנסנסי ופלוורופור, מה שהופך זאת ליכולת ניידת וזולה לשימוש בפרויקטים מרובים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מרחיב את הטווח המרחבי של בדיקות המבוססות על לומניסנציה (luminescence), ובכך מפחית תוצאות שגויות שליליות במטרות בעלות שפע נמוך או כאלו המפוזרות באופן דיפוזי.
- ערך תפעולי: מבטל את הצורך בזיגוג מולקולרי (conjugation) מדויק או בקרבה פיזית רבה, מה שמפשט את הכנת הרכיבים ומפחית את השונות.
- ערך אסטרטגי: משפר את הביטחון בקבלת החלטות מסוג go/no-go על ידי מתן אפשרות לגילוי מטרות שחומקות מבדיקות מבוססות BRET עקב מגבלות מרחק.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון באמצעות אספקת תיקוף אורתוגונלי של מעורבות המטרה (target engagement) במטריצות ביולוגיות מורכבות.
שיקולי יישום
- דורש גישה לתרביות חיידקים ביו-לומנסנטיים או למערכות לומנסנטיות מהונדסות.
- תלוי בציוד סטנדרטי לדימוי ביו-לומנסנטי עם מסנני פליטה מתאימים בעלי הסטה לאדום (למשל, 710–730 nm).
- מחייב אופטימיזציה של ריכוז הגשש ועוצמת המקור כדי למנוע רוויית אות במרחקים קצרים.
- חובה להתחשב בדעיכה לפי חוק ריבוע המרחק בעת פירוש עוצמת האות לאורך מרחקים.
- מוגבל על ידי לומנסנציה של רקע בדגימות עם אוטו-פלואורסצנציה או פיזור אור, דבר הדורש בקרות מתאימות.
